CN102146344A - 优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及外源基因表达和生物制氢技术，优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法。现有技术外源豆血红蛋白基因hemH和lba在莱茵衣藻叶绿体中的表达效率低，影响莱茵衣藻产氢量的提高。本发明公开了一种对豆血红蛋白基因hemH和lba的密码子偏向性分别优化的方法，并将密码子优化后的hemHc和lbac基因转入莱茵衣藻叶绿体中表达。本发明的优点是：显著提高了外源重组蛋白的表达量，外源豆血红蛋白hemH和Lba在莱茵衣藻叶绿体中的表达量提高6.8倍；莱茵衣藻产氢量比转未优化密码子的hemH和lba基因的莱茵衣藻提高22％；本发明适用于具有密码偏向性的更多物种的外源基因表达调控。

Description

优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法

技术领域

本发明涉及外源基因表达和生物制氢技术，具体地说是一种优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法。

背景技术

光合生物制氢是未来清洁能源的重要来源之一，包括莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)在内的许多微型绿藻和蓝藻可以在缺氧的条件下诱导细胞内的氢酶(H₂ase)基因表达，将光合作用中产生的H⁺和e^-合成H₂，释放到细胞外。这项技术是利用太阳能生产氢气的理想模式：莱茵衣藻生长速度快，培养成本低，氢酶活性高，是极有开发潜力的微藻光合制氢藻种。但是，氢酶对氧气极其敏感，很容易受氧气的抑制而失去活性，而氧气又是衣藻光合作用的主要产物，这一对矛盾限制了衣藻产氢技术的应用。为了提高衣藻光合产氢的效率，需要尽可能的降低衣藻细胞内的氧气含量或者提高氢化酶的氧耐受性。

豆科植物根瘤中的固氮酶与氢酶有相似的特性，也对氧气敏感，但是根瘤中的固氮酶却有很高的固氮活性，这与根瘤细胞中含有大量的豆血红蛋白leghemoglobin，简称Lb，有着密切的关系。豆血红蛋白有两个亚基构成，一个是球蛋白亚基，由豆科植物合成；另一个是血红素辅基，由共生的根瘤菌合成，两个亚基结合成为有活性的豆血红蛋白。豆血红蛋白具有与氧气可逆结合、降低细胞内氧浓度和调节呼吸作用的特性，既能维持根瘤细胞内较低的氧气含量，又能保障呼吸作用需氧和固氮需要的能量。中国专利200380107352.7和02138702.8分别公开了利用表达豆血红蛋白改变植物贮藏储备物含量和提高植物抗涝能力。生物发酵工程的已有技术中也有应用其它血红蛋白体外重组表达而使产量提高的报导。

在植物细胞内，尤其是叶绿体中，存在着血红素辅基合成的前体，即可以通过叶绿素合成途径的原扑啉在根瘤菌(Bradyrhizobium Japonicum)亚铁螯合酶(ferrochelatase)催化下合成血红素辅基(Sangwan和O’Brain，1991；Santana等，1998)。本发明人曾将大豆血红蛋白球蛋白亚基lba基因转入莱茵衣藻叶绿体中表达使转基因莱茵衣藻产氢量提高了50％(中国发明专利申请号201010107922.4)；将根瘤菌亚铁螯合酶基因hemH与lba基因共同转入莱茵衣藻叶绿体中表达使转基因莱茵衣藻产氢量提高了4倍(中国发明专利申请号201010115015.4)。

莱茵衣藻叶绿体基因表达的密码子具有明显的腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)偏向性(Nakamura et al.，2000)，2002年，Franklin等在莱茵衣藻叶绿体中成功表达了密码子优化的绿色荧光蛋白基因GFP基因，表达量提高了80倍。随后在2003年和2004年Mayfield等将密码子优化后的报告基因luxCt转入莱茵衣藻叶绿体，该基因得到了成功表达并具有活性。1991年Goldschmidt-Clermont构建的aadA基因表达原件之所以能用于莱茵衣藻叶绿体转化筛选的标签是因为z在构建时考虑了它的密码子偏向性与衣藻叶绿体中密码子的偏向性一致。Franklin和Mayfield 2004年指出莱茵衣藻的核基因组也具有密码子的偏向性。2004年，Gustafsson等提出其它的一些生物体包括原核(Dos和Wernisch，2003)和真核生物(Kanaya等，2001)也具有密码子的偏向性。2005年，Liu等指出在高等植物中也存在密码子的偏向性，同年Lavner和Kotlar指出人类基因组也存在密码子的偏向性。因此，除了启动子、内含子和5’UTRs和3’UTRs之外，在外源基因的表达中密码子偏向性也是一个重要的调控因子。

因此发明一种利用密码偏向性进行密码子优化，并将优化后的hemHc基因和lbac基因转入莱茵衣藻的叶绿体内表达，提高豆血红蛋白基因表达量和莱茵衣藻产氢量的方法是十分重要的。

本发明首次对豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和大豆血红蛋白球蛋白亚基基因lba按照衣藻叶绿体基因表达的A、U密码偏向性进行密码子优化，并将优化后的hemHc基因和lbac基因转入莱茵衣藻的叶绿体内表达，结果使重组蛋白hemH和Lba的表达量提高了6.8倍，使转基因莱茵衣藻的产氢量进一步提高了22％。本发明方法解决了外源基因在莱茵衣藻叶绿体中表达量低的技术难题，具有实用性，而且为进一步利用豆血红蛋白特性提高衣藻产氢的生物工程技术提供理论和实验基础。随着生物制氢技术的发展，本发明将显现出越来越大的实用性和重要性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对豆血红蛋白基因hemH和lba的密码子偏向性进行优化的方法，使之更适合于在莱茵衣藻叶绿体中表达，提高外源基因在莱茵衣藻叶绿体中表达量和提高莱茵衣藻及其它微藻制氢产量的方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法，步骤如下：

(1)莱茵衣藻培养：

A、选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849；

B、培养莱茵衣藻藻种：

(a)正常培养条件：温度25±1℃；日光灯光照强度100～200微摩尔光量子/平方米·秒；50～100ml TAP培养基液体培养，初始pH7.2，水平摇床转速100～130rpm，每5～6天1％接种继代培养；

(b)固体平板TAP培养基：琼脂粉1.5％；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；

C、产氢培养条件：在缺硫培养基中进行，把TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装在培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，橡皮塞密闭；黑暗条件下培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50～100微摩尔光量子/平方米·秒，温度25±1℃；每24小时进行气体成分和含量检测一次；

D、气相色谱仪测定氢气和氧气含量：分子筛5×1/8，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气，柱温50℃，进样温度200℃，热导检测温度300℃；

(2)豆血红蛋白hemHc基因和lbac基因的密码子优化和合成：

A、从GenBank中调取序列号为M92427的慢生大豆根瘤菌hemH基因序列和序列号为V00453的大豆lba基因序列；

B、将豆血红蛋白hemH基因和lba基因的密码子对应的DNA核苷酸序列中第三位碱基对应的DNA核苷酸序列中的鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)改为腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)；分别在hemHc基因的5’端和3’端加上限制性内切酶SacII的酶切位点序列；在lbac基因的5’端和3’端加上限制性内切酶Sma I和Sac I的酶切位点序列；

C、将优化后的hemHc基因和lbac基因的核苷酸序列以及添加的相应的限制性内切酶酶切位点核苷酸序列进行核苷酸序列合成；

(3)hemHc基因和lbac基因的扩增：

A、以步骤(2)C合成的hemHc基因和lbac基因核苷酸序列为模板，进行聚合酶链式反应，分别扩增hemHc基因和lbac基因；反应条件：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性30s，hemHc基因58℃，lbac基因59℃；退火30s，72℃延伸1.5min；30个循环；72℃延伸15min；反应产物分别纯化回收，用于测序鉴定和下一步莱茵衣藻叶绿体转化载体的构建；

B、PCR扩增、测序鉴定以及hemHc基因和lbac基因转录表达检测的特异性引物：

hemHc基因的特异性引物为：

hemHc-P1：5’-

atgtcaacagcagctccaaatgaa-3’，斜体表示SacII酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；

hemHc-P2：5’-tatatccaaccttgaagttcacgta-3’，斜体表示SacII酶切位点序列；

lbac基因的特异性引物为：

Lbac-P1：5’-c 

ttatgcttttttaatagctgctgc-3’，斜体表示SmaI酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；

Lbac-P2：5’-tcc 

atggttgcttttactgaaaaacaa-3’，斜体表示SacI酶切位点序列；

(4)莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建：

A、将步骤(3)PCR扩增并纯化回收的hemHc基因片段和lbac基因片段分别用限制性内切酶SacII酶切和用SmaI和SacI酶切；将纯化的lbac基因片段通过上述酶切位点用T4 DNA连接酶连接质粒cg401-1中的aadA 基因之后，形成aadA-lbac融合基因，得到载体cg401-1-lbac；用SacII酶切位点将hemHc基因用T4DNA连接酶连入到质粒cg401-1-lbac中aadA基因之后和lbac基因之前，形成aadA-hemHc-lbac融合蛋白，构建得到衣藻叶绿体表达载体cg401-1-hemHc-lbac；转化大肠杆菌DH5α，用于保存、鉴定和大量制备质粒DNA；

(4)莱茵衣藻叶绿体的转化：

A、取100ml对数期中后期的莱茵衣藻，25℃，3000rpm离心5min收集藻细胞，用新鲜TAP洗三次，涂于新鲜TAP固体平板上；光照100微摩尔光量子/平方米·秒，25±1℃条件下培养24小时；基因抢轰击转化；真空度9.48192×10⁴Pa，轰击距离9cm，氦气压力7.584236×10⁶Pa，金粉子弹经限制性内切酶EcoRI酶切质粒cg401-1-hemHc-lbac DNA包裹，金粉子弹颗粒直径1.0微米；

B、转化后的衣藻在光照和25±1℃条件下，过渡培养18h，用TAP液体培养基冲洗，涂布于含壮观霉素100μg/ml的TAP固体选择培养基上，25±1℃，100微摩尔光量子/平方米·秒连续光照，培养约7～15天；取有抗性的单藻落分别在选择培养基上多次继代培养；分别进行产氢培养，并检测产氢量和耗氧量；

(5)分析转基因莱茵衣藻中hemHc-lbac基因的整合及其表达：

A、hemHc-lbac基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的检测：

a、hemHc基因和lbac基因同源重组交换整合到莱茵衣藻叶绿体DNA，以转基因衣藻总DNA为模板的PCR产物为5254bp；未整合的PCR产物是3732bp；与莱茵衣藻叶绿体DNA结合的引物是cpDNA-P1：5’

-aacatgctaagtttacaagcccgaag-3’；cpDNA-P2：5’

-gtctttatgagccgtccccgaag-3’；

b、取对数生长后期的衣藻培养液，4℃低速离心收集，加350μl DNA提取液：0.1mol/L氯化钠，50mmol/L乙二胺四乙酸，20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.0，重悬沉淀；加入25μl 10mg/ml的蛋白酶K及25μl 20％十二烷基硫酸钠，混匀37℃水浴12小时，冰上冷却；加入200μl 5mol/L醋酸钾，静置离心；上清液中加入等体积25∶24∶1的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，总DNA用无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤，干燥后溶于30μl三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液；

B、转基因莱茵衣藻中hemHc基因和lbac基因转录的检测：

取对数生长期中期的莱茵衣藻，室温3000rpm离心5分钟收集藻细胞，提取总RNA，反转录cDNA；利用hemHc基因和lbac基因的特异性引物和扩增hemHc基因和lbac基因所述的PCR条件扩增，进行hemHc基因和lbac基因转录水平的检测；

C、转基因莱茵衣藻中重组蛋白hemH和Lba表达量的检测：

a、按下列配比制备蛋白提取缓冲液：50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH 8.3含1％曲拉通；上样缓冲液：0.25M三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.0；25％甘油；7.5％十二烷基硫酸钠；0.25mg ml^-1溴酚兰；12.5％(v/v)β-巯基乙醇；

b、取产氢培养的莱茵衣藻培养液，室温，3000rpm离心5min收集藻细胞，用250μl蛋白提取缓冲液悬浮，加入2μl β-巯基乙醇，液氮冻融三次；4℃条件下离心20min；取200μl蛋白上清液加入100μl上样缓冲液，用10％的分离胶和5％的浓缩胶进行凝胶电泳，转聚偏氟乙烯膜；分别用抗hemH多克隆抗体和抗Lba多克隆抗体做免疫杂交检测，再对HRP标记的抗体进行化学发光检测；

(6)分析重组豆血红蛋白hemH-Lba对莱茵衣藻生长的影响：

A、双光束紫外可见光分光光度计检测莱茵衣藻在750nm处的吸光度；

B、取藻液3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95％乙醇溶液，混合均匀，室温避光放置20min，4℃，12000rpm离心10min；取上清，测定665纳米吸光度值及649纳米吸光度值的吸光值；

C、计算总叶绿素的含量，单位mg/L：

叶绿素Chl mg/L＝20.04×OD₆₄₉+6.10×OD₆₆₅；

(7)分析重组豆血红蛋白hemH-Lba对莱茵衣藻产氢培养的耗氧量和产氢量的影响：

A、黑暗呼吸耗氧和缺硫培养基中耗氧量以及产氢量的检测：

B、快速充氩气耗氧和缺硫培养基中产氢量的检测。

所述的优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法，TAP培养基为三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐培养基。

本发明的要点是对豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球蛋白亚基基因lba表达的密码子按莱茵衣藻叶绿体基因密码的A、U偏向性进行修改，并在外源基因表达和莱茵衣藻产氢中的应用及其实施方法。

本发明证明了密码子优化后的豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemHc和球蛋白亚基基因lbac在莱茵衣藻的叶绿体中表达以后，重组蛋白hemH-Lba的表达量提高了6.8倍，使转基因衣藻产氢培养体系中的氧气含量快速度降低，并维持在较低的氧气含量水平，使产氢量进一步提高了22％，总产氢量比未转基因的莱茵衣藻提高了约4.9倍左右。这种结果及其用途是人们在外源基因表达调控和生物制氢领域一直寻求和难以做到的。

本发明提供了一个在莱茵衣藻叶绿体中表达的密码子优化的豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemHc和球蛋白亚基基因lbac的转基因莱茵衣藻。

按照本发明，叶绿体中表达了密码子优化的豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemHc和球蛋白亚基基因lbac的转基因莱茵衣藻，其外源重组蛋白hemH和Lba的表达量明显提高，其产氢培养体系中氧气含量明显降低，产氢量明显提高。

在本发明中，密码子优化的hemHc基因和lbac基因分别是根据慢生大豆根瘤菌的亚铁螯合酶基因hemH和大豆豆血红蛋白球蛋白亚基基因lba进行密码子优化的，它们的原始核苷酸序列和氨基酸序列是已知的，其基因库(NCBI GenBank)序列号分别是M92427和V00453。本领域的技术人员可以通过该基因序列中的数据信息进行检索得到该hemH和lba基因的信息。本发明优选具有该序列号信息所示的核苷酸序列，更优选的是编码具有该序列号信息所示的氨基酸序列的基因。在本发明的具体实例中，特别提到的密码子优化的豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemHc和球蛋白亚基基因lbac是根据慢生大豆根瘤菌的亚铁螯合酶基因hemH和大豆豆血红蛋白球蛋白亚基基因lba的原始核苷酸序列进行密码子优化后分别合成于生物公司，本发明的具体实例中是合成于上海生工公司。可选择地、利用已有的含有该基因的质粒中提取该目的基因。

在本发明中，表达载体除了上面特别提到的密码子优化的豆血红蛋白hemHc基因和lbac基因，还包括启动子、终止子，选择性标记基因、增加转录和表达稳定性的基因片段以及能够使目的基因整合到宿主细胞DNA上并稳定表达的基因片段等，这些都是在植物和藻类转基因工作中常用的基因表达元件。在本发明的具体实例中，用于豆血红蛋白hemHc基因和lbac基因的表达载体包括psbB启动子和终止子、3’-rbcL转录稳定性增强元件、aadA筛选性标记基因和帮助该表达载体整合到莱茵衣藻叶绿体DNA上的含atpB基因序列的cpDNA-1序列区域和cpDNA-2序列区域。

本发明提供的启动子、终止子、增加转录稳定性的基因片段和帮助目的基因整合到叶绿体DNA上的基因片段的种类不受限制，只要能够在hemHc基因和lbac基因导入并整合到莱茵衣藻叶绿体DNA上并能将该基因稳定表达就可以。优选是psbB启动子和终止子、3’-rbcL基因序列以及含atpB基因序列的基因序列片段等莱茵衣藻叶绿体内源基因表达调控元件。

本发明指的转化包括基因枪转化法和电击转化法，更优选的是基因枪转化法。在利于表达载体导入的条件下，用包被表达载体DNA的金粉轰击衣藻细胞，将含有包括密码子优化的豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemHc和球蛋白亚基基因lbac的表达载体导入莱茵衣藻细胞的叶绿体中。

本发明通过抗生素的选择性筛选出表达豆血红蛋白亚铁螯合酶hemH和Lba的转基因莱茵衣藻，并进一步在抗生素平板上多次继代培养，增加目的基因在转基因莱茵衣藻叶绿体DNA中的整合率；筛选出重组蛋白hemH-Lba表达量高和产氢培养体系中氧气含量低、产氢量高的转基因莱茵衣藻单克隆。

本发明表达理解为将起始DNA或RNA的遗传信息转移至基因产物多肽或蛋白质中，即本发明中的豆血红蛋白亚铁螯合酶和球蛋白亚基。

本发明转基因理解为将遗传信息转移至生物体，特别是莱茵衣藻。这意味着包括引入所有对熟练工作人员所公知信息的方法，例如粒子轰击、电穿孔、化学介导或农杆菌介导的摄入、显微注射等。遗传信息可引入细胞，例如以DNA、RNA、质粒或以任何其它方式，并且通过重组掺入宿主基因组的方式。为了本发明目的顺利实现，转基因莱茵衣藻是经过遗传修饰的莱茵衣藻。

本发明通过按照莱茵衣藻叶绿体基因密码子A、U偏向性来优化豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球蛋白亚基lba基因的密码子，使其在莱茵衣藻叶绿体中表达，提高外源重组蛋白hemH-Lba的表达量和使转基因莱茵衣藻的产氢能力提高。

本发明所述的在其叶绿体中表达密码子优化的豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemHc和球蛋白亚基lbac基因的转基因莱茵衣藻，其分类命名为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)cg401-1-hemHc-lbac。

本发明所述的转基因莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)cg401-1-hemHc-lbac，其细胞总可溶性蛋白中外源重组蛋白hemH-Lba的表达量明显增加。

本发明所述的转基因莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)cg401-1-hemHc-lbac，其密闭培养体系中的氧气含量下降地明显比未转基因莱茵衣藻和未优化密码子的转基因莱茵衣藻的快，并且氧气含量能维持较低水平，产氢量明显增加。

本发明所述的方法也适用于包括莱茵衣藻在内的其它微型绿藻的外源基因表达调控和产氢能力的提高。

本发明的创造性在于世界上首次通过修改密码偏向性使豆血红蛋白基因在莱茵衣藻叶绿体中的表达量显著提高；首次在世界上提供了按照莱茵衣藻叶绿体基因表达的密码偏向性修改豆血红蛋白基因hemH和lba密码子的模式和方法；首次提供了一个在叶绿体中表达豆血红蛋白hemHc基因和lbac基因和增加产氢量的转基因莱茵衣藻藻种。

本发明目的生物体是具有更多密码偏性的物种，如具有光合活性的产氢微藻和需要呼吸提供能量产氢的微藻或微生物，优选的藻类是莱茵衣藻。

本发明目的基因是具有更多医药、生物能源、环境保护等特殊用途的外源基因。

本发明首次对豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球蛋白亚基基因lba的密码子按照莱茵衣藻叶绿体基因表达的密码子A、U偏向性进行优化，应用于莱茵衣藻及其它具有密码偏向性的多种产氢微藻，使得外源重组蛋白的表达量明显提高，也使产氢微藻的产氢量得到进一步提高，具有创造性和实用性。本发明方法是外源基因表达调控的成功范例；是制备人类迫切需要的清洁生物能源的基础；本发明对未来的生物技术、能源技术、环境技术和医药技术的发展都具有重要意义。

本发明具有如下优点：

1、显著提高了外源重组蛋白的表达量。

2、进一步降低绿藻产氢培养体系中氧气含量和提高生物产氢量。

3、本发明方法适用于具有密码偏向性的更多物种的外源基因表达调控。

附图说明

图1为莱茵衣藻叶绿体表达载体cg40-1-1-hemHc-lbac的酶切鉴定电泳图。图中：1为分子标记λHindIII图；2为质粒cg40-1-1-hemHc-lbacDNA；3为质粒cg40-1-1-hemHc-lbac DNA经SpeI/SacII酶切图；4为分子标记DL2000。

图2为叶绿体转化hemHc-lbac基因的莱茵衣藻在含100mg.L^-1壮观霉素的TAP平板上筛选图。平板上A部分为阴性对照组，即未转基因的莱茵衣藻cc849；B部分为阳性对照组，即转化载体cg401-1的莱茵衣藻；C部分为转化hemHc-lbac基因的莱茵衣藻。

图3为莱茵衣藻叶绿体中转化hemHc基因和lbac基因的PCR鉴定图。图A为以总DNA为模板的PCR电泳图；图B为以cDNA为模板的PCR电泳图。

图4为对叶绿体中转化hemHc和lbac基因的莱茵衣藻中hemH-Lba表达量进蛋白印记杂交(Western Blot)检测图。图A为TAP培养基中培养的样品，图B为在TAP-S培养基中且密闭培养的样品。

图5为叶绿体中转化hemHc和lbac基因的莱茵衣藻与未转基因莱茵衣藻cc849的吸光值比较图。

图6为叶绿体中转化hemHc和lbac基因的莱茵衣藻与未转基因莱茵衣藻cc849的叶绿素浓度比较图。

图7为叶绿体中转化hemHc和lbac基因的莱茵衣藻黑暗呼吸耗氧和产氢情况图。

图8为叶绿体中转化hemHc和lbac基因的莱茵衣藻在缺硫培养基中充氩气快速耗氧后培养2-18小时与未转基因莱茵衣藻cc849的产氢量比较图。

图9为叶绿体中转化hemHc和lbac基因的莱茵衣藻在缺硫培养基中充氩气快速耗氧后培养1-6天与未转基因莱茵衣藻cc849的产氢量比较图。

具体实施方式

实施例1：

莱茵衣藻培养：

莱茵衣藻生长速度快、培养成本低、氢化酶活性高，是微藻光合制氢的代表物种。为了使转基因容易操作，本发明优选细胞壁缺欠型的莱茵衣藻藻种cc849。

①莱茵衣藻正常培养条件：按照Harris主编的《The ChlamydomonasSourcebook：a comprehensive guide to biology and laboratory use.NewYork：Academic Press.1989》，优选条件25±1℃，日光灯光照强度(100～200μmol photons m^-2s^-1)；液体培养是在50～100mlTris-Acetate-Phosphate(TAP)培养基，初始pH7.2，水平摇床转速100～130rpm，每5～6天1％接种继代培养；固体TAP平板培养基含1.5％的琼脂粉，藻种的保存和纯化是挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上，每3周继代一次。

②莱茵衣藻产氢培养条件：按照Melis等(Plant Physiology.2000，122：127-136)的方法，莱茵衣藻的产氢培养是在缺硫培养基(TAP-S)中进行。缺硫培养基(TAP-S)是把正常的TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔浓度的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌。本发明为了将来在工业化生产中应用，有目的的简化了其产氢培养的操作步骤：即将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用TAP-S培养基洗3次，然后悬浮在TAP-S或者含有不同浓度硫酸盐的TAP-S培养基内，分别装在50ml的培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，用翻口橡皮塞塞紧培养瓶密闭培养。放在黑暗条件下培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50～100μmol photons m^-2s^-1，温度25±1℃。每24小时用微量气密进样器抽取瓶中气体，进行气体成分和含量检测。

③按照冉春秋等(高等学校化学学报，2006，27：62-66.)的方法用GC测定氢气和氧气含量。气相色谱仪为Agilent Technologies GC7890A，USA，分子筛5×1/8(OD)，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气。进样体积0.5ml，柱温50℃，进样温度200℃，热导检测温度300℃。用本领域技术人员公知的外标法计算氢气和氧气体积。

实施例2：

豆血红蛋白hemH基因和lba基因的密码子优化、合成和PCR扩增：

从GenBank中调取序列号为M92427的慢生大豆根瘤菌hemH基因序列和序列号为V00453的大豆lba基因序列；

莱茵衣藻叶绿体基因表达的密码子具有明显的腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)偏向性，尤其是密码子的第三位碱基具有明显的A、U偏向性。按照编码氨基酸密码子的兼并性和在不改变原有基因氢基酸序列的前提下，分别对豆血红蛋白hemH基因和lba基因的密码子进行修改，将原密码子对应的DNA核苷酸序列中、尤其是密码子的第三位碱基对应的DNA核苷酸序列中原来的鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)改为腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)，如附件1和附件2所示。分别将优化后的基因命名为hemHc和lbac，且分别在hemHc基因的5’端和3’端加上限制性内切酶SacII的酶切位点序列，在lbac基因的5’端和3’端加上限制性内切酶Sma I和Sac I的酶切位点序列。

分别将上述优化后的hemHc基因和lbac基因的核苷酸序列以及添加的相应的限制性内切酶酶切位点核苷酸序列送上海生工公司进行核苷酸序列合成。

hemHc基因和lbac基因的扩增：

以上述合成的hemHc基因和lbac基因核苷酸序列为模板，进行聚合酶链式反应PCR扩增相应的hemHc基因和lbac基因，反应条件为：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性30s，58℃(hemHc)或59℃(lbac)退火30s，72℃延伸1.5min；共30个循环；72℃延伸15min；反应产物纯化回收，用于测序鉴定和下一步莱茵衣藻叶绿体转化载体的构建；

用于PCR扩增、测序鉴定以及hemHc基因和lbac基因转录表达检测的特异性引物：

hemHc基因的特异性引物为：

hemHc-P1：5’-

atgtcaacagcagctccaaatgaa-3’，斜体表示SacII酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；

hemHc-P2：5’-

tatatccaaccttgaagttcacgta-3’，斜体表示SacII酶切位点序列。

lbac基因的特异性引物为：

Lbac-P1：5’-c 

ttatgcttttttaatagctgctgc-3’，斜体表示SmaI酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；

Lbac-P2：5’-tcc 

atggttgcttttactgaaaaacaa-3’，斜体表示SacI酶切位点序列。

实施例3：

莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建：

通过本领域熟练技术人员所公知的标准方法(Sambrook等，MolecularCloning.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press.1998)和Vaistij等对莱茵衣藻叶绿体表达载体cg40描述的方法(The PlantJournal，2000，21(5)：469-482)进行载体构建。分别用限制性内切酶SmaI和SacI酶切上述克隆得到的lbac基因片段和载体cg401-1，将纯化的lbac基因片段通过上述两个酶切位点用T4 DNA连接酶连接在质粒cg401-1中的aadA基因之后形成aadA-lbac融合基因，得到载体cg401-1-lbac，再用SacII酶切位点将hemHc基因用T4DNA连接酶连入到质粒cg401-1-lbac中aadA基因之后和lbac基因之前，形成aadA-hemHc-lbac融合蛋白，构建得到衣藻叶绿体表达载体cg401-1-hemHc-lbac，转化大肠杆菌DH5α，用于保存、鉴定和大量制备质粒DNA，图1。

实施例4：

莱茵衣藻叶绿体的转化：

通过Boynton等(Science，1988，240(4858)：1534-1538)的方法对莱茵衣藻叶绿体进行转化。取100ml生长至对数期中后期(约4-5×10⁶)的莱茵衣藻，25℃下3000rpm离心5min收集藻细胞，用新鲜TAP洗三次，涂于新鲜TAP固体平板上，在光照100μmol m^-2s^-1和25±1℃条件下培养1天，用基因抢(

Model：PDS1000/He Biolistic particledelivery system)进行轰击转化。参数为：真空度9.48192×10⁴Pa，轰击距离9cm，氦气压力7.584236×10⁶Pa，金粉颗粒直径1.0μm。金粉子弹用经EcoRI酶切的线性化质粒cg401-1-hemHc-lbac DNA包裹。

转化后的衣藻在25℃和光照下经过18h过渡培养后，用TAP液体培养基冲洗，涂布于含壮观霉素100μg/ml的TAP固体选择培养基上，在25℃和100μmol·m^-2·s^-1的连续光照条件下，培养7-15天，挑取有抗性的单藻落分别在选择培养基上多次继代培养，见图2中C。然后分别进行产氢培养并检测产氢量和耗氧量，使用上海基量标准气体有限公司生产的标准品定义所测气体的组成和含量。

实施例5：

分析转基因莱茵衣藻中hemHc-lbac基因的整合及其表达：

①hemHc-lbac基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的检测：

测定hemHc-lbac基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的合适方法是实施下文所述的PCR法，如果hemHc基因和lbac基因通过同源重组交换的方式整合到莱茵衣藻叶绿体DNA上，则以转基因衣藻总DNA为模板的PCR产物应该是5254bp，而未整合的PCR产物应该是3732bp，图3A。其中与莱茵衣藻叶绿体DNA结合的引物是cpDNA-P1：5’-aacatgctaagtttacaagcccgaag-3’；cpDNA-P2：5’-gtctttatgagccgtccccgaag-3’。

通过Rochaix和Erickson的方法(Trends in Biochemistry Science，1988，13：56-59)提取衣藻总DNA。取10ml处于对数生长后期的衣藻培养液，4℃低速离心收集，加350μl NET(0.1mo l/L NaCl，50mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)重悬沉淀，加入25μl 10mg/ml的蛋白酶K(Proteinase K)及25μl 20％SDS，混匀并于37℃水浴过夜，冰上冷却，加入200μl 5mol/L KAc，冰上静置后离心，上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，总DNA用无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤，干燥后溶于30μl TE缓冲液，用于上述PCR检测。

②转基因莱茵衣藻中hemHc基因和lbac基因转录的检测：

检测hemHc基因和lbac基因在转基因莱茵衣藻中是否转录的合适方法是按照本领域熟练技术人员所公知的反转录PCR的标准方法(Sambrook等，Molecular Cloning.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press.1998)或参照上述的hemHc基因和lbac基因PCR扩增方法的实施部分。莱茵衣藻的取样是取对数生长期中期的莱茵衣藻1ml左右，室温3000rpm离心5分钟收集藻细胞。按照试剂盒制造商的产品说明书(QIAGEN，Promega)提取莱茵衣藻的总RNA和按照Promega AMV RT Protocol说明书合成cDNA，利用上述hemHc基因和lbac基因的特异性引物和所述的PCR条件进行扩增，进行hemHc基因和lbac基因转录水平的检测，图3B。分别扩增到一条1000bp左右的片断和一条148bp左右的片断，将PCR产物回收纯化，送基因测序公司证明所得核苷酸序列正确。

③转基因莱茵衣藻中重组蛋白hemH-lba表达量的检测：

参照Hemschemeier等(Planta，2008，227：397-407)的方法提取莱茵衣藻总蛋白和进行Western blot检测。取30ml进行产氢培养的莱茵衣藻培养液，快速室温3000rpm离心5min收集藻细胞。用250μl蛋白提取缓冲液(50mM Tris/HCl pH 8.3，1％Triton-X 100)悬浮，加入2μl β-巯基乙醇，液氮冻融三次；在4℃，14000g离心20min，取100μg的蛋白上清液加上样缓冲液(0.25M Tris-HCl，pH 8.0；25％glycerol；7.5％SDS；0.25mg ml-1 bromophenolblue；12.5％(v/v)2-mercaptoethanol)于10％的分离胶和5％的浓缩胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，转PVDF膜(Millipore，USA)，一抗分别用抗hemH多克隆抗体和抗大豆Lba多克隆抗体(上海中科蛋白抗体制备公司)进性免疫杂交检测，按照ECL Plus(Amersham公司)说明书对HRP标记的抗体进行化学发光检测，见图4。结果表明，无论在正常培养条件下(图4，A)还是在缺硫无氧的产氢条件下(图4，B)，重组蛋白hemH-Lba的表达量都提高了6.8倍。而且产氢培养条件下，重组蛋白hemH-Lba的最大表达量出现在产氢培养的第5天，这个时间与转基因衣藻的最大产氢速率出现的时间一致，说明重组hemH-Lba对转基因莱茵衣藻的耗氧和产氢产生影响。

对于蛋白质的定量和SDS-PAGE凝胶电泳以及western blot实验中的转膜、封闭、杂交、洗膜、显影等操作技术均为本领域熟练技术人员所公知的标准方法(Sambrook等，Molecular Cloning.New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press.1998)或按照试剂盒制造商说明书(Bio-RadBradford kit和GE Healthcare)操作。

实施例6：

分析重组豆血红蛋白hemH-Lba基因对莱茵衣藻生长的影响：

本发明通过测量转基因藻前后莱茵衣藻的细胞数和叶绿素含量的变化来比较在叶绿体中表达豆血红蛋白亚铁螯合酶和球蛋白亚基Lba对莱茵衣藻生物量的影响。藻细胞数和叶绿素含量的测定参照Harris主编的《TheChlamydomonas Sourcebook：a comprehensive guide to biology andlaboratory use.New York：Academic Press.1989》方法。莱茵衣藻在750nm处的吸光度(OD₇₅₀)与莱茵衣藻的细胞数正相关，用TU-1901双光束紫外可见光光度计直接检测培养的莱茵衣藻在750nm处的吸光度作为莱茵衣藻细胞数的生长指标。叶绿素含量的测定是取1ml藻液，3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95％乙醇溶液，混匀，室温避光放置20min，4℃下12000rpm离心10min，取上清，按比例稀释后，测定OD₆₆₅及OD₆₄₉的吸光值，根据下列公式计算出总叶绿素的含量，单位是mg/L。

叶绿素Chl(mg/l)＝20.04×(OD₆₄₉)+6.10×(OD₆₆₅)。

结果表明在叶绿体中表达hemHc基因和lbac基因未使转基因莱茵衣藻的生长受到抑制，见图5、图6。

实施例7：

分析重组豆血红蛋白hemH-Lba对莱茵衣藻产氢培养的耗氧量和产氢量的影响：

①在黑暗呼吸耗氧的缺硫培养基中对耗氧量和产氢量的检测：

在缺硫培养基中，莱茵衣藻PSII的活性受到抑制，但是呼吸作用不受影响。在密封条件下莱茵衣藻液体培养基中的氧气含量因为呼吸消耗而快速下降，致使液体培养基中出现缺氧状态，诱导莱茵衣藻氢酶表达而开始产生氢气，通过检测密封瓶子上方封存的空气中的氧气和氢气含量变化情况就能反映出莱茵衣藻的耗氧和产氢情况，图7。结果表明转hemHc-lbac基因的莱茵衣藻的培养体系氧气消耗量和氢气产量都比未转基因衣藻cc849和转未优化hemH-lba基因的要高。转hemHc-lbac基因的氧气含量由最初黑暗处理后一天的5.2％下降到产氢培养第六天的2.1％，而转未优化hemH-lba基因衣藻的由6.5％下降到3.1％，未转基因衣藻cc849由10.1％下降到4.4％。转hemHc-lbac基因莱茵衣藻的产氢最大速率从第三天持续到第五天，约为23.5μl mg^-1chl h^-1，比转未优化hemH-lba基因衣藻在第四和五天的最高速率22.0μl mg^-1chl h^-1要高，比未转基因衣藻cc849的4.0μl mg^-1chl h^-1更高。同时氢气的积累量是hemHc-lbac基因莱茵衣藻为2.2ml每瓶，转未优化hemH-lba基因衣藻为1.8ml每瓶，而未转基因cc849仅为0.4ml每瓶，图7。

②在充氩气快速耗氧的缺硫培养基中对产氢量的影响：

为消除黑暗呼吸耗氧诱导产氢方法中残留氧气对衣藻产氢能力的影响，本实验使用了对缺硫培养基中的莱茵衣藻培养体系快速充高纯氩气10分钟的方法，使培养体系内的氧气被快速排除掉，迅速诱导莱茵衣藻产氢，并比较密码子优化前后的转基因莱茵衣藻与未转基因莱茵衣藻cc849的产氢量之差别，图8、图9。本发明的结果表明在充氩气后的两个小时，转密码子优化后hemHc-lbac的莱茵衣藻首先检测到了氢气的产生，产量为2.8μl，而转未优化hemH-lba的藻株和未转基因衣藻cc849都没有检测到氢气的产生。冲氩气后四天，转密码子优化后hemHc-lbac基因的衣藻氢气积累量达到稳定水平为2.6ml每瓶，转未优化hemH-lba的藻株为1.7ml每瓶，未转基因衣藻cc849仅为0.25ml每瓶。

本发明前期工作结果显示，单独在莱茵衣藻的叶绿体中表达豆血红蛋白的球蛋白亚基基因lba可以降低培养体系内的氧气含量和使产氢量提高约50％；在莱茵衣藻叶绿体中表达合成豆血红蛋白血红素辅基的hemH基因和球蛋白亚基基因lba能进一步加快莱茵衣藻产氢培养体系的氧气消耗速度和提高莱茵衣藻的氢气产量达4倍多。本发明的上述结果表明，在莱茵衣藻叶绿体中表达密码子优化的hemHc基因和lbac基因能进一步加快莱茵衣藻产氢培养体系的氧气消耗速度和提高莱茵衣藻的氢气产量达4.9倍之多，重组蛋白hemH-Lba在莱茵衣藻中的表达量提高6.8倍之多，说明密码子优化能显著提高外源基因在莱茵衣藻叶绿体中的表达量，也使转基因莱茵衣藻中的耗氧量和产氢量进一步提高，本发明方法可以用于进一步提高微型绿藻或其它物种的外源基表达和产氢能力提高。

上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改和变化，均在本发明的保护范围之内。

附件1为豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH密码子优化前后的比较。hemH指是密码子优化前；hemHc是指密码子优化后。

附件2为豆血红蛋白球蛋白亚基基因lba密码子优化前后的比较。Lba指是密码子优化前；lbac是指密码子优化后。

附件1：

附件2：

Claims (2)

1.一种优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法，步骤如下：

(1)莱茵衣藻培养：

A、选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849；

B、培养莱茵衣藻藻种：

(a)正常培养条件：温度25±1℃；日光灯光照强度100～200微摩尔光量子/平方米·秒；50～100ml TAP培养基液体培养，初始pH7.2，水平摇床转速100～130rpm，每5～6天1％接种继代培养；

(b)固体平板TAP培养基：琼脂粉1.5％；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；

C、产氢培养条件：在缺硫培养基中进行，把TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装在培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，橡皮塞密闭；黑暗条件下培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50～100微摩尔光量子/平方米·秒，温度25±1℃；每24小时进行气体成分和含量检测一次；

D、气相色谱仪测定氢气和氧气含量：分子筛5×1/8，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气，柱温50℃，进样温度200℃，热导检测温度300℃；

(2)豆血红蛋白hemHc基因和lbac基因的密码子优化和合成：

A、从GenBank中调取序列号为M92427的慢生大豆根瘤菌hemH基因序列和序列号为V00453的大豆lba基因序列；

B、将豆血红蛋白hemH基因和lba基因的密码子对应的DNA核苷酸序列中第三位碱基对应的DNA核苷酸序列中的鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)改为腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)；将优化后的基因命名为hemHc和lbac；分别在hemHc基因的5’端和3’端加上限制性内切酶SacII的酶切位点序列；在lbac基因的5’端和3’端加上限制性内切酶Sma I和Sac I的酶切位点序列；

C、将优化后的hemHc基因和lbac基因的核苷酸序列以及添加的相应的限制性内切酶酶切位点核苷酸序列进行核苷酸序列合成；

(3)hemHc基因和lbac基因的扩增：

A、以步骤(2)C合成的hemHc基因和lbac基因核苷酸序列为模板，进行聚合酶链式反应，分别扩增hemHc基因和lbac基因；反应条件：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性30s，hemHc基因58℃，lbac基因59℃；退火30s，72℃延伸1.5min；30个循环；72℃延伸15min；反应产物分别纯化回收，用于测序鉴定和下一步莱茵衣藻叶绿体转化载体的构建；

B、PCR扩增、测序鉴定以及hemHc基因和lbac基因转录表达检测的特异性引物：

hemHc基因的特异性引物为：

hemHc-P1：5’-

atgtcaacagcagctccaaatgaa-3’，斜体表示SacII酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；

hemHc-P2：5’-

tatatccaaccttgaagttcacgta-3’，斜体表示SacII酶切位点序列；

lbac基因的特异性引物为：

Lbac-P1：5’-c 

ttatgcttttttaatagctgctgc-3’，斜体表示SmaI酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；

Lbac-P2：5’-tcc

 atggttgcttttactgaaaaacaa-3’，斜体表示SacI酶切位点序列；

(4)莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建：

A、将步骤(3)PCR扩增并纯化回收的hemHc基因片段和lbac基因片段分别用限制性内切酶SacII酶切和用SmaI和SacI酶切；将纯化的lbac基因片段通过上述酶切位点用T4DNA连接酶连接质粒cg401-1中的aadA基因之后，形成aadA-lbac融合基因，得到载体cg401-1-lbac；用SacII酶切位点将hemHc基因用T4DNA连接酶连入到质粒cg401-1-lbac中aadA基因之后和lbac基因之前，形成aadA-hemHc-lbac融合蛋白，构建得到衣藻叶绿体表达载体cg401-1-hemHc-lbac；转化大肠杆菌DH5α，用于保存、鉴定和大量制备质粒DNA；

(4)莱茵衣藻叶绿体的转化：

A、取100ml对数期中后期的莱茵衣藻，25℃，3000rpm离心5min收集藻细胞，用新鲜TAP洗三次，涂于新鲜TAP固体平板上；光照100微摩尔光量子/平方米·秒，25土1℃条件下培养24小时；基因抢轰击转化；真空度9.48192×10⁴Pa，轰击距离9cm，氦气压力7.584236×10⁶Pa，金粉子弹经限制性内切酶EcoRI酶切质粒cg401-1-hemHc-lbac DNA包裹，金粉子弹颗粒直径1.0微米；

B、转化后的衣藻在光照和25±1℃条件下，过渡培养18h，用TAP液体培养基冲洗，涂布于含壮观霉素100μg/ml的TAP固体选择培养基上，25±1℃，100微摩尔光量子/平方米·秒连续光照，培养约7～15天；取有抗性的单藻落分别在选择培养基上多次继代培养；分别进行产氢培养，并检测产氢量和耗氧量；

(5)分析转基因莱茵衣藻中hemHc-lbac基因的整合及其表达：

A、hemHc lbac基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的检测：

a、hemHc基因和lbac基因同源重组交换整合到莱茵衣藻叶绿体DNA，以转基因衣藻总DNA为模板的PCR产物为5254bp；未整合的PCR产物是3732bp；与莱茵衣藻叶绿体DNA结合的引物是cpDNA-P1：5’

-aacatgctaagtttacaagcccgaag-3’；cpDNA-P2：5’

-gtctttatgagccgtccccgaag-3’；

b、取对数生长后期的衣藻培养液，4℃低速离心收集，加350μl DNA提取液0.1mol/L氯化钠，50mmol/L乙二胺四乙酸，20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.0，，重悬沉淀；加入25μl 10mg/ml的蛋白酶K及25μl 20％十二烷基硫酸钠，混匀37℃水浴12小时，冰上冷却；加入200μl 5mol/L醋酸钾，静置离心；上清液中加入等体积25∶24∶1的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，总DNA用无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤，干燥后溶于30μl三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液；

B、转基因莱茵衣藻中hemHc基因和lbac基因转录的检测：

取对数生长期中期的莱茵衣藻，室温3000rpm离心5分钟收集藻细胞，提取总RNA，反转录cDNA；利用hemHc基因和lbac基因的特异性引物和扩增hemHc基因和lbac基因所述的PCR条件扩增，进行hemHc基因和lbac基因转录水平的检测；

C、转基因莱茵衣藻中重组蛋白hemH和Lba表达量的检测：

a、按下列配比制备蛋白提取缓冲液：50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH 8.3含1％曲拉通；上样缓冲液：0.25M三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.0；25％甘油；7.5％十二烷基硫酸钠；0.25mg ml^-1溴酚兰；12.5％β-巯基乙醇；

b、取产氢培养的莱茵衣藻培养液，室温，3000rpm离心5min收集藻细胞，用250μl蛋白提取缓冲液悬浮，加入2μl β-巯基乙醇，液氮冻融三次；4℃条件下离心20min；取200μl蛋白上清液加入100μl上样缓冲液，用10％的分离胶和5％的浓缩胶进行凝胶电泳，转聚偏氟乙烯膜；分别用抗hemH多克隆抗体和抗Lba多克隆抗体做免疫杂交检测，再对HRP标记的抗体进行化学发光检测；

(6)分析重组豆血红蛋白hemH-Lba对莱茵衣藻生长的影响：

A、双光束紫外可见光分光光度计检测莱茵衣藻在750nm处的吸光度；

B、取藻液3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95％乙醇溶液，混合均匀，室温避光放置20min，4℃，12000rpm离心10min；取上清，测定665纳米吸光度值及649纳米吸光度值的吸光值；

C、计算总叶绿素的含量，单位mg/L：

叶绿素Chl mg/L＝20.04×OD₆₄₉+6.10×OD₆₆₅；

(7)分析重组豆血红蛋白hemH-Lba对莱茵衣藻产氢培养的耗氧量和产氢量的影响：

A、黑暗呼吸耗氧和缺硫培养基中耗氧量以及产氢量的检测：

B、快速充氩气耗氧和缺硫培养基中产氢量的检测。

2.根据权利要求1所述的优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法，其特征在于：TAP培养基为三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐培养基。

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