CN102505027A - 异亮氨酸发酵工艺方法 - Google Patents

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慕忠杰
张志岩
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Abstract

一种异亮氨酸发酵工艺，其技术要点是：它包括如下操作步骤：（1）培养菌种；（2）发酵；（3）发酵液分离；（4）发酵液清液离子交换；（5）蒸发结晶。本发明的工艺方法，产生了较好的发酵指标；异亮氨酸代谢产物产量提高，比创新前平均提高产酸率0.48个百分点；异亮氨酸代谢产物转化率提高，糖酸转化率提高3.2个百分点；产生菌体生长和代谢迅速，发酵周期缩短4-6小时，提高设备的周转率，相应提高了产量；.减少代谢副产物的生成，相应发酵液中代谢产物的纯度相应提高，对产物的提取操作和产品的产品的纯度有利，同时降低了发酵成本和提取成本。

Description

异亮氨酸发酵工艺方法
技术领域
本发明涉及氨基酸生产技术领域，具体地说是一种支链氨基酸中的异亮氨酸发酵工艺方法。
背景技术
我国氨基酸生产工业是陆续发展起来的产业，主要以谷氨酸、赖氨酸为主。支链氨基酸—如异亮氨酸，缬氨酸等工业发展较晚，起步较低，技术落后，并已出现了氨基酸工业发展不平衡，某些氨基酸供给大于需求。支链氨基酸生产成本降不下来，并且产品质量差，价格上不去，大部分生产的支链氨基酸都不能用在饲料的生产上，质量达不到药品级，国内许多氨基酸厂都迫切需要高品质、低成本的生产技术。因此，迫切需要发酵工艺的技术创新，使异亮氨酸的成产技术指标得到了提高，特别是糖酸转化率的提高使生产成本得到了下降，这对国内那些想要进入支链氨基酸这一生产领域、又苦于没有技术开发能力、找不到先进生产工艺技术、从而使生产成本高、市场无竟争力的企业是很有吸引力的。先进的发酵工艺创新技术在赢得了市场的同时，也对促进我国支链氨基酸行业的健康发展具有重要的意义。
1.异亮氨酸生产技术现状
（1）产酸率：国内产酸率最高达30g/L,而异亮氨酸在国外已经实现大规模工业化生产，产酸水平已达到35g/L以上；
（2）转化率：目前发酵法生产异亮氨酸的最高转化率仅为20%～25%，提高转化率对工业化生产有极其重要的意义；
（3）提取收率：国内目前提取收率为78%，产品的纯度为98%；
（4）就氨基酸行业而言治污力度不够，距国家要求还有一定距离，环保任务相当繁重而艰巨。
2.支链氨基酸的工业存在的问题
在支链氨基酸工业化方面我国和国外相比还有很大的差距，无论从料收水平和规模产量上有处于劣势，其主要表现如下：
（1）技术经济指标低，产品成本高；
（2）研发投入少、品种少，应变能力和抗风险能力差，影响了企业的自主创新和技术水平的提高，致使企业发展后劲不足；
（3）环保治理不彻底，行业总体清洁生产水平不高；
（4）现代化管理和产品品质管理水平低下，生产波动、染菌、丰产不丰收等现象时而发生，影响盈利水平的提高；
（5）连续化、自动化水平较低，影响工装和现代管理水平的提高；
（6）竞争加剧，协作交流少，企业间技术水平不平衡，差距加大。
发明内容
本发明的目的是提供一种支链氨基酸中的异亮氨酸发酵工艺方法。
本发明的目的是这样实现的：它包括如下操作步骤：
（1）培养菌种
选育在含180g/L-220g/L葡萄糖和含30g/L-40g/L异亮氨酸的平板上生长好的高产菌种，在菌种室经扩大培养生产一级种子，然后接入二级种子罐继续扩大培养，该二级种子罐内的二级种子培养基配方为：葡萄糖：2.0-3.5g/L、玉米浆：20-30g/L、磷酸氢二钾：2-5g/L、硫酸铵：20-50g/L、硫酸镁：0.1-0.3g/L、VH：2.0-6.0μg/L、糖蜜：20-50g/L、硫胺素：400-800μg/L、VB1：0.1-0.5g/L；每小时二级种子培养基与通入无菌空气通风量的体积比为：1：15-38，二级种子在二级种子罐内经过实消、降温、培养得到的的菌种指标为：△OD≥0.8，革兰氏染色阳性；
（2）发酵
将二级种子培养基液接入装好发酵培养基的发酵罐，发酵培养基与二级种子液的体积比是1:0.10～0.20，该发酵培养基配方为：葡萄糖：150g/L、硫酸铵：40g/L、玉米浆：15g/L、硫酸镁：0.2g/L、磷酸二氢钾：2.0g/L、VB1：0.15g/L、VH：2.5μg/L、糖蜜：20g/L、硫胺素：500μg/L；每小时二级种子培养基液及发酵培养基与通入无菌空气通风量的体积比例为1:25～58，连续发酵50小时～60小时，使菌体利用葡萄糖而代谢积累异亮氨酸；
（3）发酵液分离
发酵罐放出的发酵液经降温25-40℃，采用膜过滤处理工艺，在0.2Mpa-0.5Mpa压力下将发酵液中的菌丝体和蛋白分离出来，分离出的菌丝体和蛋白加入5g-20g/L的絮凝剂絮凝，然后在0.1Mpa-0.5Mpa的压力、温度40-60℃下经板框过滤得湿蛋白饲料；
（4）发酵液清液离子交换
发酵液清液经调PH1.5-3.0进入离交柱，在强酸阳离子树脂的作用下，吸附异亮氨酸，树脂吸附饱和时，停止进发酵清液，用氨浓度为0.3-1.0mol/L的洗脱液洗脱树脂吸附的异亮氨酸，洗脱时先流出的为发酵清液，回发酵清液罐，中间流出的为异亮氨酸液进下道工序，最后流出的为尾液，大部分为配制洗脱液回洗脱罐再经冲氨重复使用，离交过程为常温，压力为0.1-0.2Mpa，经离交洗脱下来的液体再经有机浓缩膜在压力0.2-0.5Mpa，温度30-40℃下除去一部分水分，进入蒸发结晶工序；
（5）蒸发结晶
料液进入蒸发结晶器在真空-0.09Mpa，温度小于70℃，通入0.5Mpa饱和蒸汽下，进行浓缩蒸发结晶，浓度后得到的异亮氨酸结晶体经过离心分离除去母液，异亮氨酸结晶体在真空-0.08Mpa，温度小于70℃干燥，然后进入包装工序，包装成成品异亮氨酸。
本发明的通过对微生物生长、繁殖及代谢有影响的营养成分选择、配比的调整和添加，产生了较好的发酵指标；异亮氨酸代谢产物产量提高，比创新前平均提高产酸率0.48个百分点；异亮氨酸代谢产物转化率提高，糖酸转化率提高3.2个百分点；产生菌体生长和代谢迅速，发酵周期缩短4-6小时，提高设备的周转率，相应提高了产量；.减少代谢副产物的生成，相应发酵液中代谢产物的纯度相应提高，对产物的提取操作和产品的产品的纯度有利，同时降低了发酵成本和提取成本。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
实例1   
在50m3发酵罐及7 m3种子罐生产实践中的，操作如下步骤：
（1）培养菌种
选育在含200g/L葡萄糖和含35g/L异亮氨酸的平板上生长好的高产菌种，在菌种室经扩大培养生产一级种子，然后接入二级种子罐继续扩大培养，该二级种子罐内的二级种子培养基配方为：葡萄糖：2.2g/L、玉米浆：20g/L、磷酸氢二钾：3g/L、硫酸铵：25 g/L、硫酸镁：0.15/g/L、VH：3.0μg/L、糖蜜：25g/L、硫胺素：500μg/L、VB1：0.2g/L，二级种子液在二级种子罐内经过实消、降温、培养得到的的菌种指标为：△OD=1.05，革兰氏染色阳性；
（2）发酵
将二级种子液接入装好发酵培养基的发酵罐，发酵培养基配料量为30000L、二级种子液的体积是4200L，该发酵培养基配方为：葡萄糖：150g/L、硫酸铵：40g/L、玉米浆：15g/L、硫酸镁：0.2g/L、磷酸二氢钾：2.0g/L、VB1：0.15g/L、VH：2.5μg/L、糖蜜：20g/L、硫胺素：500μg/L，二级种子液与发酵培养基连续发酵58小时，使菌体利用葡萄糖而代谢积累异亮氨酸；
（3）发酵液分离
发酵罐放出的发酵液经降温30℃，采用膜过滤处理工艺，在0.4Mpa压力下将发酵液中的菌丝体和蛋白分离出来，分离出的菌丝体和蛋白加入15g/L的絮凝剂絮凝，然后在0.3Mpa的压力、温度50℃下经板框过滤得湿蛋白饲料；
（4）发酵液清液离子交换
发酵液清液经调PH2.0进入离交柱，在强酸阳离子树脂的作用下，吸附异亮氨酸，树脂吸附饱和时，停止进发酵清液，用氨浓度为1.0mol/L的洗脱液洗脱树脂吸附的异亮氨酸，洗脱时先流出的为发酵清液，回发酵清液罐，中间流出的为异亮氨酸液进下道工序，最后流出的为尾液，大部分为配制洗脱液回洗脱罐再经冲氨重复使用，离交过程为常温，压力为0.2Mpa，经离交洗脱下来的液体再经有机浓缩膜在压力0.4 Mpa，温度35℃下除去一部分水分，进入蒸发结晶工序；
（5）蒸发结晶
料液进入蒸发结晶器在真空-0.09Mpa，温度小于70℃，通入0.5Mpa饱和蒸汽下，进行浓缩蒸发结晶，浓度后得到的异亮氨酸结晶体经过离心分离除去母液，异亮氨酸结晶体在真空-0.08Mpa，温度小于70℃干燥，然后进入包装工序，包装成成品异亮氨酸。
二级种子培养记录表一：
Figure 278134DEST_PATH_IMAGE002
异亮氨酸发酵记录表二：
发酵时间h 电极测PH 试纸测PH 残糖含量（GR）g/L 累计流加糖量m3 异亮氨酸含量g/L 光密度OD 通风量m3/h 温度℃
0 7.21 7.0 152.00     0.3 900 30
2 7.23 7.0         900 30
4 7.24 7.0         900 30
6 7.25 7.0         900 30
8 7.25 7.0       0.42 1000 30
10 7.28 7.0 100.00     0.50 1000 31
12 7.31 7.0 80.00     0.60 1500 31
14 7.30 7.0       0.70 1500 31
16 7.29 7.0 60.00     0.90 1500 32
18 7.31 7.0       0.10 1800 32
20 7.30 7.0 38.50   3.0 1.24 1800 32
22 7.30 7.0       1.30 1900 32
24 7.34 7.0 19.60 0.5 6.0 1.36 1900 32
26 7.32 7.0 18.00     1.36 1900 32
28 7.34 7.0 18.50   10.0 1.36 1900 32
30 7.32 7.0 18.60     1.36 1900 32
32 7.40 7.0 18.70 0.5 12.00 1.36 1900 32
34 7.41 7.0 18.90 0.3   1.36 1900 32
36 7.4 7.0 19.1   15.00 1.36 1900 32
38 7.42 7.0 19.0     1.34 1800 32
40 7.50 7.0 21.2 0.3 18.00 1.32 1800 32
42 7.52 7.0 21.0 0.2   1.29 1800 34
44 7.50 7.0 21.6 0.2 20.00 1.23 1800 34
46 7.54 7.0 20.8     1.24 1600 34
48 7.54 7.0 20.20   22.00 1.20 1600 34
50 7.54 7.0 15.10     1.16 1500 34
52 7.54 6.9 11.10   23.80 1.11 1500 34
54 7.55 6.9 10.2   24.6 1.0 1500 34
56 7.56 6.9 8.00   25.00 0.9 1500 34
58 7.5 6.8 3.20   26.1 0.8 1500 34
发酵指标计算表三：
产酸 26.1g/L
放罐体积 38 m3
异亮氨酸量 991.8kg
流加糖浓度 300g/L
流加糖体积 7.2 m3
流加糖质量 2.16吨
发酵培养基用糖 4.5吨
总糖量 6.66吨
转化率 14.89%
实例2
实例2与实例1的区别在于二级种子培养基配方和发酵培养基配方的配方不同，工艺步骤与实例1相同故省略。其中二级种子培养基配方为：葡萄糖：3.0g/L、玉米浆：25g/L、磷酸氢二钾：3g/L、硫酸铵：30g/L、硫酸镁：0.15/g/L、VH：4.0μg/L、糖蜜：50g/L、硫胺素：600μg/L、VB1：0.3g/L，二级种子液在二级种子罐内经过实消、降温、培养得到的的菌种指标为：△OD=1.16，革兰氏染色阳性；
发酵培养基配方为：葡萄糖：160g/L、硫酸铵：50g/L、玉米浆：20g/L、硫酸镁：0.2g/L、磷酸二氢钾：3.0g/L、VB1：0.2g/L、VH：4.0μg/L、糖蜜：30g/L、硫胺素：600μg/L，二级种子液与发酵培养基连续发酵54小时，使菌体利用葡萄糖而代谢积累异亮氨酸。
二级种子培养记录表四：
Figure 257591DEST_PATH_IMAGE003
异亮氨酸发酵记录表五：
发酵时间h 电极测PH 试纸测PH 残糖含量（GR）g/L 累计流加糖量m3 异亮氨酸含量g/L 光密度OD 通风量m3/h 温度℃
0 7.20 7.0 161.00     0.35 900 30
2 7.21 7.0         900 30
4 7.22 7.0         900 30
6 7.21 7.0         900 30
8 7.3 7.0       0.46 1000 30
10 7.31 7.0 110.90     0.51 1000 31
12 7.34 7.0 111.00     0.62 1500 31
14 7.32 7.0       0.75 1500 31
16 7.35 7.0 102.00     1.00 1500 32
18 7.38 7.0       1.21 1800 32
20 7.40 7.0 80.00   4.00 1.30 1800 32
22 7.41 7.0       1.34 1900 32
24 7.38 7.0 60.00   7.00 1.38 1900 32
26 7.42 7.0       1.38 1900 32
28 7.43 7.0 30.00   11.00 1.38 1900 32
30 7.41 7.0   0.5   1.38 1900 32
32 7.41 7.0 21.20   13.20 1.40 1900 32
34 7.43 7.0 21.3 0.5   1.40 1900 32
36 7.42 7.0 12.2 0.3 16.80 1.41 1900 32
38 7.45 7.0 21.0     1.39 1800 32
40 7.46 7.0 21.1 0.3 19.80 1.39 1800 32
42 7.45 7.0 20.8 0.2   1.38 1800 32
44 7.50 6.8 20.3   22.10 1.36 1800 34
46 7.51 6.8 15.2 0.2   1.34 1500 34
48 7.50 6.8 11.3   25.2 1.32 1500 34
50 7.52 6.8 10.2   26.4 1.28 1500 34
52 7.52 6.8 8.20   28.2 1.2 1500 34
54 7.53 6.8 3.0   29.8 1.00 1500 34
发酵指标计算表六：
产酸 29.8g/L
放罐体积 40m3
异亮氨酸量 1192kg
流加糖浓度 300g/L
流加糖体积 5.0m3
流加糖质量 1.5吨
发酵培养基用糖 4.8吨
总糖量 6.3吨
转化率 18.92%

Claims (1)

1.一种异亮氨酸发酵工艺，其特征是：它包括如下操作步骤：
（1）培养菌种
选育在含180g/L-220g/L葡萄糖和含30g/L-40g/L异亮氨酸的平板上生长好的高产菌种，在菌种室经扩大培养生产一级种子，然后接入二级种子罐继续扩大培养，该二级种子罐内的二级种子培养基配方为：葡萄糖：2.0-3.5g/L、玉米浆：20-30g/L、磷酸氢二钾：2-5g/L、硫酸铵：20-50g/L、硫酸镁：0.1-0.3g/L、VH：2.0-6.0μg/L、糖蜜：20-50g/L、硫胺素：400-800μg/L、VB1：0.1-0.5g/L；每小时二级种子培养基与通入无菌空气通风量的体积比为：1：15-38，二级种子在二级种子罐内经过实消、降温、培养得到的的菌种指标为：△OD≥0.8，革兰氏染色阳性；
（2）发酵
将二级种子培养基液接入装好发酵培养基的发酵罐，发酵培养基与二级种子液的体积比是1:0.10～0.20，该发酵培养基配方为：葡萄糖：150g/L、硫酸铵：40g/L、玉米浆：15g/L、硫酸镁：0.2g/L、磷酸二氢钾：2.0g/L、VB1：0.15g/L、VH：2.5μg/L、糖蜜：20g/L、硫胺素：500μg/L；每小时二级种子培养基液及发酵培养基与通入无菌空气通风量的体积比例为1:25～58，连续发酵50小时～60小时，使菌体利用葡萄糖而代谢积累异亮氨酸；
（3）发酵液分离
发酵罐放出的发酵液经降温25-40℃，采用膜过滤处理工艺，在0.2Mpa-0.5Mpa压力下将发酵液中的菌丝体和蛋白分离出来，分离出的菌丝体和蛋白加入5g-20g/L的絮凝剂絮凝，然后在0.1Mpa-0.5Mpa的压力、温度40-60℃下经板框过滤得湿蛋白饲料；
（4）发酵液清液离子交换
发酵液清液经调PH1.5-3.0进入离交柱，在强酸阳离子树脂的作用下，吸附异亮氨酸，树脂吸附饱和时，停止进发酵清液，用氨浓度为0.3-1.0mol/L的洗脱液洗脱树脂吸附的异亮氨酸，洗脱时先流出的为发酵清液，回发酵清液罐，中间流出的为异亮氨酸液进下道工序，最后流出的为尾液，大部分为配制洗脱液回洗脱罐再经冲氨重复使用，离交过程为常温，压力为0.1-0.2Mpa，经离交洗脱下来的液体再经有机浓缩膜在压力0.2-0.5Mpa，温度30-40℃下除去一部分水分，进入蒸发结晶工序；
（5）蒸发结晶
料液进入蒸发结晶器在真空-0.09Mpa，温度小于70℃，通入0.5Mpa饱和蒸汽下，进行浓缩蒸发结晶，浓度后得到的异亮氨酸结晶体经过离心分离除去母液，异亮氨酸结晶体在真空-0.08Mpa，温度小于70℃干燥，然后进入包装工序，包装成成品异亮氨酸。
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