CN104561076B - 一种高产l‑丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的构建及其发酵方法 - Google Patents
一种高产l‑丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的构建及其发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本专利提出了代谢工程改造和发酵工艺相结合的策略，一方面通过代谢工程手段转变代谢流从糖酵解途径流向L‑丝氨酸合成途径，提高了L‑丝氨酸的糖酸转化效率；另一方面通过添加营养成分满足代谢改造后导致的谷氨酸棒杆菌对营养物质的需求，解决菌体生长缓慢的问题，提高L‑丝氨酸的生产强度。
Description
技术领域
高产L-丝氨酸菌株谷氨酸棒杆菌的构建及其发酵工艺，本发明涉及微生物利用糖质原料生产L-丝氨酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术
L-丝氨酸属于非必需氨基酸，具有重要的生理功能和应用价值，广泛应用于医药、食品和化工领域。目前L-丝氨酸的生产主要依赖于蛋白水解法、酶法转化法及微生物前体发酵法，然而这些方法存在产量小，生产成本高，环境污染大等问题，不适合进行大规模工业化生产L-丝氨酸。微生物发酵法利用可再生的糖质原料直接代谢生产L-丝氨酸是一种绿色环保可持续的生产方式，已经成为研究L-丝氨酸工业化生产的热点。然而这种生产方法由于受到菌株的限制，始终没有获得进一步的突破，这也使得L-丝氨酸成为瓶颈氨基酸。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是重要的氨基酸生产菌株，广泛应用于发酵法生产谷氨酸、赖氨酸和缬氨酸等。谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的主要代谢网络图见图1。目前在构建高产L-丝氨酸的菌株研究中，主要集中于解除L-丝氨酸对L-丝氨酸合成途径关键酶3-磷酸甘油酸(PGDH)的反馈抑制现象，降低L-丝氨酸的降解途径等。本实验室以一株诱变的谷氨酸棒杆菌33a(CGMCC No.8667)通过解除L-丝氨酸对PGDH的反馈抑制，降低L-丝氨酸的降解的手段获得了能够利用蔗糖直接发酵生产L-丝氨酸的重组菌株33a ΔSS。与此同时，在L-丝氨酸合成的途径中存在着代谢流的竞争现象，过量的改变代谢流流向L-丝氨酸途径会导致减少代谢流流向丙酮酸途径和三羧酸循环，这会显著的降低谷氨酸棒杆菌的生长速率。通过代谢工程的手段虽然能够有效的提高L-丝氨酸的糖酸转化率，但是由于减少了代谢流流向三羧酸循环会导致谷氨酸棒杆菌生产速率降低，直接影响L-丝氨酸的生产效率，不利于工业化生产L-丝氨酸，这也成为微生物发酵法生产L-丝氨酸亟需解决的难题。为了解决代谢流过量流向L-丝氨酸途径导致L-丝氨酸的生产效率降低的问题，本专利提出了代谢工程改造和发酵工艺相结合的策略，一方面通过代谢工程手段转变代谢流从糖酵解途径流向L-丝氨酸合成途径，提高了L-丝氨酸的糖酸转化效率；另一方面通过添加营养成分满足代谢改造后导致的谷氨酸棒杆菌对营养物质的需求，解决菌体生长缓慢的问题，提高L-丝氨酸的生产强度。
发明内容
本发明的目的是为了提高谷氨酸棒杆菌利用可再生的糖质原料(如蔗糖)产L-丝氨酸的产量，糖酸转化率和生产强度。通过代谢工程的手段改变蔗糖代谢流量流向L-丝氨酸途径，提高L-丝氨酸产量和糖酸转化率，同时通过添加营养成分玉米浆提高谷氨酸棒杆菌的生长速率和蔗糖消耗速率，使L-丝氨酸的生产强度得到进一步提高。本发明选用的菌株为保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年12月31日，保藏编号为CGMCCNo.8666，分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)33aΔSS。
选择将代谢流流向L-丝氨酸竞争途径，即支链氨基酸方向的关键酶缬氨酸：丙酮酸氨基转移酶的编码基因avtA在基因组水平上进行敲除，随后进一步对代谢流流向该途径的限速酶乙酰羟酸合酶(AHAS)在基因组水平上进行了弱化，使代谢流成功的从支链氨基酸方向流向了L-丝氨酸合成方向，最终获得了一株缬氨酸：丙酮酸氨基转移酶敲除，乙酰羟酸合酶弱化的重组谷氨酸棒杆菌33a ΔSS ΔavtAΔC-T ilvN。将该菌株在有添加营养成分玉米浆的发酵培养基上进行培养，能够有效的提高细胞的生长速率及L-丝氨酸的产量，糖酸转化率和生产强度。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
分别按照如下实验方案将avtA进行基因敲除和对乙酰羟酸合酶(AHAS)进行弱化，最后获得重组谷氨酸棒杆菌33a ΔSS ΔavtAΔC-T ilvN。
1)基因扩增：根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息，设计引物以谷氨酸棒杆菌33a ΔSS基因组DNA为模板，分别扩增目的基因上游序列和下游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的片段，再将该片段连接至pMD19-T，对目的基因序列进行测序验证，确证重组克隆质粒序列的准确性；
2)重组敲除质粒的构建：将所述步骤(1)中的连接有目的片段进行双酶切处理，将目的片段连接至相同双酶切处理的质粒pK18mobsacB，转化至E.coli JM109感受态细胞，筛选验证阳性克隆；
3)基因的重组整合：提取步骤(2)构建的用于目的基因整合修饰的重组质粒pK18mobsacB-geneX，电激转化至谷氨酸棒杆菌33a ΔSS及其系列衍生菌株感受态细胞，通过两次筛选获得成功敲除目的基因的重组菌株。
4)重组菌株的验证：利用引物通过PCR扩增验证重组菌株。重复上述实验即可获得了重组谷氨酸棒杆菌33a ΔSS ΔavtAΔC-T ilvN。
5)将步骤(4)获得的重组菌株在接种至含有2g/L的玉米浆的发酵培养基中发酵培养96h，定时取样检测生物量，糖浓度和氨基酸浓度。
其中步骤(5)所述的发酵培养基为(g/L):蔗糖100；硫酸铵30；碳酸钙60；MgSO4·7H2O 0.5；FeSO4·7H2O 0.02；MnSO4·H2O 0.02；原儿茶酸30mg；生物素50μg；硫胺素450μg；调节初始pH为7.2。
本发明的的优点和积极效果如下：
通过代谢工程的手段成功的将代谢流从糖酵解途径流向支链氨基酸方向转向了L-丝氨酸合成途径，提高了重组菌株的L-丝氨酸的产量和糖酸转化率。通过添加营养物质玉米浆成分能够有效的补给由于代谢流改变导致菌株对营养物质的需求，提高了菌株的生长速率，蔗糖的利用速率，进一步的提高了L-丝氨酸的生产强度。这样结合代谢工程的手段和发酵工艺优化的策略成功的提高了L-丝氨酸的产量，糖酸转化率和生产强度，是非常适合工业化大规模生产L-丝氨酸，有效的解决了微生物发酵利用糖质原料生产L-丝氨酸存在产量低，生产强度弱的问题。
附图说明
图1为谷氨酸棒杆菌生产L-丝氨酸的代谢网络示意图
图2为用于基因avtA敲除的敲除质粒pK18mobsacBΔavtA构建图。泳道M：DL-5000DNA Marker；泳道1：引物avtA-1和avtA-2获得的上游序列；泳道2：引物avtA-3和avtA-4获得的下游序列；泳道3：引物avtA-1和avtA-4进行交叉PCR扩增上下游融合片段获得的缺失的片段ΔavtA泳道4：片段ΔavtA与敲除质粒pK18mobsacB连接后的双酶切验证
图3为重组菌33a ΔSS ΔavtA的PCR验证avta是否成功敲除图。泳道M：DL-5000DNA Marker；泳道13和14：为重组菌成功敲除基因avta后缺失片段；其他泳道为未成功敲除基因avta后的片段
图4为用于基因ilvN敲除的敲除质粒pK18mobsacBΔC-T ilvN构建图。泳道M：DL-5000DNA Marker；泳道1：引物ilvN-1和ilvN-2获得的上游序列；泳道2：引物ilvN-3和ilvN-4获得的下游序列；泳道3：引物ilvN-1和ilvN-4进行交叉PCR扩增上下游融合片段获得的缺失的片段ΔC-T ilvN泳道5：片段ΔC-T ilvN与敲除质粒pK18mobsacB连接后的双酶切验证
图5为重组菌33a ΔSS ΔavtAΔC-T ilvN的PCR验证ilvN是否成功敲除图。泳道M：DL-5000DNA Marker；泳道1,8,11和15：为重组菌成功敲除基因ilvN后缺失片段；其他泳道为未成功敲除基因ilvN后的片段
图6为比较不同菌株的乙酰羟酸合酶酶活。A：重组菌33a ΔSS；B：重组菌33a ΔSSΔavtA；C:重组菌33a ΔSS ΔavtAΔC-T ilvN
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应指出，以下实例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：重组菌谷氨酸棒杆菌33a ΔSS ΔavtA的构建
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息，设计用于构建avtA敲除的重组敲除质粒的引物，引物序列如下：
avtA-1:5’-GAAAAGCTTAAGGCCCTGCAGTAGTG-3’(HindIII)
avtA-2:5’-CCCATCTGTTAAACTTAAACCAAACGGCTGAACATTGCTT-3’
avtA-3:5’-GGTTTAAGTTTAACAGATGGGGGTGTGCGCAAAATCGG-3’
avtA-4:5’-ATTCTAGACCTGCGCTGCCACGTTGT-3’(XbaI)
分别用引物avtA-1和avtA-2扩增上游片段，以引物avtA-3和avtA-4扩增下游片段，分别用琼脂糖凝胶电泳纯化上下游片段，见图2，长度分别为507bp和548bp；分别以上游片段和下游片段作为模板，以引物avtA-1和avtA-4进行交叉PCR扩增上下游融合片段，利用琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，结果见图2。将目的片段用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切后回收片段与用相同的限制性内切酶处理的pK18mobsacB混合，T4DNA ligase过夜处理。连接产物转化至E.coliJM109。挑取单菌落培养提取质粒，HindIII和XbaI酶切鉴定，见图2，该转化子含有重组敲除质粒pK18mobsacBΔavtA。将pK18mobsacBΔavtA电击转化至谷氨酸棒杆菌33a ΔSS感受态细胞，进行两次重组和筛选，长出的单菌落包括回复野生型和目的片段缺失型，分别挑取单菌落进行PCR扩增验证基因表型，结果见图3，目的重组工程菌株PCR结果为图3泳道13和14。
实施例2：重组菌谷氨酸棒杆菌33a ΔSS ΔavtAΔC-T ilvN的构建
以实施例1构建的重组菌株作为出发菌株，将催化丙酮酸生成α-乙酰乳酸的乙酰羟酸合酶(AHAS)的编码调控基因ilvN的C末端的249bp进行精确的删除，使之乙酰羟酸合酶的酶活得到降低。设计合成如下引物用于构建敲除ilvN的重组质粒：
ilvN-1:5’-CCCAAGCTTGCTGTTTCCAGATGACCAACC-3’(HindIII)
ilvN-2:5’-GGCGATAGTGGTCTCTTCATCAAGTCGCACGACTTTGAGC-3’
ilvN-3:5’-GAAGAGACCACTATCGCCACAGCAATTAATCTGATTGC-3’
ilvN-4:5’-CGCGGATCCCGTTCAGGTTTGGCTCGATG-3’(BamHI)
具体实验步骤参考实施例1，敲除质粒pK18mobsacBΔC-T ilvN的构建图见图4。重组菌谷氨酸棒杆菌33a ΔSS ΔavtAΔC-T ilvN的验证PCR引物为：
PD1：5’-CCAAGATGGCTAATTCTGACGTCACC-3’
PD2：5’-GACTAGTCACATTTATGCAGCAGGTGC-3’
目的重组菌谷氨酸棒杆菌33a ΔSS ΔavtAΔC-T ilvN验证结果见图5泳道1,8,11和15。
实施例3：乙酰羟酸合酶(AHAS)的酶活测定方法
反应体系：100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.3),50mM丙酮酸钠,10mM MgCl2and 100μM黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。取对数期的谷氨酸棒杆菌细胞，离心去上清液后，用0.2％冰KCl洗涤3遍后，超声破碎后离心获得上清液，取一定量上清液加入到反应体系中，37℃保温20min后添加100μL 50％H2SO4终止反应。37℃保温30min后使α-乙酰乳酸生产乙偶姻，用气相色谱测定反应液中的乙偶姻的含量。一个单位的酶活设定为：每毫克蛋白每分钟生成的1nmol的α-乙酰乳酸。蛋白浓度是用Bradford法测定。乙酰羟酸合酶酶活测定结果见图6。
实施例4：重组菌株谷氨酸棒杆菌33a ΔSS ΔavtAΔC-T ilvN发酵生产L-丝氨酸
利用接种环将出发菌株和重组工程菌划线于种子培养基固体平板中，将平板置于30℃恒温培养箱中培养至长出单菌落，接种环分别划取一环菌体接种至20ml种子培养基中，30℃，120rpm培养至对数生长中期，按照5％的接种比接种至25ml摇瓶发酵培养基中，30℃，120rpm发酵96h。
其中种子培养基为(g/L)：蔗糖20；酵母粉37；玉米浆10；硫酸铵10；MgSO4·7H2O0.5；NaH2PO4 0.3；K2HPO4 0.2；
发酵取样，利用分光光度计测定生物量(OD562)，HPLC法测定发酵液中糖浓度和氨基酸浓度。
HPLC法测定发酵液中糖浓度条件如下：
柱子:Cosmosil Sugar-D(4.6×250mm)；检测器：RI；流动相：75％乙腈；样品处理：样品12000r/min离心10min,取200μL上清液，添加600μL乙醇和200μL超纯水，0.45μm滤膜过滤后上柱进样；
HPLC法测定发酵液中氨基酸浓度条件如下：
将发酵液用ddH2O稀释至合适浓度，以异硫氰酸苯酯(PITC)作为衍生剂将氨基酸衍生化，产物苯氨基酸硫甲酰衍生物(PTC-AA)在254nm有稳定的强紫外吸收，采用Venusil-AA氨基酸分析专用柱(4.6×250mm，5μm)，在紫外下检测衍生物。
流动相A相：92.6mM乙酸钠，用冰醋酸将pH调节到6.50±0.05；流动相B相：80％乙腈，流速1.0ml/min，柱温：40℃，紫外检测器波长254nm。梯度洗脱程序为：0～4min，100％A；4～16min，97％A；16～17min，89％；17～32min，79％A；32～34min，66％A；34～38min，0％A；38.01，100％A。
氨基酸标准品和样品衍生化步骤：
(1)准确量取氨基酸混合标准液及样品200μl，分别置于1.5ml离心管中；
(2)每管中准确加入正亮氨酸内标液20μl；
(3)分别向每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液100μl，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混匀，室温放置反应1h；
(4)加入正己烷400μl，剧烈震荡后放置10min；
(5)取下层PTC-AA溶液，用0.45μm针式过滤器过滤；
(6)取滤过清液100μl，加入400μl ddH2O稀释，摇匀，进样20μl
样品衍生化反应中所需的溶液如下：
三乙胺乙腈：三乙胺1.4ml+乙腈8.6ml，混匀；-20℃保存。
异硫氰酸苯酯乙腈溶液：PITC 25μl，加入乙腈2ml，混匀。(密闭，4℃放置保质期为7天)
正亮氨酸内标液：秤取正亮氨酸10mg，加入0.1M盐酸溶液10ml使其溶解，混匀，4℃保存。
实施例5：出发菌株和构建后的重组菌株在不同发酵培养基的发酵参数比较
首先对实验出发菌株和进行代谢工程改造获得的重组菌株在发酵培养基上进行培养，具体的培养方法见实施例4，定时取样，测定生物量(OD562)，糖耗，氨基酸产量，实验结果见表1。在发酵培养基上，与出发菌株相比，重组菌株发酵96h后，L-丝氨酸产量提高了23.32％，糖酸转化率提高了23.32％；与此同时，副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸积累分别降低了87.45％和59.79％。通过代谢工程的手段既提高了L-丝氨酸产量和糖酸转化率，又降低后副产物的积累，有利于下游的L-丝氨酸的分离纯化。随后在不同的发酵培养基上培养，实验结果见表2。在添加了2g/L的玉米浆的情况下，发酵周期缩短了40h，糖的消耗速率提高了68.34％，L-丝氨酸的生产强度提高了66.67％。因此结合代谢工程和发酵工艺优化策略成功的解决了菌体生长缓慢的问题，提高了L-丝氨酸的产量，糖酸转化率和生产强度，同时降低了副产物的积累，具有大规模工业化利用糖质原料生产L-丝氨酸的前景。
表1：出发菌株和构建后的重组菌株在不同发酵培养基的发酵参数比较
Csugar(g/L):糖消耗；PL-serine:L-丝氨酸的生产强度
表2：重组菌株33a ΔSS ΔavtAΔC-T ilvN在不同发酵培养基上的发酵参数比较
Conc.:营养物质浓度；Csugar:糖消耗；PL-serine:L-丝氨酸的生产强度；Corn steepliquor：玉米浆。
avtA-1: 5’-GAAAAGCTTAAGGCCCTGCAGTAGTG-3’ (HindIII)
avtA-2: 5’- CCCATCTGTTAAACTTAAACCAAACGGCTGAACATTGCTT-3’
avtA-3: 5’- GGTTTAAGTTTAACAGATGGGGGTGTGCGCAAAATCGG-3’
avtA-4: 5’- ATTCTAGACCTGCGCTGCCACGTTGT-3’ (XbaI)
ilvN-1: 5’-CCCAAGCTTGCTGTTTCCAGATGACCAACC-3’ (HindIII)
ilvN-2: 5’-GGCGATAGTGGTCTCTTCATCAAGTCGCACGACTTTGAGC-3’
ilvN-3: 5’-GAAGAGACCACTATCGCCACAGCAATTAATCTGATTGC-3’
ilvN-4: 5’-CGCGGATCCCGTTCAGGTTTGGCTCGATG-3’ (BamHI)
PD1：5’-CCAAGATGGCTAATTCTGACGTCACC-3’
PD2：5’-GACTAGTCACATTTATGCAGCAGGTGC-3’
Claims (2)
1.一种高产L-丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征为：分别按照如下实验方案将avtA进行基因敲除和对乙酰羟酸合酶(AHAS)进行弱化，最后获得重组谷氨酸棒杆菌33a△SS△avtA△C-T ilvN，所述的对乙酰羟酸合酶(AHAS)进行弱化，指的是敲除乙酰羟酸合酶的编码调控基因ilvN的C末端249bp；
(1)基因扩增：根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息，设计引物以谷氨酸棒杆菌33a△SS基因组DNA为模板，分别扩增目的基因上游序列和下游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的片段，再将该片段连接至pMD19-T，对目的基因序列进行测序验证，确证重组克隆质粒序列的准确性；
(2)重组敲除质粒的构建：将所述步骤(1)中的连接有目的片段的重组克隆质粒进行双酶切处理，将目的片段连接至相同双酶切处理的质粒pK18mobsacB，转化至E.coli JM109感受态细胞，筛选验证阳性克隆；
(3)基因的重组整合：提取步骤(2)构建的用于目的基因整合修饰的重组质粒pK18mobsacB△avtA电激转化至谷氨酸棒杆菌33a△SS感受态细胞，提取重组质粒pK18mobsacB△C-T ilvN电激转化至33a△SS△avtA感受态细胞，通过两次筛选获得成功敲除目的基因的重组菌株；
(4)重组菌株的验证：利用引物通过PCR扩增验证重组菌株；重复上述实验即可获得重组谷氨酸棒杆菌33a△SS△avtA△C-T ilvN。
2.一种如权利要求1所述的高产L-丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的发酵方法，其特征为：权利要求1获得的重组菌株接种至含有2g/L的玉米浆的发酵培养基中发酵培养96h，定时取样检测生物量，糖浓度和氨基酸浓度；所述的发酵培养基为：蔗糖100g/L；硫酸铵30g/L，碳酸钙60g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；FeSO4·7H2O 0.02g/L；MnSO4·H2O 0.02g/L；原儿茶酸30mg；生物素50μg；硫胺素450μg；调节初始pH为7.2。
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