CN104862240A - 乳酸菌株及其引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳酸菌株及其引物组，其中该乳酸菌株为Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101，其寄存于德国微生物菌种保藏中心，寄存编号为DSM 28047，并且该Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101具有SEQ ID NO:1的一核苷酸序列。本发明提供了乳酸菌株L.paracasei subsp.paracasei NTU 101的核苷酸序列及其引物组，使得相关技术人员于L.paracasei subsp.paracasei NTU 101的菌株鉴别上可以有所依据；并且，进一步地，相关技术人员还可通过DNA分子识别标记来快速地鉴定NTU 101菌株，而不需要培养分离菌株或者培养活菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌株，尤指关于Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101的一种乳酸菌株及其引物组。
背景技术
乳酸菌是指能够代谢醣类，并产生50％以上乳酸的细菌，例如：乳酸杆菌(Lactobacillus)、键球菌(Streptococcus)、念球菌(Leuconostoc)等。人类饮用酦酵乳品历史非常悠久，所以，乳酸菌一直被认为是非常安全的菌种(GRAS,generally recognized as safe)，是最具代表性的肠内有益菌。
乳酸菌是益生菌中最重要的一群，益生菌的定义为某一种或多种微生物当喂食予人类时可增进人类肠内菌丛的质量。其中，乳酸菌能增进肠内菌丛质量的作用机理有以下几种：
(1)生产有机酸、降低肠pH；
(2)和有害菌竞争养份；
(3)附着于肠粘膜上皮，减少有害菌增殖场所；以及
(4)产生抗菌物质。
目前国内许多酦酵乳产品，皆实施大规模人体饮用实验，证明其产品增进肠道有益菌的效果，且通过卫生署的保健食品认证。
Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101由台湾国立大学微生物与生化学研究所所长潘子明教授及其研发团队所研发的一个优良的本土乳酸菌株。目前，许多文献已证实L.paracasei subsp.paracasei NTU 101具有改善肠胃道菌相、降血压、降血脂、降胆固醇、抗过敏等多种保健功效，深具市场潜力，已有多种产品上市或准备上市。虽然，L.paracasei subsp.paracasei NTU 101已成功商品化，但是仍缺乏菌株鉴别与申请专利保护所需的DNA分子识别标记。DNA分子识别标记为可供鉴别特定菌株的DNA序列或是DNA多型性图谱。
因此，为了提供L.paracasei subsp.paracasei NTU 101的可供鉴别特定菌株的DNA序列及其DNA多型性图谱，本案的发明人极力加以研究发明，终于研发完成本发明的一种NTU 101乳酸菌株及其引物组。
发明内容
在下文中给出关于本发明的简要概述，以便提供关于本发明的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本发明的穷举性概述。它并不是意图确定本发明的关键或重要部分，也不是意图限定本发明的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
本发明的主要目的，在于提供关于L.paracasei subsp.paracasei NTU101的一种乳酸菌株及其引物组。
因此，为了达成上述本发明的主要目的，本案的发明人提出一种乳酸菌株，为Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101(副干酪乳杆菌副干酪亚种)，且其系寄存于德国微生物菌种保藏中心，寄存编号为DSM 28047，其中该Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101具有SEQ ID NO:1的一核苷酸序列。前述的该核苷酸序列可通过逢机增殖多型性DNA(RandomAmplification of Polymorphic DNA,RAPD)以及聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的技术进而增幅多条引物增幅而得。并且，该多条引物系包括具有SEQ ID NO:2的一核苷酸片段与具有SEQ IDNO:3的一核苷酸片段。
进一步地，通过将该Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101与一碳源置入一培养基之中，并经过至少24小时的培养，该Lactobacillusparacasei subsp.paracasei NTU 101会产生乳酸。
进一步地，该碳源为下列任一种：葡萄糖、半乳糖、D-核糖、木糖、果糖、α-乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、肌醇、山梨糖醇、D-甘露糖醇、柠檬酸、糊精、淀粉、以及糖蜜。
进一步地，通过将该Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101与一氮源置入一培养基之中，并经过至少24小时的培养，该Lactobacillusparacasei subsp.paracasei NTU 101会产生乳酸。
进一步地，该氮源为下列任一种：酵母萃取物、牛肉膏、蛋白胨、大豆胨、胰蛋白、玉米浆、酪蛋白、尿素、柠檬酸铵、以及硫酸铵。
并且，为了达成上述本发明的主要目的，本发明提出一种用以鉴别前述的Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101乳酸菌株的引物组，该引物组为：(1)A3-5F3CGCCGAACGCGACTTACATC(SEQ ID NO:4)；或(2)A3-5R3GGCAAATTTAAACTTGCCTTCAACG(SEQ ID NO:4)。其中，通过逢机增殖多型性DNA以及聚合酶链式反应的技术可将该A3-5F3引物增幅制成具有SEQ ID NO:1的该核苷酸序列。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明使得相关技术人员于L.paracasei subsp.paracasei NTU 101的菌株鉴别上可以有所依据；并且，进一步地，相关技术人员还可通过DNA分子识别标记来快速地鉴定NTU 101菌株，而不需要培养分离菌株或者培养活菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为引物组合A、J与L的RAPD多型性图谱的影像图；
图2A为一引物组A与casei group乳酸杆菌的RAPD多型性图谱的比对分析的影像图；
图2B为又一引物组A与casei group乳酸杆菌的RAPD多型性图谱的比对分析的影像图；
图2C为再一引物组A与casei group乳酸杆菌的RAPD多型性图谱的比对分析的影像图；
图3A为一引物组L与casei group乳酸杆菌的RAPD多型性图谱的比对分析的影像图；
图3B为又一引物组L与casei group乳酸杆菌的RAPD多型性图谱的比对分析的影像图；
图3C为再一引物组L与casei group乳酸杆菌的RAPD多型性图谱的比对分析的影像图；
图4为RAPD多型性片段A3-5的序列比对图；以及
图5为RAPD多型性片段L3-18的序列比对图。
图6A为一RAPD多型性片段A3-5的分子标记专一性的测试图谱。
图6B为又一RAPD多型性片段A3-5的分子标记专一性的测试图谱。
具体实施方式
为了能够更清楚地描述本发明所提出的一种乳酸菌株及其引物组，以下将配合附图，详尽说明本发明的较佳实施例。
NTU 101乳酸菌株(Lactobacillus mutant)，由台湾国立大学微生物与生化学研究所所长潘子明教授及其研发团队所研发的一个优良的本土乳酸菌株-Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101，其于公元2013年11月18日寄存于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSMZ,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany))，且寄存编号为DSM 28047。保藏该生物材料样品的单位名称：DSMZ-德国微生物菌种保藏中心，地址：德国38124布伦瑞克市茵和芬史塔街7B号，该生物材料命名为：副干酪乳酸杆菌副干酪亚种NTU 101菌株(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101)该生物材料的特性为：NTU 101菌株在乳酸细菌培养基，即，洋菜胶平板上，以厌氧(anaerobic)或好氧(aerobic)状态，37℃，培养24-48小时，可在平板上观察到乳白色、圆形、表面光滑、边缘平整，直径2-3mm的菌落。NTU 101菌株细胞为不具运动性的杆状细胞(0.8-1.0x2.0-4.0μm),细胞末端圆滑平整，常为单一细胞或链状群聚。会产生乳酸(1(+)-Lactic acid).不会自arginine(精氨酸)代谢产生氨。不具Urease(尿素酶)活性。
请参阅下列表一，通过将该Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU101与一碳源置入一培养基之中，并经过至少24小时的培养，则该Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101会产生一定量的乳酸。并且，如表一所列的，该碳源可以是下列任一种：葡萄糖、半乳糖、D-核糖、木糖、果糖、α-乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、肌醇、山梨糖醇、D-甘露糖醇、柠檬酸、糊精、淀粉、或者糖蜜。
表一
并且，参见下列表二，通过将该Lactobacillus paracasei subsp.paracaseiNTU 101与一氮源置入一培养基之中，并经过至少24小时的培养，则该Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101会产生一定量的乳酸。并且，如表二所列的，该氮源可以是下列任一种：酵母萃取物、牛肉膏、蛋白胨、大豆胨、胰蛋白、玉米浆、酪蛋白、尿素、柠檬酸铵、或者硫酸铵。
表二
上述的表一与表二所详列的实验数据，证实乳酸菌株L.paracasei subsp.paracasei NTU 101确实可以产生一定量的乳酸，因此，其用于作为加工制品的发酵菌。
接着，为了有效鉴别乳酸菌株L.paracasei subsp.paracasei NTU 101的DNA序列，在本发明中，先自生工股份有限公司(MDBio,Inc.,Taipei,Taiwan)购入20条逢机引物(Random Primer)，且该些逢机引物整理于下列表三之中。
表三
| 引物编号 | 引物序列(5’→3’) |
| B01 | GTTTCGCTCC |
| B02 | TGATCCCTGG |
| B03 | CATCCCCCTG |
| B04 | GGACTGGAGT |
| B05 | TGCGCCCTTC |
| B06 | TGCTCTGCCC |
| B07 | GGTGACGCAG |
| B08 | GTCCACACGG |
| B09 | TGGGGGACTC |
| B10 | CTGCTGGGAC |
| D11 | AGCGCCATTG |
| D12 | CACCGTATCC |
| D13 | GGGGTGACGA |
| D14 | CTTCCCCAAG |
| D15 | CATCCGTGCT |
| D16 | AGGGCGTAAG |
| D17 | TTTCCCACGG |
| D18 | GAGAGCCAAC |
| D19 | CTGGGGACTT |
| D20 | ACCCGGTCAC |
接着，将表三所载的20条引物以无菌水回溶至100μM的浓度之后，存放于-20℃的环境下。继续地，请参阅下列表四，应用于RAPD的引物组合。如表四所示，为了通过逢机增殖多型性DNA(Random Amplification ofPolymorphic DNA,RAPD)的技术将上述的引物增幅成类似乳酸菌株L.paracasei subsp.paracasei NTU 101的DNA序列，表三所载的20条引物依据表四而被配制成16种引物组，且每种引物组的最终浓度为1μM。
表四
| 引物组合 | 引物 |
| A | B01、B02、D11、与D12 |
| B | B03、B04、D13、与D14 |
| C | B05、B06、D15、与D16 |
| D | B07、B08、D17、与D18 |
| E | B09、B10、D19、与D20 |
| F | B07、B08、B09、与D10 |
| G | D11、D12、D13、与D14 |
| H | D15、D16、D17、与D18 |
| I | B01、B02、D13、与D14 |
| J | B03、B04、D15、与D16 |
| K | B05、B06、D17、与D18 |
| L | B08、B09、D19、与D20 |
| M | B05、B06、D11、与D20 |
| N | B03、B04、D11、与D20 |
| O | B07、B08、D11、与D20 |
| P | B09、B10、D11、与D20 |
继续地，以聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)对上述表四的16种引物组进行RAPD。其中，PCR(Polymerase Chain Reaction)的反应总体积为25μl，内含3ng菌株DNA、80nM引物、1X Exsel reaction buffer、5U的Exsel DNA polymerase(Bertec Enterprise,Taipei,Taiwan)、以及200M dNTP。PCR的反应条件为95℃加热5min，之后再以95℃加热30sec，25℃黏合3min，70℃延展45sec，以此条件进行35个循环；最后，以70℃延展7min。
完成上述PCR反应后，便可取出PCR产物并以1％的琼脂胶体(agarose)进行电泳分析；接着，以SYBR Safe染剂(Life Technologies Corporation)将电泳胶片染色30min，并于退染20min后将该染色的电泳胶片置于一蓝光(488nm)灯箱内观察，并以图像处理系统拍照存盘。进一步地，经由上述工艺所得的RAPD片段系以FavorPrepTMGel/PCR Purification Kit(Favorgenbiotech Corp)进行切胶回收，并以T&ATM Cloning Kit(Yeastern BiotechCo.,Ltd.,Taipei,Taiwan)对回收RAPD片段进行选殖，最后委托明欣生物科技有限公司(Taipei,Taiwan)进行NTU 101菌株独特序列的确认。
请参阅图1，引物组合A、J与L的RAPD多型性图谱的影像图。如图1所示，在16种引物组合中，引物组A、J与L能产生适当数量的RAPD多型性片段；因此，引物组A、J与L能产生具有L.paracasei subsp.paracaseiNTU 101菌株专一性的独特RAPD多型性图谱，尤其是引物组合A与L。
请继续参阅下列表五，用以确认NTU 101菌株独特序列的菌株。如表五所示，除L.paracasei subsp.paracasei NTU 101以外，表五所列的菌株都是购自于台湾食品工业发展研究所(Food Industry Research and DevelopmentInstitute,FIRDI,Hsinchu,Taiwan)，并且该些菌株都属于与L.paracaseisubsp.paracasei有着非常接近的亲缘关系的casei group乳酸杆菌，其中包含有12株L.paracasei、10株L.casei、7株L.rhamnosus、与3株L.zeae。
表五
请参阅图2A、图2B与图2C，为引物组A与casei group乳酸杆菌的RAPD多型性图谱的比对分析的影像图。如图2A所示，将引物组A的RAPD多型性片段与Lactobacillus paracasei(副干酪乳杆菌)进行比对，其比对结果显示引物组A的RAPD多型性片段的(核酸)序列系具有显着、独特序列差异。并且，如图2B所示，将引物组A的RAPD多型性片段与Lactobacillus casei(干酪乳杆菌)进行比对，其比对结果显示引物组A的RAPD多型性片段的序列系具有显着、独特的序列差异。再者，如图2C所示，将引物组A的RAPD多型性片段与Lactobacillus zeae(玉米乳杆菌)及Lactobacillusrhamnosus(鼠李糖乳杆菌)进行比对，其比对结果显示引物组A的RAPD多型性片段的序列具有显着、独特的序列差异。其中，此独特性的引物组A由引物B02与D11所增幅而得，进一步地被标示为A3-5。并且，如附件的序列表所示，此A3-5核苷酸序列片段具有838bp，且其核苷酸序列定义为SEQID NO:1。此外，如附件的序列表的第2页所示，引物B02的核苷酸序列片段具有10bp，且其核苷酸序列定义为SEQ ID NO:2；相对的，引物D11的核苷酸序列片段也具有10bp，且其核苷酸序列定义为SEQ ID NO:3。
继续地，请参阅图3A、图3B与图3C，为引物组L与casei group乳酸杆菌的RAPD多型性图谱的比对分析的影像图。如图3A所示，将引物组L的RAPD多型性片段与Lactobacillus paracasei(副干酪乳杆菌)进行比对，其比对结果显示引物组L的RAPD多型性片段的(核酸)序列系具有显着、独特序列差异。并且，如图3B所示，将引物组L的RAPD多型性片段与Lactobacillus casei进行比对，其比对结果显示引物组L的RAPD多型性片段的序列系具有显着、独特的序列差异。再者，如图3C所示，将引物组L的RAPD多型性片段与Lactobacillus zeae(玉米乳杆菌)及Lactobacillusrhamnosus(鼠李糖乳杆菌)进行比对，其比对结果显示引物组L的RAPD多型性片段的序列系具有显着、独特的序列差异。其中，此独特性的引物组L由引物B09与D19所增幅而得，进一步地被标示为L3-18。并且，如下列表六所示，此L3-18核苷酸序列片段具有2477bp。
表六
经由上述各种实验结果与数据，初步得知由引物组A与L增幅而得的RAPD多型性片段A3-5与L3-18可能带有L.paracasei subsp.paracasei NTU101(副干酪乳杆菌副干酪亚种NTU101)的独特序列片段。为了近一步确认这部分，必须自DNA序列数据库--Genbank内取出与L.paracasei subsp.paracasei NTU 101同源的序列加以比对。请参阅图4与图5，分别为RAPD多型性片段A3-5与L3-18的序列比对图。如图4所框起来的虚线所示，经与Genbank数据库内的同源序列相互比对后，发现RAPD多型性片段A3-5的确带有可作为L.paracasei subsp.paracasei NTU 101的分子识别标示的独特序列片段；并且，如图5所框起来的虚线所示，RAPD多型性片段L3-18也同样带有可作为L.paracasei subsp.paracasei NTU 101的分子识别标示的独特序列片段。
因此，由上述的比对结果，可得知RAPD多型性片段A3-5及L3-18都带有可作为L.paracasei subsp.paracasei NTU 101的分子识别标示的独特序列片段。因此，为了确认分子标记的专一性，必须再进一步进行分子标记专一性的测试。如下列表七所示，预先设计用以确认专一性序列的引物。
表七
请参阅图6A与图6B，为RAPD多型性片段A3-5的分子标记专一性的测试图谱。如图6A所示与图6B所示，使用上述表七的引物对NTU 101的近亲菌种(casei group乳酸杆菌)进行专一性测试后，发现引物组A3-5(F3/R3)具NTU 101菌株专一性，因此其(核酸)序列可作为鉴别NTU 101菌株专一性之用。如附件的序列表的第3页所示，引物组A3-5F3的核苷酸序列片段具有20bp，且其核苷酸序列定义为SEQ ID NO:4；并且，引物组A3-5R3的核苷酸序列片段具有25bp，且其核苷酸序列定义为SEQ ID NO:5。
经由上述的说明，已将NTU 101乳酸菌株及其引物组完整地揭露；并且，综合上述，可以得知本发明具有下列的优点：本发明提供了L.paracasei subsp.paracasei NTU 101乳酸菌株的核苷酸序列及其引物组，使得相关技术人员于L.paracasei subsp.paracasei NTU 101的菌株鉴别上可以有所依据；并且，进一步地，相关技术人员还可通过DNA分子识别标记来快速地鉴定NTU101菌株，而不需要培养分离菌株或者培养活菌。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本实用新型各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种乳酸菌株，其特征在于，为Lactobacillus paracasei subsp.paracaseiNTU 101，其于公元2013年11月18日寄存于德国微生物菌种保藏中心，寄存编号为DSM 28047，其中该Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101具有SEQ ID NO:1的一核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的乳酸菌株，其特征在于，该核苷酸序列通过逢机增殖多型性DNA(Random Amplification of Polymorphic DNA,RAPD)以及聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的技术进而增幅多条引物增幅而得。
3.如权利要求2所述的乳酸菌株，其特征在于，该多条引物包括具有SEQID NO:2的一核苷酸片段与具有SEQ ID NO:3的一核苷酸片段。
4.如权利要求1所述的乳酸菌株，其特征在于，通过将该Lactobacillusparacasei subsp.paracasei NTU 101与一碳源置入一培养基之中，并经过至少24小时的培养，该Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101会产生乳酸。
5.如权利要求4所述的乳酸菌株，其特征在于，该碳源为下列任一种：葡萄糖、半乳糖、D-核糖、木糖、果糖、α-乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、肌醇、山梨糖醇、D-甘露糖醇、柠檬酸、糊精、淀粉、以及糖蜜。
6.如权利要求1所述的乳酸菌株，其特征在于，通过将该Lactobacillusparacasei subsp.paracasei NTU 101与一氮源置入一培养基之中，并经过至少24小时的培养，该Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101会产生乳酸。
7.如权利要求6所述的乳酸菌株，其特征在于，该氮源为下列任一种：酵母萃取物、牛肉膏、蛋白胨、大豆胨、胰蛋白、玉米浆、酪蛋白、尿素、柠檬酸铵、以及硫酸铵。
8.一种用以鉴别如权利要求1所述的Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101乳酸菌株的一引物组，其特征在于，该引物组为：
(1)A3-5F3CGCCGAACGCGACTTACATC(SEQ ID NO:4)；或
(2)A3-5R3GGCAAATTTAAACTTGCCTTCAACG(SEQ ID NO:5)。
9.如权利要求8所述的引物组，其特征在于，通过逢机增殖多型性DNA以及聚合酶链式反应的技术将该A3-5F3引物增幅制成具有SEQ ID NO:1的该核苷酸序列。
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