CN110218749A - 用改变NCgl1859的细菌发酵生产赖氨酸的方法 - Google Patents

用改变NCgl1859的细菌发酵生产赖氨酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110218749A
CN110218749A CN201910408874.3A CN201910408874A CN110218749A CN 110218749 A CN110218749 A CN 110218749A CN 201910408874 A CN201910408874 A CN 201910408874A CN 110218749 A CN110218749 A CN 110218749A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ncgl1859
corynebacterium glutamicum
lysine
gene
transformation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910408874.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110218749B (zh
Inventor
孟刚
周晓群
魏爱英
马风勇
赵春光
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inner Mongolia Iray Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Inner Mongolia Iray Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inner Mongolia Iray Biological Technology Co Ltd filed Critical Inner Mongolia Iray Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201910408874.3A priority Critical patent/CN110218749B/zh
Publication of CN110218749A publication Critical patent/CN110218749A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110218749B publication Critical patent/CN110218749B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了发酵生产L‑赖氨酸的方法，其包括改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的NCgl1859基因；和，用改造而得到的谷氨酸棒杆菌发酵生产L‑赖氨酸。另外，本发明还提供了由该方法衍生的方法和应用，以及可以用在这些方法和应用中的谷氨酸棒杆菌、多核苷酸等。

Description

用改变NCgl1859的细菌发酵生产赖氨酸的方法
技术领域
本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵生产L-赖氨酸的方法及其衍生的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的细菌等。
背景技术
通过产L-赖氨酸的细菌（如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌）发酵来生产L-赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。
现有文献中有报道DeoR/GlpR转录调节因子（DeoR/GlpR transcriptionalregulator，在本文中简称为NCgl1859）基因及其编码蛋白的增加、减少或突变等用于氨基酸（包括L-赖氨酸）生产中，例如，EP1108790A2和WO2005058945A2等，然而，突变后的蛋白质活性是难以预料的，相应地，其对L-赖氨酸生产的影响也难以预料，尤其是，近十多年来，对NCgl1859基因及其编码蛋白的突变对L-赖氨酸生产的影响的新的研究已经越来越少，表明研究人员对是否有新的NCgl1859基因及其编码蛋白的突变来改善L-赖氨酸生产的兴趣已经越来越小了。
本发明人没有受到近十多年来的趋势影响，经过长期研究和实践，尤其凭借了一些运气，偶然发现对NCgl1859基因的新的改造能够有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的产量。而且，该方法与现有改造的大量高产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产L-赖氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造谷氨酸棒杆菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的方法，改造的谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，改造的谷氨酸棒杆菌在相对于未改造谷氨酸棒杆菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造谷氨酸棒杆菌的方法等。另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的突变蛋白、多核苷酸、载体和/或谷氨酸棒杆菌等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括：
（1）改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的NCgl1859基因，使其编码的蛋白质的第78位发生突变；和，
（2）用步骤（1）改造而得到的谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸。
在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因或调控元件的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。改造位于染色体上的基因使得该基因的核苷酸序列被添加、缺失或替换一个或多个核苷酸。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式中，根据同源重组的原理，可以采用Addgene公司商品化的pKOV质粒系统来进行改造，也可以采用pK18mobsacB质粒系统来进行改造，改造谷氨酸棒杆菌染色体上的野生型的NCgl1859基因。因此，在本文中，优选改造是通过同源重组进行的改造。
本发明人经过长期研究发现，在谷氨酸棒杆菌中，使野生型的NCgl1859基因编码的蛋白质的第78位发生突变，可以提高L-赖氨酸的产量。在本发明的具体实施方式中，野生型的NCgl1859基因编码的蛋白质的第78位发生M78I突变，即甲硫氨酸残基（Met）被取代为异亮氨酸残基（Ile）。
野生型的NCgl1859基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，在本发明的具体实施方式中，野生型的NCgl1859基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中的编码部分的所示。另外，发生突变的NCgl1859基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，在本发明的具体实施方式中，发生突变的NCgl1859基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中的编码部分所示。
在本发明的具体实施方式中，用如SEQ ID NO：2中的编码部分所示的核苷酸序列取代谷氨酸棒杆菌染色体上的如SEQ ID NO：1中的编码部分所示的核苷酸序列，实施改造。
相应地，本发明还提供了其他的应用或方法。例如，在第二方面，本发明提供了提高L-赖氨酸的发酵量的方法，其包括：
（1）改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的NCgl1859基因，使其编码的蛋白质的第78位发生突变；和，
（2）用步骤（1）改造而得到的谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸。
L-赖氨酸作为细菌的重要代谢产物，大多数细菌或多或少都能够发酵产生一定量的L-赖氨酸，尤其是谷氨酸棒杆菌。尽管低产L-赖氨酸的细菌不适合有经济效益地生产L-赖氨酸，但是通过本发明的方法，仍旧能提高L-赖氨酸的发酵量，仍旧可以供对经济效益不敏感的地方使用。当然，在本文中，优选细菌是高产L-赖氨酸的细菌。通过本发明的方法，可以进一步提高其产量。另外，在本发明的方法或应用中，除了改造细菌染色体上NCgl1859基因以外，可以不再进行其他改造，当然也可以进行其他改造。
又如，在第三方面，本发明提供了改造获得的谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，其中，所述改造获得是改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的NCgl1859基因，使其编码的蛋白质的第78位发生突变，而获得。
改造获得的谷氨酸棒杆菌可以单独应用于发酵生产L-赖氨酸中，也可以和其他产L-赖氨酸的细菌混合发酵生产L-赖氨酸，或者以其他方式应用于发酵生产L-赖氨酸中。在本文中，如无特别限定（如未以“改造获得”来限定），术语“谷氨酸棒杆菌”是未改造或改造前的谷氨酸棒杆菌，其染色体的NCgl1859基因是野生型的。
还如，在第四方面，本发明提供了改造获得的谷氨酸棒杆菌在提高L-赖氨酸的发酵量中的应用，其中，所述改造获得是改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的NCgl1859基因，使其编码的蛋白质的第78位发生突变，而获得。
在本文中，谷氨酸棒杆菌可以是产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌。诸如北京棒杆菌，其特性，尤其是野生型的NCgl1859基因，与谷氨酸棒杆菌基本相同，因此也可以纳入本发明的谷氨酸棒杆菌的范围内。
更本质地，在第五方面，本发明提供了改造谷氨酸棒杆菌的方法，其包括改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的NCgl1859基因，使其编码的蛋白质的第78位发生突变。
本发明第五方面的方法改造而获得的谷氨酸棒杆菌能够用于发酵生产或产生L-赖氨酸。因此，在第六方面，本发明提供了本发明第五方面的方法改造而获得的谷氨酸棒杆菌。
另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的中间产物，如突变蛋白、多核苷酸和/或载体等物质，以及它们的应用等。例如，在第七方面，本发明提供了突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在第八方面，本发明提供了多核苷酸，其编码本发明第七方面的蛋白。在本发明的具体实施方式中，本发明第八方面的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中编码部分所示。
在第九方面，本发明提供了载体，其包含本发明第八方面的多核苷酸。
在第十方面，本发明提供了本发明第七方面的突变蛋白和/或本发明第八方面的多核苷酸和/或本发明第九方面的载体在本发明第一、二、三和/或四方面的方法或应用中的应用。即在本发明第一、二、三和/或四方面的方法或应用中，使用了本发明提供了本发明第七方面的突变蛋白和/或本发明第八方面的多核苷酸和/或本发明第九方面的载体。
在第十一方面，本发明提供了本发明第七方面的突变蛋白和/或本发明第八方面的多核苷酸和/或本发明第九方面的载体在制备本发明第五方面的谷氨酸棒杆菌中的应用。即在制备本发明第五方面的谷氨酸棒杆菌的过程中，使用了本发明第七方面的突变蛋白和/或本发明第八方面的多核苷酸和/或本发明第九方面的载体。
本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高L-赖氨酸的发酵量的方式，而且与现有改造的大量高产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的染色体改造位点没有冲突，应用在现有高产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌上观察到了可以进一步提高产量的效果，从而在实践上可用于谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸，便于推广应用。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南（第3版）》（科学出版社）、《微生物学实验（第4版）》（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
实施例1 包含点突变的NCgl1859基因的转化载体pK18-NCgl1859 M78I的构建
根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组序列，合成两对扩增NCgl1859基因编码区片段（其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，或可登陆https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/*term=NCgl1859获取）的引物，以通过等位基因置换在菌株YPL-4染色体上的野生型的NCgl1859基因中引入点突变（其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示）。引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：
P1: 5' CCGGAATTC AGTAGCCACCCATCCTCAC 3' （EcoR I）
P2: 5' CTAAAACACGGGGTTCCGGTGGAATTCCTTTACCCAAGGCA 3'
P3: 5' TGCCTTGGGTAAAGGAATTCCACCGGAACCCCGTGTTTTAG 3'
P4: 5' CCCAAGCTT AAAGCCCGCAAGCAAGAC 3' (Hind III)
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1/P2及P3/P4，进行PCR扩增，获得两条含有NCgl1859基因编码区分离的DNA片段，大小分别为672bp及733bp。再用引物P1/P4进行OVERLAP PCR得到整个等位替换的片段1364bp，片段包含NCgl1859基因的完整编码区，且片段两端分别含有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点。此DNA片段导致野生型NCgl1859基因的第234位的核酸改变，最终导致编码蛋白的第78位氨基酸由蛋氨酸（M）被异亮氨酸（I）所取代。PCR反应结束后，对扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化所需要的DNA片段，将片段双酶切（EcoRⅠ/ HindⅢ）后回收，与同样双酶切（EcoRⅠ/ HindⅢ）后的穿梭质粒pk18mobsacB质粒相连接，获得等位替换质粒pK18- NCgl1859 M78I，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。
实施例2 包含点突变的NCgl1859 M78I的菌株的构建
将实施例1获得的质粒pK18- NCgl1859 M78I电转化入赖氨酸生产菌（谷氨酸棒杆菌）专利菌株YPL-4（即YP97136）中（其构建方法可参见WO2014121669A1；经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的NCgl1859基因），对培养产生的单菌落分别通过引物P1/M13F进行鉴定，能扩增出1400bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含12%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物（上海invitrogen公司合成）进行PCR鉴定：
P5：5' GAGATTTAGCCGAGCATTTC 3'
P6:5' GCCGGGGGAACTTGTAAC 3'
上述PCR扩增产物通过高温变性、冰浴后进行sscp电泳（以质粒pK18-NCgl1859 M78I扩增片段为阳性对照，野生型扩增片段为阴性对照，水作为空白对照），由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过PCR扩增阳性菌株目的片段，并连接到PMD19-T载体，并测序，通过序列比对，碱基序列发生突变的序列验证菌株的等位替换成功，并被命名为YPL-4-001。
实施例3 赖氨酸发酵实验
将实施例2构建的菌株和原始菌株在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐（购自上海百仑生物科技有限公司）中以表1所示的培养基和表2所示的过程进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表3所示。
表1 发酵培养基配方
品名 配比
淀粉水解糖 30g/L
硫酸铵 12g/L
硫酸镁 0.87g/L
糖蜜 20g/L
酸化玉米浆 3ml/L
磷酸 0.4ml/L
氯化钾 0.53g/L
消泡剂（2%泡敌） 4ml/L
硫酸亚铁 120mg/L
硫酸锰 120mg/L
烟酰胺 42mg/L
泛酸钙 6.3mg/L
VB1 6.3mg/L
铜、锌盐溶液 0.6g/L
生物素 0.88mg/L
表2 发酵过程
表3 赖氨酸发酵实验结果
结果如表3所示，对谷氨酸棒杆菌中NCgl1859 M78I进行点突变，有助于L-赖氨酸产量的提高。
序列表
<110> 内蒙古伊品生物科技有限公司
<120> 用改变NCgl1859基因的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法
<130> CN
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 1
ggtagttcgg ggcgtggggt aatccacacc gcgcttgcat aacggactcc accgacaacg 60
ccggtgccct tcagtacagt gtcttgattc acatcagcca cagtagccac ccatcctcac 120
aatcattgag ttaatttcct caagatcacc acaaaaccaa cagttgtgca actattcaaa 180
catttggata ttgacaaaca aacacatatc aacatagcgt gttgttaagc gatcaccata 240
tttcatacgt tgagaccatc gtcacaagtt gatattccac cagcttatca atgcatttga 300
aggagattta acaccttctc catcatagtg actgaggcca catcatgtgt tttccgctcg 360
atttatttta gattttccgc tttaaccagc acttttaata acttcatacg gttcttccac 420
aatcggaacc aaaacaacac tggtcaaaaa ccagtttccc gcttgaacaa aatttcttcc 480
acgtcaacac caactccaac atcagcgagg ttaagcatgg tcagccaaac ggaaagacag 540
catgcaattg cttctttact ggcaccaact ggtgcggtgt ctgtaggaga tttagccgag 600
catttccatg tgacaaccga aacagtgcga cgtgatcttc ggatcatgga gtcactgggt 660
ttgttgcaac gagttcacgg tggcgccatt agcccagagc ccatgggtac gtctccccct 720
cggctgaaac ctgccttggg taaaggaatg ccaccggaac cccgtgtttt agaacttgca 780
gaaactgcag tttccctcat cacacctcta gcacgcagca ttttcctgga ttcaggttta 840
gcgtgcacgg cgattgccac ggtgttgggg gatcctccag aagatgccag gtggactgtt 900
gttacaagtt cccccggcgc tgtgattgcc ttgtccgcga cagatgccac ctccacggtg 960
gtgctgcacg ggcaggttca cggtaattgt tcttcaatca ttgggtccac ggcagtagac 1020
atgatttcgc agttgcgcgc tgatatcgcc ttcgtggagg ttgatgcgat tcaatccgat 1080
acaagtctgt gcacgttttt cccggagacg attcccatca agcaagccat gatcaaaaac 1140
gcggctttca cagttgctgt tctcagcccg agatctcccc aagatcaaga acttcaactt 1200
ttgaagcacc ctttttccac cttggctgat tttgatgccc ttgttaccga tgaccacacg 1260
ctagattttc cagttttgcc cgaccacaac tttcaggtgg taaccccatg atcatcacat 1320
tcaccccaaa cccgagtatt gattccacgc tgtcgctcgg cgaagagctc tcccgtggat 1380
ccgtccaacg acttgattcc gtcaccgctg tcgcaggtgg taaaggcatc aatgtcgccc 1440
acgctgtctt gcttgcgggc tttgaaacct tggctgtgtt cccagccggc aagctcgacc 1500
<210> 2
<211> 1500
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 2
ggtagttcgg ggcgtggggt aatccacacc gcgcttgcat aacggactcc accgacaacg 60
ccggtgccct tcagtacagt gtcttgattc acatcagcca cagtagccac ccatcctcac 120
aatcattgag ttaatttcct caagatcacc acaaaaccaa cagttgtgca actattcaaa 180
catttggata ttgacaaaca aacacatatc aacatagcgt gttgttaagc gatcaccata 240
tttcatacgt tgagaccatc gtcacaagtt gatattccac cagcttatca atgcatttga 300
aggagattta acaccttctc catcatagtg actgaggcca catcatgtgt tttccgctcg 360
atttatttta gattttccgc tttaaccagc acttttaata acttcatacg gttcttccac 420
aatcggaacc aaaacaacac tggtcaaaaa ccagtttccc gcttgaacaa aatttcttcc 480
acgtcaacac caactccaac atcagcgagg ttaagcatgg tcagccaaac ggaaagacag 540
catgcaattg cttctttact ggcaccaact ggtgcggtgt ctgtaggaga tttagccgag 600
catttccatg tgacaaccga aacagtgcga cgtgatcttc ggatcatgga gtcactgggt 660
ttgttgcaac gagttcacgg tggcgccatt agcccagagc ccatgggtac gtctccccct 720
cggctgaaac ctgccttggg taaaggaatt ccaccggaac cccgtgtttt agaacttgca 780
gaaactgcag tttccctcat cacacctcta gcacgcagca ttttcctgga ttcaggttta 840
gcgtgcacgg cgattgccac ggtgttgggg gatcctccag aagatgccag gtggactgtt 900
gttacaagtt cccccggcgc tgtgattgcc ttgtccgcga cagatgccac ctccacggtg 960
gtgctgcacg ggcaggttca cggtaattgt tcttcaatca ttgggtccac ggcagtagac 1020
atgatttcgc agttgcgcgc tgatatcgcc ttcgtggagg ttgatgcgat tcaatccgat 1080
acaagtctgt gcacgttttt cccggagacg attcccatca agcaagccat gatcaaaaac 1140
gcggctttca cagttgctgt tctcagcccg agatctcccc aagatcaaga acttcaactt 1200
ttgaagcacc ctttttccac cttggctgat tttgatgccc ttgttaccga tgaccacacg 1260
ctagattttc cagttttgcc cgaccacaac tttcaggtgg taaccccatg atcatcacat 1320
tcaccccaaa cccgagtatt gattccacgc tgtcgctcgg cgaagagctc tcccgtggat 1380
ccgtccaacg acttgattcc gtcaccgctg tcgcaggtgg taaaggcatc aatgtcgccc 1440
acgctgtctt gcttgcgggc tttgaaacct tggctgtgtt cccagccggc aagctcgacc 1500
<210> 3
<211> 264
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 3
Met Val Ser Gln Thr Glu Arg Gln His Ala Ile Ala Ser Leu Leu Ala
1 5 10 15
Pro Thr Gly Ala Val Ser Val Gly Asp Leu Ala Glu His Phe His Val
20 25 30
Thr Thr Glu Thr Val Arg Arg Asp Leu Arg Ile Met Glu Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Leu Gln Arg Val His Gly Gly Ala Ile Ser Pro Glu Pro Met Gly
50 55 60
Thr Ser Pro Pro Arg Leu Lys Pro Ala Leu Gly Lys Gly Met Pro Pro
65 70 75 80
Glu Pro Arg Val Leu Glu Leu Ala Glu Thr Ala Val Ser Leu Ile Thr
85 90 95
Pro Leu Ala Arg Ser Ile Phe Leu Asp Ser Gly Leu Ala Cys Thr Ala
100 105 110
Ile Ala Thr Val Leu Gly Asp Pro Pro Glu Asp Ala Arg Trp Thr Val
115 120 125
Val Thr Ser Ser Pro Gly Ala Val Ile Ala Leu Ser Ala Thr Asp Ala
130 135 140
Thr Ser Thr Val Val Leu His Gly Gln Val His Gly Asn Cys Ser Ser
145 150 155 160
Ile Ile Gly Ser Thr Ala Val Asp Met Ile Ser Gln Leu Arg Ala Asp
165 170 175
Ile Ala Phe Val Glu Val Asp Ala Ile Gln Ser Asp Thr Ser Leu Cys
180 185 190
Thr Phe Phe Pro Glu Thr Ile Pro Ile Lys Gln Ala Met Ile Lys Asn
195 200 205
Ala Ala Phe Thr Val Ala Val Leu Ser Pro Arg Ser Pro Gln Asp Gln
210 215 220
Glu Leu Gln Leu Leu Lys His Pro Phe Ser Thr Leu Ala Asp Phe Asp
225 230 235 240
Ala Leu Val Thr Asp Asp His Thr Leu Asp Phe Pro Val Leu Pro Asp
245 250 255
His Asn Phe Gln Val Val Thr Pro
260
<210> 4
<211> 264
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 4
Met Val Ser Gln Thr Glu Arg Gln His Ala Ile Ala Ser Leu Leu Ala
1 5 10 15
Pro Thr Gly Ala Val Ser Val Gly Asp Leu Ala Glu His Phe His Val
20 25 30
Thr Thr Glu Thr Val Arg Arg Asp Leu Arg Ile Met Glu Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Leu Gln Arg Val His Gly Gly Ala Ile Ser Pro Glu Pro Met Gly
50 55 60
Thr Ser Pro Pro Arg Leu Lys Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Pro Pro
65 70 75 80
Glu Pro Arg Val Leu Glu Leu Ala Glu Thr Ala Val Ser Leu Ile Thr
85 90 95
Pro Leu Ala Arg Ser Ile Phe Leu Asp Ser Gly Leu Ala Cys Thr Ala
100 105 110
Ile Ala Thr Val Leu Gly Asp Pro Pro Glu Asp Ala Arg Trp Thr Val
115 120 125
Val Thr Ser Ser Pro Gly Ala Val Ile Ala Leu Ser Ala Thr Asp Ala
130 135 140
Thr Ser Thr Val Val Leu His Gly Gln Val His Gly Asn Cys Ser Ser
145 150 155 160
Ile Ile Gly Ser Thr Ala Val Asp Met Ile Ser Gln Leu Arg Ala Asp
165 170 175
Ile Ala Phe Val Glu Val Asp Ala Ile Gln Ser Asp Thr Ser Leu Cys
180 185 190
Thr Phe Phe Pro Glu Thr Ile Pro Ile Lys Gln Ala Met Ile Lys Asn
195 200 205
Ala Ala Phe Thr Val Ala Val Leu Ser Pro Arg Ser Pro Gln Asp Gln
210 215 220
Glu Leu Gln Leu Leu Lys His Pro Phe Ser Thr Leu Ala Asp Phe Asp
225 230 235 240
Ala Leu Val Thr Asp Asp His Thr Leu Asp Phe Pro Val Leu Pro Asp
245 250 255
His Asn Phe Gln Val Val Thr Pro
260

Claims (10)

1.发酵生产L-赖氨酸的方法或者提高L-赖氨酸的发酵量的方法，其包括：
（1）改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的NCgl1859基因，使其编码的蛋白质的第78位发生突变，优选发生M78I突变；和，
（2）用步骤（1）改造而得到的谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸。
2.改造获得的谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-赖氨酸或者提高L-赖氨酸的发酵量中的应用，其中，所述改造获得是改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的NCgl1859基因，使其编码的蛋白质的第78位发生突变，优选发生M78I突变，而获得。
3.改造谷氨酸棒杆菌的方法，其包括改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的NCgl1859基因，使其编码的蛋白质的第78位发生突变，优选发生M78I突变。
4.权利要求1-3之任一所述的方法或应用，其中，野生型的NCgl1859基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中的编码部分所示；和/或，野生型的NCgl1859基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.权利要求1-3之任一所述的方法或应用，其中，发生突变的NCgl1859基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中的编码部分所示；和/或，发生突变的NCgl1859基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
6.权利要求3所述的方法改造而获得的谷氨酸棒杆菌。
7.突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
8.多核苷酸，其编码权利要求7所述的蛋白，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO：2的互补序列所示。
9.载体，其包含权利要求8所述的多核苷酸。
10.权利要求7所述的突变蛋白和/或权利要求8所述的多核苷酸和/或权利要求9所述的载体在权利要求1-5之任一所述的方法或应用中的应用。
CN201910408874.3A 2019-05-16 2019-05-16 用改变NCgl1859的细菌发酵生产赖氨酸的方法 Active CN110218749B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910408874.3A CN110218749B (zh) 2019-05-16 2019-05-16 用改变NCgl1859的细菌发酵生产赖氨酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910408874.3A CN110218749B (zh) 2019-05-16 2019-05-16 用改变NCgl1859的细菌发酵生产赖氨酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110218749A true CN110218749A (zh) 2019-09-10
CN110218749B CN110218749B (zh) 2023-05-12

Family

ID=67821276

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910408874.3A Active CN110218749B (zh) 2019-05-16 2019-05-16 用改变NCgl1859的细菌发酵生产赖氨酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110218749B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471693A (zh) * 2019-11-27 2020-07-31 内蒙古伊品生物科技有限公司 一种产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
CN112175894A (zh) * 2020-10-13 2021-01-05 宁夏伊品生物科技股份有限公司 一种产l-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用
RU2794485C1 (ru) * 2021-01-29 2023-04-19 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Новый вариант белка и способ получения L-лизина с его применением

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2310890A1 (en) * 1999-07-07 2001-01-07 Degussa-Huls Aktiengesellschaft L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of l-lysine
CN1898259A (zh) * 2003-12-18 2007-01-17 巴斯福股份公司 用于编码精细化学品的代谢途径的蛋白质的基因变体
US20090081740A1 (en) * 2007-09-26 2009-03-26 Binder Thomas P Production of amino acids from sucrose in corynebacterium glutamicum
CN105754922A (zh) * 2016-04-27 2016-07-13 齐鲁工业大学 一种高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2310890A1 (en) * 1999-07-07 2001-01-07 Degussa-Huls Aktiengesellschaft L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of l-lysine
CN1898259A (zh) * 2003-12-18 2007-01-17 巴斯福股份公司 用于编码精细化学品的代谢途径的蛋白质的基因变体
US20090081740A1 (en) * 2007-09-26 2009-03-26 Binder Thomas P Production of amino acids from sucrose in corynebacterium glutamicum
CN105754922A (zh) * 2016-04-27 2016-07-13 齐鲁工业大学 一种高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LARS GAIGALAT等: "The DeoR-type transcriptional regulator SugR acts as a repressor for genes encoding the phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system (PTS) in Corynebacterium glutamicum", 《BMC MOL BIOL.》 *
VERENA ENGELS等: "The DeoR-Type Regulator SugR Represses Expression of ptsG in Corynebacterium glutamicum", 《J BACTERIOL.》 *
刘冬冬: "强化葡萄糖代谢途径提高L-赖氨酸发酵水平的研究", 《中国知网》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471693A (zh) * 2019-11-27 2020-07-31 内蒙古伊品生物科技有限公司 一种产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
CN111471693B (zh) * 2019-11-27 2022-04-01 内蒙古伊品生物科技有限公司 一种产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
CN112175894A (zh) * 2020-10-13 2021-01-05 宁夏伊品生物科技股份有限公司 一种产l-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用
CN112175894B (zh) * 2020-10-13 2023-01-06 宁夏伊品生物科技股份有限公司 一种产l-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用
RU2794485C1 (ru) * 2021-01-29 2023-04-19 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Новый вариант белка и способ получения L-лизина с его применением

Also Published As

Publication number Publication date
CN110218749B (zh) 2023-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106367432B (zh) 发酵生产l‑赖氨酸的方法及改造的棒杆菌
CN106459977B (zh) 新的启动子及其用途
CN108026539B (zh) 新型启动子及其应用
JP6873244B2 (ja) 新規な５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ及びこれを用いた５’−イノシン酸の製造方法
CN110195087A (zh) 用改变ppc基因的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法
CN110248955A (zh) 新型多肽及使用其产生imp的方法
CN107002027A (zh) 用于生产l‑精氨酸的棒状杆菌属微生物和使用其的l‑精氨酸生产方法
CN113667682B (zh) Yh66-rs11190基因突变体及其在制备l-缬氨酸中的应用
CN110423734A (zh) 具有增强的l-赖氨酸生产力的微生物和用于通过使用该微生物产生l-赖氨酸的方法
JP6646075B2 (ja) Ｌ−リジンを生産する微生物及びそれを用いたｌ−リジン生産方法
CN109517751A (zh) 发酵生产l-氨基酸的方法
CN104619852A (zh) 用改变乌头酸酶基因和/或其调控元件的细菌发酵生产l-赖氨酸的方法
TW202035686A (zh) 變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶及使用該轉移酶製備嘌呤核苷酸的方法
CN110218749A (zh) 用改变NCgl1859的细菌发酵生产赖氨酸的方法
JP2024505808A (ja) 増強されたｌ－グルタミン酸生産能を有する菌株及びその構築方法と応用
CN110079566A (zh) 用改变ppc启动子的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法
CN107974473A (zh) 谷氨酸的发酵生产及后处理
CN106701649B (zh) 生产l-谷氨酰胺的菌株和生产l-谷氨酰胺的方法
CN111471693B (zh) 一种产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
CN110846333B (zh) 一种deoB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用
CN111961635A (zh) 一种产l-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用
CN114181288B (zh) 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质
CN114349831B (zh) aspA基因突变体、重组菌及制备L-缬氨酸的方法
CN106318964B (zh) 棒杆菌发酵生产l‑赖氨酸的方法及其启动子改造
WO2022143639A1 (zh) 一种改造基因bbd29_11265产l-谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant