KR101609401B1 - 항균성 및 면역조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이의 신규한 균주 - Google Patents

항균성 및 면역조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이의 신규한 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항균성 및 면역조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이의 신규한 균주 및 상기 균주를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

Description

항균성 및 면역조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이의 신규한 균주{NOVEL STRAIN OF LACTOBACILLUS PARACASEI SUBSPECIES PARACASEI HAVING ANTIMICROBIAL AND IMMUNOMODULATORY PROPERTIES}
본 발명은 항균성 및 면역조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이의 신규한 균주에 관한 것이다.
매우 많은 과학적 연구들이 발효 식품, 특히 낙농 제품에 존재하는 특정 미생물의 건강에 대한 유익한 효과들을 보고해왔다. 이들 미생물은 통상적으로 "생균제(probiotics)"라고 지칭된다. 요즘 일반적으로 받아들여지고 있는 정의에 따르면, 생균제는 다음과 같다: "적절한 양으로 소비될 때 숙주의 건강에 유리한 효과를 가지는 살아있는 미생물"(생 젖산균을 함유하는 분유를 포함하여 식품 중의 생균제의 건강적 및 영양학적 성질의 평가에 대한 FAO/WHO 보고서; Cordoba, Argentina; 2001. 10. 1-4).
생균활성 박테리아를 함유하는 식품 제품의 소비가 특히 장내 세균을 재-평형시키고, 감염 내성을 증가시키고, 그리고 면역반응을 조절하는 것에 의하여 건강에 바람직한 효과를 나타낼 수 있다는 것이 확인되었다.
일반적으로 인간 식품에서 사용되는 생균활성 미생물은 주로 락토바실러스와 비피도박테리아 속, 특히 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이(특허 출원 EP 0794707에 기재된 균주)에 속한 젖산균이다.
그러나, 건강에 대한 유리한 효과는 동일한 종은 아닐지라도, 일반적으로 동일한 속의 모든 세균들에서 공통적이다. 이들은 가장 일반적으로 특정 균주에서만 나타난다; 또한, 관찰된 효과는 동일한 종 내에 포함되는 한 생균활성 균주로부터 다른 균주까지 질적으로 그리고/또는 양적으로 다양할 수 있다.
미생물이 잠재적으로 생균제로 사용될 수 있는 것으로 여겨질 수 있기 위해서는 다음의 기준 중 적어도 하나 이상, 그리고 이상적으로는 여러 개를 충족하여야 한다:
- 장내 세균에 존재할 수 있는 병원성 미생물에 대하여 억제 활성을 나타냄, 이 활성은 장내 세포에 부착하여 병원균의 부착을 배제하거나 감소시킬 수 있는 능력, 또는 병원성을 억제하는 성분들을 제조하는 능력, 또는 이들 두 특성의 조합으로부터 얻어질 수 있음;
- 면역조절성, 및 특히 면역 자극 및/또는 항-염증성을 나타냄.
또한, 이 미생물을 낙농 제품으로 혼입시키고자 한다면, 바람직하게는 우유로 만족스러운 성장이 나타나야만 한다.
최종적으로, 장에 도달하고 장내 환경에서 살아남을 수 있기 위해서는, 혼입되는 식품의 생산과 저장동안, 그리고 소비자에 의하여 식품이 소화된 후에도 우수한 생활성을 유지하여야만 한다.
그러나, 요즘의 "생균제" 정의에 맞기 위하여 생활성이 필수적이기는 하지만, 생균활성 균주와 관련된 유리한 효과들 중 일부는 생균이 없을 때조차도 얻어질 수 있고, 특정 세균 분획 또는 이들의 배양 상청액의 활성 분획에 기여할 수 있는 것으로 나타나는 것을 주목해야만 한다. 예를 들어, PCT 출원 WO2004093898호는 CNCM I-2219 균주의 배양 상청액의 분획화에 의하여 얻어지는 면역조절 제제를 기재한다.
본 발명자들은 상기한 생균제의 기준을 충족하는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이의 신규한 균주를 분리하는데 성공하였다. 본 발명은 항균성 및 면역조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이의 신규한 균주 및 상기 균주를 함유하는 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 대상은 부다페스트 조약에 따라 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National collection of microorganism cultures], 25 rue du Docteur Roux, Paris)에 2006년 11월 9일자로 I-3689호로 기탁된 균주이다.
CNCM I-3689 균주는 다음의 특징을 갖는다:
- 형태: 그람-양성 미생물, 작고 얇은 간균, 독립된 또는 작은 사슬
- 다음의 당의 발효(37℃에서 48시간 동안 api 50 CH 스트립-API MRS 배지에서 얻어진 결과): 리보오스, 갈락토오스, D-글루코스, D-프럭토오스, D-만노오스, 만니톨, N-아세틸글루코사민, 알부틴, 셀로비오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스, 멜레지토오스, D-투라노오스, D-타가토오스, 글루코네이트.
- 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:2로 나타나는 반복 서열을 함유하는 서열 SEQ ID NO:1의 단일 CRISPR 좌(locus)의 존재.
또한, 이는 배양액 중의 병원성 미생물, 특히 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)의 성장을 억제하는 강한 활성을 나타내는 항균성을 가진다.
CNCM I-3689 균주는 또한 면역조절성, 및 특히 항-염증성을 가진다.
또한, 본 발명의 대상은 또한 CNCM I-3689 균주의 돌연변이 또는 유전자 형질전환에 의하여 얻어질 수 있는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주를 포함한다. 바람직하기는, 이들 균주들이 CNCM I-3689 균주의 항균성 및 면역조절성을 보유하는 것이다. 이들은 예를 들면, 대사 특성(예: 설탕을 대사하는 이 균주의 활성, 장 통과에 대한 저항성, 산성에 대한 저항성, 후-산성화 또는 대사물 생산)의 일부를 수정하기 위하여 CNCM I-3689 균주의 내생적 유전자 중 하나 또는 그 이상이 돌연변이된 균주일 수 있다. 이들은 예를 들면, 상기 균주에 부가적인 생리적 특성을 부여하거나 또는 상기 균주에 의하여 전달되기를 희망하는 관심의 치료제나 백신의 단백질을 발현하는 것이 가능하도록, 관심의 하나 이상의 유전자(들)을 갖는 CNCM I-3689 균주의 유전자 형질전환으로부터 얻어지는 균주일 수 있다.
이들 균주는, 예를 들어 Gury 등(Arch Microbiol., 182, 337-45, 2004) 또는 Velez 등(Appl Environ Microbiol., 73, 3595-3604, 2007)에 의하여 기재된 기술과 같은 락토바실러스의 유전자 형질전환 및 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이를 위한 통상적인 기술, 또는 "게놈 셔플링"으로 알려진 기술(Patnaik 등, Nat Biotechnol, 20, 707-12, 2002; Wang Y. 등, J biotechnol., 129, 510-15, 2007)에 의하여 CNCM I-3689 균주로부터 얻어질 수 있다. 이들 균주는 특히 서열 SEQ ID NO: 1의 CRISPR 좌를 갖는다.
본 발명의 대상은 또한 CNCM I-3689 균주의 돌연변이 또는 유전자 형질전환 단계를 포함하는 항균성 및/또는 면역 조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이를 얻는 방법이다.
또한, 본 발명의 대상은 본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주로부터 항균성 및/또는 면역 조절성을 갖는 세포 분획을 얻는 방법이다. 상기 세포 분획은 특히 상기 균주의 배양물로부터 얻어지는 DNA 제제 또는 세균막 제제이다. 또한 이들은 배양 상청액 또는 이들 상청액의 분획이 될 수 있다.
또한, 본 발명의 대상은 본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주 또는 상기 균주로부터 얻어지는 세포 분획을 포함하는 조성물이다.
이들 조성물은 특히 본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주를 젖산균의 하나 이상의 다른 균주(들), 임의로 생균활성인 균주(들)와 혼합한 젖산 발효물(lactic ferments)이 될 수 있다. 젖산균의 균주의 예로는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) 및 스트렙토코커스 서모필러스(Streptococcus thermophilus) 균주를 들 수 있다.
이들은 또한 본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주 또는 상기 균주로부터 얻어진 세포 분획을 포함하는 식품, 그리고 특히 낙농 제품, 또는 약제, 또는 미용 제품일 수 있다.
상기 균주가 생균 형태로 존재한다면, 바람직하기는 이들이 제품 그람당 105 cfu 이상, 바람직하기는 그람당 106 cfu 이상, 보다 바람직하기는 그람당 107 cfu 이상, 그리고 보다 더 바람직하기는 그람당 108 cfu 이상의 비율로 존재하는 것일 것이다.
본 발명에서는 항균성 및 면역조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이의 신규한 균주, 및 상기 균주를 함유하는 조성물을 얻을 수 있다.
도 1은 항-병원성 스코어(임의 유니트)의 함수로서 각 세균 균주의 IL-10/IL-12의 비를 나타낸 도면이다.
도 2는 우유에서 CNCM I-3689 균주의 성장 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 CNCM I-3689 균주에 특이적인 PCR 증폭 프라이머의 아가로즈 겔 전기영동 사진이다.
본 발명은 CNCM I-3689 균주와 이 균주의 분자형의 항균, 면역 조절, 및 항염증성을 설명하는 실시예를 기재하는 다음의 추가적인 설명으로부터 보다 더 명확하게 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: CNCM I-3689 균주와 공지된 생균활성 균주의 특성 비교
CNCM I-3689 균주의 특성들이 생균 특성으로 알려진, 다양한 공지 문헌의 균주의 특성과 비교되었다.
이들 균주 리스트는 하기 표 1에 나타내었다.
속 종 명칭(들) 특허출원 공개번호
락토바실러스 존소니이( johnsonii ) NCC533 = La1 = CNCM I-1225 EP0577903
락토바실러스 아시도필러스 NCFM WO2004032639
락토바실러스 아시도필러스 La-5
락토바실러스 카세이 Shirota
락토바실러스 파라카세이 CRL431 =
ATCC 55544
락토바실러스 람노서스 LGG =
ATCC 53103		 US4839281
락토바실러스 람노서스 HN001 =
NM97/09514		 WO9910476
락토바실러스 플란타룸 ATCC 14917 =
DSMZ 20174 = WCFS1
락토바실러스 플란타룸 Probi 299v =
DSM 9843		 WO9391823
락토바실러스 로테리 DSMZ 20016
락토바실러스 로테리 Biogaia SD 2112 = ATCC 55730 WO2004034808
비피도박테리아 브레베 ATCC 15700
비피도박테리아 브레베 BBC50 =
CNCM I-2219		 EP1189517
비피도박테리아 인판티스 ATCC 15697
비피도박테리아 롱검 BB536
비피도박테리아 롱검 NCC2705 =
CNCM I-2618
비피도박테리아 아니말리스 아종 락티스 BB12 = ATCC 27536
비피도박테리아 아니말리스 아종 락티스 HN019 = NM97/01925 WO9910476
1 - 항균 활성
항균 활성 조사는 세 표적 병원균: Escherichia coli E1392-75-2A, Salmonella enteritidis NIZO B1241 및 Listeria monocytogenes 4B에 대하여 실시되었다. 젖산균은 두 개의 다른 배지: Elliker 배지(Elliker 등, J. Dairy Sci., 39, 1611-1612, 1956) 및 TGE 배지(트립톤-글루코스-미트 추출물)의 페트리 접시 상에서 배양되었다.
상기 접시들을 세균 콜로니가 나타날 때까지 37℃에서 배양한다. 비피도박테리아 배양이 혐기 조건 하에서 실시되었다. 그 다음 BHI(Brain-heart infusion: 뇌-심장 주입) 배지와 병원균을 함유하는 아가 층을 상기 접시의 표면에 부었다. 상기 접시들을 37℃에서, 24시간 동안 다시 배양하였다. 그 다음 젖산균의 각 콜로니 주위에서 병원균 억제 영역의 직경을 측정하였다. 스코어 1은 1 내지 3mm의 직경에 해당된다. 스코어 2는 4 내지 6mm의 직경에 해당된다. 스코어 3은 6mm보다 큰 직경에 해당된다. 각 실험이 각 균주에 대하여 독립적으로 3회 실시되었다.
각 젖산균에 대하여 항균 활성에 대한 종합적인 스코어를 얻기 위하여, 각 실험에서 표적 병원균에 대하여 얻어진 스코어가 더해졌다.
결과는 하기 표 2에 나타내었다.
이 결과들은 시험된 균주 중에서 ATCC 55544 균주와 함께 CNCM I-3689 균주가 가장 높은 항균 활성을 가지는 것임을 보여준다.
Figure 112010074341161-pct00001
2 - 면역 조절성
다양한 젖산균의 면역 조절성이 IL-10/IL-12 비를 측정하여 평가되었다.
건강한 개체로부터 얻어진 인간 혈액 샘플을 PBS-CA(Gibco)로 1:2의 비로 희석하고, Ficoll(Gibco) 구배를 사용하여 정제하였다. 20℃에서 30분간 400×g에서 원심분리한 다음, PBMCs (peripheral blood mononuclear cells: 말초혈액 단핵 세포들)를 얻었다. 그 다음 세 단계의 세정 단계를 거치고, PBMCs를 1%의 태아 소 혈청, 1%의 L-글루타민(Gibco), 및 150㎍/㎖의 겐타마이신(Gibco)이 보충된 RPMI 배양 배지(Gibco)에 재현탁시켰다. PBMCs를 현미경으로 계수하고, 2×106 세포/㎖의 농도로 조정한 다음 24-웰 세포 배양 플레이트(Corning, Inc.)에 1㎖의 분취량으로 분배하였다.
락토바실러스 균주를 MRS 배지(de Man 등, J. Appl. Bacteriol. 23, 130-135, 1960)에서 배양하였고, 비피도박테리아 균주를 혐기 조건 하에서 0.03% L-시스테인(Sigma)으로 보충된 MRS 배지에서 배양하였다. 모든 균주를 37℃에서 배양하였다. 세균의 성장을 정지기에서 정지시킨 다음 세정하고, 세균을 20% 글리세롤을 함유하는 PBS에서 3 MacFarlan 유니트의 농도로 재현탁하였다.
10㎕의 세균 제제를 PBMCs를 함유하는 플레이트의 각 웰에 첨가하였다(세균:세포 비 10:1). 상기 플레이트를 5% CO2를 함유하는 대기 하에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 상청액을 꺼내어 2000rpm에서 원심분리하고, -20℃에서 보관하였다.
공지된 면역 조절성을 갖는 대조 세균 균주를 시험에 포함시켰다. 또한, 세균 없는 PBS-20% 글리세롤을 음성 대조군으로 사용하였다. 세개의 다른 공여자에서 유래한 PBMCs에 대하여 각 균주로 실험을 실시하였다.
시토킨 (cytokines)의 발현을 상업적 키트(Pharmingen, BD Biosciences)를 사용하여 ELISA 검사에 의하여 측정하였다. 두 시토킨을 연구하였다: IL-10과 IL-12
각 균주가 시험되고, IL-10/IL-12의 비의 평균이 계산되었다. 이들 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
속 종 참조 IL-10/IL-12 비
락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 DN 114121 =
CNCM I-3689		 11.8
락토바실러스 플란타룸 Probi 299v =
DSM 9843		 12.7
락토바실러스 아시도필러스 La-5 23.5
락토바실러스 아시도필러스 NCFM 23.6
락토바실러스 존소니이 NCC533 =
La1 = I-1225		 23.7
락토바실러스 플란타룸 A TCC 14917 =
DSMZ 20174 =
WCFS1		 25.0
락토바실러스 로테리 Biogaia SD 2112 ATCC 55730 25.4
비피도박테리아 롱검 BB536 26.4
비피도박테리아 아니말리스 아종 락티스 HN019 =
NM97/01925		 28.7
비피도박테리아 아니말리스 아종 락티스 BB12 =
ATCC 27536		 32.4
락토바실러스 람노서스 LGG = ATCC 53013 34.5
락토바실러스 로테리 DSMZ 20016 42.0
비피도박테리아 인판티스 ATCC 15697 51.4
비피도박테리아 브레베 BBC50 = 1-2219 58.6
락토바실러스 카세이 Shirota 67.6
비피도박테리아 브레베 ATCC 15700 68.5
비피도박테리아 롱검 NCC2705 =
CNCM I-2618		 72.6
락토바실러스 람노서스 HN001 =
NM97/09514		 92.1
락토바실러스 파라카세이 CRL431 =
ATCC 55544		 164.0
이 결과는 CNCM I-3689 균주가 이 모델에서 상당한 항-염증성을 나타낸다는 것을 보여준다. 비교 균주 중 어느 것도 이처럼 우수한 특성을 나타내지는 못하였다.
도 1은 앞서 정해진 항-병원성 스코어(임의 유니트)의 함수로서 각 세균 균주의 IL-10/IL-12의 비를 나타낸다. 이 도면은 CNCM I-3689 균주가 시험된 다른 균주들과 얼마나 다른지를 보여준다.
3 - 장내 스트레스에 대한 생존
장내 스트레스 조건을 반영한 인 비트로 (in vitro: 시험관) 모델이 사용되었다.
젖산균 배양액이 효모 추출물을 보충한 우유에 준비되었다. 상기 배양액을 종에 따라 (배양의 정지기까지) 24 내지 48시간 동안 배양하였다.
돼지의 담즙염(3.3 g/l) 및 NaHCO3 탄산염 완충액(16.5　g/l)으로 구성된 인공 장액이 준비된다. pH를 6.3으로 조정한다. 이 장액 1㎖를 100㎕의 세균 배양액에 첨가한다. 그 다음 이 배양물들을 5시간 동안 배양한다. 그 다음 접시 상에서 스트레스 전과 후의 세균 개체수를 측정한다.
값은 다음과 같이 표현된다:
장내 스트레스=log(cfu5h/cfu0h).
cfuXmin은 배양 x분 후의 콜로니 형성 유니트(Colony Forming Units: CFUs)로 표현되는 세균 농도임.
장내 스트레스에서, 그 값이 -0.5보다 큰 값일 때 생존이 우수하고, -0.5 내지 -1.5일 때 보통으로 우수하고, -0.5 미만일 때는 열악한 것이다.
그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
속 종 참조 장내 스트레스
락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 DN 114121 =
CNCM I-3689 		-0.40
비피도박테리아 아니말리스 아종 락티스 HN019 = NM97/01925 3.40
비피도박테리아 인판티스 ATCC 15697 2.79
락토바실러스 로테리 Biogaia SD 2112 ATCC 55730 1.00
락토바실러스 존소니이 NCC533 = La1 =
I-1225		 0.69
비피도박테리아 아니말리스 아종 락티스 BB12 = ATCC 27536 0.07
락토바실러스 파라카세이 CRL431 = ATCC 55544 0.04
락토바실러스 람노서스 HN001 = NM97/09514 0.00
락토바실러스 람노서스 LGG = ATCC 53103 -0.07
비피도박테리아 브레베 ATCC 15700 -0.14
비피도박테리아 롱검 NCC2705 =
CNCM I-2618		 -0.22
락토바실러스 아시도필러스 La-5 -0.23
락토바실러스 플란타룸 ATCC 14917 = DSMZ 20174 = WCFS1 -0.79
비피도박테리아 브레베 BBC50 = I-2219 -0.91
락토바실러스 플란타룸 Probi 299v =
DSM 9843		 -1.04
비피도박테리아 롱검 BB536 -1.12
락토바실러스 아시도필러스 NCFM -1.45
락토바실러스 카세이 Shirota -1.50
락토바실러스 로테리 DSMZ 20016 -1.91
4. 결론
상기 표 2, 3, 및 4에 기재된 결과들은 시험된 다양한 균주 중에서 CNCM I-3689 균주가 매우 우수한 장내 스트레스에 대한 내성을 수반함과 동시에 현저한 항균성 및 현저한 항염증성 모두를 가지는 유일한 균주임을 나타낸다.
실시예 2: 우유에서 CNCM I-3689 균주의 성장
CNCM I-3689 균주의 우유 중 성장성을 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 시험하였다:
- 탈지된 분유가 첨가된 물로 재구성된 탈지 우유로 구성된 배지가 CNCM I-3689 균주(5.6×106 cfu/g 또는 1.1×107 cfu/g)로 접종되었다.
- 성장과 연관된 이 균주의 발효 활성이 성장 배지의 pH를 지속적으로 관찰하여 측정되었다.
그 결과를 도 2에 나타낸 그래프에 도시하였다.
이들 결과는 CNCM I-3689 균주가 우유에서 효과적으로 성장할 수 있고, 따라서 발효된 낙농 제품의 제조에 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 3: CNCM I-3689 균주의 분자형
많은 원핵 유기체는 하나 이상의 CRISPR 좌―"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"의 두문자어(Jansen 등, 2002, OMICS, Vol.　6, No. 1, 23-33)―를 가진다. CRISPR 좌는 가변 서열("스페이서")이라고 불리는, 일반적으로 20 내지 40개 염기쌍(bp)의 특징적인 서열에 의하여 분리된, 일반적으로 21 내지 37개의 염기쌍의 비연쇄 반복 서열(또는 DRs)에 특징이 있다. 한 균주와 다른 균주 사이에는 다음과 같은 차이점을 관찰할 수 있다:
- CRISPR 좌의 수,
- 게놈 내의 CRISPR 좌의 위치,
- 반복 서열의 수, 및/또는
- 가변 서열의 특성 및/또는 크기
1 - CNCM I-3689 균주의 CRISPR 좌의 동정
CNCM I-3689 균주를 서열화하였다. ERGOTM 소프트웨어 시리즈를 사용한 게놈 분석은 이 균주 내 단일 CRISPR 좌를 동정할 수 있게 한다. 크기가 3323bp인 이 좌는 ORF RDBK00370의 20개 염기 쌍 하류에 위치한다. 이의 게놈성 DNA 서열은 SEQ ID NO: 1로 나타난다. 이것은 ATCC 334 균주(락토바실러스 카세이) 및 54개의 가변 서열(스페이서)의 CRISPR 좌의 반복 단위와 동일한 반복 단위 (GTTTTCCCCGCACATGCGGGGGTGATCC; SEQ ID NO: 2)로 구성된다.
2 - CNCM I-3689 균주에 특이적인 PCR 증폭 프라이머의 구성
CNCM I-3689 균주의 CRISPR 좌의 가변 서열을 기초로 올리고뉴클레오티드 프라이머의 여러 쌍을 정의하였다. CNCM I-3689 균주에 대한 특이성을 확인하기 위하여 다양한 세균 균주에 대한 PCR 증폭에 의하여 이들 프라이머를 시험하였다.
한 쌍의 프라이머는 다음을 보유하였다:
- 2049-2068 위치에서 CRISPR 좌의 33번째 가변 서열에 위치한 프라이머 OFF2486 (CTCAACAGGATAAGTGCCAC; SEQ ID NO: 3); TM = 60℃
- 2093-2110 위치에서 CRISPR 좌의 37번째 가변 서열에 위치한 프라이머 OFF2488 (GGTTGGCTGGGTTTAACGC; SEQ ID NO: 4); TM = 60℃.
보유된 PCR 조건은 다음과 같다:
반응 혼합물:
DNA: 1 ㎕
dNTPs: 4 ㎕
10X 완충액: 5 ㎕
프라이머 OFF2486: 0.3 ㎕
프라이머 OFF2488: 0.3 ㎕
Ex taqTM DNA 폴리머라아제: 0.2 ㎕
물: 39.2 ㎕
사이클:
Figure 112010074341161-pct00002
CNCM I-3689 균주 유래의 PCR 제품의 예상된 크기는 263bp이다.
프라이머 OFF2486/OFF2488 쌍이 CNCM I-3689 균주, 및 CNCM I-1518과 ATCC 334 균주를 포함하는 락토바실러스 카세이의 18개의 다른 균주에 대하여 시험되었다. CNCM I-1518 및 ATCC 334 균주는 상기 프라이머가 상기한 PCR 조건 하에서 이들 균주의 게놈 DNA 서열에 혼성화할 수 없기 때문에 음성 대조를 대표한다.
이 결과들은 도 3에 나타낸 PCR 증폭 제품의 아가로즈 겔 전기영동에 의하여 설명되는데, "121"은 CNCM I-3689 균주를 나타내고, "001"은 CNCM I-1518 균주를 나타내고, "S3" 내지 "S18"은 각각 락토바실러스 카세이의 16개의 다른 균주를 나타내고, "SL"은 분자량 마커를 나타낸다(SmartLadder; Eurogentec).
프라이머 OFF2486/OFF2488 쌍이 예상된 크기(즉, 약 260bp)의 PCR 증폭 산물이 이 균주에서만 얻어지기 때문에 이 결과는 CNCM I-3689 균주에 매우 특이적이라는 것을 나타낸다.
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes I-03689 20061109
SEQUENCE LISTING <110> COMPAGNIE GERVAIS DANONE CHAMBAUD, Isabelle KHLEBNIKOV, Artem VILLAIN, Anne-Catherine GROMPONE, Gianfranco SAINT DENIS, Thierry DRUESNE, Anne SMOKVINA, Tamara <120> NOVEL STRAIN OF LACTOBACILLUS PARACASEI SUBSPECIES PARACASEI HAVING ANTIMICROBIAL AND IMMUNOMODULATORY PROPERTIES <130> F191PCT233 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3323 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei <400> 1 gttttccccg cacatgcggg ggtgatcctt acaagctgaa tggtacgcca cagccagcgc 60 tgttttcccc gcacatgcgg gggtgatccc tacatcaacg aaacgctgat aacgcgatca 120 gcgttttccc cgcacatgcg ggggtgatcc tgagatcagg gtttatccaa ctaccgtctt 180 caagttttcc ccgcacatgc gggggtgatc cctgatctca aagccttatc cagcatcaga 240 tattgttttc cccgcacatg cgggggtgat cctggatcag gcaaaaggcg atcttgataa 300 ctacagtttt ccccgcacat gcgggggtga tccctgttta gcctaatcat taagcgcctc 360 aacgttgttt tccccgcaca tgcgggggtg atccctgtat gaacccatta cgcttgccat 420 gcttgctgtt ttccccgcac atgcgggggt gatcctatca agcccgatta tttggttcac 480 gattctaagt tttccccgca catgcggggg tgatccttat gtcattagga acgaatgcct 540 atcaacatag ttttccccgc acatgcgggg gtgatcctaa ccgtttagaa gggatcacta 600 gccagctgaa gttttccccg cacatgcggg ggtgatcctg taaatgtccg cgtccgatgg 660 ttcgtccgcc ggttttcccc gcacatgcgg gggtgatcct ggtaaattgc aggctcaata 720 tacccagcta aagttttccc cgcacatgcg ggggtgatcc cgccccctcc cgcataacct 780 gtgttgtcta aacgttttcc ccgcacatgc gggggtgatc caaaccaaga gcaacaaaat 840 gttattaagc cattgttttc cccgcacatg cgggggtgat cctacgctca atctgcagct 900 tgctggtatt gttcagtttt ccccgcacat gcgggggtga tcccttggtt atcaagcgac 960 acagacccca caaacagttt tccccgcaca tgcgggggtg atcccagaat aatgttctta 1020 aagctgtcct tggtgaggtt ttccccgcac atgcgggggt gatcccgcgg ccgtaacagc 1080 ggcagaacag cttggtgtgt tttccccgca catgcggggg tgatcctaag gtgagtgcat 1140 atgtctaaaa aaattgatcg ttttccccgc acatgcgggg gtgatcctat ggcagctaat 1200 acggatgcca ttttagctgg gttttccccg cacatgcggg ggtgatcccg gactgctagt 1260 agtatcaaaa tacatgatga ggttttcccc gcacatgcgg gggtgatccc gacaagttcg 1320 gaatttctca gattggcggt tagttttccc cgcacatgcg ggggtgatcc ccaagataaa 1380 tctatatctt tgcaataaat agcgttttcc ccgcacatgc gggggtgatc ccggtggtat 1440 cccaaacttt tgacataccc tttggttttc cccgcacatg cgggggtgat cctaaatgtt 1500 cccttaatcc tcaaaaggcc tttcggtttt ccccgcacat gcgggggtga tccccaatga 1560 cattattttt ataatcagtc atttctgttt tccccgcaca tgcgggggtg atcccaaaat 1620 gccgaaggtc aacaaaaatg gtgatccgtt ttccccgcac atgcgggggt gatcccaatg 1680 catcaaacac catttcgaag ggcattaggt tttccccgca catgcggggg tgatcccaac 1740 agatgatgtc aaaatcccag caagtgattg ttttccccgc acatgcgggg gtgatccccg 1800 ctgaaatatc gctaatcatg ccatcaatga gttttccccg cacatgcggg ggtgatcccc 1860 attcaggaga tctcgaatac gcttttcttt agttttcccc gcacatgcgg gggtgatccc 1920 cagccactgg taaacctgat cggtgttgat tagttttccc cgcacatgcg ggggtgatcc 1980 tggtcattga tgattaaaaa caagccaatg gcagttttcc ccgcacatgc gggggtgatc 2040 ctaactggct caacaggata agtgccacca ttatgttttc cccgcacatg cgggggtgat 2100 cccatcgtct tctgtataag aagacggatc agatggtttt ccccgcacat gcgggggtga 2160 tccttacttg tccgactaat ggactgactg agaatggttt tccccgcaca tgcgggggtg 2220 atcctaaagc tggttacaag gtaccggcca acatggggtt ttccccgcac atgcgggggt 2280 gatcctacca taggttggct gggtttaacg caatgtgagt tttccccgca catgcggggg 2340 tgatcccaac aatttacaaa acgccattca agaaagttag ttttccccgc acatgcgggg 2400 gtgatcctca gacttagccg aatccacctt cttgtctttg gttttccccg cacatgcggg 2460 ggtgatcccc agtcagagta atgtgggggc cagacgaaat agttttcccc gcacatgcgg 2520 gggtgatccc gagatcattc aacacatata ttcacctcca cagttttccc cgcacatgcg 2580 ggggtgatcc tactagtcca tatcagctgg agatcagcgc ctagttttcc ccgcacatgc 2640 gggggtgatc ccacctaaag atgtggaagc atgaccatgg agacgttttc cccgcacatg 2700 cgggggtgat cctggcaagt gacgctaaag gatcacacca atactgtttt ccccgcacat 2760 gcgggggtga tcccagtagt tactatgcgt caaacaagca gattttgttt tccccgcaca 2820 tgcgggggtg atccctacaa agacaagtac gcgtttgctc gcaagatgtt ttccccgcac 2880 atgcgggggt gatcctacta agggagacgg cggtaagtat ggacatttgg ttttccccgc 2940 acatgcgggg gtgatcctaa caacattaaa ggtgaatgcc gccactgcaa gttttccccg 3000 cacatgcggg ggtgatcctg gtcaagctcg gcaagatttc gccagcgtgg ggttttcccc 3060 gcacatgcgg gggtgatccc aatcggtgca cgtccggctg ttggtaagtc gggttttccc 3120 cgcacatgcg ggggtgatcc ttgtcgccat tctttgacgg agtttgaccc tgagttttcc 3180 gcgcacatgc gggggtgatc ccatggctag cgatggtatt atttctgggg ctgagttttc 3240 cgcgcacatg cgggggtgat cctatcagcc ggaagcggtg aagctggcgc gtttggtttt 3300 ccccgcacat gcgggggtga tcc 3323 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei <400> 2 gttttccccg cacatgcggg ggtgatcc 28 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei <400> 3 ctcaacagga taagtgccac 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei <400> 4 ggttggctgg gtttaacgc 19

Claims (17)

  1. 시험관에서 박테리아인 대장균 E1392-75-2A (Escherichia coli E1392-75-2A), 살모넬라 엔테리티디스 NIZO B1241 (Salmonella enteritidis NIZO B1241), 및 리스테리아 모노사이토게네스 4B (Listeria monocytogenes 4B)에 대한 항균성, 및 시험관에서 인간 말초혈액 단핵 세포들 (PBMC)에 의한 시토킨 IL-10 및 IL-12의 발현에 대한 면역 조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주로서, 번호 I-3689로 CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)에 기탁된 균주인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주.
  2. 항균성 및 면역조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주로서, CNCM I-3689 균주의 내생적 유전자 중 하나 이상의 돌연변이 또는 관심의 하나 이상의 유전자(들)을 갖는 CNCM I-3689 균주의 유전자 형질전환에 의하여 제1항에 따른 균주로부터 얻을 수 있고, 시험관에서 박테리아인 대장균 E1392-75-2A, 살모넬라 엔테리티디스 NIZO B1241, 및 리스테리아 모노사이토게네스 4B에 대한 항균성, 및 시험관에서 인간 말초혈액 단핵 세포들 (PBMC)에 의한 시토킨 IL-10 및 IL-12의 발현에 대한 면역조절성을 가지며, 그리고 서열 SEQ ID NO: 1의 CRISPR 좌를 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주.
  3. 균주 CNCM I-3689의 항균성 및 면역조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주를 얻는 방법으로서, 상기 방법은 CNCM I-3689 균주의 내생적 유전자 중 하나 이상의 돌연변이 단계 또는 관심의 하나 이상의 유전자(들)을 갖는 CNCM I-3689 균주의 유전자 형질전환 단계를 포함하고, 여기서 상기 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주는 서열 SEQ ID NO: 1의 CRISPR 좌를 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주를 얻는 방법.
  4. 시험관에서 박테리아인 대장균 E1392-75-2A, 살모넬라 엔테리티디스 NIZO B1241, 및 리스테리아 모노사이토게네스 4B에 대한 항균성, 및 시험관에서 인간 말초혈액 단핵 세포들 (PBMC)에 의한 시토킨 IL-10 및 IL-12의 발현에 대한 면역조절성을 갖는 세포 분획을 얻는 방법으로서, 상기 세포 분획은 제1항 또는 제2항에 따른 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주로부터 얻어지고, 상기 세포 분획은 균주 CNCM I-3689의 항균성 및 면역조절성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균성 및 면역조절성을 갖는 세포 분획을 얻는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세포 분획은 DNA 제제, 세균막 제제, 배양 상청액, 및 상기 상청액의 분획으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항균성 및 면역조절성을 갖는 세포 분획을 얻는 방법.
  6. 시험관에서 박테리아인 대장균 E1392-75-2A, 살모넬라 엔테리티디스 NIZO B1241, 및 리스테리아 모노사이토게네스 4B에 대한 항균성, 및 시험관에서 인간 말초혈액 단핵 세포들 (PBMC)에 의한 시토킨 IL-10 및 IL-12의 발현에 대한 면역조절성을 갖는 조성물을 얻는 방법으로서, 상기 방법은 제4항에 따른 방법에 의하여 세포 분획을 얻고, 상기 분획을 조성물에 혼입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균성 및 면역조절성을 갖는 조성물을 얻는 방법.
  7. 시험관에서 박테리아인 대장균 E1392-75-2A, 살모넬라 엔테리티디스 NIZO B1241, 및 리스테리아 모노사이토게네스 4B에 대한 항균성, 및 시험관에서 인간 말초혈액 단핵 세포들 (PBMC)에 의한 시토킨 IL-10 및 IL-12의 발현에 대한 면역조절성을 갖는 조성물을 얻는 방법으로서, 상기 방법은 제5항에 따른 방법에 의하여 세포 분획을 얻고, 상기 분획을 조성물에 혼입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균성 및 면역조절성을 갖는 조성물을 얻는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 조성물이 식품인 항균성 및 면역조절성을 갖는 조성물을 얻는 방법.
  9. 제1항에 따른 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주를 포함하는, 시험관에서 박테리아인 대장균 E1392-75-2A, 살모넬라 엔테리티디스 NIZO B1241, 및 리스테리아 모노사이토게네스 4B에 대한 항균성, 및 시험관에서 인간 말초혈액 단핵 세포들 (PBMC)에 의한 시토킨 IL-10 및 IL-12의 발현에 대한 면역조절성을 갖는 항균성 및 면역조절성을 갖는 조성물.
  10. 제2항에 따른 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주를 포함하는, 시험관에서 박테리아인 대장균 E1392-75-2A, 살모넬라 엔테리티디스 NIZO B1241, 및 리스테리아 모노사이토게네스 4B에 대한 항균성, 및 시험관에서 인간 말초혈액 단핵 세포들 (PBMC)에 의한 시토킨 IL-10 및 IL-12의 발현에 대한 면역조절성을 갖는 항균성 및 면역조절성을 갖는 조성물.
  11. 제4항에 따른 방법으로 얻어진 세포 분획을 포함하는, 시험관에서 박테리아인 대장균 E1392-75-2A, 살모넬라 엔테리티디스 NIZO B1241, 및 리스테리아 모노사이토게네스 4B에 대한 항균성, 및 시험관에서 인간 말초혈액 단핵 세포들 (PBMC)에 의한 시토킨 IL-10 및 IL-12의 발현에 대한 면역조절성을 갖는 항균성 및 면역조절성을 갖는 조성물.
  12. 제5항에 따른 방법으로 얻어진 세포 분획을 포함하는, 시험관에서 박테리아인 대장균 E1392-75-2A, 살모넬라 엔테리티디스 NIZO B1241, 및 리스테리아 모노사이토게네스 4B에 대한 항균성, 및 시험관에서 인간 말초혈액 단핵 세포들 (PBMC)에 의한 시토킨 IL-10 및 IL-12의 발현에 대한 면역조절성을 갖는 항균성 및 면역조절성을 갖는 조성물.
  13. 제9항 또는 제10에 있어서, 상기 조성물은 식품인 항균성 및 면역조절성을 갖는 조성물.
  14. 약제로 사용하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주.
  15. 제14항에 있어서, 상기 약제는 박테리아인 대장균, 살모넬라 엔테리티디스, 및 리스테리아 모노사이토게네스에 대한 미생물 감염 치료에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는, 약제로 사용하기 위한 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주.
  16. 제14항에 있어서, 상기 약제는 항-염증성인 것을 특징으로 하는, 약제로 사용하기 위한 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주.
  17. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 식품인 항균성 및 면역조절성을 갖는 조성물.
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