SK4252001A3 - Nucleotide sequences which code for the rp1k gene - Google Patents

Description

TF* //.pr' w

Sekvencie nukleotidov kódujúce gén rplK

Oblasť techniky

Vynález sa týka nukleotidových sekvencií kódujúcich gén rplK z koryneformných baktérií a spôsobu fermentačnej prípravy aminokyselín, najmä L-lyzínu, za zoslabenia génu rplK.

Doterajší stav techniky

L-aminokyseliny, najmä L-lyzín, nachádzajú použitie v strave zvierat, v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle.

Je známe, že tieto aminokyseliny sa pripravujú fermentáciou kmeňov koryneformných baktérií, najmä CoryneJbacterium glutamicum. Kvôli velkému významu sa stále pracuje na zlepšovaní spôsobu prípravy. Na zlepšenie výkonnostných vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a výberu mutantov. Týmto spôsobom sa získajú kmene, ktoré sú rezistentné voči antimetabolitom, ako napríklad analógom lyzínu S—(2— aminoetyl)-cysteín, alebo auxotrofné pre regulačné významné metabolity a produkujú L-aminokyseliny.

Už roky sa používajú rovnako metódy rekombinantnej DNAtechniky na zlepšovanie kmeňov produkujúcich L-lyzín pri kmeňoch Corynebacterium glutamicum, v ktorých sa jednotlivé gény biosyntézy aminokyselín amplifikujú a skúma sa pôsobenie na produkcii L-aminokyselín. Prehladné články je možné nájsť okrem iných v Kinoshita („Glutamic Acid Bacteria, v: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten a Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) a Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).

Proteín rplK (ribozomálna velká podjednotka proteínu K) je najskôr pre Escherichia coli opísanou súčásťou bakteriálneho ribozómu, translačného aparátu bunky, na ktorom prebieha syntéza proteínov.

Ribozómy sú bunkové častice, ktoré sa skladajú z troch molekúl ribonukleovej kyseliny (RNA) a definovaného počtu proteínov. Ribozómy sa získavajú väčšinou z bunkového extraktu ultracentrifugáciou. Ďalšie čistenie zvyšných bunkových súčastí sa vykonáva zvyčajne sedimentáciou v sacharózových gradientoch. Táto technika preparácie viedla k používaným označovaním pre súčasti ribozómov, ktoré sa priamo vzťahujú k sedimentačným vlastnostiam. Funkčný bakteriálny ribozóm sa označuje z tohto dôvodu často ako 70S-ribozóm, ktorý sa skladá z malých (small subunit) 30Spodjednotiek a veľkých (large subunit) 50S-podjednotiek. Malá 30S-podjednotka E. coli sa skladá z 21 rôznych polypeptidov a jednej molekuly RNA s dĺžkou 1542 nukleotidov, ktorá je odborníkovi známa ako 16S-rRNA; veľká 50S-podjednotka obsahuje okrem proteínu rplK ďalších 31 rozdielnych polypeptidov, spolu s dvoma molekulami RNA s dĺžkou 120 respektíve 2904 nukleotidov, takzvaných 5Srespektíve 23S-rRNA-molekúl. Medzitým sa pre ribozomálne proteíny etablovala alternatívna nomenklatúra. Tak sa označujú polypeptidy malej 30S-podjednotky SI až S21, veľkej 50S-podjednotky Ll až L32. RplK-proteín zodpovedá pritom ribozomálnemu Lll-proteínu (Noller a Nomura, v: Neidhardt et al., Escherichia coli and Salmonella typhimuriumz Cellular and molecular biology. American Society for Microbiology, Washington D. C., 167-186, 1996). V posledných rokoch boli proteíny podobné Lll identifikované tiež v iných organizmoch ako je Borrelia burgdorferi (Fraser et al., Náture, 390, 580-586, 1997), Helicobacter pylori (Tomb et al., Náture, r · · r r r r r · r · r r

3* r r r r · r P r

388, 539-547, 1997), Serratia marcescens (Sor and Nomura, Molecular and generál Genetics, 210, 52-59, 1987), Haemophilus influenzae (Fleischmann et al., Science, 269, 496-512, 1995) a v gram pozitívnej baktérii Bacillus subtilis (Jeong et al., Molecular Microbiology, 10, 133-142, 1993).

Proces translácie prebiehajúci na ribozóme, čiže biosyntéza polypeptidov riadená matricami RNA (mRNA), je zložitý. Okrem ribozómu sú pre translačný proces esenciálne ďalšie proteíny, ktoré odborník označuje ako faktory proteínovej syntézy (Noller, Annual Rewiew of Biochemistry, 60, 191-227, 1991). Lll-proteín sprostredkováva interakciu medzi ribozómom a niektorými faktormi proteínovej syntézy; ako príklad tu môžu byť menované elongačný faktor G (EF-G) a terminačný faktor 1 (RF-1). Absencia Lll-proteínu v ribozómoch E. coli Lll-mutantov vedie preto k zmenšeniu translačnej rýchlosti (Xing and Draper, Biochemistry, 35, 1581-1588, 1996).

Lll-proteín je rovnako esenciálny pre väzbu a aktivitu RelA-proteínu na ribozómu. RelA katalyzuje za podmienok nedostatku aminokyselín syntézu guanozíntetrafosfátu (ppGpp) prenosom pyrofosfátovej skupiny z ATP na GDP. ppGpp ovplyvňuje v E. coli expresiu mnohých génov, buď negatívne alebo pozitívne. Všeobecne sa pritom stimuluje expresia génových produktov, ktoré sú v biosyntetickom procese účinné. Génové produkty, ktoré pôsobia katabolicky, sú spravidla zodpovedajúcim spôsobom negatívne regulované. Prostredníctvom ppGpp sa reguluje v E. coli velký počet génov a operónov, ktoré hrajú ústrednú úlohu v biosyntéze aminokyselín. K tým až dosial známym v E. coli pozitívne ovplyvňovaným génom patrí okrem iných argF, argl, argECBH (biosyntéza arginínu), gltB, glnA, gdh (biosyntéza glutamín/glutamát), ilvB, ilvA (biosyntéza izoleucínu), metC, metF, metK (biosyntéza metionínu) , thrA, thrB, thrC (biosyntéza treonínu), lysA, lysC, dapB, asd (biosyntéza lyzínu) (Cashel et al., v: Neidhardt et al. Escherichia coli and Salmonella typhimurium·. Cellular and molecular biology. American Society for Microbiology, Washington D.C., 14581496, 1996). Funkcia ppGpp ako pozitívneho regulátoru biosyntézy aminokyselín bola medzitým tiež ukázaná v iných baktériách ako je Salmonella typhimurium (Rudd et al., Journal of Bacteriology, 163, 534-542, 1985), Vibrio sp. (Flärdh et al., Journal of Bacteriology, 176, 5949-5957, 1994) a B. subtilis (Wendrich and Marahiel, Molecular Microbiology, 26, 65-79, 1997).

Zo stavu techniky je zrejmé, že je záujem zistiť, či znalosť sekvencie nukleotidov génu rplK koryneformných baktérií prispieva k zlepšeniu reprodukcie aminokyselín týchto baktérií.

Úloha vynálezu

Úloha vynálezu spočíva v tom, dať k dispozícii nové opatrenia na zlepšenie fermentačnej prípravy aminokyselín, najmä L-lyzínu.

Opis vynálezu

L-aminokyseliny, najmä lyzín, nachádzajú použitie v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle, v potravinárskom priemysle a predovšetkým v zvieracej potrave. Existuje preto všeobecný záujem pripraviť nové formulácie na zlepšenie spôsobu prípravy aminokyselín, najmä L-lyzínu.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je izolovaný polynukleotid, ktorý obsahuje sekvenciu polynukleotidov, vybranú zo skupiny

a) polynukleotidu, ktorý je aspoň z 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, obsahujúci sekvenciu aminokyselín SEQ ID No. 2,

b) polynukleotidu, ktorý kóduje polypeptid, obsahujúci sekvenciu aminokyselín, ktorá je aspoň z 70 % identická so sekvenciou aminokyselín SEQ ID No. 2,

c) polynukleotidu, ktorý je komplementárny k polynukleotidom a) alebo b) , a

d) polynukleotidu, obsahujúceho aspoň 15 po sebe idúcich báz sekvencie polynukleotidov a), b) alebo c.

Predmetom vynálezu je rovnako polynukleotid podlá nároku 1, pričom prednostne ide o replikovateľnú DNA, ktorá obsahuje:

(i) sekvenciu nukleotidov, ukázanú v SEQ-ID-No. 1, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii (i) vnútri úseku degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje sekvenciu komplementárnu k sekvencii (i) alebo (ii), a prípadne (iv) funkčne neutrálne zmysluplné mutácie v (i).

Ďalšími predmetmi vynálezu sú polynukleotid podľa nároku 4, obsahujúci sekvenciu nukleotidov, ako je znázornené v SEQ ID No. 1, polynukleotid podľa nároku 2, kódujúci polypeptid, ktorý obsahuje sekvenciu aminokyselín ako je znázornené v SEQ ID No. 2, polynukleotid podía nároku 1, najmä bodu d, obsahujúci sekvenciu nukleotidov, ako je znázornené v SEQ ID No. 3, polynukleotid podľa nároku 1, bodu d, ktorý kóduje polypeptid, obsahujúci sekvenciu aminokyselín, ako je znázornené v SEQ ID No. 4, vektor, obsahujúci mutovaný polynukleotid podľa nároku 1, bod d, zobrazený v SEQ ID No. 3 a na obrázku 1 (Δ = deHa) a podía Budapeštianskej zmluvy uložený v E. coli DH5a/pArplk ako DSM 13158 a ako hostiteľské bunky slúžiace koryneformné baktérie, ktoré v géne rplK obsahujú inzerciu alebo deléciu.

Predmetom vynálezu sú práve tak polynukleotidy, ktoré sa skladajú hlavne zo sekvencie polynukleotidov, ktoré sú dosiahnutelné screeningom pomocou hybridizácie príslušnej génovej banky, ktorá obsahuje úplný gén so sekvenciou polynukleotidov ako zodpovedá SEQ ID No. 1 so sondou, ktorá obsahuje sekvenciu menovaného polynukleotidu podía SEQ ID No. 1 alebo jej fragment a izoláciu menovanej sekvencie DNA.

Sekvencie polynukleotidov podía vynálezu sú vhodné ako hybridizačné sondy pre RNA, cDNA a DNA, aby sa cDNA izolovala v plnej dĺžke, kódujúci ribozomálny proteín Lll a také cDNA alebo gény, ktoré vykazujú vysokú podobnosť so sekvenciou génu rplK.

Polynukleotidové sekvencie podía vynálezu sú ďalej vhodné ako prajmer, s ktorého pomocou môžu byť polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) pripravené DNA génov, ktoré kódujú rplK-génový produkt respektíve ribozómální proteín Lll.

Také oligonukleotidy, slúžiace ako sondy alebo prajmer, obsahujú aspoň 30, s výhodou aspoň 20, celkom výhodne predovšetkým aspoň 15 po sebe idúcich nukleotidov. Vhodné sú rovnako oligonukleotidy s dĺžkou minimálne 40 alebo 50 párov báz.

„Izolované znamená prirodzene oddelené.

respektíve respektíve „Polynukleotid sa vzťahuje všeobecne na polyribonukleotidy a polydeoxyribonukleotidy, pričom môže ísť o nemodifikované RNA alebo DNA alebo modifikované RNA alebo DNA.

Pod pojmom „polypeptidy sa rozumejú peptidy alebo proteíny, ktoré obsahujú dve alebo viac aminokyselín viazaných peptidickou väzbou.

Polypeptidy podía vynálezu ukončujú polypeptid podľa SEQ ID No. 2, najmä také s biologickou aktivitou rplKgénového produktu, a tiež také, ktoré sú prinajmenšom z 70 % identické s polypeptidom podľa SEQ ID No. 2, s výhodou prinajmenšom z 80 % a predovšetkým prinajmenšom z 90 % až 95 % identity s polypeptidom podľa SEQ ID No. 2, a vykazujú menovanú aktivitu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu fermentačnej prípravy aminokyselín, najmä lyzínu, pri použití koryneformných baktérií, ktoré najmä produkujú aminokyseliny a v ktorých sú zoslabené sekvencie nukleotidov kódujúce gén rplK.

Pojem „zoslabenie opisuje v tejto súvislosti zmenšenie alebo vyradenie vnútrobunkovej aktivity, respektíve funkcie jedného alebo viacerých enzýmov, prípadne proteínov v mikroorganizme, ktorý je kódovaný zodpovedajúcou DNA, pri ktorom sa používa napríklad slabý promotor alebo gén, alela, ktorá kóduje zodpovedajúci enzým, proteín s nižšou aktivitou alebo inaktivuje zodpovedajúci gén alebo enzým, respektíve proteín, a rovnako kombinuje tieto opatrenia.

Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, môžu pripravovať aminokyseliny, najmä lyzín z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerínu a etanolu. Môže ísť o zástupca koryneformných baktérií, najmä rodu

Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium je potrebné menovať najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je známy v odbornom svete pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.

Vhodné kmene rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutainicum, sú najmä známe typy divokých kmeňov

Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870

Corynebacterium melassecola ATCC17965

Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539

Brevibacterium flavum ATCC14067

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a

Brevibacterium flavum divaricatum ATCC14020 a z nich pripravené L-aminokyseliny produkujúce mutanty, respektíve kmene, ako napríklad kmene produkujúce L-lyzín

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709

Brevibacterium flavum FERM-P 1708

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464

Corynebacterium glutamicum DSM 5715

Corynebacterium glutamicum DSM 12866 a

Corynebacterium glutamicum DM58-1

Vynálezcom sa podarilo izolovať nový gén rplK z Corynebacterium glutamicum.

Na izolovanie génu rplK z C. glutamicum sa najskôr založí génová banka z Corynebacterium glutamicum. Založenie génové banky je vo všeobecne známych učebniciach a r p kozmidového

Proceedings príručkách opísané. Ako príklad môže slúžiť učebnica Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die

Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručka Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Veľmi známa génová banka je banka E. coli K-12 kmeň W3110, ktorá bola založená Koharou et al. (Celí 50, 495-508 (1987)) v λ-vektoroch. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) opísali génovú banku C.

glutamicum ATCC13032, ktorá bola založená pomocou vektoru SuperCos I (Wahl et al., 1987, of the National Academy of Sciences USA,

84:2160-2164) v E. coli K-12 kmeň NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575) Bôrmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)) naopak opísal génovú banku C. glutamicum ATCC13032 pri použití kozmidu pHC79 (Hohn a Collins, Gene 11, 291-298 (1980)).

Na prípravu génovej banky C. glutamicum v E. coli môžu byť takisto použité plazmidy ako je pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979) alebo pUC9 (Vieira et al.,1982, Gene 19:259-268). Ako hostitelia sú vhodné najmä také kmene E. coli, ktoré sú reštrikčné alebo rekombinantne defektné.

Príkladom je kmeň DH5amcr, ktorý opísal Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649).

Pomocou kozmidov klonované dlhé fragmenty DNA môžu byť potom subklonované na bežné vektory vhodné na sekvenovanie.

Metódy sekvenovania DNA opisuje okrem iných Sagner et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74:5463-5467(1977).

Týmto spôsobom boli získané nové sekvencie DNA kódujúce gén rplK z C. glutamicum, ktoré sú ako SEQ ID No. 1 súčásťou predkladaného vynálezu. Ďalej boli z predloženej sekvencie

DNA odvodené hore uvedenými metódami sekvencie aminokyselín zodpovedajúceho proteínu. V SEQ ID No. 2 je znázornená vyplývajúca sekvencia aminokyselín génového produktu rplK, respektíve proteínu L-ll.

Kódujúce sekvencie DNA, ktoré vyplynú z SEQ ID No. 1 degenerovaním genetického kódu, sú rovnako súčasťou vynálezu. Rovnako tak sú aj sekvencie DNA, ktoré hybridizujú SEQ ID No. 1 alebo častmi SEQ ID No. 1, súčasťou vynálezu. Sekvencie aminokyselín, ktoré vyplynú zodpovedajúcim spôsobom z SEQ ID No. 2 sú rovnako súčasťou vynálezu.

Vynálezcovia zistili, že koryneformné baktérie po zoslabení génu rplK produkujú zlepšeným spôsobom L-aminokyseliny, najmä L-lyzín.

Na dosiahnutie zoslabenia môžu byť znížené buď expresia génu rplK alebo s výhodou funkčnej vlastnosti proteínu. Rovnako je možné obidve opatrenia kombinovať.

Zmenšenie génovej expresie sa môže vykonávať vhodným vedením kultúry alebo genetickou zmenou (mutáciou) signálnej štruktúry génovej expresie. Signálne štruktúry génovej expresie sú napríklad represorové gény, aktivátorové gény, operátory, promotory, atenuátory, väzbové miesta ribozómov, štartovacie kodóny a terminátory. Údaje nájde odborník napríklad v patentovej prihláške WO 96/15246, Boyd a Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988), Voskuil a Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1988), Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengenering 58: 191 (1998)), Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996) a v známych učebniciach Genetiky a Molekulárnej biológie ako je napríklad učebnica od Knippersa („Molekulare Genetik)z 6. vyd., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1995) alebo od Winnackera („Gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Nemecko, 1990).

Mutácie, vedúce k zmene respektíve zníženiu funkčných vlastostí proteínov, sú zo stavu techniky známe. Ako príklady sú práce: Qiu a Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) a Môckel (Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms, Berichte des Forschungszentrum JUlichs, JU1-2906, ISSN09442952, Júlich, Nemecko, 1994). Zhrňujúce znázornenia môžu byt prevzaté zo známych učebníc genetiky a molekulárnej biológie ako napríklad Hagemann („Allgemeine Genetik, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Ako mutácie prichádzajú do úvahy transicie, transverzie, inzercie a delécie. V závislosti od účinku výmeny aminokyselín na aktivitu sa hovorí o mutciách s chybným zmyslom (missense) alebo o nezmyselných mutáciách (nonsense). Inzercie alebo delécie aspoň jedného pár báz v génu vedú k rámcovému posunu mutácií (fráme shift mutations) v ktorého dôsledku môžu byť zabudované nesprávne aminokyseliny alebo predčasne ukončená translácia. Návody na produkovanie takých mutácii patrí do stavu techniky a je možné ich prevziať zo známych učebníc genetiky a molekulárnej biológie ako sú napr. učebnice: Knippers („Molekulare Genetik, 6. vyd., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1995), Winnacker: „Gene und Klone, VCH Verlagsgeselschaft, Weiheim, Nemecko, 1990) alebo Hagemann („Allgemeine Genetik, Gustáv Fischer, Stuttgart, 1986). Metódy na prípravu mutácií pomocou polymerázových reťazových reakcií (PCR) sú opísané v: Newton C. R., Graham A., „PCR, 2. vyd., Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1997.

Príkladom plazmidu, s ktorého pomocou môže byť vykonaná delečná mutagenéza génu rplK, je plazmid pÄrplK znázornený na obrázku 1.

Plazmid pArplK sa skladá z plazmidu pK18mobsacB, ktorý opísal Jäger et al. (Journal of Bacteriology, 1992, 174:

5462-65), do ktorého je zabudovaná alela génu rplK, znázornená v SEQ ID No. 3. Alela označená ako ArplK nesie 12 bp dlhú deléciu v úseku 5' génu. Alelou ArplK kódovaný variant proteínu Lll je znázornený ako SEQ ID No. 4. Znázornený variant proteínu Lll sa líši od formy divokého typu proteínu Lll chýbaním tetrapeptidu „prolín-alanínleucín-glycín , ktorý zodpovedá aminokyselinám s pozíciou 30 až 33 zo SEQ ID No. 2.

Plazmid pArplK vedie po homologickej rekombinácii k výmene chromozomálneho génu rplK za alelu ArplK. Návody a objasnenia k inzertnej mutagenéze sa nachádzajú napríklad v pracích Schwarzer a Ptihler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) alebo Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580(1994)).

Ďalej môže byť pre produkciu L-aminokyselín, najmä L-lyzínu výhodné, navyše na zoslabenie génu rplK jeden alebo viac enzýmov každého procesu biosyntézy zosilniť, najmä preexprimovať.

Tak sa môže napríklad, najmä na prípravu L-lyzínu, jeden alebo viac gíénov vybraných zo skupiny • gén dapA kódujúci dihydropikolinát-syntázu (EP-B 0 197 335), • gén lysC kódujúci feed back rezistentnú aspartátkinázu (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324), • gén pyc kódujúci pyruvát-karboxylázu (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086), • gén mqo kódujúci malát:chinón oxidoreduktázu (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), e r • gén lýzy kódujúci export lyzínu (DE-A-195 48 222), • gén zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115), súčasne zosilovať, respektíve preexprimovať.

Ďalej môže byť pre produkciu L-aminokyselin výhodné, aby sa navyše na zoslabenie génu rplK zoslabil súčasne jeden alebo viac génov, vybraných zo skupiny:

• gén pck kódujúci fosfoenolpyruvát-karboxykinázu (DE 199 50 409.1; DSM 13047), • gén pgi kódujúci glukózo-6-fosfát-izomerázu (US 09/396, 478, DSM 12969), • gén poxB kódujúci pyruvát-oxidázu (DE 199 51 975.7; DSM 13114), • gén zwa2 (DE 199 59 327.2; DSM 13113), • gén relA kódujúci PPGPP-syntetázu I (EC 2.7.6.5).

Ďalej môže byť pre produkciu L-aminokyselín výhodné, vylúčiť popri preexprimovaní 6-fosfoglukonát-dehydrogenázy nežiadúce vedľajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms, v: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Mikroorganizmy obsahujúce mutovaný polynukleotid, získané podľa nároku 1 bod d, sú rovnako predmetom vynálezu a môžu byť kultivované kontinuálne alebo diskontinuálne batch metódou (vsádzková kultivácia) alebo fed batch metódou prítoková metóda) alebo repeated fed batch metódou opakovaná prítoková metóda) za účelom produkcie L-aminokyselín, najmä L-lyzínu. Súhrn známych kultivačných metód je opísaný v učebnici Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) alebo v učebnici Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

Kultivačné prostredie, ktoré sa bude používať, musí vhodným spôsobom vyhovovať nárokom príslušných kmeňov mikroorganizmov. Opisy kultivačných prostredí rôznych mikroorganizmov sú obsiahnuté v príručke „Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Ako zdroj uhlíka môžu byť použité cukor a sacharidy ako je napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza, oleje a tuky ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk, mastné kyseliny ako napríklad kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová, alkoholy ako napríklad glycerín a etanol a organické kyseliny ako napríklad kyselina octová. Tieto látky môžu byť použité jednotlivo alebo ako zmes. Ako zdroj dusíka môžu byť použité organické zlúčeniny obsahujúce dusík ako peptóny, kvasnicový extrakt, masový extrakt, sladový extrakt, kukuričný vodný extrakt, sójová múčka a močovina alebo anorganické zlúčeniny ako síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Zdroje dusíka môžu byť použité jednotlivo alebo ako zmes. Ako zdroj fosforu môžu byť použité dihydrogénfosforečnan draselný alebo monohydrogenfosforečnan draselný alebo zodpovedajúce soli obsahujúce sodík. Kultivačné prostredie musí ďalej obsahovať soli kovov ako napríklad síran horečnatý alebo síran železa, ktoré sú nutné pre rast. Konečne môžu byť použité esenciálne rastové látky ako aminokyseliny a vitamíny navyše k hore uvedeným látkam. Do kultivačného prostredia sa môžu navyše pridať vhodné predstupne. Menované použité látky môžu byť pridané ku kultúre vo forme jednorázovej násady alebo vhodným spôsobom pridávané počas kultivácie.

Na kontrolu pH kultúry sa vhodným spôsobom používajú zásadité zlúčeniny ako hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, respektíve čpavková voda alebo kyslé zlúčeniny ako kyselina fosforečná alebo sírová. Na kontrolu vývoja peny môžu byť použité odpeňovacie prostriedky ako napríklad polyglykolester mastných kyselín. Na zachovanie stability plazmidov sa do prostredia môžu pridávať vhodné selektívne pôsobiace látky ako napríklad antibiotiká. Aby boli zachované aeróbne podmienky, vnáša sa do kultúry kyslík alebo kyslík obsahujúci plynné zmesi ako napríklad vzduch. Teplota kultúry je zvyčajne 20°C až 45°C, s výhodou 25°C až 40°C. Kultivácia sa nechá pokračovať tak dlho, až sa vytvorí maximum žiadaného produktu. Tento ciel je dosiahnutý zvyčajne počas 10 až 160 hodín.

Metódy stanovenia L-aminokyselín sú zo stavu techniky známe. Analýza sa môže vykonávať tak, ako je opísané pri Spackmanne et al. (Analytical Chemistry 30, 1190 (1958) aniónmeničovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou, alebo sa môže vykonať reverznou fázou HPLC, ako opisuje Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Nasledujúci mikroorganizmus bol uložený podlá Budapeštianskej zmluvy v Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Nemecko):

• Escherichia coli kmeň DH5a/pArplK jako DSM 13158

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predkladaný vynález bude v nasledujúcom texte objasnený na základe príkladov uskutočnenia:

Príklad 1

Príprava génómovej banky kozmidov z Corynebaeterium glutamicum ATCC 13032

Chromozomálna DNA bola izolovaná z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ako bolo opísané Tauchom et al. (1995, Plasmid 33:168-179) a čiastočne štiepená reštrikčným enzýmom

Sau3AI (Amersham

Pharmacia,

Freiburg,

Nemecko,

Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02). Fragmenty

DNA boli defosforylované Molecular Biochemicals, beschreibung SAP, Code no. DNA kozmidového vektoru alkalickou fosfatázou kraba(Roche Mannheim, Nemecko, Produkt1758250).

SuperCosl (Wahl et al. (1987)

Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:21602164), od firmy Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCosl Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) bola štiepená reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, Produktbeschreibung Xbal, Code no. 270948-02 a. rovnako, defosforylovaná alkalickou fosfatázou kraba. Potom bola DNA kozmidu štiepená reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04. Týmto spôsobom ošetrená DNA kozmidu bola zmiešaná s ošetrenou ATCC13032-DNA a násada ošetrená T4-DNA-ligázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, Produktbeschreibung T4-DNA-ligáza, Code no. 27-0870-04. Ligačná zmes bola potom pomocou extraktu Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) zabalená do fágov. Na infekciu E. coli kmeň NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575) boli bunky zachytené v 10 mM MgSO₄ a zmiešané s alikvótnou suspenziou fágov. Infekcia a titer kozmidovej banky boli uskutočnené ako bolo opísané v práci Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom bunky boli rozotrené na LB-agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) so 100 mg/1 ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri 37°C boli vybrané jednotlivé rekombinantné klony.

r r

Príklad 2

Izolácia a sekvenovanie génu rplK

DNA kozmidu jednotlivej kolónie bola izolovaná s Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podía údajov výrobcu a parciálne štiepená reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-091302) . Fragmenty DNA boli defosforylované alkalickou fosfatázou kraba (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, Produktbeschreibung SAP, Product no. 1758250). Po separácii gélovou elektroforézou sa vykonala izolácia kozmidových fragmentov v oblasti veľkostí od 1500 do 2000 bp s QiaExII_ Gel Extraction Kit. (Product No. 20021; Qiagen, Hilden, Nemecko). DNA sekvenovacieho vektoru pZero-1 získaná od firmy Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No. K250001) bola štiepená reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04). Ligácia kozmidového fragmentu do sekvenovacieho vektoru Zero-1 bola vykonaná tak, ako opísal Sambrook et al.: (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor), pričom zmes DNA bola cez noc inkubovaná s ligázou T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko). Táto ligačná zmes bola potom elektroporáciou zanesená (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol. Letters, 123:343-7) do E. coli kmeň DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649) a nanesená na LB-agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) s 50 mg/1 zeocínu. Preparácia plazmidu rekombinantných klonov bola uskutočnená s Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Nemecko). Sekvenovanie sa robilo metódou pretrhnutia dideoxy-reťazca podľa Sangera et. al. (1977,

Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74:5463-5467) s modifikáciami podľa Zimmermanna et al. (1990, Nucleic Acid Research, 18:1067). Bol použitý „RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit od PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Nemecko). Separcáia gélovou elektroforézou a analýza sekvenovacej reakcie sa vykonala v géli „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Nemecko) so sekvenovacím prístrojom „ABI Prism 377 od PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).

Získané hrubé údaje sekvencií boli potom procesované pri použití programu Staden-Programpaket (1986, Nucleic Acid Research, 14:217-231) verzia 97-0. Jednotlivé sekvencie pZerol-derivátov boli zhromaždené v jednom spolu súvisiacom kontigu. Počítačovo p.odporená. analýza kódovacieho úseku bola zhotovená programom XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acid Research, 14:217-231. Ďalšie analýzy boli vykonané s programami „BLAST search Programms (Altschul et al., 1997, Nucleic Acid Research, 25:3389-3402, voči nonredundantnej databanke „National Center for Biotechnology Information (NCBI, Betheseda, MD, USA).

Získaná sekvencia nukleotidov je znázornená v SEQ ID No. 1. Analýza sekvencie nukleotidov poskytla voľný čítací rámec 438 párov báz, ktorý bol označený ako gén rplK. Gén rplK kóduje polypeptid zo 145 aminokyselín v SEQ ID No. 2.

Príklad 3

Príprava vektoru s kópiou génu rplK

Chromozomálny 1200 bp fragment DNA, ktorý obsahuje gén rplK z C. Glutamicum, bol klonovaný pomocou PCR.

K tomu bola izolovaná chromozomálna DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, ako opísal Tauch et

Γ r al. (1995, Plasmid 33:168-179). Pomocou polymerázovej reťazovej reakcie bol amplifikovaný fragment DNA s veľkosťou 1200 bp, obsahujúci gén rplK. Potom boli na základe SEQ ID No. 1 odvodené nasledujúce prajmery:

Pl-up (pozri tiež SEQ ID No. 5):

5'-AGG AGC AGG CTG TTG TCA CC -3'

P2-down (pozri tiež SEQ ID No. 6):

5'-GCG GAT AGC TAC GTC GAT GG -3'

Znázornené oligonukleotidy boli syntetizované firmou ARK Scientific (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstadt, Nemecko) a vykonaná PCR-reakcia pri použití Pfu-DNApolymerázy (Stratagene, La Jolla, USA) a termálneho cyklátoru PTC-100 (MJ Research'Inc., Waltham, USA).

Pri PCR sa nechal 35krát prebehnúť cyklus, skladajúci sa z tepelnej denaturácie (94°C, 90 sekúnd), chladenie (58°C, 90 sekúnd) a polymerázovej reakcie (72°C, 90 sekúnd) . Takto získaný 1200 bp fragment DNA bol potom pomocou Qiagen PCR Purification Spin Kits (Qiagen, Hilden, Nemecko) vyčistený.

Na klonovanie amplifikátu DNA, obsahujúceho gén rplK, na plazmid, ktorý sa môže replikovať v C. glutamicum, bol pripravený plazmid pECM3, derivát s deléciou opísaného plazmidu pECM2 (Tauch et al., FEMS Microbiological Letters, 123, 343-347 (1994)). Pre to bol restringovaný plazmid pECM2 reštrikčnými enzýmami BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko) a BglII (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko) a ošetrený T4-ligázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko), ako v práci Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), čím bol získaný plazmid pECM3. Transformácia Grantom et al. opísaného (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87:4645-4649 (1990)) kmeňa E. coli DH5aMCR plazmidom pECM3 sa vykonávala tak, ako opísal Tauch et al. (FEMS

Microbiological Letters, 123, 343-347 (1994)). Transformanty boli selektovné na LBG-agare (10 g Tryptonu, 5 g kvasnicového extraktu, 5 g NaCl, 2 g glukózy, 15 g agaru na liter), ku ktorému bol pridaný chloramfenikol (Merck, Darmstadt, Nemecko) (50 mg/1).

Potom bol 1200 bp amplifikát DNA obsahujúci gén rplK zmiešaný s plazmidom pECM3, ktorý bol vopred linearizovaný reštrikčným enzýmom Smal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko), a ošetrený T4-DNA-ligázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko), čim bol získaný plazmid prplK. Transformácia kmeňa E. coli DH5aMCR plazmidom prplK sa vykonala tak, ako opísal Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123, 343-347 (1994)), a transformanty boli selektované na LBG-agare, ku ktorému bol pridaný chloramfenikol (Merck, Darmstadt, Nemecko) (50 mg/1). Plazmid prplK tým nesie kompletný gén rplK z C. glutamicum a môže autonómne replikovať ako v E. coli, tak v C. glutamicum.

Príklad 4

Zabudovanie delécie do génu rplK

Pomocou PCR-techniky bola pripravená alela génu rplK, označená ako ArplK, ktorá nesie 12 bp dlhú deléciu. Produkovaná 12 bp delécia v géne rplK vedie k strate tetrapeptidu „prolín-alanín-leucín-glycín v N-koncovom úseku Lll-proteínu C. glutamicum.

Ako prajmer na výrobu alely s deléciou rplK boli okrem prajmerov Pl-up a P2-down, opísaných v príklade 3, použité oligonukleotidy opísané ďalej, ktoré boli pripravené firmou ARK Scientific (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstadt, Nemecko).

Pl-down (pozri tiež SEQ ID No. 7):

5'-extenze-CGC CGT GAG C-5'-strana-GCC AAC TGG AGG AGC AGG GT-3'

P2-up (pozri tiež SEQ ID No. 8):

'-extenzia-TCC AGT TGG C-5'-strana-GCC CAC GGC GTC AAC ATC AG-3'

Prajmery použité na PCR boli odvodené zo známej sekvencie DNA. Tie obsahujú vždy 10 bp 5'-extenziu, ktorá je exaktne komplementárna k 5'-stranám prajmeru Pl-up a P2down. Z C. glutamicum ATCC 13032 bola extrahovaná chromozomálnou DNA a s ňou ako maticou pri použití udaného nukleotidu Pl-up, Pl-down, P2-up a P2-down, Pfu-DNApolymerázy (Stratagene, La Jolla, USA), a termálneho cyklátoru PTC-100 (MJ. Research .Inc., Waltham, USA) najskôr v oddelených reakciách PCR vyrobené dva 600 bp fragmenty DNA. Pri týchto reakciách PCR sa nechal 35krát prebehnúť cyklus, skladajúci sa z tepelnej denaturácie (94°C, 90 sekúnd), chladenia (58°C, 90 sekúnd) a polymerázovej reakcie (72°C, 90 sekúnd).

Prvý 600 bp amplifikát DNA, označený ako rplK-časť 1, bol získaný s oligonukleotidmi Pl-up a Pl-down. Obsahuje 5'-úsek génu rplK (nukleotid 1-87) a navyše extenziu 10 bp pochádzajúcu z oligonukleotidu Pl-down, ktorá zodpovedá nukleotidom 100-109 génu rplK (SEQ ID No. 1) . Tým vykazuje tento amplifikovaný úsek génu medzeru 12 bp v porovnaní s použitou chromozomálnou šablónou DNA. Druhý 600 bp fragment DNA, rplK-časť 2, bol získaný s oligonukleotidmi P2-down a P2-up a zahŕňa 3'-úsek génu rplK (nukleotid 78435) a nesie identickú medzeru (nukleotid 88-99) vnútri amplifikovaného úseku rplK génu. Obidva tieto 600 bp amplifikáty DNA vykazujú v dôsledku toho 20 bp prekryvný úsek DNA. Obidva 600 bp PCR-produkty rplK-část 1 a rplK-časť 2 boli v ďalšej reakcii PCR použité ako šablóny DNA, pričom sa na základe prekryvného, komplementárneho úseku DNA mohol naviazať „provazec tam rplK-části 1 s povrazcom späť rplK-časti 2. Extenzia tohto prekryvného úseku DNA respektíve prídavok oligonukleotidov Pl-up a P2-down, viedla k produkcii 1200 amplifikátu PCR, ktorý zahŕňa 12 bp derivát s deléciou génu rplK C. glutamicum. Pri týchto reakciách PCR sa nechal 35krát prebehnúť cyklus, skladajúci sa z tepelnej denaturácie (94°C, 90 sekúnd), chladenia (58°C, 90 sekúnd) a polymerázovej reakcie (72°C, 90 sekúnd).

Sekvencia nukleotidov alely ArplK je znázornená v SEQ ID No. 3 a variant proteínu Lll kódovaného touto alelou v SEQ ID No. 4. Tomuto Lll-proteínovému variantu chýba tetrapeptid „prolín-alanín-leucín-glycín zodpovedajúci pozíciám aminokyselín 30 až 33 divokej formy Lll-proteínu, znázorneného v SEQ ID No. 2.

Príklad 5

Zabudovanie alely ArplK do chromozómu

Alela ArplK, ktorá obsahuje 12 bp deléciu v géne rplK, bola prostrednictvom integračnej mutagenézy za prijatia pomocného sacB-systému, ktorý opísal Schäfer et al., Gene, 14, 69-73 (1994), zabudovaná do chromozómu C. glutamicum. Tento systém dovoľuje odborníkovi identifikáciu respektíve selekciu výmen alel, ktoré sa vykonávajú homologickou rekombináciou.

1. Konštrukcia výmenného vektoru ArplK

V príklade 4 získaná 1200 bp alela ArplK s deléciou rplK bola pomocou Qiagen PCR Purification Spin Kits (Qiagen,

Hilden, Nemecko) vyčistená a použitá na ligáciu opísaného (Schäfer et al., Gene, 14, 69-73 (1994)) mobilizovatelného klonovacieho vektoru pK18mobsacB. Tento vektor bol vopred linearizovaný reštrikčným enzýmom Smal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko), zmiešaný s alelou s deléciou rplK a ošetrený T4-DNA-ligázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko).

Výsledkom bol plazmid pArplK.

Transformácia kmeňa DH5a E. coli s plazmidom pArplK sa uskutočnila tak, ako to opísal Tauch et al., (FEMS Microbiological Letters, 123, 343-347 (1994). Transformanty boli selektované na LBG-agare, ku ktorému bol pridaný kanamycín (Merck, Darmstadt, Nemecko) (50 mg/1). Týmto spôsobom vznikol kmeň DH5a/pArplK.

Bol vybraný jeden kloň a označený ako ATCC13032ArplK.

2. Vykonanie výmeny alely

Chromozomálna 12 bp delécia v géne rplK z C. glutamicum bola získaná pomocou integračnej mutagenézy pri pomoci pomocného sacB-systému, ktorý opísal Schäfer et al., Gene, 14, 69-73 (1994). Tento systém dovoluje odborníkovi identifikáciu respektíve selekciu výmen alel, ktoré sa uskutočňujú homologickou rekombináciou.

Mobilizovatelný plazmid pArplK bol - vychádzajúc zo Šimonom et al., Bio/Technology, 1, 784-794 (1993) opísaného donorového kmeňa, E. coli S17-1 - pomocou konjugačnej metódy, ktorú opísal Schäfer et al., Journal of Bacteriology, 172, 1663-1666 (1990), zavedený ako recipient do kmeňa C. glutamicum ATCC 13032. PrEtože plazmid pArplK sa nemôže replikovať v C. glutamicum, je jeho etablovanie možné len integráciou do chromozómu C. glutamicum cestou homologickej rekombinácie medzi fragmentom s deléciou rplK kódujúcim plazmid a identickým chromozomálnym úsekom rplK. Transkonjuganty boli selektované na LBG-agare, ku ktorému bol pridaný kanamycín (25 mg/1) (Merck, Darmstadt, Nemecko) a nalidixínová kyselina (Merck, Darmstadt, Nemecko) (50 mg/1).

Pre nasledujúcu exciziu plazmidu pArplK pomocou sacBsystému mohol byť selektovaný z rplK iba v prítomnosti alely divokého typu. Na to bol plazmid prplK konštituovaný v príklade 3, ktorý nesie kompletný gén rplK, transferovaný elektroporáciou metódou podľa Liebla et al., FEMS Microbiological Letters 65, 299-304 (1989) do kmeňa integrantov. Selekcia kmeňa sa vykonávala na LBG-agare, ku ktorému bol pridaný kanamycín (25 mg/1) (Merck, Darmstadt, Nemecko) a chloramfenikol (10 mg/1) (Merck, Darmstadt, Nemecko).

Vybraná, transformovaná kolónia bola preočkovaná v 100 -ml--LBG--kvapalnéhe>-média - (v-Erl-enmeyerovej- banke-250 ml so šikanami) a inkubovaná 24 hodín pri 30°C a 300 otáčkach za minútu. Potom bolo vždy 2xl0⁶ buniek/ml tejto kvapalnej kultúry rozprestrených na LBG-agar, ktorý obsahoval 10 % sacharózy (Merck, Darmstadt, Nemecko) a inkubovaných 48 hodín pri 30°C. Bunky C. glutamin, ktoré boli schopné rast na tomto prostredí, stratili integrovaný plazmid pArplK dôsledkom druhého rekombinačného javu medzi alelou s deléciou rplK a prirodzeným úsekom rplK. Tento druhý rekombinační jav vedie buď k obnove prirodzeného, chromozomálneho usporiadania génu rplK, alebo je jeho výsledkom produkcia ArplK-mutantu, ktorý stratil 12 bp Nkoncový fragment DNA. Z vybraných, voči „sacharóze rezistentných a potenciálnych buniek C. glutamicum nesúcich pArplK bola extrahovaná chromozomálna DNA. Ta slúžila ako matrica, s ktorou boli pri použití sekvencie rplK odvodené oligonukleotidy Pdel-up a P-del-down2 (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstadt, Nemecko). S prajmermi, Pfu-DNApolymerázou (Stratagene, La Jolla, USA) a termálnym cyklátorom PTC 100 (MJ Research Inc., Waltham, USA) boli vykonané PCR-experimenty. Pri PCR sa nechal 35krát prebehnúť cyklus, skladajúci sa z tepelnej denaturácie (94°C, 90 sekúnd), chladenia (58°C, 90 sekúnd) a polymerázovej reakcie (72°C, 90 sekúnd) . Takto získané amplifikáty DNA boli potom pomocou Qiagen PCR Purification Spin Kits (Qiagen, Hilden, Nemecko) vyčistené. Analýza sekvencií nukleotidov vyčistených amplifikátov, ktoré boli pripravené tak, ako to bolo opísané skôr, priniesla to, že v 43 % prípadov bol vyprodukovaný amplifikát DNA, ktorému chýbal 12 bp úsek DNA. Dôsledkom toho v príslušných transkonjugantoch nesúcich pArplK viedol druhý rekombinačný jav k produkcii chromozomálnej 12 bp delécie v géne rplK.

Nakoniec bol z vybraných transkonjugátov nesúcich deléciu—odstránený—plazmid- -prplK—metódou—,_rplazmid.-curings opísanou Schäferom et al., Journal of Bacteriology, 176, 7309-7319 (1990). Takto získaný kmeň C. glutamicum ATCC13032 ArplK nesie tak chromozomálnu 12 bp deléciu vnútri génu rplK, čo vedie k strate tetrapeptidu „prolín-alanin-leucínglycín proteínu Lll.

Príklad 6

Príprava lyzínu

Kmeň C. glutamicum ATCC13032 ArplK, ktorý bol získaný v príklade 5, bol kultivovaný v živnom prostredí vhodnom na produkciu lyzínu a bol stanovený obsah lyzínu v zvyšku kultúry.

Na to bol kmeň najskôr inkubovaný na agarovej doske (agar mozog-srdce) 24 hodín pri 33°C. Z tejto kultúry na agarovej doske bola naočkovaná predkultúra (10 ml média v

100 ml Erlenmeyerovej banke). Ako médium pre predkultúru bolo použité kompletné médium CglII ( 10 g/1 Bacto-Peptonu, g/1 kvasnicového extraktu, 2,5 g/1 NaCI, 20 g/1 glukózy, pH 7,4). Predkultúra bola inkubovaná 24 hodín pri 33°C pri 240 rpm na trepačke. Z tejto predkultúry bola naočkovaná hlavná kultúra, takže počiatočná OD (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1 OD. Pre hlavnú kultúru bolo použité médium MM.

Médium MM

CSL (Corn Steep Liquor) 5 g/1

MOPS (morfolinopropánsulfónová kyselina) 20 g/1 glukóaa (oddelene autoklávovaná) 50 g/1 (NH₄)₂SO₄ 25 g/1

KH₂PO₄ 0,1 g/1

MgSO₄ * 7 H₂O 1,0 g/1 jCaCla*-2.HaO--------------------------......_ .. ..........lCĽmg/1. .

FeSO₄ * 7 H₂O 10 mg/1

MnS0₄ * H₂O 5,0 mg/1 biotín (sterilné filtrovaný) 0,3 mg/1 tiamín * HCI (sterilné filtrovaný) 0,2 mg/1

CaCO₃ 25 g/1

CSL, MOPS a solný roztok sa nastaví čpavkovou vodou na pH 7 a autoklávujú sa. Potom sa pridajú sterilné roztoky substrátu a vitamínu, ako tiež suchý autoklávovaný CaCO₃.

Kultivácia sa vykonáva v objeme 10 ml v 100 ml Erlenmeyerových bankách s šikanami. Kultivácia bola vykonávaná pri 33°C a 80% vzdušnej vlhkosti.

Po 48 hodinách sa zisťovala OD pri vlnovej dĺžke merania 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Miinchen) . Vyprodukované množstvá lyzínu boli určené analyzátorom aminokyselín firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) iónomeničovou chromatografiou a postkolónovou derivatizáciou s ninhydrínovou detekciou.

r β r r p r

V tabulke I je znázornený výsledok pokusu.

Tabulka 1

Kmeň	OD(660)	Lyzín-HCl g/i
ATCC13032 ArplK	13,0	0,98
ATCC13032	13,8	0,0

Prehľad obrázkov na výkresoch Obr. 1 Karta plazmidu pÄrplK

Použité skratky a označenia majú nasledujúci význam:

pdeltarplK pArplK sacB-gen gén sacB z Bacillus suptilis, kódujúci enzým levansacharáza lacZ-alpha' časť 5'-konca génu β-galaktozidázy oriV počiatok replikácie

KmR: rezistencia ku kanamycínu

RP4 mob úsek mob plazmidu RP4

BamHI: miesto strihu reštrikčného enzýmu BamHI

EcoRl: miesto strihu reštrikčného enzýmu EcoRl

ArplK: alela rplK s deléciou 12 bp v N-koncovej oblasti ' f

P *

SEKVENČNÝ PROTOKOL <110> Degussa-Hiils Ag <120> Nové nukleotidové sekvencie kódujúce rplK-gén <130> 990178 BT <140>

<141>

<160> 8 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 835 ' <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> CDS <222> (201)..(635) <223> rplK-Gén <4G0> 1 ttgcgtgtag ggtagacaat cgcgtgtttt ttaagcatgc tcaaaatcat tcatccccgg 60 tggcccggtt acgtaaagat cagcaaagat gatcaactaa agcgatcatc tgaagttgta 120 gegggaccga gcatccggac ggttactagt ggggtttcat cgtcccagtt gtggccggta 180 acaaggaagc aggtttaacg atg get cct aag aag aag aag aag gtc act ggc 233 Met Ala Pro Lys Lys Lys Lys Lys Val Thr Gly

10

ctc atc aag ctc cag

atc cag gca gga cag gca aac cct

get Ala 25

cct Pro

cca Pro

261

Leu íle Lys Leu

Gin

íle

Gin

Ala

Gly 20

Gin Ala

Asn

Pro

15

gtt

ggc

cca

gca

ctt

ggt

get

cac

ggc

gtc

aac

atc

atg

gaa

ttc

tgc

329

Val

Gly

Pro

Ala

Leu

Gly

Ala

His

Gly

Val

Asn

íle

Met

Glu

Phe

Cys

30

35

40

aag

get

tac

aac

get

gcg

act

gaa

aac

cag

ege

ggc

aac

gtt

gtt

cct

377

Lys

Ala

Tyr

Asn

Ala

Ala

Thr

Glu

Asn

Gin

Arg

Gly

Asn

Val

Val

Pro

45

50

55

gtt

gag

atc

acc

gtt

tac

gaa

gac

cgt

tca

ttc

gac

ttc

aag

ctg

aag

425

Val

Glu

íle

Thr

Val

Tyr

Glu

Asp

Arg

Ser

Phe

Asp

Phe

Lys

Leu

Lys

60

65

70

75

act

cct

cca

get

gca

aag

ctt

ctt

ctg

aag

get

get

ggc

ctg

cag

aag

473

Thr

Pro

Pro

Ala

Ala

Lys

Leu

Leu

Leu

Lys

Ala

Ala

Gly

Leu

Gin

Lys

80

85

90

ggc

tcc

ggc

gtt

cct

cac

acc

cag

aag

gtc

ggc

aag

gtt

tcc

atg

get

521

Gly

Ser

Gly

Val

Pro

His

Thr

Gin

Lys

Val

Gly

Lys

Val

Ser

Met

Ala

95

100

105

cag

gtt

cgt

gag

atc

get

gag

acc

aag

aag

gaa

gac

ctg

aac

get

ege

569

Gin

Val

Arg

Glu

íle

Ala

Glu

Thr

Lys

Lys

Glu

Asp

Leu

Asn

Ala

Arg

110

115

120

Gin

Arg 50

Gly

Asn

Val

Val

Pro 55

Val

Glu

íle

Thr Val 60

Tyr

Glu

Asp

Arg

Ser 65

Phe

Asp

Phe

Lys

Leu 70

Lys

Thr

Pro

Pro

Ala Ala 75

Lys

Leu

Leu

Leu 80

Lys

Ala

Ala

Gly

Leu 85

Gin

Lys

Gly

Ser

Gly 90

Val.Pro.

His

Thr

Gin 95

Lys

Val

Gly

Lys

Val 100

Ser

Met

Ala

Gin

Val 105

Arg

Glu'íle

Ala

Glu 110

Thr

Lys

Lys

Glu

Asp 115

Leu

Asn

Ala

Arg

Asp 120

íle

Asp

Ala Ala

Ala 125

Lys

íle

íle

Ala

Gly 130

Thr

Ala

Arg .Ser

Met 135

Gly

íle

Thr

Val Glu 140

Gly

<210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Prajmer Pl-up <220>

<223>-Opi.S—umelej—sekvenie: prajmer-:<400> 5 aggagcaggc tgttgtcacc <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> P2-down <220>

<223> Opis umelej sekvenie: prajmer <400> 6 gcggatagct acgtčgatgg 20 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Pl-down <220>

<223> Opis umelej sekvenie: prajmer <400> 7 cgccgtgagc gccaactgga ggagcagggt <210> 8 gat atc gac get get gcg aag atc atc get ggt acc. get cgt tcc atg 617

Asp íle Asp Ala Ala Ala Lys íle íle Ala Gly Thr Ala Arg Ser Met

125 130 135 ggc atc acc gtc gaa ggc taaaagcttt cacaccggtt agtggctcat 665

Gly íle Thr Val Glu Gly 140 145 . tcaaaatgaa tggccaccaa ccaattttca ccaaagtttt atgtggcagg gccagctccg 725 gcccgttaaa ccacagaatt ccatgaaagg gaatttctaa tgagcaagaa ctctaaggcg 785 taccgcgagg ccgctgagaa gatcgacgct ggtcgcatct actccccact 835 <210> 2 <211> 145 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2

Met Ala Pro Lys Lys Lys Lys Lys Val Thr Gly Leu íle Lys Leu Gin

5 10 15 .

íle Gin Ala Gly Gin -Ala Asn Pro Ala Pro Pro Val Gly Pro Ala Leu

25 30

-Gly—Al-a—H-i-s—€-l-y—Va 1—Asn-il-e· 35

Ala	Thr 50	Glu	Asn	Gin	Arg	Gly 55
Tyr 65	Glu	Asp	Arg	Ser	Phe 70	Asp
Lys	Leu	Leu	Leu	Lys 85	Ala	Ala
His	Thr	Gin	Lys 100	Val	Gly	Lys
Ala	Glu	Thr 115	Lys	Lys	Glu	Asp
Ala	Lys 130	íle	íle	Ala	Gly	Thr 135

40	45	-ÄiTr
Asn	Val	Val	Pro	Val 60	Glu	íle	Thr	Val
Phe	Lys	Leu	Lys 75	Thr	Pro	Pro	Ala	Ala 80
Gly	Leu	Gin 90	Lys	Gly	Ser	Gly	Val 95	Pro
Val	Ser 105	Met	Ala	Gin	Val	Arg 110	Glu	íle
Leu 120	Asn	Ala	Arg	Asp	íle 125	Asp	Ala	Ala
Ala	Arg	Ser	Met	Gly 140	íle	Thr	Val	Glu

Gly ^r ? 145 <210> 3 <211> 825 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> CDS <222> (200)..(622) <223> delta rplK <400> 3 tgcgtgtagg gtagacaatc gcgtgttttt taagcatgct caaaatcatt catccccggt 60 ggcccggtta cgggaccgag caaggaagca cgtaaagatc agcaaagatg catccggacg gttactagtg ggtttaacg atg get cct Met Ala Pro atcaactaaa gcgatcatct gaagttgtag gggtttcatc gtcccagttg tggccggtaa aag aag aag aag aag gtc act ggc Lys Lys Lys Lys Lys Val Thr Gly .10

120

180

232

ctc Leu

atc aag ctc

cag Gin

atc cag gca. íle Gin Ala

gga cag gca aac

cct get cct cca

280

íle Lys

Leu 15

Gly 20

Gin

Ala

Asn

Pro Ala 25

Pro

Pro

gtt

ggc

get

cac

ggc

gtc

aac

atc

atg

gaa

ttc

tgc

aag

get

tac

aac

328

Val

Gly

Ala

His

Gly

Val

Asn

íle

Met

Glu

Phe

Cys

Lys

Ala

Tyr

Asn

30

35

40

get

gcg

act

gaa

aac

cag

ege

ggc

aac

gtt

gtt

cct

gtt

gag

atc

acc

376

Ala

Ala

Thr

Glu

Asn

Gin

Arg

Gly

Asn

Val

Val

Pro

Val

Glu

íle

Thr

45

50

55

gtt

tac

gaa

gac

cgt

tca

ttc

gac

ttc

aag

ctg

aag

act

cct

cca

get

424

Val

Tyr

Glu

Asp

Arg

Ser

Phe

Asp

Phe

Lys

Leu

Lys

Thr

Pro

Pro

Ala

60

65

70

75

gca

aag

ctt

ctt

ctg

aag

get

get

ggc

ctg

cag

aag

ggc

tcc

ggc

gtt

472

Ala

Lys

Leu

Leu

Leu

Lys

Ala

Ala

Gly

Leu

Gin

Lys

Gly

Ser

Gly

Val

80

85

90

cct cac

acc cag

aag gtc ggc aag

gtt tcc atg get cag gtt

cgt Arg

gag Glu

520

Pro

His

Thr

Gin 95

Lys

Val

Gly Lys

Val 100

Ser

Met

Ala

Gin

Val 105

atc

get

gag

acc

aag

aag

gaa

gac

ctg

aac

get

ege

gat

atc

gac

get

568

íle

Ala

Glu

Thr

Lys

Lys

Glu

Asp

Leu

Asn

Ala

Arg

Asp

íle

Asp

Ala

110

115

120

get

gcg

aag

atc

atc

get

ggt

acc

get

cgt

tcc

atg

ggc

atc

ácč

gtc

616

Ala

Ala

Lys

íle

íle

Ala

Gly

Thr

Ala

Arg

Ser

Met

Gly

íle

Thr

Val

125

130

135

gaa ggc taaaagcttt cacaccggtt agtggctcat tcaaaatgaa tggccaccaa 672

Glu Gly

140 ccaattttca ccatgaaagg gatcgacgct ccaaagtttt gaatttctaa ggtcgcatct atgtggcagg gccagctccg gcccgttaaa ccacagaatt 732 tgagcaagaa ctctaaggcg taccgcgagg ccgctgagaa 792 actccccáct ega 825 <210> 4 <211> 141 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4 Met Ala 1

Pro

Lys

Lys 5

Lys

Lys

Lys

Val

Thr 10

Gly

Leu

íle

Lys

Leu 15

Gin

íle

Gin

Ala

Gly 20

Gin

Ala

Asn

Pro

Ala 25

Pro

Pro

Val

Gly

Ala 30

His

Gly

Val

Asň

íle 35

Met

Glu

Phe

Cys

Lys 40

Ala

Tyr

Asn

Ala

Ala 45

Thr

Glu

Asn

<211> 30 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> P2-up <220>

<223> Opis umelej sekvenie: prajmer <400> 8

Iccagtlggc gclcacggcg Icaacalcag

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY • 1. Izolovaný polynukleotid z koryneformných baktérií, ktorý obsahuje sekvenciu polynukleotidov, zvolenú zo skupiny

   a) polynukleotidu, ktorý je aspoň zo 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, obsahujúci sekvenciu aminokyselín SEQ ID No. 2,

   b) polynukleotidu, ktorý kóduje polypeptid, obsahujúci sekvenciu aminokyselín, ktorá je aspoň zo 70 % identická so sekvenciou aminokyselín SEQ ID No. 2,

   c) polynukleotidu, ktorý je komplementárny k polynukleotidom a) alebo b) , a ______d) polynukleotidu,_obsahujúceho aspoň 15 po sebe idúcich báz sekvencie polynukleotidov a), b) alebo c.
2. 2. Polynukleotid podlá nároku 1, pričom polynukleotid je replikovatelná, s výhodou rekombinantná DNA.
3. 3. Polynukleotid podľa nároku 1, pričom polynukleotid je RNA.
4. 4. Polynukleotid podlá nároku 2, obsahujúci sekvenciu nukleových kyselín, ako je znázornené v SEQ ID No. 1.
5. 5. Sekvencie polynukleotidov podlá nároku 2, kódujúce polypeptid, ktorý obsahuje sekvenciu aminokyselín ako je znázornené v SEQ ID No. 2.
6. 6. Polynukleotid podlá nároku 1, najmä bodu d, obsahujúci sekvenciu nukleotidov, ako je znázornené v SEQ ID No. 3.

   r r
7. 7. Polynukleotid podía nároku 1, najmä bodu d, kódujúci polypeptid, ktorý obsahuje sekvenciu nukleotidov, znázornenú v SEQ ID No. 4.
8. 8. Replikovatelná DNA podía nároku 2, obsahujúca (i) sekvenciu nukleotidov, ukázanú v SEQ-ID-No. 1, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii (i) vnútri úseku degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje sekvenciu komplementárnu k sekvencii (i) alebo (ii), a prípadne (iv) funkčne verné zmysluplné mutanty v (i).
9. 9. Vektor, obsahujúci polynukleotid podía nároku 1, uložený v E. coli, DH5a/pArpk ako DSM 13158, znázornený

   v SEQ ID No. 3 a na obrázku 1. 1 10. Ako hostiteľská bunka slúžiace koryneformné baktérie, ktoré obsahujú v géne rplK deléciu alebo inzerciu. 11. Spôsob prípravy L-aminokyselín, najmä L-lyzínu,

   vyznačujúci sa tým, že sa vykonávajú nasledujúce kroky:

   a) fermentácia baktérií produkujúcich žiadanú L-aminokyselinu, v ktorých sa zoslabuje aspoň gén rplK,

   b) obohatenie žiadanou aminokyselinou v médiu alebo v bunkách baktérií a

   c) izolovanie L-aminokyseliny.
10. 12. Spôsob podía nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa navyše zosilňujú ďalšie gény v procese biosyntézy požadovanej L-aminokyseliny.

    * · * r e e P · n p

    P P p
11. 13. Spôsob podía nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa aspoň sčasti vypoja procesy látkovej výmeny, ktoré tvorbu požadovanej aminokyseliny zoslabujú.
12. 14. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa zníži expresia polynukleotidu podľa nároku 1, najmä 1 a až 1

    d.
13. 15. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa redukujú katalytické vlastnosti polypeptidu (enzýmového proteínu), ktorý kóduje polynukleotid podľa nároku 1, najmä 1 a až 1 d.
14. 16. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa na zoslabenie produkuje inzertná mutagenéza pri použití plazmidu pArpk, znázorneného na obr. 1 a uloženého ako DSM 13158.
15. 17. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa na prípravu L-aminokyselin, najmä L-lyzínu, fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne preexprimuje jeden alebo viac génov, vybraných zo skupiny

    17.1 gén dapA, kódujúci dihydrodipikolinát-syntázu

    17.2 gén lysC kódujúci „feed back resistentnú aspartát-kinázu

    17.3 fragment DNA, sprostredkovávajúci S-(2-aminoetyl)-cysteínovú rezistenciu

    17.4 gén pyc, kódujúci pyruvát-karboxylázu,

    17.5 gén pyc (Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology)

    17.6 gén mqo kódujúci malát:chinón oxidoreduktázu

    17.7 gen lysE kódujúci export lyzínu

    17.8 gén zwal.
16. 18. Spôsob podía nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa na prípravu aminokyselín, najmä L-lyzínu fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zoslabuje jeden alebo viac génov vybraných zo skupiny

    18.1 gén pck kódujúci fosfoenolpyruvát-karboxykinázu,

    18.2 gén pgi kódujúci glukózo-6-fosfát-izomerázu,

    18.3 gén poxB, kódujúci pyruvát-oxidázu,

    18.4 gén zwa2 alebo

    18.5 gén rela kódujúci PPGPP-syntetázu I.
17. 19. Spôsob podlá jedného alebo niekoľkých predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa používajú mikroorganizmy rodu Corynebacterium glutamicum.
18. 20. Používanie sekvencií polynukleotidov podľa nároku 1 ako prajmerov na prípravu DNA génov, ktoré rozvíjajú účinok zodpovedajúci génu rplK polymerázovou reťazovou reakciou.
19. 21. Používanie sekvencií polynukleotidov podľa nároku 1 ako hybridizačných sond.