JPH10313884A - 新規菌株およびその調製法 - Google Patents

新規菌株およびその調製法

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JPH10313884A
JPH10313884A JP10121975A JP12197598A JPH10313884A JP H10313884 A JPH10313884 A JP H10313884A JP 10121975 A JP10121975 A JP 10121975A JP 12197598 A JP12197598 A JP 12197598A JP H10313884 A JPH10313884 A JP H10313884A
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bacterial strain
lactobacillus
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ラピエール リュシアーヌ
Beat Mollet
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Michele Delley
デレイ ミシェル
Jacques Edouard Germond
エドアール ジェルモン ジャック
Raymond David Pridmore
デビッド プリドモア レイモンド
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Societe des Produits Nestle SA
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｌ（＋）−乳酸のみを産生して、Ｄ（−）−
乳酸に起因する副作用のないバクテリア菌株およびその
調製方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、腸で生存する能力、ヒトの腸
細胞に接着する能力および免疫調節能を有し、遺伝子組
換えによりＬ（＋）−乳酸のみを産生するバクテリア菌
株に関する。これらの菌株としては、特にラクトバチル
ス・ジョンソニイが挙げられる。かかる遺伝子組換え菌
株は、例えば、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子配列が上記各能力を有する宿主バクテリア菌株か
ら単離され、この配列上で目的とする突然変異生成を行
って修飾された配列を生じさせ、この修飾された配列を
接合性ベクターに挿入し、接合性ベクターを接合により
宿主バクテリア菌株に転換し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナー
ゼをコードする配列が修飾された配列を有する相同の組
換体に置換された宿主バクテリアを選別することによ
り、創作される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組換えのバ
クテリア菌株およびその調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】発酵は、最終的な水素受容体を有機化合
物とする炭素源の減成反応である。乳酸発酵では、２種
の特異的ＮＡＤ依存性乳酸デヒドロゲナーゼによるピル
ビン酸還元に基づいてＮＡＤ+ が再生するため、ある種
のバクテリア菌株は２種のラクテート異性体すなわちＤ
（−）−ラクテートおよびＬ（＋）−ラクテートのラセ
ミ混合物を産生する。なお、本明細書では、ラクテート
デヒドロゲナーゼ、Ｄ（−）−ラクテートおよびＬ
（＋）−ラクテートを便宜上それぞれ乳酸デヒドロゲナ
ーゼ、Ｄ（−）−乳酸およびＬ（＋）−乳酸という。
【０００３】ある個人は乳糖の還元に過敏に反応するこ
とが知られている。この乳糖消化力が弱い理由は、しば
しばβ−ガラクトシダーゼが小腸に充分に存在しないこ
とに起因する。各種の研究（Kolars等.,N.Engl.J.Med.,
310,1 〜3,1984；Marteau 等.,Br.J.Nutr.,64,71〜79,1
990 ；Arrigoni等.,Am.J.Clin.Nutr.,60,926〜929,199
4）により、上記人々にとっては、乳に含まれている乳
糖よりヨーグルトに含まれているものが消化が良く、過
敏に反応しないということが明らかになった。このより
良好な消化性および乳糖非過敏性は、特に腸通過時のヨ
ーグルトに含まれるバクテリアのβ−ガラクトシダーゼ
活性に起因するものである。
【０００４】さらに、Ｄ（−）−乳酸は子供においてア
シドーシスの問題が生じることが知られている。これら
の理由から、世界保健機関（ＦＡＯ／ＷＨＯ，１９６
７；１９７４）は、Ｄ（−）−乳酸それ自体またはＬ
（＋）−乳酸とのラセミ混合物いずれかを子供用食品に
添加すべきではない旨を勧告している。また、大人に対
するＤ（−）−乳酸の消費量は、その上限を１００ｍｇ
／ｋｇ（大人の体重）・日とすべきことが好ましい。
【０００５】遺伝子組換えによりＬ（＋）−乳酸のみを
産生するバクテリア菌株は既に公知である。すなわち、
ボウミク等は、Ｌ（＋）−乳酸のみを産生するラクトバ
チルス・ヘルベチクスＣＮＲＺ３２株、特にラクトバチ
ルス・ヘルベチクスＣＮＲＺ３２（ｐＳＵＷ１０４）株
のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を定方
向突然変異誘発により単離しかつ不活性化する技術を開
示している（Bhowmik 等.,Appl.Microbiol.Biotechno
l.,432〜439,1994）。この株は、ベクターｐＳＡ３とラ
クトバチルス・ヘルベチクスのＤ−乳酸デヒドロゲナー
ゼをコードする遺伝子の０．６ｋｂのＳａｌＩ−Ｓｐｈ
Ｉ内部断片とからなるベクターｐＳＵＷ１０４をエレク
トロポレーションで組みこむことにより得られる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、腸で生
存する能力、ヒトの腸細胞に接着する能力および免疫調
節能を有し、遺伝子を組み換えてＬ（＋）−乳酸のみを
産生するバクテリア菌株は、現時点では未だ知られてな
い。ところで、人間の健康にとって有益な特性を有し、
かつＬ（＋）−乳酸のみを産生して、Ｄ（−）−乳酸に
よる悪影響を回避する腸器官での生存能を有する上記バ
クテリア菌株を実現することは、食品製造分野において
非常に価値のあることであろう。そこで、本発明の目的
はこれらの要求を満足させることにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】このため、本発明は、腸
で生存する能力、ヒトの腸細胞に接着する能力および免
疫調節能を有し、遺伝子を組み換えてＬ（＋）−乳酸の
みを産生するバクテリア菌株に関する。本発明は、特に
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が不活性
化されているバクテリア菌株に関する。
【０００８】本発明は、特にラクトバチルス・アシドフ
ィルス、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチル
ス・ガセリ、ラクトバチルス・クリスパツス、ラクトバ
チルス・アミロボルスまたはラクトバチルス・ガリナル
ムの菌株にかかる。本発明は、さらに寄託番号ＣＮＣＭ
Ｉ−１８５１の菌株および寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−１
８５２の菌株にかかる。
【０００９】本発明の更に別の対象は、遺伝子を組み換
えた結果達成されるＬ（＋）−乳酸のみを産生するバク
テリア菌株の調製方法にある。最後に、本発明は、食品
の製造において、本発明の方法を実施することにより得
られるバクテリア菌株の使用方法にかかる。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下の明細書において、「接合性
ベクター」なる用語は、２種の異なる乳酸菌菌株同士を
接合することにより転換可能なＤＮＡベクターを意味す
る。また、以下の明細書において、「腸で生存する能力
を有する菌株」なる用語は、消化後に大便中に見い出さ
れる乳酸菌菌株を意味する。さらに、以下の明細書にお
いて、「免疫調製能を有するバクテリア菌株」なる用語
は、免疫系に有益な効果があり、特にマクロファージの
食作用を高める性質のある乳酸菌菌株を意味する。
【００１１】したがって、本発明は、腸で生存する能
力、ヒトの腸細胞に接着する能力および免疫調節能を有
し、遺伝子を組み換えてＬ（＋）−乳酸のみを産生する
バクテリア菌株にかかる。特に、本発明は、腸で生存す
る能力、ヒトの腸細胞に接着する能力および免疫調節能
を有し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
が不活性化されたバクテリア菌株にかかる。本発明にか
かる菌株は、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクト
バチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラ
クトバチルス・クリスパツス、ラクトバチルス・アミロ
ボルスまたはラクトバチルス・ガリナルムの菌株を例示
することができる。
【００１２】特に、遺伝子を組み換えてＬ（＋）−乳酸
のみを産生する２種のラクトバチルス・ジョンソニイ菌
株が単離された。これらの菌株は、ブダペスト条約に基
づき、25, rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS CEDEX
15 所在の国立微生物カルチャーコレクション、パスツ
ール研究所に１９９７年２月２０日に寄託され、それぞ
れ寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−１８５１および寄託番号ＣＮ
ＣＭ Ｉ−１８５２が付与された。
【００１３】さらに、本発明は、Ｄ−乳酸デヒドロゲナ
ーゼをコードする遺伝子配列が腸で生存する能力，ヒト
の腸細胞に接着する能力および免疫調節能を有する宿主
バクテリア菌株から単離され、定方向突然変異誘発を上
記配列上で行って修飾された配列を生じさせ、この修飾
された配列を接合性ベクターに組みこみ、接合性ベクタ
ーを接合により宿主バクテリア菌株に転換し、そして、
相同の組換により、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコード
する配列を修飾された配列と置換された宿主バクテリア
を選別する上記菌株の調製方法にかかる。
【００１４】本発明にかかる方法において、Ｄ−乳酸デ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子配列は、例えばＰＣ
Ｒ，クローニングまたは相補性の技術を利用して宿主バ
クテリア菌株から単離することができる。定方向突然変
異誘発を上記配列上で行うと、例えば１またはそれ以上
のヌクレオチドが導入または削除された遺伝子配列を生
じる遺伝子スプライシング重複拡張法（Molecular Biot
echnology,R.M.Horton,1995,3,93〜99）により修飾され
た配列が得られる。
【００１５】宿主バクテリア菌株のドナーバクテリア菌
株における接合性ベクターに修飾された配列を組みこむ
ためには、例えば、宿主バクテリア菌株内で複製能を持
たない接合性ベクターを有するドナーバクテリア菌株を
選別し、宿主ドナーバクテリアのバクテリア菌株内で増
殖することができない第一のベクターに修飾された配列
を連結することにより組立体を生成し、この組立体をド
ナーバクテリア菌株に導入し、そして、第一のベクター
と接合性ベクターが組み換えられたドナーバクテリア供
与体を選別することができる。したがって、修飾された
配列を含む接合性ベクターは、接合により宿主バクテリ
ア菌株に転換される。
【００１６】Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする配
列が修飾された配列と相同の組換により置換した宿主バ
クテリアは、選別される。例えば、接合性ベクターをゲ
ノムに組みこんだ宿主バクテリアは、ある種の抗生物質
を含有する培地で選別することができる。実際、ゲノム
に接合性ベクターを組みこむとき、上記バクテリアは該
ベクターの配列に含まれるが抗生物質耐性遺伝子を発現
し得る。
【００１７】最後に、修飾された配列を除いて、接合性
ベクターのＤＮＡ配列をゲノムから除去した宿主バクテ
リアを選別する。これは、まず抗生物質含有培地で選別
を行って、これらの抗生物質に感受性のバクテリア、す
なわち、例えば野生型バクテリアや修飾された遺伝子配
列の断片のみを含む遺伝子形質転換されたバクテリアを
選別することにより行うことができる。
【００１８】次いで、例えばＤ−乳酸デヒドロゲナー
ゼ，テトラゾリウム塩およびジアホラーゼの存在下に酵
素着色試験を実施して、野生型バクテリアを本発明に従
って遺伝子形質転換バクテリアと識別することができ
る。この酵素着色試験によれば、Ｄ−乳酸デヒドロゲナ
ーゼを培地に添加すると、Ｄ（−）−乳酸を産生しない
バクテリアはＤ（−）−乳酸を酸化できないため、酸化
されたＤ（−）−乳酸の不存在下培地中のテトラゾリウ
ム塩はジアホラーゼにより還元されず、上記バクテリア
は着色されない状態にあるということを明らかにするこ
とができる。
【００１９】次に、宿主バクテリア菌株に特異的なプラ
イマーを用いて、本発明に従い遺伝子が組み換えられた
宿主バクテリアのゲノム配列についてＰＣＲを行った
後、特異的制限酵素の存在下でＰＣＲ生成物を消化する
ことができる。上記のようにして生じた断片の大きさを
上記と同じ制限酵素で消化した後の野生型宿主バクテリ
アのゲノムから得られたものと比較とすることができ
る。
【００２０】さらに、本発明は、食品の製造において、
本発明の方法を実施することにより得られるバクテリア
菌株の使用方法にかかる。
【００２１】本発明の方法に従うバクテリア菌株の調製
方法およびこれら遺伝子組換えのバクテリア菌株は、添
付図面に関する次の生化学および分子分析によってより
一層詳細に特徴づけられる。
【００２２】図１は、プロメガ（米国ウィスコンシン
州、マディスン）社から市販されているベクターｐＧＥ
ＭＴの連結生成物であるベクターｐＬＬ８３を示し、Ｄ
−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の修飾され
た配列図である。図２は、大腸菌E.coliのベクターｐBl
ueScript SK+（Stratagene,LA YOLLA,CA：米国）から構
築されたベクターｐＭＤ１４を示し、該ベクターはベク
ターｐＮＺ１２（Gasson等., J.Bacteriol.,154,1 〜9,
1983）のクロラムフェニコール（ｃａｔ）耐性遺伝子の
配列ベクターｐＡＭβ１［Clewell 等.,J.Bacteriol.,3
3,426 〜428,1974；ＰＵＣ−８３８プラスミド（Mollet
等.,J.Bacteriol.,175,4315 〜4324,1993 ）から分離さ
れる］の上流５′領域を含む。
【００２３】図３は、ベクターｐＬＬ８３断片の連結生
成物であるベクターｐＬＬ８８を示し、該ベクターはベ
クターｐＭＤ１４中Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコード
する修飾された遺伝子配列からなる。図４は、ベクター
ｐＬＬ８８およびベクターｐＡＭβ１（Clewell et a
l., J.Bacteriol.,33,426 〜428,1974）の配列からなる
ベクターｐＬＬ９１を示す。
【００２４】Ｉ. ラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１
のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子配列の
単離：ＭＲＳを培地にラクトバチルス・ジョンソニイＬ
ａ１を３７℃で一昼夜増殖する。培養液はその後ＭＲＳ
培地を含有する管に移し、ＯＤ600 が約１になるまで培
養する。ラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１のゲノム
は、論文「ラクトバチルス・デルブルエツキのＤＮＡプ
ローブ」（B.Mollet等.,Appliedand Environmental Mic
robiology,June 1990,vol.56(6),p.1967〜1970）に記載
の方法により分離する。
【００２５】以下に記載の配列ＳＥＱ ＩＤ No １およ
びＳＥＱ ＩＤ No ２を特異的プライマーとして用いて
ＰＣＲにより単離する。次いで、ラクトバチルス・ジョ
ンソニイＬａ１のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子配列をラクトバチルス・ヘルベチクスのＤ−乳
酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の保存領域の配
列（大腸菌中のラクトバチルス・ヘルベチクスＤ−乳酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングとオーバー発現
Kochhar等, Eur.J.Biochem.,208,799〜805,1992）であ
る。
【００２６】これにより、プロメガ社から市販のベクタ
ーｐＧＥＭＴにクローン化された後に配列化される８９
０ｂｐの断片が得られる。ラクトバチルス・ジョンソニ
イＬａ１のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝
子の完全な配列を単離するために、各種制限酵素でサザ
ンブロットを行ない、使用するプローブはＰＣＲにより
予め得られる配列である。このようにして、反対側に配
向した２つの開放読み枠からなる３ｋｂのヌクレオチド
配列を単離する。
【００２７】開放読み枠の１つとラクトバチルス・ヘル
ベチクスのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝
子配列との間に高度の相同性が見い出される。この開放
読み枠の配列は、１０１４個のヌクレオチド長を有し、
ラクトバチルス・ヘルベチクスのＤ−乳酸デヒドロゲナ
ーゼをコードする遺伝子配列で８５％の相同を有し、ラ
クトバチルス・ブルガリクス（バーナード等.,FEBS Let
t.,290,61 〜64,1991）の配列で８１％の相同を有す
る。この配列は３３８個のアミノ酸から構成されるポリ
ペプチドをコードする。
【００２８】II. ラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１
のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする配列上への定
方向突然変異誘発：定方向突然変異誘発が、遺伝子スプ
ライシング重複拡張法（アール．エム．ホートン，Mole
cular Biotechnology,3,93〜99,1995 ）により単離され
た配列について行なう。この配列は、ＰＣＲ処理され、
中心部で１１個のヌクレオチドの欠失と３個のヌクレオ
チドの挿入が行われる。これらの配列の修飾は、Ｄｒａ
Ｉ制限部位の作出とＥｃｏＲＶ制限部位の喪失をもたら
す。これら２つの制限部位の修飾はマーカーとして用い
られ、組立体の残部とＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子の修飾された配列のみに組みこまれた突然
変異体の選別とに用いられる異なった種類のベクター中
にあるラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１のＤ−乳酸
デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の修飾された配列
の存在を明らかにする。このようにして修飾された遺伝
子配列は、３３８個のアミノ酸から構成されるポリペプ
チドに代えて１８１個のアミノ酸から構成されるポリペ
プチドをコードする。
【００２９】III.大腸菌のベクターｐＧＥＭＴにラクト
バチルス・ジョンソニイＬａ１のＤ−乳酸デヒドロゲナ
ーゼをコードする遺伝子の修飾された配列のクローニン
グ：Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の修
飾された配列が、大腸菌のベクターｐＧＥＭＴにクロー
ン化される。このクローン化は、アンピシリン耐性遺伝
子を含む上記ベクターｐＧＥＭＴに遺伝子の修飾された
配列を連結することにより行われる。
【００３０】この連結混合物をエレクトロポーレーショ
ンにより大腸菌XL1-Blueに導入し、Ｘ−ｇａｌとＩＰＴ
Ｇの存在下に陽性クローンを選別する（サムブルック
等，分子クローニング：実験室マニュアル第二版, １９
８９年発行）。得られたベクターは、図１に示すように
ｐＬＬ８３と称される。ベクターｐＬＬ８３は、その後
アルカリ溶解法により精製される（サムブルック等著，
分子クローニング：実験室マニュアル第二版, １９８９
年発行）。
【００３１】次いで、上記のようにして精製されたベク
ターｐＬＬ８３から、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子の修飾された配列からなる断片を分離す
る。この分離は、ベクターｐＬＬ８３のＳｐｈＩ制限部
位で制限酵素ＳｐｈＩを用いて消化することにより行わ
れる。次に、ポリメラーゼＴ４を上記切断部で反応さ
せ、ヌクレオチドを加えてブラント切断部が得られる。
最後に、制限酵素ＳｐｅＩを用いて消化を行なう。
【００３２】以上の操作と平行して、ドナーバクテリア
菌株のラクトコッカス・ラクチスおよび宿主バクテリア
菌株のラクトバチルス・ジョンソニイ内で複製できない
ベクターに対して消化を行う。この消化は、ポリメラー
ゼＴ４を上記切断部で反応させてヌクレオチドを加えブ
ラント切断面を得た後に、制限部位で行われる。最後
に、制限酵素ＳｐｅＩを用いて消化を行う。この組立体
を調製するために、特に図２に記載のベクターｐＭＤ１
４を用いることができる。このベクターｐＭＤ１４の消
化を制限酵素ＥｃｏＲＩで行った後、ポリメラーゼＴ４
を反応させて、制限酵素ＳｐｅＩで最終的な消化を行う
ことができる。
【００３３】次いで、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子の修飾された配列からなるベクターｐＬＬ
８３の断片をベクターｐＭＤ１４に導入する。次に、連
結混合物をエレクトロポーレーションにより大腸菌 XL1
-Blue に導入する。
【００３４】このように構築した約１００個の大腸菌 X
L1-Blue のコロニーをマイクロフィルター平板に載置
し、ニトロセルロース膜に移し換えた後、その場で溶解
して、ラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１のＤ−乳酸
デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の内部断片とハイ
ブリド化を実施する。
【００３５】そして、図３に記載のベクターｐＬＬ８８
を含む３つの陽性クローンを選別する。このベクターｐ
ＬＬ８８の配列により、ラクトバチルス・ジョンソニイ
Ｌａ１のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
の修飾された配列，この配列の側部に位置するｐＧＥＭ
Ｔ領域およびベクターｐＭＤ１４から構成されているこ
とが証明される。
【００３６】IV. ラクトコッカス・ラクチス菌株ＭＧ１
３６３（ｐＡＭβ１）へのベクターｐＬＬ８８の導入 ベクターｐＬＬ８８をエレクトロポレーションによりラ
クトコッカス・ラクチス菌株ＭＧ１３６３（ｐＡＭβ
１）に導入する。ついで、このようにして生成した形質
転換体をクロラムフェニコール１２μｇ／ｍｌ含有の寒
天培地ＧＭ１７に置き、３０℃で一昼夜培養する。ベク
ターｐＬＬ８８はグラム陽性菌中で複製することができ
ない。そして、クロラムフェニコール耐性遺伝子からな
る図３に記載のベクターｐＬＬ８８を相同領域近傍で接
合性ベクターｐＡＭβ１に挿入したラクトコッカス・ラ
クチスＭＧ１３６３（ｐＡＭβ１）のバクテリアは全
て、クロラムフェニコールを含有する上記培地で選別す
る。ベクターｐＬＬ８８およびベクターｐＡＭβ１の各
配列からなるこの組立体は、以下ベクターｐＬＬ９１
（図４に記載）と称する。
【００３７】Ｖ. 接合条件：ベクターｐＬＬ９１含有の
ラクトコッカス・ラクチスＭＧ１３６３をクロラムフェ
ニコール１２μｇ／ｍｌ含有のＧＭ１７培地で培養し、
ラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１をＭＲＳ培地で培
養する。このようにして調製した０．２％のラクトバチ
ルス・ジョンソニイＬａ１培養物を新鮮なＭＲＳ培地を
含有する管に接種して、この混合物を３７℃で丁度５時
間培養する。
【００３８】次いで、ラクトコッカス・ラクチスＭＧ１
３６３およびラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１の培
養物をそれぞれ３０００ｒｐｍで遠心分離に５分間か
け、トリプチカーゼ１０ｇ，イースト抽出物５ｇ，トリ
プトース３ｇ，リン酸二カリウム３ｇ，リン酸一カリウ
ム３ｇ，クエン酸アンモニウム２ｇ，ミネラル塩に富む
溶液５ｍｌ，トウィーン８０ １ｇ ，酢酸ナトリウム
１ｇ，グルコース２０ｇおよびシステイン０．２ｇを含
有するＬＣＭＧ培地（ラクトバチルス・アシドフィルス
の抗原分析；Efthymiou 等., J.Infect.Dis.,110,258〜
267,1962）１０ｍｌに各々の残渣を移す。
【００３９】このようにして調製したラクトコッカス・
ラクチスＭＧ１３６３ドナー菌株の培養液１ｍｌを上記
の方法で調製したラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１
菌株受容体の培養液１０ｍｌと混合し、この混合物を遠
心分離にかける。上澄み液を捨てて、ＰＥＧ6000 ５ｇ
，寒天１５ｇ，糖を含まないＬＣＭＧ溶液１０００ｍ
ｌ，糖含有溶液１００ｍｌおよびミネラル塩溶液１０ｍ
ｌを含有するＰＥＧ寒天培地（Takemoto et al.,Agric.
Biol.Chem.,53,3333〜3334,1989）の平板を濃縮した残
渣に敷く。この平板を残渣が乾燥するまで室温で放置し
た後、寒天７‰含有のＬＣＭＧ培地１０ｍｌで被覆す
る。
【００４０】上記平板を３７℃で一昼夜培養した後、増
殖したバクテリア細胞を含有する寒天を切り出し、この
寒天をＬＣＭＧ培地１０ｍｌ含有の管に入れる。次に、
上記管を激しく振盪し、このようにして調製した培養物
をトリプトン１ｇ／ｌおよび食塩８．５ｇ／ｌを含有す
るＴＳ培地で希釈する。その後、希釈した培養物をホス
ホマイシン１００μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコー
ル１４μｇ／ｍｌ含有のＭＲＳ寒天培地の平板に置き、
嫌気性下に３７℃で４８時間培養する。
【００４１】VI. ラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１
へのベクターｐＬＬ９１の接合と挿入：ベクターｐＬＬ
９１を含むラクトコッカス・ラクチスＭＧ１３６３をラ
クトバチルス・ジョンソニイＬａ１と接合する。この接
合により、形質転換体／受容体細胞間では、３×１０-7
〜１×１０-5の頻度に有する。
【００４２】次いで、クロラムフェニコールおよびホス
ホマイシンに耐性のラクトバチルス・ジョンソニイＬａ
１のコロニーを６個選別し、４５℃で数時間移植する前
に、ＭＲＳ培地で３７℃培養して、Ｄ−乳酸デヒドロゲ
ナーゼをコードする配列で、相同領域により、ベクター
ｐＬＬ９１をそれらのゲノムに組み込んだ。実際、ベク
ターｐＬＬ９１に含まれるベクターｐＡＭβ１は、４２
℃以上の温度で複製することができない。したがって、
クロラムフェニコールに耐性がありかつ４５℃で増殖し
うるラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１のバクテリア
は全て、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする配列
で、相同領域により、ベクターｐＬＬ９１をそれらのゲ
インに組み込んだ。
【００４３】したがって、ラクトバチルス・ジョンソニ
イＬａ１のゲノムへのベクターｐＬＬ９１の組みこみ
は、単一のクロスオーバーによりＤ−乳酸デヒドロゲナ
ーゼをコードする遺伝子配列の５′末端領域または該遺
伝子配列の３′末端領域のいずれかに得られる。
【００４４】ＶII. ラクトバチルス・ジョンソニイＬａ
１の染色体ＤＮＡへのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子の修飾された配列の組みこみの確認：ラク
トバチルス・ジョンソニイＬａ１のゲノムへのベクター
ｐＬＬ９１の組み込みは、ＰＣＲにより確認される。
【００４５】上記確認は、配列が以下に記載の配列ＳＥ
Ｑ ＩＤ No.３およびＳＥＱ ＩＤNo.４であるラクト
バチルス・ジョンソニイＬａ１のゲノムに特異的なプラ
イマーと、配列が以下に記載の配列ＳＥＱ ＩＤ No.５
およびＳＥＱ ＩＤ No.６であるベクターｐＬＬ９１に
特異的なプライマーとを用いて行われる。ＰＣＲにより
このように増幅された断片は、制限部位がＤ−乳酸デヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子の最初の配列に位置す
る制限酵素ＥｃｏＲＶと、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子配列の修飾された位置を制限部位とす
る制限酵素ＤｒａＩにより消化されて、最初の遺伝子配
列の５′末端領域または３′末端領域で単一のクロスオ
ーバーによる組みこみが行われるということが明かにな
る。本来の遺伝子配列の５′末端領域への修飾された遺
伝子配列の組みこみにより遺伝子的に修飾されたラクト
バチルス・ジョンソニイＬａ１のバクテリア、および本
来の遺伝子配列の３′末端領域への修飾された遺伝子配
列の組みこみにより遺伝子的に修飾されたラクトバチル
ス・ジョンソニイＬａ１のバクテリアは選別される。
【００４６】次いで、ベクターｐＬＬ９１がラクトバチ
ルス・ジョンソニイＬａ１のゲノムに組みこまれるの
は、選別されて遺伝子が修飾された上記２つのラクトバ
チルス・ジョンソニイＬａ１のバクテリアのゲノムをサ
ザンブロットすることにより確認される。この確認は、
ベクターｐＬＬ９１についておよびＤ−乳酸デヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子の修飾された配列について、
制限部位がゲノムに位置する異なった制限酵素で上記２
種のバクテリアのゲノムＤＮＡを消化することにより行
われる。用いるハイブリド化プローブは、Ｄ−乳酸デヒ
ドロゲナーゼをコードする本来の遺伝子配列の断片であ
る。
【００４７】以上のことは、異なった制限酵素で消化し
た後に得られる遺伝子的に修飾された２種のラクトバチ
ルス・ジョンソニイＬａ１のバクテリアのゲノム断片
は、これと同じ制限酵素で野生型ラクトバチルス・ジョ
ンソニイＬａ１のバクテリアのゲノムを消化した後に得
られる断片とは、大きさが異なっているということから
明らかにされる。
【００４８】VIII. 組みこみの分解：ゲノムからベクタ
ーｐＬＬ９１を放出することにより組みこみが分解され
る。ベクターｐＬＬ９１は、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ
をコードする本来の遺伝子配列と修飾された該遺伝子配
列との５′末端領域間の単一クロスオーバーにより、ま
たはＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする本来の遺伝
子配列と修飾された該遺伝子配列との３′末端領域間の
単一クロスオーバーのいずれかにより喪失される。ベク
ターの許容温度である３７℃で組みこみが分解され、ベ
クターｐＬＬ９１がゲノムから放出するのに好都合であ
る。
【００４９】Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ，テトラゾリウ
ム塩およびジアホラーゼの存在下に酵素着色試験を実施
して、野生型バクテリアと本発明に従って遺伝子が形質
転換されたバクテリアと識別する。この酵素着色試験に
よれば、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼを培地に添加する
と、Ｄ（−）−乳酸を産生しないバクテリアはＤ（−）
−乳酸を酸化できないため、酸化されたＤ−乳酸が存在
しない場合、培地中のテトラゾリウム塩はジアホラーゼ
により還元されず、上記バクテリアは着色されない状態
にあるということを明らかにすることができる。
【００５０】
【実施例】以下の実施例は、本発明のバクテリア菌株を
食品の製造に使用することを説明するためのものであ
る。なお、以下の「％」は、特に断らない限り「重量
％」を意味する。
【００５１】実施例１ 本発明の方法により得られるラクトバチルス・ジョンソ
ニイ ＣＮＣＭ Ｉ−１８５１株からヨーグルトを製造
する。
【００５２】この製造法は、９％の再構成脱脂粉乳５０
０ｍｌを調製し、イースト抽出物を０．１％添加して、
混合物をオートクレーブにおいて１２１℃で１５分間殺
菌することにより実施される。次に、殺菌処理物を４０
℃まで放冷した後、５×１０ 8 ／ｃｍ3 の微生物を含有
するラクトバチルス・ジョンソニイ ＣＮＣＭ Ｉ−１
８５１株の活性培養液を１０容量％の割合で混合する。
得られる混合物を４０℃で丁度４時間培養して、微生物
を約２．５×１０8 ／ｃｍ3 含有するパン種を製造す
る。
【００５３】以上の操作と平行して、増粘性ストレプト
コッカス・サーモフィルス菌を約５×１０8 ／ｃｍ3 含
有するパン種を上記の方法により製造する。脂肪１．５
％および脱脂粉乳３％を含有する混合物を９０℃で３０
分間殺菌する。次に、１％のラクトバチルス・ジョンソ
ニイ ＣＮＣＭ Ｉ−１８５１のパン種および３％のス
トレプトコッカス・サーモフィルスのパン種を上記混合
物に添加する。この調製物を更に混合し、４０℃で４時
間２０分培養して、ｐＨ４．６の調製物を得る。
【００５４】以上の操作から、ラクトバチルス・ジョン
ソニイ ＣＮＣＭ Ｉ−１８５１の濃度が１×１０8 細
胞数／ｃｍ3 およびストレプトコッカス・サーモフィル
スの濃度が１×１０8 細胞数／ｃｍ3 である心地よいテ
クスチャーのヨーグルトが製造される。
【００５５】実施例２ 無菌蒸留水で５０％に希釈した以外は、実施例１と同様
にしてヨーグルトを製造する。この調製物は病院等で非
経口摂取栄養物として利用することが可能である。
【００５６】実施例３ 本発明の方法により得られるラクトバチルス・ジョンソ
ニイ ＣＮＣＭ Ｉ−１８５２株から発酵乳を製造す
る。
【００５７】この製造法は、乳１ｌを１２０℃で１５分
間加熱して乳を変性させる。その後、３７℃に冷却し
て、本発明の方法により得られる５％v ／v のラクトバ
チルス・ジョンソニイ ＣＮＣＭ Ｉ−１８５２株を接
種する。このようにして得られる調製物を酸性度レベル
が１％に達するまで、室温で１８〜２４時間培養する。
最後に、製造された発酵乳を瓶詰めにして、低温保存す
る。
【００５８】実施例４ 本発明の方法により得られるラクトバチルス・ジョンソ
ニイ ＣＮＣＭ Ｉ−１８５２株からフレッシュチーズ
を製造する。この製造法は、まず乳１ｌを７２℃で１５
分間加熱した後、放置して１９℃に冷却する。次いで、
ラクトコッカス・ラクチス・クレモリス，ラクトコッカ
ス・ラクチス・ジアセチラクチスおよびラクトバチルス
・ジョンソニイ ＣＮＣＭ Ｉ−１８５２株を含有する
混合菌０．５％v ／v を接種する。得られる混合物を乳
のｐＨが４．６になるまで約２０℃で培養する。このよ
うにして凝集した乳をナイロン袋に注いで、製造される
フレッシュチーズに含まれる過剰の水を排出する。その
後、フレッシュチーズをソルビン酸カリウム等の殺菌剤
と混合して、カビの発生を防止する。最後に、緩やかに
混合して均質化すると、口当たりのよいテクスチャーの
フレッシュチーズが製造される。上記方法により製造さ
れるフレッシュチーズを小さな瓶に詰め、４〜５℃で４
〜５週間貯蔵することができる。
【００５９】配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人： （Ａ）名称：ソシエテ・デ・ブロデュイ・ネッスル （Societe des Produits NESTLE ） （Ｂ）街路名：ネスレ５５番街 （Ｃ）町名：ヴェヴェイ （Ｄ）州名：ボー州 （Ｅ）国名：スイス国 （Ｆ）郵便番号：１８００ （Ｇ）電話番号：０２１−９２４−３４２０ （Ｈ）ファックス番号：０２１−９２４−２８８０ (ii)発明の名称：Ｌ（＋）−乳酸（ラクテート）の製造 (iii) 配列の数：６ (iv)コンピュータによる読み取り可能な形式： （Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ 互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ
−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１.
０，バージョン＃１. ２５（ＥＰＯ）
【００６０】（２）ＳＥＱ ＩＤ No.１に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）形状：線状 (ii)分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ No.１ ＧＣＴＴＡＣＧＣＴＡ ＴＴＣＧＡＡＡＡＧＡ ＣＧ ２２
【００６１】（２）ＳＥＱ ＩＤ No.２に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）形状：線状 (ii)分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ No.２ ＧＴＡＧＴＧＴＡＧＡ ＡＧＧＣＧＧＴＧＴＧ ＴＧＧ ２３
【００６２】（２）ＳＥＱ ＩＤ No.３に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）形状：線状 (ii)分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ No.３ ＴＧＧＴＴＧＣＣＡＡ ＧＴＡＴＴＡＧ １７
【００６３】（２）ＳＥＱ ＩＤ No.４に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）形状：線状 (ii)分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ No.４ ＧＣＴＡＡＧＴＣＡＴ ＴＡＧＴＧＣＣ １７
【００６４】（２）ＳＥＱ ＩＤ No.５に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）形状：線状 (ii)分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ No.５ ＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧ ＧＡＧＣＴＣＣ １７
【００６５】（２）ＳＥＱ ＩＤ No.６に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）形状：線状 (ii)分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ No.６ ＴＴＧＡＣＧＴＴＧＡ ＧＣＣＴＣＧＧ １７
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
配列が修飾されたベクターｐＬＬ８３を示す。
【図２】大腸菌E.coliのベクターｐBlueScript SK+から
組み立てられたベクターｐＭＤ１４を示し、ベクターｐ
ＮＺ１２のクロラムフェニコール耐性遺伝子およびベク
ターｐＡＭβ１のエリスロマイシン耐性遺伝子配列を含
む。
【図３】ベクターｐＬＬ８３断片の連結生成物であるベ
クターｐＬＬ８８を示し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼを
コードするベクターｐＭＤ１４中の修飾された遺伝子配
列からなる。
【図４】ベクターｐＬＬ８８およびベクターｐＡＭβ１
の配列からなるベクターｐＬＬ９１を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:23） (72)発明者 ミシェル デレイ スイス国 ローザンヌ，アブニュ デ ボ ベレッセ ６ (72)発明者 ジャック エドアール ジェルモン スイス国 クリシェ，シュマン デ セド ル 18 (72)発明者 レイモンド デビッド プリドモア スイス国 ローザンヌ 26，ベルス − シェズ − レ ブランク，ルート ドュ ジョラ，126

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遺伝子組換えによりＬ（＋）−ラクテー
    トのみを産生することを特徴とする、腸で生存する能
    力、ヒトの腸細胞に接着する能力および免疫調節能を有
    するバクテリア菌株。
  2. 【請求項２】 Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする
    遺伝子が不活性化されている、請求項１記載の菌株。
  3. 【請求項３】 菌株は、ラクトバチルス・アシドフィル
    ス、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・
    ガセリ、ラクトバチルス・クリスパツス、ラクトバチル
    ス・アミロボルスまたはラクトバチルス・ガリナルムで
    ある、請求項１記載の菌株。
  4. 【請求項４】 寄託番号Ｉ−１８５１でＣＮＣＭに寄託
    された、請求項１記載の菌株。
  5. 【請求項５】 寄託番号Ｉ−１８５２でＣＮＣＭに寄託
    された、請求項１記載の菌株。
  6. 【請求項６】 ・Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードす
    る遺伝子配列を、腸で生存する能力、ヒトの腸細胞に接
    着する能力および免疫調節能を有する宿主バクテリア菌
    株から単離し、 ・定方向突然変異誘発を上記配列上で行って修飾された
    配列を生じさせ、 ・この修飾された配列を接合性ベクターに組みこみ、 ・接合性ベクターを接合により宿主バクテリア菌株に転
    換し、 ・そして、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする配列
    を相同の組換法により修飾された配列と置換された宿主
    バクテリアを選別する、請求項１記載の菌株を調製する
    方法。
  7. 【請求項７】 修飾された配列を接合性ベクターに組み
    こむために、 ・宿主バクテリア菌株内で複製能を持たない接合性ベク
    ターを含有するドナーバクテリア菌株を選別し、 ・ドナー菌株内で増殖することができない第一のベクタ
    ーに修飾された配列を連結して組立体を生成し、 ・この組立体をドナーバクテリア菌株に導入し、 ・そして、第一のベクターと接合性ベクターが組み換え
    られたドナーバクテリアを選別する、請求項６記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 修飾された配列は別として、接合性ベク
    ターのＤＮＡ配列をゲノムから除去した宿主バクテリア
    を選別する、請求項６記載の方法。
  9. 【請求項９】 食品の製造において、請求項６〜８のい
    ずれかに記載の方法を行うことにより得られるバクテリ
    ア菌株の使用方法。
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