MX2010011465A - Nueva cepa de lactobacillus paracasei subespecie paracasei, dotada de propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras. - Google Patents

Nueva cepa de lactobacillus paracasei subespecie paracasei, dotada de propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras.

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Abstract

La invención se refiere a una nueva cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei que posee propiedad s antimicrobianas e inmunomoduladoras, así como también a composiciones que contienen dicha cepa.

Description

UEVA CEPA DE LACTOBACILLUS PARACASEI SUBE ARACASEI DOTADA DE PROPIEDADES ANTIMICROB INMUNOMODULADORAS mpo de la Invención La presente invención se refiere a una cepa Ctobacillus paracasei subsp. paracasei dotada de pr timicrobianas e inmunomoduladoras. tecedentes de la Invención Numerosos estudios científicos informaron sobre I neficiosos para la salud de ciertos microorganismos los alimentos fermentados, en especial en los cteos. A esos microorganismos se los denomina, por obióticos. Según la definición que actualmente se rma general, los probioticos son organismos vivos qu los consume en las cantidades adecuadas, ejercen joramiento de la resistencia a las infecciones dulación de la respuesta inmun itaria .
Los microorganismos probióticos que se utiliz mentación humana son, en general, bacterias láct rtenecen, de modo principal, a los géneros Lacto idobacterium, y, en particular, a la especie Lac ra case i subsp. p aracase i (de la cual se describe una c licitud de patente EP0794707).
Sin embargo, los efectos beneficiosos para la salu muñes, en general, al conjunto de las bacterias de ero ; tampoco de una misma especie. Muy a menu cuentra más que algunas cepas ; además, los efecto serva pueden variar cualtitativa o cuantitativamen bas formas a la vez, de una cepa propiótica mprendiendo esto el interior de una misma especie.
Para que a un microorganismo se lo pueda conside tencialmente utilizable en carácter de probióti mb¡nac¡ón de estas dos características; Presentar propiedades inmunomoduíadoras y, en unoestimulantes o antiinflamatorias, o de ambas cla smo tiempo.
Además, si a ese microorganismo se lo destina a incorporado a un producto lácteo, de preferen sentar un crecimiento satisfactorio en la leche.
Por último debe mantener una buena viabilida nscurso de la producción y de la conservación del alt al se lo incorpore, así como después de la ingestió mento por el consumidor, de manera tal de poder m el intestino y de sobrevivir en el medio intestinal.
No obstante, hay que señalar que si bien la viab encial para responder a la definición actual de probi demostrado que a algunos de los efectos beneficioso acionan con las cepas probióticas también se l tener en ausencia de bacterias vivas y eran atri La presente invención tiene por objeto esta cepa, registró, según el Tratado de Budapest, en I ollection Nationale de Cultures de Microorganismes [" cional de Cultivos de Microorganismos], 25 rué du UX, París), el 9 de noviembre de 2006, con el número La cepa CNCM 1-3689 posee las características sig Morfología microorganismo Gram-positivo, cilos delgados, aislados o en cadenas cortas.
Fermentación de las azúcares siguientes (r tenidos sobre una galería api 50 CH - Medio MRS AP rante 48 horas) : Ribosa, galactosa, D-glucosa , D-fru ñosa, manitol, N-acetilglucosamina, arbutina, c ltosa, lactosa, trehalosa, melezitosa, D-turanosa, D- conato .
- Presencia de un solo locus CRISPR de secuenci : 1, que contiene una secuencia repetida representa La presente invención también engloba como o bj pas de Lactobacillus paracasei subsp paracasei susce tenerse por mutagénesis o por la transformación gené pa CNCM 1-3689. De preferencia, esas cepas cons opiedades anticrobianas e in m u nomod u (adoras de CM 1-3689. Se puede tratar de cepas en las cuales u nes endógenos de la cepa CNCM 1 -3689, o muchos (ron) mutado(s) de manera, por ejemplo, de modifica sus propiedades metabólicas (por ejemplo, la capa a cepa para metabolizar azúcares, su resistencia a estinal, su resistencia a la acidez, su postacidif ica ducción de metabolitos) . También se puede tratar e fueran resultado de la transformación genética de la 89 por parte de un gen de interés o de varios de ello r ejemplo, permite conferirle a la menciona racterí sticas fisiológicas suplemementarias o teínas de interés terapéutico o vaccíneo, que son d otechnol, 20, 707-12, 2002; Wang Y. Y col., J Biotech 0-15, 2007). Estas cepas poseen, en particular, ISPR con la secuencia SEQ ID NO : 1.
La presente invención también tiene como o ocedimiento para la obtención de una cepa de Lac ra case i subsp. paracasei que posee pr timicrobianas e inmunomoduladoras, que comprende mutagénesis o de transformación genética de la cepa 89.
La presente invención también tiene como o cedimiento para la obtención de una fracción ce see propiedades antimicrobianas o inmunomodulado bas clases al mismo tiempo, a partir de una ctobacillus paracasei subsp. paracasei conforme esente invención. Se trata, en especial, de preparado de preparados de paredes bacterianas que se obtuvo a Itivos de la mencionada cepa. Asimismo, se puede racasei que obedece al presente invento, con otra ce as muchas cepas, de bacterias lácticas, probióticas ulo de ejemplo de bacterias lácticas se puede citar I ctobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophüus.
También se puede tratar de productos alimentic pecial, de productos lácteos, o de productos farmac sméticos que consten de una cepa de Lactobacillus bsp. paraca se i conforme al presente invento, o de un lular que se obtuvo a partir de aquella cepa.
Cuando la mencionada cepa está presente en cterias vivas, éstas se hallarán presentes, de prefe ón de, como mínimo, 105 ufe por gramo ; ventajo mo mínimo 106 ufe por gramo de producto; de m ntajoso, como mínimo 107 ufepor gramo y, de modo ntajoso, como mínimo 108 ufe por gramo. eve Descripción de las Figuras La Figura 1 representa la proporción IL-10/ÍL-12 mplos que ilustran las propiedades antimicro unomoduladoras de la cepa CNCM 1-3689, así ificación molecular de esta cepa.
EMPLO 1 : COMPARACIÓN DE LAS PROPIEDADE PA CNCM I-3689 CON LAS DE LAS CEPAS PRO NOCIDAS Las propiedades de la cepa CNCM 1-3689 se co las diferentes cepas de la tecnología anterior, cono s propiedades probióticas.
La lista de esas cepas se da en la Tabla I de a Tabla I énero Especie Denominación(ones) Nume public Solicit Patent actobacillus johnsonii NCC533 = Lal = EP057 CNCM 1-1225 actobacillus acidophilus NCFM WO20 actobacillus acidoph ilus La-5 ATCC 14917= ctobacillus plantarum DSMZ 20174 = WCFS1 ctobacillus plantarum Probi 299v = DSM W 9843 ctobacil lus reuteri DSMZ 20016 ctobacillus reuteri Biogaia SD 2112 = W ATCC55730 fidobacterium breve ATCC 15700 fidobacterium bréve BBC50 = CNCM 1- EP 2219 fidobacterium inf antis ATCC 15697 fidobacterium iongum BB536 fidobacterium longum NCC2705 = CNCM I- 2618 fidobacterium a ni m al i s BB12 - ATCC 27536 nocytogenes 4B. A las bacterias lácticas se las puso cajas de Petri, en dos medios diferentes : medi LLIKER y col. J. Dairy 10 Sci., 39, 1611-1612, 1956) V (Triptona-Glucosa-Meat Extract [Extracto de Carne]) A las cajas se las incuba a 37°C hasta la apa lonias bacterianas. Los cultivos de Bifidobact ctuaron en condiciones de anaerobiosis. Un lecho de tiene el medio BHI (brain - heart infusión [infusión de razón]) y el patógeno se vierte entonces sobre la sup cajas. Las cajas se incuban de nuevo a 37 °C d ras. A continuación, alrededor de cada colonia de ticas se mide el diámetro de las zonas de inhib tógeno. El puntaje [score] 1 corresponde a un diá tre 4 y 6 mm. El puntaje 3 corresponde a un diámetro los 6 mm. Cada experimento se llevó a cabo tres ñera independiente y para cada cepa. 2 - Immu nomodu lación Se evaluó las propiedades inmunomoduladoras de cterias lácticas, para hacer la medición de la prop /IL-12.
Muestras de sangre humana obtenidas de sujetos uyeron en una proporción 1 :2 con PBS-CA (G rificaron merced a un gradiente de Ficoll (GIBCO). De a centrifugación a 400xg durante 30 minutos a 20°C, PBMC(peripherical blood mononuclear cells) nguíneas mononucleares periféricas]. A continuación bo tres etapas de lavado; después a las PBMC se las ner en suspensión en un medio de cultivo RPMI plementado con 1% de suero de ternero fetal, 1 taminado (GIBCO) y 150 g/ml de gentamicina (GIBC MC se las contó bajo microscopio y se las ajustó h ncentración de 2xl06 células/ml, después se las distri ncentración de 3 unidades MacFarlan, en PBS que % de glicerol.
En cada alvéolo de las placas que contenían \ roporción bacterias: célula 10:1) se agregó un volumen de preparación bacteriana. A las placas se las incub horas a 37 °C bajo una atmósfera que contení 2(proporción bacterias: célula 10:1). A las placas se l rante 24 horas a 37 °C bajo una atmósfera que conte 2. A continuación se aspiró el residuo líquido, se lo 000 rpm y se lo guardó a -20°C.
Las cepas bacterianas testigo, con pr unomoduladoras conocidas, se incluyeron en la pru 20% de glicerol y sin bacterias también se util ntrol negati o. El experimento se llevó a cabo para ca cepas sobre las PBMC provenientes de tres erentes.
Se midió la expresión de las citocinas por medio d bla III Estos resultados muestran que la cepa CNC esenta importantes propiedades antiinflamatorias delo. Ninguna de las cepas de referencia sometidas esenta propiedades tan buenas.
La Figura 1 representa la proporción IL-10/IL-12 pa bacteriana en función de su puntaje antipatógen bitraria) establecido arriba. Esta Figura muestra h nto la cepa CNCM 1-3689 se diferencia, en relació más cepas puestas a prueba. 3- Supervivencia ante el estrés intestinal Se utilizó un modelo in vitro que reflejaba (as co estrés intestinal .
Se efectúa cultivos de bacterias lácticas plementada con extracto de levadura. Se incuba lo rante 24 a 48 horas, según las especies (hasta tacionaria de cultivo). cabo de X minutos de incubación.
Para el estrés intestinal, la supervivencia es buen valor es superior a -0,5; medianamente buena, cuand tá comprendido entre -0,5 y -1 ,5 y mala, cuando el erior a -1 ,5.
Los resultados se dan en la Tabla IV siguiente.
Tabla IV Especie Referencia énero paracasei ctobacillus subsp. DN 114121 = CNCM I-36 paracasei ifidobacteri animalis subsp. HN019 = NM97/01925 f aclis ifidobacteri inf antis ATCC 15697 Tabla rhamnosus LGG = ATCC 53103 IV Lactobacillus Bifidobacterium breve ATCC 15700 Bifidobacterium Longum NCC2705 = CNCM 1- Lactobacillus acidophilus La-5 Lactobaciflus Plantarum ATCC 14917= 20174 = WCFS1 Bifidobacterium bré ve BBC50 = 1-2219 Lactobacillus Plantarum Probí 299v = DSM 98 Bifidobacterium Longum BB536 Lactobacillus acidophilus NCFM Lactobacillus case i Shirota Lactobacillus reuteri DS Z 20016 riDa muestran que entre las airerenies cepas so eba, la CNCM 1- 3689 es la única que al mism Un medio constituido por leche descremada rec n agua, a la que se añadió polvo de leche descre mbró con la cepa CNCM 1-3689 (5,6 x I06 pfc/g o l,l x l La inactividad de fermentación de es relacionada con su crecimiento, se mide sigu manera continua el pH del medio de crecimiento.
Los resultados se ilustran con la gráfica 5 que se n la Figura 2.
Estos resultados demuestran que la cepa CNC ne la capacidad de crecer de manera eficaz sobre lec r consiguiente, se la puede utilizar en la fabric ductos lácteos fermentados.
EMPLO 3: TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE LA CEPA 89 Numerosos organismos procariontes poseen un chos ioci, CRISPR, sigla que significa « Clustered ers aced Short Palindromic Re eats » Re - el número de loci CRISPR, - la posición de los loci CRISPR en el geno - el número de secuencias repetidas, y/o - la naturaleza o el tamaño, o ambos a la v secuencias variables.
Identificación del locus CRISPR de la cepa CNCM 1 Se obtuvo la secuencia de la cepa CNCM 1-3689. E su genoma, con ayuda de la sucesión de soporte GO™ permitió identificar un solo locus CRISPR en e e locus, con un tamaño de 3323 pbs, se sitúa a 20 ses más abajo del ORF RDBK00370. Su secuenci nómico se representa con la secuencia SEQ ID NO mpuesta por una unidad TTTTCCCCGCACATGCGGGGGTGATCC; SEQ ID NO: ntica a la del locus CRISPR de la cepa ATCC 33A{Lac sei) y de 54 secuencias variables (spacers).
Construcción de cebadores para la amplificaci : 3), situado en la 33ra secuencia variable del locus las posiciones 2049-2068; TM = 60°C ; - cebador OFF2488 {GGTTGGCTGGGTTTAACGC; : 4) , situado en la 33ra secuencia variable del locus las posiciones 2093-2110; TM = 60°C.
Las condiciones de PCR retenidas son las sig lezcla debida a la reacción: ADN : 1 µ| dNTPs: 4 µ I Amortiguadora 10X: 5 µ? Cebador OFF2486 : 0,3 Cebador OFF2488 0,3 Polimerasa ADN Ex taq™: 0,2 µ? Agua 39,2µ Ciclos : 95°C 5 min 95°C 30 seg ctobacillus casei diferentes, entre ellos las cepas CNC ATCC 334. Las cepas CNCM 1-1518 y ATCC presentaban los testigos negativos, pues los me badores no podían hibridizarse a la secuencia nómico de esas cepas en las condiciones de PC scribe arriba.
Los resultados se ilustran mediante electrof oresis agarosa de los productos de amplificación PCR, esenta en la Figura 3, donde «121 » representa la ce 3689, «001 » representa la cepa CNCM 1-1518; «S3» presentan, respecti amente, 16 cepas diferen ctobacillus casei y «SL» representa un marcador lecular (SmartLadder; Eurogentec).
Estos resultados demuestran que el par de C F2486/OFF2488 es bien específico de la cepa CNC la medida en que se lo obtuvo de productos de amp R del tamaño esperado (es decir, de alrededor de

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una cepa de Lactobacillus paracasei subsp. e posee propiedades antimicrobianas e inmunomod e se caracteriza porque se trata de la cepa registrad CM con el número 1-3689. 2. Una cepa de Lactobacillus paracasei subsp. e posee propiedades antimicrobianas e inmunomo e se caracteriza porque es susceptible de obtención a a cepa según la reivindicación 1, por mutagénes nsformación genética, y porque tiene pr timicrobianas o inmunomoduladoras de la cepa CN o tiene un locus CRISPR de la SEQ. 1D NO. 1. 3. Un procedimiento para la obtención de una ctobacillus paracasei subsp. paracasei que posee pr timicrobianas o inmunomoduladoras, que se caract )mprender una etapa de mutagénesis o de trans - . upo consistente en: preparados de ADN, preparados d cterianas, residuos líquidos de cultivo o de fraccione siduos líquidos. 6. Un procedimiento para la obtención de una lular que posee propiedades antimicrobi munomoduladoras, que se caracteriza porque co tener la fracción celular mediante un procedimien alquiera de las reivindicaciones 3 y 4, e incorporar l la composición. 7. El procedimiento según la reivindicación 6, racteriza porque el producto es un producto alimentico 8. Una composición que comprende una tctobacillus paracasei subsp. paracasei según la reivi y 2, o una fracción celular que se caracteriza porque gún el procedimiento que se define ya sea en la reivi o en la 5. 9. Una composición según la reivindicación 4 12. La cepa de Lactobacillus paracasei subsp. ra usarse como medicamento según la reivindic racterizada porque el medicamento es un anti-infl
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