BR112019027949B1 - Polipeptídeo que compreende atividade de o-succinil, polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, micro-organismo de produção de osuccinil, método para produzir o-succinil e l-metionina - Google Patents
Polipeptídeo que compreende atividade de o-succinil, polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, micro-organismo de produção de osuccinil, método para produzir o-succinil e l-metionina Download PDFInfo
- Publication number
- BR112019027949B1 BR112019027949B1 BR112019027949-0A BR112019027949A BR112019027949B1 BR 112019027949 B1 BR112019027949 B1 BR 112019027949B1 BR 112019027949 A BR112019027949 A BR 112019027949A BR 112019027949 B1 BR112019027949 B1 BR 112019027949B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- homoserine
- seq
- succinyl homoserine
- microorganism
- activity
- Prior art date
Links
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 76
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 69
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 74
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 60
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 59
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 59
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims description 27
- GNISQJGXJIDKDJ-YFKPBYRVSA-N O-succinyl-L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCOC(=O)CCC(O)=O GNISQJGXJIDKDJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 86
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 58
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 29
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims description 26
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 23
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 18
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 claims description 16
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 11
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 8
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 claims description 5
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 108700027408 O-acetylhomoserine (thiol)-lyase Proteins 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 claims description 4
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 46
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 22
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 14
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101150043924 metXA gene Proteins 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 101150003180 metB gene Proteins 0.000 description 11
- 101150115974 metX gene Proteins 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N O-acetyl-L-homoserine Chemical compound CC(=O)OCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 101100116199 Streptomyces lavendulae dcsE gene Proteins 0.000 description 10
- 101150095438 metK gene Proteins 0.000 description 10
- 101150059195 metY gene Proteins 0.000 description 10
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 10
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 101150060102 metA gene Proteins 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010016979 Homoserine O-succinyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108010061618 O-succinylhomoserine (thiol)-lyase Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- YPWSLBHSMIKTPR-UHFFFAOYSA-N Cystathionine Natural products OC(=O)C(N)CCSSCC(N)C(O)=O YPWSLBHSMIKTPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N D-cystathionine Natural products OC(=O)C(N)CCSCC(N)C(O)=O ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- ILRYLPWNYFXEMH-WHFBIAKZSA-N L-cystathionine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O ILRYLPWNYFXEMH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 101150086633 metAA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150091110 metAS gene Proteins 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002804 saturated mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100242035 Bacillus subtilis (strain 168) pdhA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100350224 Bacillus subtilis (strain 168) pdhB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100439426 Bradyrhizobium diazoefficiens (strain JCM 10833 / BCRC 13528 / IAM 13628 / NBRC 14792 / USDA 110) groEL4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 1
- 101100236536 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) glcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 101100123255 Komagataeibacter xylinus aceC gene Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010049977 Peptide Elongation Factor Tu Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100134871 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceE gene Proteins 0.000 description 1
- 101100406344 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceF gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 101150094017 aceA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150036393 aceB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101150070136 axeA gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- YYRMJZQKEFZXMX-UHFFFAOYSA-L calcium bis(dihydrogenphosphate) Chemical compound [Ca+2].OP(O)([O-])=O.OP(O)([O-])=O YYRMJZQKEFZXMX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019700 dicalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010034653 homoserine O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002803 maceration Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000008155 medical solution Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- XHXXWWGGXFUMAJ-UHFFFAOYSA-N methanethiol;sodium Chemical compound [Na].SC XHXXWWGGXFUMAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229910000150 monocalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000003541 multi-stage reaction Methods 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 125000002730 succinyl group Chemical group C(CCC(=O)*)(=O)* 0.000 description 1
- VNOYUJKHFWYWIR-FZEDXVDRSA-N succinyl-coa Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-FZEDXVDRSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Abstract
Trata-se de uma variante de O-succinil homosserina transferase, um polinucleotídeo que codifica a variante, um micro-organismo que compreende a variante e um método para produzir O- succinil homosserina com o uso do micro-organismo.
Description
[001] A presente invenção refere-se a uma variante de O-succinil homosserina transferase, um polinucleotídeo que codifica a variante, um micro-organismo que compreende a variante e um método para produzir O-succinil homosserina com o uso do micro-organismo.
[002] O-succinil homosserina atua como um precursor de metionina que é um tipo de aminoácidos essenciais em um organismo vivo. A metionina é usada como aditivos alimentares e para rações e também usada como matéria-prima sintética para soluções médicas e suprimentos médicos.
[003] A metionina é produzida através de síntese química e síntese biológica. Enquanto isso, é revelado um processo de duas etapas (WO/2008/013432), no qual um precursor de L-metionina é produzido por fermentação e depois convertido em L- metionina por uma reação de conversão enzimática.
[004] No processo de duas etapas, O-succinil homosserina ou O-acetil homosserina é usado como precursor da metionina e, para a produção em massa econômica de metionina, é muito importante produzir O-succinil homosserina com alto rendimento.
[005] O gene metA é um gene que codifica a homosserina O-succiniltransferase (MetA), que é uma enzima que conjuga um grupo succinil de succinil-coA com homosserina para produzir O-succinil homosserina e o gene metA é um dos genes mais importantes no desenvolvimento de uma mancha produtora de O-succinil- homosserina.
[006] Uma cepa que acumula O-succinil homosserina pode ser preparada através da deleção do gene metB que codifica a cistationina gama sintase na via de biossíntese de metionina. No entanto, a cepa produtora de O-succinil-homosserina requer L-metionina. Por esse motivo, a atividade de homosserina O- succiniltransferase é inibida pela inibição da retroalimentação pela metionina, que é adicionada a um meio e, eventualmente, é difícil obter O-succinil homosserina em alta concentração.
[007] Consequentemente, muitas patentes anteriores concentraram seus estudos na liberação da inibição de retroalimentação de metA a partir de um sistema de controle de retroalimentação. No entanto, a homosserina O-succiniltransferase codificada por metA tem problemas em que a própria proteína do tipo selvagem tem baixa estabilidade e a introdução de uma mutação para a liberação da inibição da realimentação agrava a instabilidade. Consequentemente, para o desenvolvimento de uma cepa produtora de O-succinil-homosserina com alta produtividade, é necessário remover a inibição de retroalimentação do gene metA e garantir a estabilidade da enzima.
[008] É sabido que a maioria dos micro-organismos presentes na natureza utiliza O-succinil homosserina ou O-acetil homosserina como intermediário para a biossíntese de metionina. Geralmente, o MetA produz O-succinil homosserina e a homosserina O-acetiltransferase (MetX) produz O-acetil homosserina. Ao contrário do MetA, o MetX não é inibido por retroalimentação e tem alta estabilidade enzimática.
[009] Os presentes inventores fizeram esforços intensos para aumentar a produção de O-succinil homosserina e, como resultado, constataram uma proteína com atividade de síntese de O-succinil homosserina, completando assim a presente invenção.
[010] Um objeto da presente invenção é fornecer um polipeptídeo que tem atividade de O-succinil homosserina transferase, sendo que o peptídeo inclui substituição de um aminoácido diferente de leucina para um aminoácido na posição 313 em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
[011] Outro objeto da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
[012] Ainda outro objeto da presente invenção é fornecer um micro-organismo produtor de O-succinil homosserina do gênero Corynebacterium, em que o micro-organismo compreende o polipeptídeo que tem a atividade de O-succinil homosserina transferase.
[013] Ainda outro objeto da presente invenção é fornecer um método de produção de O-succinil homosserina, sendo que o método compreende as etapas de cultivar o micro-organismo em um meio; e isolar ou coletar O-succinil homosserina do micro-organismo cultivado ou do meio.
[014] Ainda outro objeto da presente invenção é fornecer um método de produção de L-metionina, em que o método compreende as etapas de cultivar o micro-organismo em um meio; e reagir a O-succinil homosserina com sulfeto.
[015] Uma variante da proteína O-succinil homosserina transferase de acordo com a presente invenção pode ter atividade de conversão aumentada de O-succinil homosserina, em comparação com uma forma natural da mesma, sendo assim amplamente aplicada à produção em massa mais eficiente de O-succinil homosserina como alternativa às vias de síntese química existentes.
[016] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes.
[017] Enquanto isso, cada descrição e modalidade revelada nessa invenção também pode ser aplicada a outras descrições e modalidades. Ou seja, todas as combinações de vários elementos revelados nessa invenção se enquadram no escopo da presente invenção. Ademais, o escopo do presente invenção é limitado pela descrição específica descrita abaixo.
[018] Além disso, uma pessoa versada na técnica pode reconhecer ou identificar muitos equivalentes a certos aspectos da presente invenção descritos nessa invenção com uso de apenas experimentos comuns. Além disso, esses equivalentes devem ser incluídos nessa invenção.
[019] Para alcançar os objetos, um aspecto da presente invenção fornece um polipeptídeo inovador com atividade de O-succinil homosserina transferase. A variante de polipeptídeo inovador pode ser um polipeptídeo com atividade de O-succinil homosserina transferase, sendo que o polipeptídeo compreende a substituição de um aminoácido diferente da leucina por um aminoácido na posição 313 em uma sequência de aminoácidos derivada de Corynebacterium glutamicum, especificamente, em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Além disso, o polipeptídeo pode compreender a substituição de um aminoácido diferente de leucina na posição 313 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e pode ter atividade de O-succinil homosserina transferase. Mais especificamente, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo com atividade de O-succinil homosserina transferase, em que o polipeptídeo compreende a substituição de aminoácido arginina, cisteína, isoleucina ou lisina pelo aminoácido na posição 313 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, porém não está limitada a isso.
[020] Tal variante de polipeptídeo é caracterizada por ter atividade aprimorada de O-succinil homosserina transferase, em comparação com o polipeptídeo que tem atividade de O-succinil homosserina transferase de SEQ ID NO: 1.
[021] Conforme usado no presente documento, o termo "atividade de O-succinil homosserina transferase" se refere à atividade de conversão da homosserina em O- succinil homosserina. A O-succinil homosserina transferase se refere coletivamente a uma enzima com capacidade para converter succinil CoA e L-homosserina como substratos em CoA e O-succinil homosserina.
[022] succinil CoA + L-homosserina ^ CoA + O-succinil homosserina
[023] Na presente invenção, a O-succinil homosserina transferase se refere a uma enzima que tem atividade de O-succinil homosserina transferase, que é obtida substituindo-se outro aminoácido por parte da sequência de aminoácidos de proteína MetX que é uma O-acetil homosserina transferase. A proteína MetX pode ser MetX derivado do gênero Corynebacterium, e mais especificamente, sendo que MetX tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que é derivada de Corynebacterium glutamicum, mas não é limitada a isso. A sequência da proteína MetX está disponível no NCBI GenBank, que é um banco de dados conhecido.
[024] Na presente invenção, vários métodos conhecidos na técnica são aplicáveis a um método para obter a O-succinil homosserina transferase. Por exemplo, a O-succinil homosserina transferase pode ser obtida a partir de um microorganismo do gênero Corynebacterium que é amplamente usado para expressão enzimática, usando-se técnicas de síntese gênica com base em otimização de códons pelas quais as enzimas podem ser obtidas com alto rendimento ou usando-se métodos de triagem de recursos enzimáticos úteis, com base na bioinformática de grandes quantidades de informações genéticas sobre micro-organismos, mas não se limitam aos mesmos.
[025] Na presente invenção, a variante O-succinil homosserina transferase pode ser usada de forma intercambiável com "O-succinil homosserina transferase mutada" ou "O-succinil homosserina transferase variante". Enquanto isso, a variante pode ser uma variante que não ocorre naturalmente.
[026] Especificamente, a O-succinil-homosserina transferase mutada da presente invenção pode ter a substituição de um aminoácido diferente de leucina pelo resíduo de aminoácido na posição 313 do terminal N do gênero Corynebacterium (Corynebacterium sp.) - derivado de MetX, que tem a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1. Especificamente, o resíduo de aminoácido leucina na posição 313 pode ser substituído por arginina, cisteína, isoleucina ou lisina, mas não está limitado a isso. A O-succinil-homosserina transferase mutada da presente invenção pode incluir um polipeptídeo que compreende uma variação na posição 313 do terminal N da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, em que a variação inclui substituição de um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em arginina, cisteína, isoleucina e lisina, e o polipeptídeo pode ter pelo menos 85% de homologia ou identidade para SEQ ID NO: 1, porém não está limitada a isso.
[027] Além disso, o polipeptídeo que tem a atividade de O-succinil homosserina transferase da presente invenção pode ser qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75 e SEQ ID NO: 81, que são especificamente sequências de aminoácidos de polipeptídeos que tem atividade de O-succinil homosserina transferase, nas quais o aminoácido na posição 313 do terminal N da SEQ ID NO: 1 é mutado para arginina, cisteína, isoleucina ou lisina, respectivamente, mas não estão limitados a isso. O polipeptídeo pode compreender qualquer polipeptídeo que tem 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% ou mais de homologia ou identidade para as sequências acima sem limitação, desde que o polipeptídeo compreenda a variação acima e tenha maior atividade de conversão de O-succinil homosserina, em comparação com o tipo selvagem.
[028] Além disso, MetX da presente invenção pode ser uma proteína MetX que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem 80% ou mais homologia ou identidade com a mesma, mas não é limitada a isso. Especificamente, a proteína MetX da presente invenção pode incluir a proteína de SEQ ID NO: 1 e uma proteína com pelo menos 80% ou mais, 85% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, ou muito mais especificamente 99% ou mais homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 1.
[029] Conforme usado no presente documento, o termo "variante de polipeptídeo" se refere a um polipeptídeo, do qual um ou mais aminoácidos diferem da sequência recitada em substituições e/ou modificações conservadoras, mas mantém funções ou propriedades do polipeptídeo. Os polipeptídeos variantes diferem de uma sequência identificada por substituição, exclusão ou adição de vários aminoácidos. Tais variantes podem ser geralmente identificadas modificando-se uma das sequências de polipeptídeo acima e avaliando-se as propriedades do polipeptídeo modificado. Em outras palavras, a capacidade de uma variante pode ser aumentada, inalterada ou diminuída, em comparação com a de uma proteína nativa. Tais variantes podem ser geralmente identificadas modificando-se uma das sequências de polipeptídeo acima e avaliando-se a reatividade do polipeptídeo modificado. Além disso, algumas variantes podem incluir aquelas nas quais uma ou mais porções, tais como uma sequência líder de terminal N ou domínio transmembranar, foram removidas. Outras variantes podem incluir variantes nas quais uma porção foi removida do terminal N e/ou C de uma proteína madura. O termo "variante" também pode ser usado como modificação, proteína modificada, polipeptídeo modificado, mutante, muteína, divergente etc., e qualquer termo não é limitado, desde que seja usado no sentido de ser mutado. Especificamente, a variante inclui uma variante na qual a atividade da O-succinil homosserina transferase derivada de Corynebacterium glutamicum é eficientemente aprimorada pela variação dos aminoácidos dos mesmos, em comparação com o tipo selvagem.
[030] Conforme usado no presente documento, o termo "substituição conservadora" significa substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes. A variante pode ter, por exemplo, uma ou mais substituições conservadoras, enquanto retém uma ou mais atividades biológicas. Tais substituições de aminoácidos podem geralmente ser feitas com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido glutâmico e ácido aspártico; aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina, triptofano e tirosina; e aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina e triptofano. Geralmente, a substituição conservadora tem pouco ou nenhum efeito na atividade do polipeptídeo resultante.
[031] Além disso, as variantes podem incluir outra modificação, incluindo a deleção ou adição de aminoácidos que têm influência mínima nas propriedades e uma estrutura secundária do polipeptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado com uma sequência de sinal (ou líder) no terminal N da proteína, que direciona de forma translacional ou pós-translacional a transferência da proteína. O polipeptídeo também pode ser conjugado com outra sequência ou um ligante para identificação, purificação ou síntese do polipeptídeo. Em outras palavras, mesmo que 'uma proteína ou polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO’ particular seja descrita no presente documento, é aparente que uma proteína com uma sequência de aminoácidos, parte da qual é excluída, modificada, substituída, conservadoramente substituída ou adicionada, pode ser utilizada na presente invenção, desde que tenha atividade idêntica ou correspondente à do polipeptídeo composto da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Por exemplo, desde que uma proteína tenha atividade idêntica ou correspondente à do polipeptídeo variante, a adição de uma sequência que não altera a função da proteína antes e depois da sequência de aminoácidos, mutações que ocorrem naturalmente, mutações silenciosas ou substituições conservadoras não são excluídas. É aparente que, embora o polipeptídeo tenha tal adição ou mutação de sequência, o mesmo se enquadra no escopo da presente invenção.
[032] Além disso, é aparente que, devido à degeneração do códon, um polinucleotídeo que pode ser traduzido na proteína que compreende qualquer sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75 e SEQ ID NO: 81, ou uma proteína que tem homologia ou identidade com o mesmo pode também ser incluída. Alternativamente, uma sonda que pode ser produzida a partir de uma sequência de nucleotídeos conhecida, por exemplo, uma sequência que hibrida com uma sequência complementar a toda ou parte da sequência de polinucleotídeos sob condições rigorosas para codificar a proteína que tem a atividade de O-succinil homosserina transferase pode também podem ser incluídas sem limitação. O termo "condições rigorosas" significa condições sob as quais é permitida a hibridação específica entre polinucleotídeos. Tais condições são descritas em detalhes em uma literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., supra). Por exemplo, as condições rigorosas podem incluir, por exemplo, condições sob as quais genes com alta homologia ou identidade, 80% ou mais, 85% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, muito mais especificamente 97% ou mais, particularmente especificamente 99% ou mais de homologia ou identidade são hibridizados entre si e genes com homologia ou identidade inferior à homologia ou identidade acima não são hibridados entre si ou condições de lavagem comuns da hibridação Southern, isto é, lavagem uma vez, especificamente, duas ou três vezes em uma concentração de sal e uma temperatura correspondente a 60 °C, 1*SSC, 0,1% SDS, especificamente, 60 °C, 0,1*SSC, 0,1% SDS, e mais especificamente 68 °C, 0,1xSSC, 0,1% SDS.
[033] Embora possa ocorrer uma incompatibilidade entre nucleotídeos devido ao rigor da hibridação, é necessário que os dois ácidos nucleicos tenham uma sequência complementar. O termo "complementar" é usado para descrever a relação entre bases nucleotídicas que podem hibridar entre si. Por exemplo, em relação a DNA, adenosina é complementar à timina e citosina é complementar à guanina. Consequentemente, a presente invenção pode incluir não apenas as sequências de ácido nucleico substancialmente semelhantes, mas também fragmentos de ácido nucleico isolados que são complementares a toda a sequência.
[034] Especificamente, o polinucleotídeo que tem homologia ou identidade pode ser detectado com uso de condições de hibridação, incluindo a etapa de hibridação com um valor de Tm de 55 °C e as condições descritas acima. Além disso, o valor de Tm pode ser de 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não está limitado a isso, e pode ser adequadamente controlado por uma pessoa versada na técnica de acordo com os propósitos.
[035] O rigor apropriado para a hibridação dos polinucleotídeos depende do comprimento e do grau de complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis são bem conhecidas na técnica (consulte Sambrook et al., Supra, 9.50-9.51, 11.711.8).
[036] A 'homologia' ou 'identidade' se refere ao grau de relevância entre duas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos fornecidas e pode ser expressa como uma porcentagem.
[037] Os termos 'homologia' e 'identidade' podem ser frequentemente usados de forma intercambiável.
[038] A homologia ou identidade de sequência do polinucleotídeo ou polipeptídeo conservado pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão e pode ser usada com penalidades de intervalo padrão estabelecidas pelo programa usado. Substancialmente, sequências homólogas ou idênticas podem hibridar sob condições moderadas ou altamente rigorosas, de modo que o comprimento total da sequência ou pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais do comprimento total possa hibridar. Além disso, são contemplados polinucleotídeos que contêm códons degenerados no lugar de códons na hibridação.
[039] Se duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos têm ou não homologia, similaridade ou identidade podem ser determinadas com uso de algoritmos de computador conhecidos, como o programa "FASTA", com uso, por exemplo, dos parâmetros padrão como em Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85]: 2444, ou determinadamente com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) conforme implementado no programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (versão 5.0.0 ou posterior) (incluindo o pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por exemplo, o BLAST do banco de dados do National Center for Biotechnology Information, ou ClustalW, pode ser usado para determinar a homologia, similaridade ou identidade.
[040] A homologia, similaridade ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada, por exemplo, comparando-se informações de sequência com uso de um programa de computador GAP, como Needleman et al. (1970), J Mol. Biol.48: 443, como revelado em Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482). Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) que são similares, dividido pelo número total de símbolos na mais curta das duas sequências. Parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (que contém um valor de 1 para identidades e 0 para não- identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, Fundação Nacional de Pesquisa Biomédica, páginas 353 a 358 (1979) (ou matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4)); (2) uma penalidade de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo (ou penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão do intervalo de 0,5); e (3) nenhuma penalidade por intervalos finais. Portanto, conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” representa relevância entre sequências.
[041] Outro aspecto da presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo que tem a atividade de O-succinil homosserina transferase.
[042] Conforme usado no presente documento, o termo "polinucleotídeo" se refere a um DNA ou fio RAN com um comprimento predeterminado ou mais, que é um polímero de cadeia longa de nucleotídeos formado ligando-se monômeros de nucleotídeos por meio de ligações covalentes. Mais especificamente, o polinucleotídeo se refere a um fragmento de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo variante.
[043] Na presente invenção, o gene que codifica a sequência de aminoácidos da O-succinil homosserina transferase pode ser um gene da variante O-succinil homosserina transferase, especificamente, derivado de Corynebacterium glutamicum. Com base na degenerescência do código genético, sequências de nucleotídeos que codificam a mesma sequência de aminoácidos e variantes da mesma também são incluídas na presente invenção, por exemplo, representada por SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 82, mas não são limitadas à mesma.
[044] Adicionalmente, como para o polinucleotídeo variante, com base na degenerescência do código genético, sequências de nucleotídeos que codificam a mesma sequência de aminoácidos e variantes da mesma também são incluídas na presente invenção.
[045] Como ainda outro aspecto da presente invenção, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo variante, ou um micro-organismo transformado com um vetor que inclui o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo variante. Especificamente, a introdução pode ser realizada por transformação, mas não é limitada à mesma.
[046] Especificamente, o micro-organismo que compreende o polipeptídeo da variante O-succinil homosserina transferase pode ter uma produtividade aumentada da O-succinil homosserina sem inibir o crescimento da célula hospedeira, em comparação com um microrganismo que compreende o polipeptídeo da O-succinil homosserina transferase do tipo selvagem e, portanto, O-succinil-homosserina pode ser obtida a partir do micro-organismo com alto rendimento.
[047] Conforme usado no presente documento, o termo "vetor" é uma construção de DNA que inclui uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica uma proteína desejada operacionalmente ligada a uma sequência reguladora apropriada para permitir a expressão da proteína desejada em uma célula hospedeira apropriada. A sequência reguladora pode incluir um promotor com capacidade de iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para regulação de tal transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação de ribossomo de mRNA apropriado e uma sequência que regula o término da transcrição e da tradução. Após o vetor ser transformado na célula hospedeira apropriada, pode se replicar ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro e pode ser integrado ao próprio genoma.
[048] O vetor usado na presente invenção não é particularmente limitado, desde que tenha capacidade de se replicar na célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de vetores comumente usados podem incluir um plasmídeo natural ou recombinante, cosmídeo, vírus e bacteriófago. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A etc., podem ser usados como um vetor de fago ou vetor de cosmídeo. Como vetor de plasmídeo, pode ser usado o tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL, tipo pET etc. Especificamente, os vetores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC etc. podem ser usados, mas não são limitados a isso.
[049] O vetor aplicável na presente invenção não é particularmente limitado e um vetor de expressão conhecido pode ser usado. Além disso, o polinucleotídeo que codifica a proteína desejada pode ser inserido no cromossomo com uso de um vetor para inserção cromossômica intracelular. A inserção cromossômica do polinucleotídeo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, recombinação homóloga, mas não está limitado a isso. Um marcador de seleção para confirmar a inserção cromossômica pode ser adicionalmente incluído. O marcador de seleção deve selecionar células transformadas com o vetor, ou seja, para confirmar a inserção do polinucleotídeo desejado, e o marcador de seleção pode incluir marcadores que fornecem fenótipos selecionáveis, como resistência a drogas, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos ou expressão da superfície proteínas. Uma vez que apenas as células que expressam o marcador de seleção têm capacidade de sobreviver ou mostrar diferentes fenótipos sob o ambiente tratado com um agente seletivo, as células transformadas podem ser selecionadas.
[050] Conforme usado no presente documento, o termo "transformação" significa a introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína desejada em uma célula hospedeira de maneira que a proteína codificada pelo polinucleotídeo é expressa na célula hospedeira. Desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira, pode ser integrado e colocado no cromossomo da célula hospedeira, ou pode existir extracromossômica ou independentemente dele. Além disso, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido em qualquer forma desde que possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é um construto de gene que inclui todos os elementos exigidos para sua expressão autônoma. Comumente, o cassete de expressão inclui um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, sinais de terminação transcricional, locais de ligação ao ribossomo e sinais de terminação da tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão auto replicável. Além disso, o polinucleotídeo tal como está pode ser introduzido na célula hospedeira e operacionalmente ligado às sequências necessárias para expressão na célula hospedeira, mas não está limitado a isso. Um método para realizar a transformação pode incluir qualquer método de introdução de ácidos nucleicos em uma célula, e a transformação pode ser realizada selecionando-se uma técnica padrão apropriada, como conhecida na técnica, de acordo com a célula hospedeira. Por exemplo, o método pode incluir eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio (Ca(H2PO4)2, CaHPO4, ou Ca3(PO4)2), precipitação com cloreto de cálcio (CaCl2), micro injeção, um método de polietileno glicol (PEG), um DEAE-dextrano, um método de lipossoma catiônico e um método acetato de lítio-DMSO etc., mas não está limitado a isso.
[051] Conforme usado no presente documento, o termo "operacionalmente ligado" significa uma ligação funcional entre a sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína desejada da presente invenção e uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo. A ligação operacional pode ser preparada com uso de uma tecnologia genética recombinante conhecida na técnica, e a clivagem e ligação de DNA específicas do local podem ser preparadas com uso de enzimas de clivagem e ligação etc., na técnica, mas não se limita a isso.
[052] Conforme usado no presente documento, o termo "microrganismo produtor de O-succinil homosserina" se refere a um micro-organismo que tem naturalmente capacidade de produção de O-succinil homosserina ou um micro-organismo que é preparado fornecendo-se uma cepa mãe que não tem capacidade de produzir O- succinil homosserina com a capacidade de produção de O-succinil homosserina.
[053] O micro-organismo produtor de O-succinil homosserina pode ser uma célula ou micro-organismo que pode incluir o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo variante ou que pode expressar o polipeptídeo variante por transformação com o vetor que inclui o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo variante. No que diz respeito aos objetos da presente invenção, a célula ou microorganismo hospedeiro pode ser qualquer micro-organismo, desde que tenha capacidade de produzir O-succinil homosserina incluindo-se o polipeptídeo MetX variante. Exemplos específicos do mesmo podem incluir micro-organismos do gênero Escherichia, do gênero Serratia, do gênero Erwinia, do gênero Enterobacteria, do gênero Salmonella, do gênero Streptomyces, do gênero Pseudomonas, do gênero Brevibacterium e do gênero Corynebacterium, especificamente, um micro-organismo do gênero de Corynebacterium e, mais especificamente, Corynebacterium glutamicum, mas sem limitação aos mesmos.
[054] Conforme usado no presente documento, o termo "micro-organismo produtor de O-succinil homosserina do gênero Corynebacterium" se refere a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem capacidade de produzir O- succinil homosserina naturalmente ou por mutação. É sabido que uma cultura do micro-organismo do gênero Corynebacterium inclui O-succinil homosserina. No entanto, a sua capacidade de produção de O-succinil-homosserina é notavelmente baixa e os genes envolvidos no mecanismo de produção ou mecanismos do mesmo não foram revelados. Portanto, na presente invenção, o micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem a capacidade de produzir O-succinil homosserina se refere a uma forma natural do próprio micro-organismo ou um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem a capacidade de produzir O-succinil homosserina que é melhorada pela inserção de um gene estranho relacionado ao mecanismo de produção de O-succinil homosserina ou pelo aprimoramento ou inativação da atividade de um gene endógeno.
[055] Na presente revelação, “o micro-organismo do gênero Corynebacterium” pode ser especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, mas sem limitação aos mesmos. Mais especificamente, na presente invenção, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum, cujo crescimento e sobrevivência celular são menos influenciados, embora expostos a altos níveis de O- succinil homosserina.
[056] No micro-organismo, a atividade de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste em cistationina sintase, O-acetil homosserina (tiol)-liase e homosserina quinase pode ser inativada. Em outras palavras, a atividade de uma proteína selecionada a partir da mesma, as atividades de duas proteínas selecionadas a partir das mesmas, ou as atividades de todas as três proteínas podem ser inativadas.
[057] Conforme usado no presente documento, o termo "inativação" da atividade da proteína é um conceito que inclui o enfraquecimento da atividade, em comparação com sua atividade intrínseca, ou nenhuma atividade.
[058] A inativação da atividade da proteína pode ser alcançada através da aplicação de vários métodos bem conhecidos na técnica. Exemplos dos métodos podem incluir um método para apagar a totalidade ou parte do gene que codifica proteína no cromossomo, que inclui o caso quando a atividade de proteína é eliminada; um método para substituir o gene que codifica proteína no cromossomo com um gene que é mutado para reduzir a atividade de enzima; um método para introduzir uma variação na sequência de controle de expressão do gene que codifica proteína no cromossomo; um método para recolocar a sequência de controle de expressão do gene que codifica proteína com uma sequência que tem atividade fraca ou nenhuma atividade (por exemplo, um método para recolocar o promotor do gene com um promotor mais fraco que o promotor intrínseco); um método para apagar a totalidade ou parte do gene que codifica proteína no cromossomo; um método para introduzir um oligonucleotídeo antisense (por exemplo, RNA antisense), que inibe a translação do mRNA em uma proteína através de uma ligação complementar a um transcrito do gene no cromossomo; um método para tornar impossível a ligação de um ribossomo, formando-se uma estrutura secundária, adicionando-se artificialmente uma sequência complementar à sequência SD na extremidade frontal da sequência SD do gene que codifica proteína; um método de engenharia de transcrição reversa (RTE) para adicionar um promotor a ser transcrito reversamente no terminal 3'da estrutura de leitura aberta (ORF) da sequência correspondente; ou uma combinação dos mesmos, mas não estão particularmente limitados a isso.
[059] Especificamente, o método para apagar parte ou a totalidade do gene que codifica proteína pode ser executado substituindo-se o polinucleotídeo que codifica a proteína endógena desejada dentro do cromossomo por um polinucleotídeo ou um gene marcador com uma sequência de nucleotídeos parcialmente apagada, através de um vetor para inserção de cromossômica no micro-organismo. Por exemplo, um método para apagar o gene por recombinação homóloga pode ser usado, mas não está limitado a isso. Adicionalmente, a "parte", embora possa variar dependendo dos tipos de polinucleotídeo, pode ser adequadamente determinada por pessoas versadas na técnica, e pode ser especificamente 1 nucleotídeo a 300 nucleotídeos, mais especificamente 1 nucleotídeo a 100 nucleotídeos e até mais especificamente 1 nucleotídeo a 50 nucleotídeos, mas não está particularmente limitado a isso.
[060] Além disso, o método para modificar a sequência de controle de expressão pode ser realizado induzindo-se uma modificação na sequência de controle de expressão por meio de exclusão, inserção, substituição não conservadora ou conservadora ou uma combinação das mesmas, de modo a inativar ainda mais a atividade da sequência de controle de expressão ou substituindo-se a sequência por uma sequência de nucleotídeos com uma atividade mais fraca. A sequência de controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica um domínio de ligação de ribossomo e uma sequência para regular a transcrição e tradução, mas não é limitada a isso.
[061] Além disso, o método para modificar a sequência de nucleotídeos no cromossomo pode ser realizado induzindo-se uma modificação na sequência por meio de exclusão, inserção, substituição conservadora ou não conservadora ou uma combinação das mesmas, de modo a inativar ainda mais a atividade da proteína, ou substituindo-se a sequência por uma sequência de nucleotídeos que é melhorada para ter uma atividade mais fraca ou uma sequência de nucleotídeos que é melhorada para não ter atividade, mas não está limitada a isso. Especificamente, no microorganismo, pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste em um gene metB codificador de cistationina gama sintase, um gene metY codificador de O-acetil homosserina (tiol)-liase que é uma via de degradação de O-succinil homosserina e um gene thrB que codifica a homosserina quinase pode ser ainda mais apagado ou enfraquecido.
[062] Conforme usado no presente documento, o termo "exclusão" se refere a um tipo de remoção, dentro do cromossomo, de uma parte ou a totalidade de uma região de sequência de nucleotídeos de um gene desejado a partir da sequência de nucleotídeos correspondente ao códon de início correspondente ao códon de parada ou uma parte ou a totalidade da sequência de nucleotídeos de uma região reguladora da mesma.
[063] Conforme usado no presente documento, o termo "enfraquecimento" se refere à remoção ou redução da atividade intracelular de uma ou mais enzimas que são codificadas pelo DNA correspondente em uma cepa de micro-organismos. Por exemplo, a expressão da proteína pode ser enfraquecida pela modificação de uma sequência de nucleotídeos de uma região promotora ou 5'-UTR de um gene, ou a atividade da proteína pode ser enfraquecida pela introdução de uma mutação na região ORF do gene correspondente.
[064] Além disso, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser um micro-organismo de produção de O-succinil homosserina do gênero Corynebacterium, no qual a atividade de aspartoquinase é ainda mais aprimorada, em comparação com um micro-organismo não variante.
[065] Conforme usado no presente documento, o termo "aprimoramento da atividade da proteína" se refere à introdução da atividade da proteína ou aumento da atividade da proteína, em comparação com sua atividade intrínseca. A "introdução" da atividade significa ocorrência de atividade de um polipeptídeo específico que não é natural ou artificialmente possuído pelo micro-organismo.
[066] Conforme usado no presente documento, o termo "aumento" da atividade da proteína, em comparação com sua atividade intrínseca, significa que a atividade é melhorada, em comparação com a atividade intrínseca da proteína do microorganismo ou a atividade antes da modificação. O termo "atividade intrínseca" se refere à atividade de uma proteína específica originalmente possuída por uma cepa parental ou micro-organismo não modificado antes de alterar sua característica, quando a característica do micro-organismo é alterada devido à variação genética causada por fatores naturais ou artificiais. O mesmo pode ser usado de forma intercambiável com a atividade antes da modificação.
[067] Especificamente, na presente invenção, o aprimoramento da atividade pode ser realizado por: 1) aumentar o número de cópias do polinucleotídeo que codifica a proteína, 2) modificar a sequência de controle de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo, 3) modificar a sequência de polinucleotídeos no cromossomo para aumentar a atividade da proteína, 4) introduzir um polinucleotídeo estranho que exibe a atividade da proteína ou um polinucleotídeo variante no qual o polinucleotídeo é otimizado por códon, ou 5) modificar para o aprimoramento por uma combinação dos mesmos, mas não está limitado a isso.
[068] 1) O aumento do número de cópias do polinucleotídeo pode ser, mas particularmente sem limitação, realizado de uma forma na qual o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um vetor ou pela inserção do polinucleotídeo no cromossomo de uma célula hospedeira. Especificamente, o aumento do número de cópias do polinucleotídeo no cromossomo da célula hospedeira pode ser realizado através da introdução de um vetor em uma célula hospedeira, o vetor que pode se replicar e funcionar independentemente de uma célula hospedeira e ao qual o polinucleotídeo que codifica a proteína da presente invenção está operacionalmente ligado, ou pode ser realizada através da introdução de um vetor em uma célula hospedeira, o vetor que pode inserir o polinucleotídeo no cromossomo de uma célula hospedeira e ao qual o polinucleotídeo está operacionalmente ligado.
[069] A seguir, 2) a modificação da sequência de controle de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo pode ser, mas particularmente sem limitação, realizada pela indução de uma modificação na sequência através de exclusão, inserção, substituição não conservadora ou conservadora da sequência de nucleotídeos, ou uma combinação dos mesmos para aumentar ainda mais a atividade da sequência de controle de expressão ou substituindo-se a sequência de polinucleotídeos por uma sequência de nucleotídeos com uma atividade mais forte. A sequência de controle de expressão inclui, porém, sem limitação particular a um promotor, uma sequência operadora, uma sequência que codifica um sítio de vinculação de ribossomos, e uma sequência que regula a terminação de transcrição e translação.
[070] Um promotor exógeno forte, em vez do promotor original, pode ser conectado à região a montante da unidade de expressão do polinucleotídeo. Exemplos do promotor forte podem incluir o promotor CJ7 (Patente número KR 0620092 e WO2006/065095), promotor lysCP1 (WO2009/096689), promotor EF-Tu, promotor groEL, promotor aceA ou aceB etc., mas não está limitado a isso. Além disso, 3) a modificação da sequência de polinucleotídeos no cromossomo pode ser, mas particularmente sem limitação, realizada introduzindo-se uma modificação na sequência de controle de expressão por meio de exclusão, inserção, substituição não conservadora ou conservadora da sequência de polinucleotídeos, ou uma combinação dos mesmos para aumentar ainda mais a atividade da sequência de polinucleotídeos ou substituindo-se a sequência de polinucleotídeos por uma sequência de polinucleotídeos que é aprimorada para ter uma atividade mais forte.
[071] Além disso, 4) a introdução da sequência de polinucleotídeos estranhos pode ser realizada introduzindo-se uma sequência de polinucleotídeos estranhos que codifica uma proteína que mostra a atividade idêntica/semelhante à da proteína acima ou introduzindo-se um polinucleotídeo variante otimizado por códon em uma célula hospedeira. Qualquer sequência de polinucleotídeos estranhos pode ser usada sem limitação na origem ou sequência da mesma, desde que mostre a atividade idêntica/semelhante à da proteína acima. Além disso, o polinucleotídeo estranho pode ser introduzido na célula hospedeira, após a otimização de seus códons, de modo que ocorra a transcrição e tradução otimizadas na célula hospedeira. A introdução pode ser realizada por um método de transformação conhecido que é adequadamente selecionado pelas pessoas versadas na técnica, e a proteína pode ser produzida por expressão do polinucleotídeo introduzido na célula hospedeira e, como resultado, sua atividade pode ser aumentada.
[072] Por fim, 5) o método para modificar para o aprimoramento por uma combinação de 1) a 4) pode ser realizado aplicando-se um ou mais dos métodos para aumentar o número de cópias do polinucleotídeo que codifica a proteína, modificando- se a sequência de controle de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo, modificando-se a sequência de polinucleotídeos no cromossomo e modificando-se um polinucleotídeo estranho que exibe a atividade da proteína ou de um polinucleotídeo variante no qual seus códons são otimizados por códons.
[073] a presente invenção, as sequências dos genes ou dos polinucleotídeos estão disponíveis em um banco de dados como o National Center for Biotechnology Information (NCBI).
[074] Ainda conforme outro aspecto da presente invenção, a presente invenção fornece um método para a produção de O-succinil homosserina, sendo que o método compreende as etapas de cultivar o micro-organismo descrito acima; e coletar O- succinil homosserina do micro-organismo cultivado ou do meio de cultura.
[075] Ainda conforme outro aspecto da presente invenção, a presente invenção fornece um método para produzir L-metionina, sendo que o método compreende as etapas de cultivar o micro-organismo descrito acima; e reagir o micro-organismo cultivado ou a O-succinil homosserina com sulfeto.
[076] Especificamente, a etapa de reagir com sulfeto significa produzir L- metionina a partir de O-succinil-homosserina com uso de qualquer método conhecido. Por exemplo, a L-metionina pode ser produzida por reação de O-succinil homosserina com metil-mercaptano como sulfeto, ou a metionina pode ser produzida por uma reação gradual através da produção de cistationina pela reação de O-succinil- homosserina com cisteína como o sulfeto. Além disso, para melhorar a taxa de reação e o rendimento, um catalisador ou uma enzima pode ser adicionado ou a reação pode ser permitida em um micro-organismo que inclui enzimas.
[077] A 'O-succinil homosserina' pode ser um caldo de fermentação que contém O-succinil homosserina produzida pelo micro-organismo acima descrito da presente invenção ou uma forma purificada do mesmo. Além disso, o "sulfeto" pode ser, por exemplo, metil mercaptano. O metil mercaptano se refere a todos os derivados de metil mercaptano com capacidade para fornecer átomos de enxofre, como uma forma de metil mercaptano de sódio liquefeito (CH3S-Na) e forma gasosa ou liquefeita de metil mercaptano (CH3SH), bem como um metil mercaptano que inclui dimetilsulfeto ( DMS), que é revelado na Publicação de Patente WO2010/098629 etc.
[078] O método de produção de L-metionina pode ser facilmente determinado pelos especialistas na técnica sob condições de cultura otimizadas e condições de ativação enzimática conhecidas na técnica. Um método e um meio de cultura específico são os mesmos que os descritos acima.
[079] Além disso, o método de produção de L-metionina pode ainda compreender a etapa de isolar ou coletar O-succinil homosserina do micro-organismo cultivado na etapa de cultura ou no meio.
[080] É evidente para as pessoas versadasna técnica que a "O-succinil homosserina" da presente invenção pode incluir toda a O-succinil homosserina e seus sais.
[081] No método acima, a etapa de cultivar o micro-organismo pode ser realizada por um método conhecido de cultura em batelada, cultura contínua ou cultura em batelada alimentada, mas não é particularmente limitado a isso. Em relação às condições de cultura, o pH adequado (ou seja, pH de 5 a 9, especificamente pH de 6 a 8 e mais especificamente pH de 6,8) pode ser ajustado com uso de um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), e uma condição aeróbica pode ser mantida pela adição de oxigênio ou uma mistura gasosa contendo oxigênio à cultura, mas não são particularmente limitados a isso. A temperatura da cultura pode ser mantida de 20 °C a 45 °C, e especificamente de 25 °C a 40 °C, e o micro-organismo pode ser cultivado por cerca de 10 horas a cerca de 160 horas, mas não é limitado a isso. A O-succinil-homosserina produzida pela cultura acima pode ser secretada no meio ou permanecer dentro das células.
[082] Adicionalmente, no meio de cultura a ser usado, fontes de carbono, como açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido, e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, semente de girassol óleo, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético), etc. podem ser usados individualmente ou em uma mistura dos mesmos, mas não são limitadas a isso. Fontes de nitrogênio, como compostos orgânicos que contém nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, suco de carne, extrato de malte, aguardente de milho, farinha de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio), podem ser usados, individualmente ou em uma mistura dos mesmos, mas não são limitados a isso. Fontes de potássio, como di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio ou sais que contém sódio correspondentes, podem ser usadas individualmente ou em uma mistura dos mesmos, mas não estão limitadas as mesmas. Adicionalmente, outras substâncias essenciais para estimular o crescimento, incluindo sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas podem ser incluídos no meio.
[083] Um método para coletar o O-succinil homosserina ou L-metionina que é produzido na etapa de cultivar da presente invenção pode ser coletar o aminoácido desejado do caldo de cultura com uso de um método apropriado conhecido na técnica de acordo com o método de cultura. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC etc., podem ser usados, e a O- succinil homosserina ou L-metionina desejada pode ser coletada do meio ou microorganismo com uso de um método apropriado conhecido na técnica.
[084] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, esses Exemplos são para propósitos ilustrativos apenas e o escopo da presente invenção não se destina a ser limitado por esses Exemplos.
[085] Para amplificar um gene codificador de O-acetil homosserina transferase (MetX), os locais de restrição BamHI foram inseridos nas duas extremidades dos iniciadores (SEQ ID NOS: 5 e 6) para amplificar de uma região promotora (cerca de 300 bp a montante dos códons de início) para uma região terminadora (cerca de 100 bp a jusante dos códons de parada), com base na sequência derivada relatada por WT (tipo selvagem). TABELA 1
[086] Após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi realizada por um total de 30 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 90 segundos. Posteriormente, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, foi obtido um fragmento de DNA de 1546 bp da região codificadora do gene metX. Um vetor pECCG117 (Patente número KR 10-0057684) e o fragmento de DNA metX foram tratados com uma enzima de restrição BamHI e ligados entre si com uso de DNA ligase e clonados, obtendo assim um plasmídeo, que foi projetado como pECCG117-metX WT.
[087] Locais de variação metX inovadores foram selecionados e um aminoácido na posição 313 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 foi substituído por um aminoácido diferente de leucina.
[088] Mais especificamente, para preparar um vetor variante, no qual o aminoácido na posição 313 de O-acetil homosserina transferase foi substituído com outro aminoácido, com uso do plasmídeo pECCG117-metX WT construído no Exemplo 1 as como um modelo, um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 7 e 8) foram projetados. TABELA 2
[089] Os iniciadores e um kit de mutagênese direcionada ao local (Stratagene, EUA) foram usados para preparar um gene variante metX. O plasmídeo variante L313R, com base no plasmídeo de tipo selvagem WT, foi projetado como WT_L313R.
[090] Para comparar a atividade da variante metX que produz uma grande quantidade de O-succinil homosserina, foi preparada uma cepa na qual a homosserina foi acumulada e a disponibilidade da O-succinil homosserina produzida foi apagada. Uma cepa na qual o gene metB que codifica a cistationina gama sintase envolvida na via de degradação da O-succinil homosserina e o gene metY que codifica a O-acetil homosserina (tiol)-liase que está envolvida na via de degradação da O-succinil homosserina foram apagados, foram preparados. Primeiro, para apagar o gene metB, um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 9 e 10) para amplificação de região 5'-a montante do gene metB e um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 11 e 12) para amplificação da região 3'-a jusante do gene metB foram projetados, com base na sequência de nucleotídeos do gene metB derivado de WT. Os locais de restrição XbaI (sublinhados) foram inseridos em cada extremidade dos iniciadores da SEQ ID NOS: 9 e 12. TABELA 3
[091] PCR foi realizado com uso do cromossomo de WT como um modelo e os iniciadores de SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12. Após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi realizada por um total de 30 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 90 segundos. Posteriormente, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA de 450 bp da região 5'-a montante do gene metB e um fragmento de DNA de 467 bp da região 3'-a jusante do gene metB foram obtidos.
[092] A PCR foi realizada com uso dos dois tipos amplificados de fragmentos de DNA como modelo e iniciadores da SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 12. Após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi realizada por um total de 30 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 3 minutos. Posteriormente, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA de 917 bp, que inclui apenas os fragmentos a montante e a jusante por exclusão do meio do gene metB, foi amplificado.
[093] O vetor pDZ e o fragmento de DNA de 917 bp foram tratados com uma enzima de restrição XbaI, e depois ligados entre si com uso de DNA ligase e clonados, obtendo assim um plasmídeo, que foi projetado como pDZ-AmetB.
[094] O vetor pDZ-AmetB foi introduzido na cepa WT preparada por um método de pulso elétrico e, em seguida, uma cepa transformante foi selecionada em um meio de seleção que contém 25 mg/l de canamicina. Foi obtida a cepa WTAmetB na qual o gene metB foi excluído pelo fragmento de DNA inserido no cromossomo por um processo secundário de recombinação (cruzamento).
[095] Para excluir o gene metY, que é outra via de degradação da O-succinil homosserina, um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 13 e 14) para amplificação de região 5'-a montante do gene metY e um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 15 e 16) para amplificação da região 3'-a jusante do gene metY foram projetados, com base na sequência de nucleotídeos do gene metY derivado de WT. Os locais de restrição XbaI (sublinhados) foram inseridos em cada extremidade dos iniciadores da SEQ ID NOS: 13 e 16. TABELA 4
[096] PCR foi realizado com uso do cromossomo de WT como um modelo e os iniciadores de SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16. Após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi realizada por um total de 30 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 90 segundos. Posteriormente, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA de 512 bp da região 5'-a montante do gene metY e um fragmento de DNA de 520 bp da região 3'-a jusante do gene metY foram obtidos.
[097] A PCR foi realizada com uso dos dois tipos amplificados de fragmentos de DNA como modelo e iniciadores da SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 16. Após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi realizada por um total de 30 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 3 minutos. Posteriormente, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA de 1032 bp, que inclui apenas os fragmentos a montante e a jusante por exclusão do meio do gene metY, foi amplificado.
[098] O vetor pDZ e o fragmento de DNA de 1.032 bp foram tratados com uma enzima de restrição XbaI, e depois ligados entre si com uso de DNA ligase e clonados, obtendo assim um plasmídeo, que foi projetado como pDZ-ΔmetY.
[099] O vetor pDZ-ΔmetY foi introduzido na cepa WTΔmetB preparada por um método de pulso elétrico e, em seguida, uma cepa transformante foi selecionada em um meio de seleção que contém 25 mg/l de canamicina. Foi obtida a cepa WTΔmetBΔmetY na qual o gene metY foi excluído pelo fragmento de DNA inserido no cromossomo por um processo secundário de recombinação (cruzamento).
[0100] Para maximizar a produção de O-succinil homosserina, um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 19 e 20) para amplificar a região 5'-a montante e um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 21 e 22) para amplificar a região 3'-a jusante em torno do local de variação foi projetado para construir um vetor de introdução de variante para o gene lysC (SEQ ID NO: 18) que codifica aspartoquinase derivada de WT (SEQ ID NO: 17). Os iniciadores de SEQ ID NOS: 19 e 22 foram inseridos nos locais de restrição XbaI (sublinhados) em cada extremidade e os iniciadores de SEQ ID NOS: 20 e 21 foram autorizados a colocar a variação de substituição de nucleotídeos (sublinhada) na região que foi projetada para cruzar entre si. TABELA 5
[0101] PCR foi realizado com uso do cromossomo de WT como um modelo e iniciadores de SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22. Após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi realizada por um total de 30 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 30 segundos. Posteriormente, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA de 509 bp da região 5’ a montante e um fragmento de DNA de 520 bp da região 3' a jusante ao redor da variação do gene lysC foram obtidos.
[0102] A PCR foi realizada com uso dos dois tipos amplificados de fragmentos de DNA como modelo e iniciadores da SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 22. Após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi realizada por um total de 30 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 60 segundos. Posteriormente, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA de 1011 bp que inclui a variação do gene lysC (SEQ ID NO: 24) codificando a variante aspartoquinase (SEQ ID NO: 23) em que a treonina na posição 311 foi substituída por isoleucina foi amplificada.
[0103] O vetor pDZ (Patente número KR 0924065) que não é replicável em Corynebacterium glutamicum e o fragmento de DNA de 1011 bp foram tratados com uma enzima de restrição XbaI, e ligados entre si usando DNA ligase e clonados, obtendo assim um plasmídeo, que foi projetado como pDZ-lisC (T311I).
[0104] O vetor pDZ-lysC(T311I) foi introduzido em WTΔmetBΔmetY por um método de pulso elétrico (Appl. Microbiol. Biothcenol. (1999) 52:541 a 545) e depois uma cepa transformante foi selecionada em um meio de seleção que contém 25 mg/l de canamicina. A cepa WTΔmetBΔmetY, lysC(T311I) na qual a variação de nucleotídeos foi introduzida no gene lysC pelo fragmento de DNA inserido no cromossomo por um processo de recombinação secundária (cruzamento), foi obtida e a cepa foi projetada como Corynebacterium glutamicum WTΔmetBΔmetY, lysC(T311I).
[0105] Os vetores pECCG117-metX WT e pECCG117-metX WT_L313R preparados nos Exemplos 1 e 2 foram introduzidos no WTΔmetBΔmetY preparado como acima pelo método de pulso elétrico, e então cada cepa transformante foi selecionada em um meio de seleção que contém 25 mg/l de canamicina.
[0106] Para comparar as capacidades de produção de O-acetil homosserina (O- AH) e O-succinil homosserina (O-SH) das cepas preparadas, foram cultivadas pelo método a seguir, e as concentrações de O-acetil homosserina e O-succinil homosserina em cultura, os meios foram analisados.
[0107] Cada um dos laços de platina das cepas foi inoculado em um balão de Erlenmeyer de 250 ml que contém 25 ml do meio seguinte e depois cultivado a 37 °C e 200 rpm sob agitação por 20 horas. As concentrações de O-acetil homosserina e O- succinil homosserina foram analisadas por HPLC, e as concentrações analisadas são mostradas na Tabela 6.
[0108] <Composição de meio (pH 7,0)>
[0109] 100 g de glicose, 40 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de sólidos de maceração de milho, 3 g de ureia, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO47H2O, 100 μg de biotina, 1.000 μg de tiamina HCl, 2.000 μg de pantotenato de cálcio, 3.000 μg de nicotinamida, 30 g de CaCO3, 0,3 g de L-metionina (por 1 litro de água destilada). TABELA 6
[0110] Com referência à Tabela 6, foi confirmado que a cepa introduzida com o plasmídeo de controle metX WT produzia O-acetil homosserina, enquanto a cepa introduzida com o plasmídeo variante metX produzia O-succinil homosserina. Em outras palavras, a especificidade do substrato da transferase foi alterada na cepa introduzida com a variante e, como resultado, foi produzida a O-succinil homosserina.
[0111] Além disso, a cepa WTΔmetBΔmetY, lysC(T311I)/ pECCG117-metX WT_L313R preparada foi projetada como CA05-5132 e depois depositada no Centro de Cultura de Micro-organismos da Coreia, que é a autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste em 11 de maio de 2017 com o número de acesso KCCM12023P.
[0112] Para preparar variantes nas quais outro aminoácido foi substituído no local de variação metX que mostra alta capacidade de produção de O-succinil- homosserina, foi usada mutagênese saturada. Foram preparados 18 tipos de variantes nas quais o aminoácido na posição 313 de metX foi substituído por outro aminoácido, e o plasmídeo preparado no Exemplo 1 foi usado como modelo. Cada variante, aminoácidos substituídos e SEQ ID NOs. dos iniciadores usados em cada variante são mostrados na tabela 7 a seguir. TABELA 7
[0113] Especificamente, os iniciadores sugeridos na Tabela 2 e um kit de mutagênese direcionada ao local (Stratagene, EUA) foram usados para preparar genes variantes metX. Cada um dos plasmídeos variantes preparados foi introduzido na cepa WTΔmetBΔmetY, lysC(T311I) e um teste em balão foi realizado da mesma maneira que no Exemplo 4. Os resultados são mostrados na Tabela 8 a seguir. TABELA 8
[0114] Em referência à Tabela 3, foi confirmado que a maioria das variantes não produzia O-succinil homosserina, enquanto a variante (L313R), (L313C), (L313I) ou (L313K) com a variação de aminoácidos na posição 313 do metX produzia O-succinil- homosserina em níveis mais elevados do que o tipo selvagem, respectivamente. Em outras palavras, quando o aminoácido na posição 313 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por arginina, cisteína, isoleucina ou lisina, a especificidade do substrato para succinil CoA pode ser fornecida e, como resultado, pode ser produzida O-succinil homosserina.
[0115] Tomados em conjunto, os resultados sugerem que as variantes da presente invenção podem aumentar a produção de O-succinil homosserina.
[0116] Com base na descrição acima, será compreendido pelas pessoas versadas na técnica que a presente revelação pode ser implantada em uma forma específica diferente sem mudar o espírito técnico ou características essenciais da mesma. Portanto, deve ser compreendido que a modalidade acima não é limitante, mas ilustrativas em todos os aspectos. O escopo da invenção é definido pelas reivindicações anexas, e não pela descrição que as precede, e, portanto, todas as alterações e modificações que se enquadram dentro das métricas e limites das reivindicações, ou equivalentes de tais métricas e limites são, portanto, destinadas a serem abrangidas pelas reivindicações.
[0117] Autoridade de Depósito: Centro De Cultura Coreano de Micro-Organismos
[0118] Número de Registro: KCCM12023P
[0119] Data do Depósito: 11 de maio de 2017
Claims (12)
1. Polipeptídeo caracterizado por compreender atividade de O-succinil homosserina transferase, em que o polipeptídeo compreende a substituição de um aminoácido selecionado do grupo que consiste em arginina, cisteína, isoleucina e lisina para um aminoácido na posição 313 em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
2. Polipeptídeo que tem atividade de O-succinil homosserina transferase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo compreender qualquer sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75 e SEQ ID NO: 81.
3. Polinucleotídeo caracterizado por codificar o polipeptídeo que tem atividade de O-succinil homosserina transferase, conforme definido na reivindicação 1, em que o polinucleotídeo compreende qualquer sequência de nucleotídeos selecionados do grupo que consiste em sequências de nucleotídeo da SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76 e SEQ ID NO: 82.
4. Micro-organismo de produção de O-succinil homosserina do gênero Corynebacterium, caracterizado por compreender o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 3.
5. Micro-organismo de produção de O-succinil homosserina do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por uma atividade de aspartoquinase ser intensificada adicionalmente em comparação a um microorganismo não variante.
6. Micro-organismo de produção de O-succinil homosserina do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o microorganismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium glutamicum.
7. Micro-organismo de produção de O-succinil homosserina do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a atividade de um ou mais selecionados do grupo que consiste em cistatonina sintase, O-acetil homosserina (tiol)-liase e homosserina quinase ser inativada.
8. Micro-organismo de produção de O-succinil homosserina do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a atividade de aspartoquinase ser intensificada adicionalmente em comparação a um microorganismo não variante, e a atividade de um ou mais selecionados do grupo que consiste em cistatonina sintase, O-acetil homosserina (tiol)-liase e homosserina quinase é inativada.
9. Método para produzir O-succinil homosserina, em que o método é caracterizado por compreender as etapas de: cultivar o micro-organismo de produção de O-succinil homosserina do gênero Corynebacterium, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 8 em um meio; e isolar ou coletar O-succinil homosserina do micro-organismo cultivado na etapa de cultura ou no meio.
10. Método para produzir L-metionina, em que o método é caracterizado por compreender as etapas de: (a) cultivar o micro-organismo de produção de O-succinil homosserina do gênero Corynebacterium, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 8 em um meio; e (b) reagir a O-succinil homosserina com sulfeto.
11. Método para produzir L-metionina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender a etapa de isolar ou coletar O-succinil homosserina do micro-organismo cultivado na etapa (a) ou no meio.
12. Método para produzir L-metionina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de isolar ou coletar L- metionina que é produzida reagindo-se O-succinil homosserina com sulfeto na etapa (b).
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20170083438 | 2017-06-30 | ||
| KR10-2017-0083438 | 2017-06-30 | ||
| PCT/KR2018/007408 WO2019004779A2 (ko) | 2017-06-30 | 2018-06-29 | 신규한 o-숙시닐 호모세린 트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 o-숙시닐 호모세린의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112019027949A2 BR112019027949A2 (pt) | 2020-07-21 |
| BR112019027949B1 true BR112019027949B1 (pt) | 2024-04-16 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6998466B2 (ja) | クエン酸シンターゼの活性が弱化された変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－アミノ酸生産方法 | |
| JP6759484B1 (ja) | 新規なアスパルトキナーゼ変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 | |
| ES2944588T3 (es) | Homoserina deshidrogenasa modificada, y método para la producción de homoserina o L-aminoácido derivado de homoserina usando la misma | |
| BR112019021322B1 (pt) | Homosserina desidrogenase modificada, polinucleotídeo, microorganismo do gênero corynebacterium e método para produzir homosserina ou um l-aminoácido derivado de homosserina | |
| BR112019013003B1 (pt) | Micro-organismo modificado corynebacterium stationis e método para preparar monofosfato de 5-inosina | |
| BR112020002790A2 (pt) | variante de proteína receptora de camp, polinucleotídeo, vetor, micro-organismo do gênero escherichia, método para produzir um l-aminoácido, e, uso de uma variante de proteína receptora | |
| BR112019014101B1 (pt) | Variante de proteína que tem uma atividade de exportação de inosina-5'-monofosfato, polinucleotídeo, vetor, micro-organismo do gênero corynebacterium que produz inosina-5'- monofosfato, método para preparar inosina-5'-monofosfato e uso da variante de proteína | |
| BR112020012963A2 (pt) | variante de proteína de receptor de camp e método de produção de l-aminoácido com uso do mesmo | |
| US11142779B2 (en) | O-succinyl homoserine transferase variant and method of producing O-succinyl homoserine using the same | |
| JP6946479B2 (ja) | 新規なｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ変異体及びこれを用いたｏ−スクシニルホモセリンの製造方法 | |
| BR112019019867A2 (pt) | Micro-organismo para produzir l-aminoácido com atividade aprimorada de a-glucosidase e método para produzir l-aminoácido com o uso do mesmo | |
| BR112019027949B1 (pt) | Polipeptídeo que compreende atividade de o-succinil, polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, micro-organismo de produção de osuccinil, método para produzir o-succinil e l-metionina | |
| JP7407941B2 (ja) | Ｏ－ホスホセリン排出タンパク質変異体、並びにそれを用いたｏ－ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法 | |
| BR112020001762B1 (pt) | Variante de atp fosforribosiltransferase, polinucleotídeo, vetor, microrganismo do gênero corynebacterium e método para produzir histidina com o uso do mesmo | |
| BR112020001762A2 (pt) | variante de atp fosforribosiltransferase, polinucleotídeo, vetor, micro-organismo do gênero corynebacterium, e, método para produzir histidina. | |
| BR112019009942B1 (pt) | Micro-organismo do gênero corynebacterium que produz l-lisina e método para produzir l-lisina |