WO2016042242A1 - Cassettes d'expression et leurs utilisations - Google Patents

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WO2016042242A1
WO2016042242A1 PCT/FR2015/052451 FR2015052451W WO2016042242A1 WO 2016042242 A1 WO2016042242 A1 WO 2016042242A1 FR 2015052451 W FR2015052451 W FR 2015052451W WO 2016042242 A1 WO2016042242 A1 WO 2016042242A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
clostridium
promoter
seq
cassette
Prior art date
Application number
PCT/FR2015/052451
Other languages
English (en)
Inventor
Florent COLLAS
Nicolas Lopes Ferreira
Benjamin Clement
Angélique BISSON
Original Assignee
IFP Energies Nouvelles
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IFP Energies Nouvelles filed Critical IFP Energies Nouvelles
Publication of WO2016042242A1 publication Critical patent/WO2016042242A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Definitions

  • the present application relates to a novel gene expression cassette, and its incorporation into a microorganism to obtain a platform strain.
  • Clostridia solvent-borne bacteria are anaerobic microorganisms capable of synthesizing a wide variety of products such as acetic acid, butyric acid, isopropanol, acetone, butanol, ethanol, acetoin, 2 , Butanediol and dihydrogen from fermentable sugars. These products are synthesized by Clostridia during ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) or IBE (Isopropanol-Butanol-Ethanol) fermentations, which have been extensively studied over the last four decades.
  • ABE Acetone-Butanol-Ethanol
  • IBE Isopropanol-Butanol-Ethanol
  • mazF cassette for Bacillus subtilis containing the genes of the E. coli and the spectinomycin resistance gene spc.
  • the expression of the mazF gene is placed under the control of an IPTG inducible promoter: P spac .
  • a 125 base pair DNA sequence, named DR (Directly Repeated sequence) was flanked at each end (5 'and 3') of the mazF cassette.
  • the mazF cassette is also flanked at the 3 'and 5' ends of the Bacillus subtilis amyE gene. 1A751 encoding a non-essential ⁇ -amylase.
  • this tool must be adapted to a wide range of genetic recombination events occurring within targeted microorganisms.
  • this tool must make it possible to obtain stable recombinant cells, said cells dispensing with the use of antibiotics.
  • This advantage makes it possible to envisage the use of these strains on an industrial scale with reduced constraints and production costs, as well as a reduced environmental impact.
  • platform strain a strain, called “platform strain”, which can be modified according to the goal to be achieved.
  • This platform strain is easy to produce and use, especially for obtaining strains usable in industrial conditions.
  • strain "girl” is thus free from any use of antibiotic, which can be expensive during a transition to the industrial scale.
  • the present invention therefore aims first of all at a gene cassette, schematized in FIG. 1, and comprising at least one prokaryotic gene flanking the 5 'end and a prokaryotic gene flanking the 3' end, said genes being chosen from two genes present adjacently in a Clostridium genome, and between which are inserted at least: an antibiotic resistance gene, devoid of its promoter,
  • the ydcE gene of the strain Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO: 5), or a variant thereof, said gene or variant being placed under the control of the promoter of the xyl gene of Clostridium difficile ssp. 630
  • the antibiotic resistance gene being adjacent to said prokaryotic gene flanking the 5 'end or said prokaryotic gene flanking the 3' end.
  • the present invention also relates to a vector comprising such a cassette.
  • the present invention also provides a method for preparing an isolated cell of Clostridium, comprising at least one step a) of transforming at least one Clostridium cell with said vector, which is preferably a plasmid.
  • the isolated cell of Clostridium thus transformed corresponds to the platform strain.
  • the present invention also relates to an isolated cell of Clostridium obtained by said method.
  • the present invention also relates to an isolated cell of Clostridium comprising in its genome at least the gene cassette according to the invention, wherein the gene for resistance to an antibiotic is under the control of an endogenous promoter.
  • the subject of the present invention is an isolated cell of Clostridium acetobutylicum accessible from the CNCM (National Collection of Microorganism Cultures, Institut Pasteur, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), deposited according to the Budapest Treaty. , July 25, 2014 under number 1-4878.
  • the isolated Clostridium cell is preferably a cell isolated from Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium beijerinckii or Clostridium butylicum.
  • the present invention provides a gene cassette comprising at least one prokaryotic gene flanking the 5 'end and a prokaryotic gene flanking the 3' end, said genes being chosen from two genes present adjacently in a genome Clostridium, and between which are inserted at least:
  • the ydcE gene of the strain Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO: 5), or a variant thereof, said gene or variant being placed under the control of the promoter of the xyl gene of Clostridium difficile ssp. 630
  • the antibiotic resistance gene being adjacent to said prokaryotic gene flanking the 5 'end or said prokaryotic gene flanking the 3' end.
  • This cassette contains all the elements necessary for the Clostridium cell which contains it in its genome (called the platform strain), to allow subsequent modifications of its genome, and thus obtain "daughter” strains with an insertion of an exogenous gene, a deletion of an endogenous gene, or both an insertion of an exogenous gene and a deletion of an endogenous gene.
  • this cassette comprises at least one prokaryotic gene flanking the 5 'end and a prokaryotic gene flanking the 3' end, said genes being selected from two genes present adjacently in a Clostridium genome. Indeed, the genes flanking the 5 'and 3' ends are chosen because of their proximity in the genome of the cell.
  • genes flanking the 5 'and 3' ends are respectively the hbd genes
  • genes of interest are inserted between these two flanking genes. These genes of interest are:
  • an antibiotic resistance gene devoid of its promoter, for example the erythromycin resistance gene ermB from Clostridium difficile (SEQ ID NO: 3), the xylR gene of Clostridium difficile ssp. 630 under the control of a promoter (SEQ ID NO: 4), and
  • the ydcE gene of the strain Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO: 5), or a variant thereof, said gene or variant being placed under the control of the promoter of the xyl gene of Clostridium difficile ssp. 630.
  • the antibiotic resistance gene may be chosen from among all the existing antibiotic resistance genes, and in particular from the erythromycin resistance genes, the ampicillin, chloramphenicol, tetracycline, spectinomycin, or vancomycin.
  • the erythromycin resistance gene is used, preferably the Clostidium difficile ermB gene (SEQ ID NO: 3).
  • This antibiotic resistance gene must satisfy two conditions:
  • flanking genes i.e. the prokaryotic gene flanking the 5 'end or the prokaryotic gene flanking the 3' end.
  • the resistance gene will be integrated, in the genome of the Clostridium cell considered, adjacent to one of the flanking genes, and will thus work under the control of the promoter of this flanking gene, said promoter being present in the genome and capable of controlling, within the framework of an operon, several genes of which one of the two flanking genes is located at the end of said operon.
  • the resistance gene will be functionally linked, ultimately in the platform strain, to an endogenous promoter of said strain.
  • this resistance gene will be functionally linked, ultimately in the platform strain, to the endogenous promoter of the hbd gene of said strain.
  • the endogenous promoter of the hbd gene will therefore control the expression of both hbd and the antibiotic resistance gene.
  • this promoter controls the expression of other genes, since the hbd gene is the last gene of the BCS operon also comprising the genes crt, bcd, etfB and eta (ZL Boynton, GN Bennett, FB Rudolph Cloning, sequencing, and expression of clustered Î2-hydroxybutyryl-coenzyme A (CoA) dehydrogenase, crotonase, and butyryl-CoA dehydrogenase genes from Clostridium acetobutylicum ATCC 824, J. Bacteriol., 178 (1996), pp. 3015-3024).
  • CoA Î2-hydroxybutyryl-coenzyme A
  • promoter is meant a regulation region located upstream of an open reading frame (ORF) near its 5 'end.
  • ORF open reading frame
  • a promoter comprises certain characteristic nucleotide sequences for the binding of the transcription initiation complex as well as the binding of transcriptional regulators.
  • the endogenous promoter that controls the expression of the antibiotic resistance gene is a strong promoter, ie a promoter that allows a high rate of transcription.
  • a promoter is in particular the promoter of the BCS operon, which comprises several genes including the hbd gene located at the end of the operon (SEQ ID NO: 6).
  • the prokaryotic gene flanking the 5 'end or prokaryotic gene flanking the 3' end present in the cassette is adjacent to the antibiotic resistance gene; in addition, it is present in the genome of Clostridium under the control of a strong promoter.
  • the prokaryotic gene flanking the 5 'or 3' end in the cassette, adjacent to the antibiotic resistance gene is a gene that is already present in the Clostridium genome, and which is under the control of a strong (endogenous) promoter.
  • Clostridium cells naturally have a very low frequency of homologous recombination, and without effective selection pressure, the plasmid comprising the cassette can be integrated in its entirety, which then promotes simple recombinations.
  • the cassette according to the invention also comprises the xylR gene of Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO: 4) placed under the control of a promoter.
  • this gene is placed under the control of its own promoter.
  • the xylR gene is present as such, but may also be present as a variant.
  • variant is meant a nucleic acid having at least 80% identity, preferably at least 85%, preferably at least 90%, 95%, 97%, 99% identity with the xylR gene.
  • the cassette according to the invention comprises the ydcE gene of the strain Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO: 5), or a variant thereof, said gene or variant being placed under the control of the promoter of the xylB gene of Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO: 8).
  • the ydcE gene encodes the YdcE or EndoA toxin.
  • the expression of this gene is placed under the control of the xylB gene promoter (SEQ ID NO: 8).
  • the ydcE gene is expressed only in the presence of xylose in the culture medium.
  • the platform strains according to the invention, which carry the cassette, are incapable of growing in the presence of xylose.
  • the ydcE operon encodes a toxin-antitoxin system belonging to the MazF / ChpAK / PemK family. These genes encode endo-ribonucleases that cleave messenger RNAs at specific sites.
  • the ydcE gene is present as such, or as a variant.
  • variant is meant a nucleic acid having at least 80% identity, preferably at least 85%, preferably at least 90%, 95%, 97%, 99% identity with the ydcE gene.
  • percentage identity between two nucleic acid sequences in the sense of the present invention, denotes a percentage of identical nucleotides between the two sequences to be compared.
  • the percent identity between two nucleic acid sequences is determined by comparing these two significantly aligned sequences, the nucleic acid sequence to be compared that may include additions or deletions relative to the reference sequence for meaningful alignment. between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide is identical between the two sequences, dividing this number of identical positions by the total number of positions compared and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • significant alignment is meant the alignment for which the percent identity determined as hereinafter is the highest. Preferentially, the BLAST program will be used to obtain a significant alignment.
  • the cassette according to the invention comprises, in the direction 5 'to 3':
  • the xylR gene of Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO: 4) placed under the control of its own promoter, the ydcE gene of the strain Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO: 5), or a variant thereof, said gene or variant being placed under the control of the promoter of the xyl gene of Clostridium difficile ssp. 630, and
  • the present invention also relates to any purified or isolated nucleic acid comprising at least the gene cassette according to the invention.
  • the subject of the present invention is any isolated or purified nucleic acid comprising at least the sequence SEQ ID NO: 7.
  • nucleic acid refers to a precise sequence of nucleotides, which may correspond to both double-stranded DNA, single-stranded DNA and transcripts of said DNA, and / or a fragment of RNA.
  • the nucleic acid according to the invention is a recombinant nucleic acid.
  • recombinant nucleic acid is meant a single or double-stranded nucleic acid molecule which has been modified by human intervention so as to contain nucleic acid fragments combined or juxtaposed in an arrangement which does not exist at all. the natural state.
  • the invention also relates to any vector comprising at least the cassette according to the invention.
  • vector is meant an extrachromosomal nucleic acid molecule, in particular a plasmid, having autonomous replication and capable of being incorporated into a host cell, in this case a Clostridium cell.
  • a vector is designed to allow the transport of the cassette and contains one or more recognition sites for restriction enzymes that allow the insertion or cloning of said cassette, which allows the identification and selection of Clostridium cells. transformed by said vector (in particular by the antibiotic resistance gene).
  • a preferred vector according to the invention is the plasmid pEC500C_EXyII_2707.5 of sequence SEQ ID NO: 9.
  • the subject of the invention is also a method for preparing an isolated cell of Clostridium, comprising at least one step a) of transforming at least one Clostridium cell with a vector, preferably a plasmid, according to the invention.
  • Step a) of transformation is typically carried out according to the following protocol:
  • the cells are made electrocompetent by a method inspired by that described by Oultram et al., 1988 (FEMS Microbiology Letters, vol.56, Issue 1, 83-88). Only the centrifugation steps are performed out of the anaerobic chamber, but in sealed tubes. Briefly, 180 ml of mCGM medium are seeded with 20 ml of a preculture, obtained from a suspension of spores. The incubation is carried out at 35 ° C. until an optical density (OD) of 0.7 to 600 nm is obtained.
  • OD optical density
  • the pellet after centrifugation for 10 min at 6000 rpm, is washed in 20 ml of electroporation buffer (270 mM sucrose, pH 7.4 phosphate buffer 7 mM, 1 mM MgCl 2) and then taken up in 4 ml of this same buffer after new centrifugation.
  • electroporation buffer 270 mM sucrose, pH 7.4 phosphate buffer 7 mM, 1 mM MgCl 2
  • the competent cells thus obtained are aliquoted by 700 in cryotubes stored at -80 ° C under anaerobic conditions (tubes placed in sealed and deoxygenated vials).
  • the plasmid DNA is inserted by electroporation.
  • 300 Suspended competent cells are placed in an electroporation vat (2 mm gap) in the presence of 1 to 5 ⁇ g of methylated plasmid (Heap et al 2007, L. Mermelstein & Papoutsakis, 1993).
  • the assembly is electroporated at 1.25 kV, 25 ⁇ and 100 ⁇ , knowing that the electroporation time must be between 1.2 and 2.1 ms.
  • the method according to the invention may also comprise, after step a):
  • a step d) of verifying the correct integration of the gene cassette into the genome of the Clostridium cell a step d) of verifying the correct integration of the gene cassette into the genome of the Clostridium cell.
  • the different constructs and transformed strains are typically verified by PCR on a thermal cycler. The temperature conditions and the incubation times are adapted according to the fragments to be amplified and the primers used.
  • DNA of transformed strains Clostridium is obtained in particular after depositing 8 of FTA plate culture. These plates contain agents that lyse cells, denature proteins, and protect nucleic acids from nucleases, oxidation, and UV. For analyzes, a punch can be taken from the plate and used directly after rinsing with water.
  • step d) is carried out by PCR, in particular by multiple PCRs. Indeed, after transformation of the vector in the cell, the correct integration of the cassette into the genome must be sought, in particular by different PCRs.
  • this PCR uses a primer whose sequence hybridizes with endogenous portions 5 'and 3' external to said flanking genes. This PCR A makes it possible to check the integration of the cassette into the genome of the cell;
  • PCR B and C these PCRs make it possible to check the presence of the cassette on the vector.
  • PCR B and C are used to check the presence of residual vectors containing the non-integrated cassette in the genome of Clostridium cells.
  • primers are used in PCRs A to C:
  • an isolated cell of Clostridium stably transformed by the gene cassette is thus obtained.
  • This cell is called platform strain.
  • a suitable vector in particular a plasmid, optionally comprising a gene of interest
  • the "daughter" strain obtained finally comprises genetic modifications (deletion, insertion or deletion and insertion) such that no longer contains a selection marker (for example an antibiotic resistance gene) or any other genetic element that does not correspond to the genetic modifications made.
  • the platform strain is therefore an essential tool for obtaining strains that can be used on an industrial scale.
  • the subject of the present invention is also an isolated Clostridium cell capable of being obtained by the process according to the invention.
  • the present invention also relates to an isolated cell of Clostridium comprising in its genome at least the gene cassette according to the invention, wherein the antibiotic resistance gene is under the control of an endogenous promoter.
  • the isolated Clostridium cell which comprises in its genome at least the gene cassette according to the invention, is such that the antibiotic resistance gene and an endogenous gene are both under the control of an endogenous promoter. unique.
  • a "daughter" strain is obtained, ultimately comprising genetic modifications of interest (deletion, insertion or deletion and insertion).
  • the "daughter” strain obtained comprises the insertion of at least one gene of interest.
  • the "daughter” strain obtained is capable of producing isopropanol.
  • the "daughter” strain obtained comprises the insertion of a gene cassette of interest, in particular the Ipa6 cassette.
  • the Ipa6 cassette comprises the following 4 genes, under the control of a single promoter, the thiolase promoter (thIP):
  • sADH gene encoding secondary alcohol dehydrogenase
  • Ctf A gene coding for A subunit of Coenzyme A transferase
  • ctfB gene coding for the subunit B of Coenzyme A transferase
  • Adc gene encoding acetoacetate decarboxylase
  • Such a "daughter" strain is stable without antibiotics, and is capable of producing ⁇ (Isopropanol / Butanol / Ethanol).
  • the subject of the invention is an isolated cell of Clostridium acetobutylicum chosen from cells accessible from the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), filed under the Budapest Treaty on August 26, 2015, under the numbers 1-5006, I-5007, 1-5008 and 1-5009.
  • the subject of the invention is also a process for obtaining an isolated cell of Clostridium acetobutylicum comprising at least one heterologous gene ("daughter" strain), comprising the following steps:
  • FIG. 1 Diagram of the EXy II cassette (Erythromycin, xylR, ydcE II).
  • Figure 2 Scheme of the PCR A used to distinguish the C. acetobutylicum ATCC 824 strains having integrated the EXy II cassette from those which did not integrate it.
  • Figure 3 Results of PCR A performed on certain transfected C. acetobutylicum ATCC 824 strains.
  • Clones 14 and 22 did not integrate it, and are identical to the wild-type (WT) strain.
  • Clones 11 and 35 partially integrated the cassette EXy IL
  • PCR B and C are specific for plasmid DNA. They therefore identify the clones that present the cassette in the plasmid.
  • Ipa6 genetic structure to produce isopropanol.
  • Thlp thiolase promoter
  • sADH gene encoding the secondary alcohol dehydrogenase
  • ctf A gene coding for the subunit A of Coenzyme A transferase
  • ctfB gene coding for the subunit B of Coenzyme A transferase
  • Adc gene encoding acetoacetate decarboxylase.
  • E. coli and Bacillus lichenijormis were cultured on liquid LB medium and agar. Culture media could be supplemented with antibiotics (ampicillin (10 (g / mL) and / or chloramphenicol (30 ⁇ g / mL)) when these were recommended.
  • antibiotics ampicillin (10 (g / mL) and / or chloramphenicol (30 ⁇ g / mL)
  • genomic DNAs of the cultured strains were extracted using Sigma Aldrich's "GenElute Bacterial Genomic” kit. Genetic construction
  • Plasmids pSEC500E and pSEC500C are derived from E. coliClostridium plasmid vectors pMTL500E and pMTL500C.
  • a "Saccharomyces" cassette containing the URA3 gene and the 2 ⁇ origin of replication of the plasmid pSR426 was inserted into these two plasmids.
  • the "Saccharomyces” cassette can be easily removed by digestion with the restriction enzyme april followed by autoligation.
  • the plasmid pSEC501E is a plasmid derived from pSEC500E.
  • the DNA sequence from the promoter of the amp r gene to the replication origin ⁇ was amplified with the 13_ermB_amp_F / 13_URA3_pAMpi_F oligonucleotide pairs.
  • the pSEC500C DNA sequence from the ermB r gene promoter to the URA3 gene was amplified with oligonucleotides 13_amp_ermB_F and 13_pAMB1_URA3_R.
  • the two PCR fragments were used to transform S. cerevisiae W303.
  • the plasmid pSEC501E unlike pSEC500E, contains a spel restriction site between the ermB r and amP r genes. digesting pSEC501E with Avril and spel, the genes ermB r , URA3 and the origin of replication 2 ⁇ can be excised to give pMTL501.
  • the erythromycin gene lacking its promoter was amplified from the plasmid pMTL500E with primers 13_pAMB1_ermB_F (agctggcgaaagggggatgtg ctgcactgccgggcctcttgcgggatc, SEQ ID NO: 20) and 13_xylR_ermB_R (ataaccctttaaattatacattcctttccaaa tttacaaaagcgactc, SEQ ID NO: 21).
  • the PCR product measures 1100 bp.
  • the XylR regulator gene and the xylB gene promoter were de novo synthesized by Eurofins mwg and introduced into plasmid pUC57.
  • the xylR gene and the xylB gene promoter were amplified by PCR from the plasmid pUC57_xylR with primers 13_ermB_xylR_R and 13 ydcE_xylR_F.
  • the PCR product measures 1463 bp.
  • the genomic DNA of the strain B. licheniformis DSM 13 was extracted from a nocturnal culture.
  • the ydcE (or ndoA) gene was amplified by PCR from B. licheniformis DSM 13 genomic DNA with primers 13_xyl_ydcE_F and 13_426_ydcE_R.
  • the PCR product measures 400 bp.
  • Plasmid pSR426 was linearized with xhoI and BamHI and gel purified. A mix containing each PCR and 4 ⁇ L of the linearized plasmid pSR426 was used to transform S. cerevisiae W303. Transformed cells were plated on CSM-URA agar. The total DNA is then extracted from the transformants of S. cerevisiae and used to transform Top10 competent E. coli and obtain a plasmid pSR426 EXY (SEQ ID NO: 12).
  • the EXY cassette once constructed in this plasmid was then integrated by PCR amplification (colEl_hbd_f: gcggataacaatttcacacaggaaacagctgggaggtctgtttaatgaa SEQ ID NO: 22 / 13_pAMB l_2706_R agctggcgaaagggggatgtgCTCGAGccaagtatctacaggaaatg SEQ ID NO: 23) into the plasmid vector pEC500C (SEQ ID N: 10) to form plasmid pEC500C EXY (SEQ ID NO: 11).
  • PCR amplifications are carried out with the G_2707_ydcE-xR_F / G_hbd_ermB_R primer pairs to amplify the EXy II cassette from the plasmid pEC500C_EXy.
  • PCR amplifications were transformed into S. cerevisiae W303 with plasmid pSEC500C (SEQ ID NO: 13) digested with PvuI / Sapl. Once recovered, this plasmid is digested with Avril and retransformed in E. coli in order to recover the plasmid pEC500C_EXYII_2707.5 (SEQ ID NO: 9). Obtaining the plasmid
  • the selection cassette EXy II was therefore integrated into a plasmid vector designated pEC500C_ExyII_2707.5 containing: an E. coli origin of replication (ColEl), a chloramphenicol resistance gene (CatP), a Clostridium origin of replication ( ⁇ ), the EXy II selection cassette inserted between the hbd and CAC_2707 genes of the Clostridium genome. Selection by the EXy II cassette
  • the plasmid pEC500C_EXyII_2707.5 is transformed into the strain C. acetobutylicum ATCC 824. The growth of the strain is then observed. The agars used all contain 25 ⁇ g / ml of erythromycin. Only the wild strain (WT) is inhibited by this antibiotic, strains containing a plasmid (pEC500E or pEC500C_EXyII_2707.5) are not (data not shown).
  • the plasmid pEC500C_EXyII_2707.5 is transformed into the strain C. acetobutylicum ATCC 824.
  • the integration of the EXy II cassette into the genome of the strain between the ORFs Ca_C2707 and Ca_C2708 (hbd) is then sought by different PCRs, the PCRs A to C.
  • the primers used for these are described in Tables 3 to 5.
  • PCR A PCR amplification
  • Figure 2 Recombinant strains of ATCC 824 (pEC500C_EXyII_2707.5) were obtained and tested by PCR amplification A for insertion of the EXy IL cassette.
  • Clones 1 and 25 show an insertion of the EXy II cassette at the correct location (FIG. 3). .
  • the PCR A amplification carried out on the DNA extracted from clones 11 and 35 shows that there exists for these clones a mixed population: with and without insertion of the EXy IL cassette.
  • V_etfa_hbd_R cagcatttagcaggtatgcaag 58.4 25
  • cultures in microplates were carried out with successive dilutions of a preculture on medium containing glucose (dilution of the preculture ranging from 10 ° to 10 4 ). Under conditions of sufficient dilution, it is observed that the toxin produced causes a low growth, or even a total absence of growth, on a liquid medium containing Xylose. In agar medium, the phenomenon is even clearer, even if the clones still end up growing after prolonged incubation.
  • a new vector pEC750C was created, in which the pAMB1C pA500C ipa ⁇ 2707.5 replication origin is replaced by the origin of replication pIP404 from the plasmid pJIR750ai. Given the complexity of the cloning (PCR amplification of the origin of replication impossible), it was decided to go through an E. coliS vector. cerevisiae to realize the different constructions.
  • the plasmid pJIR750ai is digested with XmnI and NheI then the pIP404 fragment of 2710 bp is recovered.
  • the plasmid pSEC750C by XbaI-BamHI is digested.
  • E.coli clones are verified by both PCR (Ipa ⁇ amplification) and restriction (NheI).
  • an April digestion is performed to remove the 2 ⁇ - ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 3 cassette before retransforming the plasmid into E. coli.
  • the plasmid is then methylated and checked by Fnu4HI restriction before transformation into Clostridium.
  • Table 6 List of primers used for the construction of plasmids pEC750C and pEC750C Ipa6 2707.5
  • the plasmid pEC750C_Ipa6_2707.5 and the control plasmid (pEC750C) were transformed into the strain C. acetobutylicum IFP950.
  • the first selection of the recombinant strains was carried out on YTG plates containing 25 ⁇ g / ml of Chloramphenicol. At the end of this transformation, all the recombinant strains containing the plasmid pEC750C Ipa6_2707.5 growing on CGM-Chloramphenicol was isolated.
  • PCR analysis shows that, after step 2, all the strains contain both the plasmid pEC750C Ipa6 and the gene cluster EXY. This confirms that the toxin, once expressed, only allows stunting, and that the strains are able to tolerate it after a latency.
  • step 3 comprising the accelerated subculture phase, it was possible to isolate clones having lost the insertion of the EXYII cluster on the hbd side (erythromycin sensitive phenotype). But the insertion of the Ipa6 cluster is not complete since there is no positive band on the PCRs controlling integration by double homologous recombination.
  • a final round of PCR was performed to verify the presence of the EXY cassette or stabilized Ipa6 cluster in the genome (full integration). Compared to a clone control from the first transformation box, no amplification is visible in the clones obtained at the end of step 3. This can be explained by a stable integration of the plasmid in the genome of the strain IFP950 and at the continuation of the EXYII cassette.
  • the GAPES medium has the following composition:
  • the clone 2X is the one which presents the best performances, with the final time a total production of solvents approaching the 23 g / L, among which 13 g / L of butanol and 10 g / L of isopropanol (productivity at 48h of 0.41 g / L / h).
  • Clones 3 and 1XC have lower performances (15 and 17 g / l of solvents) and clone 1 does not exceed 10 g / l of solvents produced.
  • IFP956 strain (clone 2X / Ipa2) CNCM 1-5007 IFP957 strain (clone 3X / Ipa3) CNCM 1-5008
  • This example therefore describes the construction of genetically improved strains for the production of Isopropanol / Butanol / Ethanol (IBE). They were created from the strain Clostridium acetobutylicum ATCC824, ABE fermentative strain (Acetone / Butanol / Ethanol). These IBE + strains are stable and efficient.
  • the phenotype and genotype analyzes of the strains finally obtained demonstrate complete integration of the plasmid, without a double recombination event making it possible to eliminate the vector plasmid.
  • This strain is however stable without antibiotic, since only traces of acetone are produced by these strains in antibiotic-free medium.
  • fermentation tests have shown interesting performance without use of antibiotic in the vials (up to 23 g / l of IBE, including 9.8 g / l of isopropanol after 96h in flasks).

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Abstract

La présente demande est relative à une cassette de gènes comprenant au moins un gène procaryote flanquant l'extrémité 5' et un gène procaryote flanquant l'extrémité 3', lesdits gènes étant choisis parmi deux gènes présents de façon adjacente dans un génome de Clostridium, et entre lesquels sont insérés au moins : - un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur, - le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 placé sous le contrôle d'un promoteur, et - le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13, ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xylB de Clostridium difficile ssp. 630, - le gène de résistance à l'antibiotique étant adjacent audit gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou audit gène procaryote flanquant l'extrémité 3'. Une fois intégrée, cette cassette permet après transformation ultérieure avec un vecteur adapté, une souche « fille » intégrant in fine des modifications génétiques (délétion, insertion ou délétion et insertion) mais aucun marqueur de sélection (par ex : de gène de résistance à un antibiotique) ni autre élément génétique ne correspondant pas aux modifications génétiques réalisées.

Description

CASSETTES D'EXPRESSION ET LEURS UTILISATIONS
La présente demande se rapporte à une nouvelle cassette d'expression de gènes, et à son incorporation dans un micro-organisme pour obtenir une souche plateforme.
Les bactéries Clostridia solvantogènes sont des micro-organismes anaérobies capables de synthétiser une variété importante de produits comme l'acide acétique, l'acide butyrique, l'isopropanol, l'acétone, le butanol, l'éthanol, l'acétoïne, le 2,3 butanediol et du dihydrogène à partir de sucres fermentescibles. Ces produits sont synthétisés par les Clostridia lors des fermentations ABE (Acétone-Butanol-Ethanol) ou IBE (Isopropanol-Butanol-Ethanol), très étudiées ces quatre dernières décennies.
Les récents développements en biologie moléculaire ont permis d'explorer plus en profondeur la génétique et le métabolisme des Clostridia solvantogènes, afin de mettre en avant des voies d'amélioration possibles pour ces micro-organismes. L'amélioration génétique ciblée des souches de Clostridium requiert l'acquisition et/ou le développement de techniques du génie génétique permettant l'expression, l'insertion et la délétion de gènes.
Classiquement la surexpression de gènes se fait par l'insertion d'un plasmide. L'utilisation d'un plasmide présente plusieurs inconvénients pour l'utilisation des micro-organismes à des fins industrielles. En effet, le maintien du plasmide requiert la présence d'un agent de sélection, le plus souvent un antibiotique, dans le milieu de culture. De plus, la quantité de gènes insérés reste limitée.
Afin de construire des souches de Clostridium modifiées et stables, l'insertion du gène d'intérêt dans le génome semble être la meilleure solution. Différentes techniques décrivent l'insertion d'ADN dans le génome de C. acetobutylicun.
hang et al. (2006) (Nucleic Acid Res., 34(9) :71) ont développé une cassette mazF pour Bacillus subtilis contenant les gènes de la toxine mazF d'E. coli et le gène de résistance à la spectinomycine spc. L'expression du gène mazF est placée sous le contrôle d'un promoteur inductible à l'IPTG: Pspac. Une séquence d'ADN de 125 paires de base, nommée DR (Directly Repeated séquence), a été flanquée à chaque extrémité (5' et 3') de la cassette mazF. La cassette mazF est également flanquée aux extrémités 3' et 5' du gène amyE de Bacillus subtilis 1A751 codant pour une α-amylase non essentielle. Ces séquences d'ADN permettent l'insertion ciblée, sous forme linéarisée, de la cassette mazF au sein du gène amyE. In fine, par double recombinaison homologue, puis culture dans un milieu avec IPTG, seules les souches ayant expulsé la cassette mazF sont capables de pousser. Cependant, cette méthode est adaptée à Bacillus subtilis et laisse des cicatrices dues à l'utilisation de séquences DR. En outre, elle n'est pas adaptée à la simple insertion d'une séquence dans le génome.
Al-Hinai et al. (2012) (Appl Environ Microbiol, 78(22) :8112-21) ont développé un système similaire dédié à C. acetobutylicum ATCC 824. Dans ce système, des séquences flanquant la région à déléter sont introduites, les séquences FRT. Là encore, cette méthode laisse des cicatrices dues à l'utilisation de ces séquences FRT.
Malgré l'existence de ces quelques outils, il existe donc un besoin de disposer d'un outil de recombinaison qui soit efficace, simple et rapide à mettre en œuvre, notamment pour l'obtention de souches destinées à la production de molécule d'intérêt à l'échelle industrielle. Cet outil doit être particulièrement applicable à Clostridium, notamment à C. acetobutylicun, qui est très difficilement modifiable sans recours à des outils permettant le maintien des modifications génétiques par une pression de sélection (antibiotique ou marqueur auxotrophique).
En outre, cet outil doit être adapté à un large éventail d'événements de recombinaisons génétiques se produisant au sein des micro-organismes ciblés.
Enfin, cet outil doit permettre l'obtention de cellules recombinantes stables, lesdites cellules se dispensant de l'utilisation d'antibiotiques. Cet avantage permet d'envisager une utilisation de ces souches à l'échelle industrielle avec des contraintes et des coûts de production réduits, ainsi qu'un impact environnemental réduit.
De manière surprenante, les inventeurs ont mis au point une souche, appelée « souche plateforme », pouvant être modifiée selon le but à atteindre. Cette souche plateforme est facile à produire et à utiliser, notamment pour l'obtention de souches utilisables en conditions industrielles.
Elle permet en effet, après une seconde étape de recombinaison homologue, l'obtention d'une souche finale qui ne contient aucun marqueur de sélection (antibiotique et toxine). La souche finale (souche « fille ») s'affranchit donc de toute utilisation d'antibiotique, qui peut être coûteuse lors d'un passage à l'échelle industrielle.
La présente invention vise donc tout d'abord une cassette de gènes, schématisée dans la Figure 1, et comprenant au moins un gène procaryote flanquant l'extrémité 5' et un gène procaryote flanquant l'extrémité 3', lesdits gènes étant choisis parmi deux gènes présents de façon adjacente dans un génome de Clostridium, et entre lesquels sont insérés au moins : un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur,
le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle d'un promoteur, et
le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xyl de Clostridium difficile ssp. 630,
le gène de résistance à l'antibiotique étant adjacent audit gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou audit gène procaryote flanquant l'extrémité 3' .
La présente invention vise également un vecteur comprenant une telle cassette.
La présente invention vise également un procédé de préparation d'une cellule isolée de Clostridium, comprenant au moins une étape a) de transformation d'au moins une cellule de Clostridium avec ledit vecteur, qui est de préférence un plasmide. La cellule isolée de Clostridium ainsi transformée correspond à la souche plateforme.
La présente invention a également pour objet une cellule isolée de Clostridium obtenue par ledit procédé.
La présente invention a également pour objet une cellule isolée de Clostridium comprenant dans son génome au moins la cassette de gènes selon l'invention, dans laquelle le gène de résistance à un antibiotique est sous le contrôle d'un promoteur endogène.
Enfin, la présente invention a pour objet une cellule isolée de Clostridium acetobutylicum accessible auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), déposée selon le Traité de Budapest, le 25 juillet 2014 sous le numéro 1-4878. Dans la présente demande, la cellule isolée de Clostridium est de préférence une cellule isolée de Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium beijerinckii ou de Clostridium butylicum. Selon un premier aspect, la présente invention vise une cassette de gènes comprenant au moins un gène procaryote flanquant l'extrémité 5' et un gène procaryote flanquant l'extrémité 3', lesdits gènes étant choisis parmi deux gènes présents de façon adjacente dans un génome de Clostridium, et entre lesquels sont insérés au moins :
un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur,
- le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle d'un promoteur, et
le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xyl de Clostridium difficile ssp. 630,
le gène de résistance à l'antibiotique étant adjacent audit gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou audit gène procaryote flanquant l'extrémité 3' .
Cette cassette contient tous les éléments nécessaires à la cellule de Clostridium qui la contient dans son génome (appelée souche plateforme), pour permettre des modifications ultérieures de son génome, et ainsi obtenir des souches « filles » présentant une insertion d'un gène exogène, une délétion d'un gène endogène, ou à la fois une insertion d'un gène exogène et une délétion d'un gène endogène.
Précisément, cette cassette comprend au moins un gène procaryote flanquant l'extrémité 5' et un gène procaryote flanquant l'extrémité 3', lesdits gènes étant choisis parmi deux gènes présents de façon adjacente dans un génome de Clostridium. En effet, les gènes flanquant les extrémités 5' et 3' sont choisis en raison de leur proximité dans le génome de la cellule de
Clostridium considérée. Ils sont présents de façon adjacente dans le génome de la cellule de
Clostridium considérée, i.e. ils sont consécutifs.
Par exemple, les gènes flanquant les extrémités 5' et 3' sont respectivement les gènes hbd
(SEQ ID NO : 1) et Ca_C2707 (SEQ ID NO :2).
Entre ces deux gènes flanquants, les gènes d'intérêt sont insérés. Ces gènes d'intérêt sont les suivants :
un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur, par exemple le gène de résistance à l'érythromycine ermB de Clostridium difficile (SEQ ID NO :3), le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 placé sous le contrôle d'un promoteur (SEQ ID NO :4), et
le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xyl de Clostridium difficile ssp. 630.
Les séquences listées dans la présente invention sont répertoriées dans le tableau suivant
Figure imgf000006_0001
Le gène de résistance à l'antibiotique peut être choisi parmi tous les gènes de résistance aux antibiotiques existants, et notamment parmi les gènes de résistance à l'érythromycine, à l'ampicilline, au chloramphénicol, à la tétracycline, à la spectinomycine, ou à la vancomycine. De préférence, on utilise le gène de résistance à l'érythromycine, de préférence le gène ermB de Clostidium difficile (SEQ ID NO :3).
Ce gène de résistance à l'antibiotique doit satisfaire à deux conditions :
- il doit être présent dans la cassette sans son promoteur, et
il doit être adjacent à l'un des deux gènes flanquants, i.e. le gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou le gène procaryote flanquant l'extrémité 3'.
En effet, grâce à ces deux caractéristiques, le gène de résistance sera intégré, dans le génome de la cellule de Clostridium considérée, de façon adjacente à l'un des gènes flanquants, et fonctionnera ainsi sous la dépendance du promoteur de ce gène flanquant, ledit promoteur étant présent dans le génome et pouvant contrôler, dans le cadre d'un opéron, plusieurs gènes dont l'un des deux gènes flanquants est situé en fin dudit opéron. En d'autres termes, le gène de résistance sera lié de façon fonctionnelle, in fine dans la souche plateforme, à un promoteur endogène de ladite souche.
Par exemple, dans le cas où les gènes flanquant les extrémités 5' et 3' sont respectivement les gènes hbd et Ca_C2707, et où le gène de résistance est adjacent à hbd, ce gène de résistance sera lié de façon fonctionnelle, in fine dans la souche plateforme, au promoteur endogène du gène hbd de ladite souche. Le promoteur endogène du gène hbd contrôlera donc l'expression à la fois d'hbd mais aussi du gène de résistance à l'antibiotique. Par ailleurs ce promoteur contrôle l'expression d'autres gènes, car le gène hbd est le dernier gène de l'opéron BCS comprenant également les gènes crt, bcd, etfB et etfA (Z.L. Boynton, G.N. Bennett, F.B. Rudolph Cloning, sequencing, and expression of clustered gènes encoding β-hydroxybutyryl- coenzyme A (CoA) dehydrogenase, crotonase, and butyryl-CoA dehydrogenase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824, J. Bacteriol., 178 (1996), pp. 3015-3024).
Par « promoteur », on désigne une région de régulation située en amont d'un cadre de lecture ouvert (ORF), à proximité de son extrémité 5'. Dans la présente demande, on utilisera les termes « ORF » et « gène » de façon interchangeable. Un promoteur comporte certaines séquences nucléotidiques caractéristiques permettant la fixation du complexe d'initiation de la transcription ainsi que la fixation de régulateurs transcriptionnels. De préférence, le promoteur endogène qui contrôle l'expression du gène de résistance à l'antibiotique est un promoteur fort, i.e. un promoteur qui permet une grande vitesse de transcription. Un tel promoteur est notamment le promoteur de l'opéron BCS, qui comprend plusieurs gènes dont le gène hbd situé en fin d'opéron (SEQ ID NO :6).
De préférence, le gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou le gène procaryote flanquant l'extrémité 3' présent dans la cassette est adjacent au gène de résistance à un antibiotique ; en outre, il est présent dans le génome de Clostridium sous le contrôle d'un promoteur fort. En d'autres termes, de préférence, le gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou 3' dans la cassette, adjacent au gène de résistance à un antibiotique, est un gène qui est déjà présent dans le génome de Clostridium, et qui est sous le contrôle d'un promoteur (endogène) fort.
Les caractéristiques ci-dessus mentionnées relatives au gène de résistance à l'antibiotique sont importantes pour l'obtention d'une souche plateforme selon l'invention. En effet, des cassettes similaires ont été construites, mais avec le promoteur propre du gène de résistance à l'antibiotique. Les résultats obtenus avec ces cassettes ne sont pas concluants, car la pression de sélection exercée sur les cellules de Clostridium n'est pas suffisante pour obtenir des événements de recombinaison homologue stable.
Les cellules de Clostridium présentent en effet naturellement une très faible fréquence de recombinaison homologue, et, sans pression de sélection efficace, le plasmide comprenant la cassette peut être intégré en entier, ce qui favorise ensuite des recombinaisons simples.
La cassette selon l'invention comprend également le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle d'un promoteur. De préférence, ce gène est placé sous le contrôle de son propre promoteur.
Le gène xylR est présent en tant que tel, mais peut également être présent sous forme de variant. Par « variant », on entend un acide nucléique présent au moins 80% d'identité, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, 95%, 97%, 99% d'identité avec le gène xylR. Enfin, la cassette selon l'invention comprend le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xylB de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :8). Le gène ydcE code pour la toxine YdcE ou EndoA. L'expression de ce gène est placée sous le contrôle du promoteur du gène xylB (SEQ ID NO :8). Ainsi, le gène ydcE n'est exprimé qu'en présence de xylose dans le milieu de culture. In fine, les souches plateformes selon l'invention, qui portent la cassette, sont incapables de croître en présence de xylose.
L'opéron ydcE (endoA) code pour un système toxine-antitoxine appartenant à la famille de MazF/ChpAK/PemK. Ces gènes encodent des endo-ribonucléases qui clivent les ARN messagers au niveau de sites spécifiques.
Le gène ydcE est présent en tant que tel, ou bien sous forme de variant. Par « variant », on entend un acide nucléique présent au moins 80% d'identité, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, 95%, 97%, 99% d'identité avec le gène ydcE.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques au sens de la présente invention, on désigne un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière significative, la séquence d'acides nucléiques à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement significatif entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par « alignement significatif », on désigne l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Préférentiellement, on utilisera le programme BLAST pour obtenir un alignement significatif.
De préférence, la cassette selon l'invention comprend, dans le sens 5' à 3' :
un gène procaryote flanquant l'extrémité 5',
un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur et adjacent au gène procaryote flanquant l'extrémité 5',
- le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle de son propre promoteur, le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xyl de Clostridium difficile ssp. 630, et
un gène procaryote flanquant l'extrémité 3' .
La présente invention vise également tout acide nucléique purifié ou isolé comprenant au moins la cassette de gènes conforme à l'invention. Préférentiellement, la présente invention a pour objet tout acide nucléique isolé ou purifié comprenant au moins la séquence SEQ ID NO :7.
Dans le contexte de l'invention, le terme « acide nucléique » désigne un enchaînement précis de nucléotides, pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN, et/ou un fragment d'ARN. Selon un mode préféré de réalisation, l'acide nucléique conforme à l'invention est un acide nucléique recombinant. Par « acide nucléique recombinant », on désigne une molécule d'acide nucléique, simple ou double brin, qui a été modifiée par une intervention humaine de manière à contenir des fragments d'acides nucléiques combinés ou juxtaposés selon un arrangement n'existant pas à l'état naturel.
L'invention a également pour objet tout vecteur comprenant au moins la cassette conforme à l'invention. Par « vecteur », on désigne une molécule d'acide nucléique extrachromosomique, notamment un plasmide, ayant une réplication autonome et pouvant être incorporé dans une cellule hôte, en l'occurrence une cellule de Clostridium.
Typiquement, un vecteur est conçu pour permettre le transport de la cassette et contient un ou plusieurs sites de reconnaissance pour des enzymes de restriction qui permettent l'insertion ou clonage de ladite cassette, ce qui permet l'identification et la sélection des cellules de Clostridium transformées par ledit vecteur (notamment par le gène de résistance à l'antibiotique).
Un vecteur préféré selon l'invention est le plasmide pEC500C_EXyII_2707.5 de séquence SEQ ID NO :9. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une cellule isolée de Clostridium, comprenant au moins une étape a) de transformation d'au moins une cellule de Clostridium avec un vecteur, de préférence un plasmide, selon l'invention.
L'étape a) de transformation est typiquement réalisée selon le protocole suivant :
Les cellules sont rendues électrocompétentes par une méthode inspirée de celle décrite par Oultram et al, 1988 (FEMS Microbiology Letters, vol.56, Issue 1, 83-88). Seules les étapes de centrifugation sont réalisées hors de la chambre anaérobie, mais dans des tubes scellés. Brièvement, 180 mL de milieu mCGM sont ensemencés avec 20 mL d'une préculture, obtenue à partir d'une suspension de spores. L'incubation s'effectue à 35 °C jusqu'à obtention d'une densité optique (DO) de 0,7 à 600 nm. Le culot, après centrifugation de 10 min à 6000 rpm, est lavé dans 20 mL de tampon d'électroporation (Saccharose 270 mM ; Tampon phosphate pH 7,4 7mM; MgC12 1 mM) puis repris dans 4 mL de ce même tampon après nouvelle centrifugation.
Les cellules compétentes ainsi obtenues sont aliquotées par 700
Figure imgf000011_0001
dans des cryotubes conservés à -80°C en conditions anaérobies (tubes placés dans des flacons scellés et désoxygénés). L'ADN plasmidique est inséré par électroporation. 300
Figure imgf000011_0002
de suspension de cellules compétentes sont placés dans une cuve d'électroporation (fente de 2 mm) en présence de 1 à 5 μg de plasmide méthylé (Heap et al 2007 ; L. Mermelstein & Papoutsakis, 1993). L'ensemble est électroporé à 1,25 kV, 25 μΡ et 100 Ω, sachant que le temps d'électroporation doit être compris entre 1,2 et 2,1 ms. Le contenu des cuves est ensuite transféré dans 3 mL de milieu mCGM frais et incubé à 37 °C dans la chambre anaérobie pendant au moins 3h. 2mL sont ensuite centrifugés et repris dans 200
Figure imgf000011_0003
de mCGM avant étalement sur boîte de sélection appropriée. De préférence, le procédé selon l'invention peut également comprendre, après l'étape a) :
- une étape b) d'incubation de Clostridium obtenue à l'étape a) ;
- une étape c) de repiquage(s) des colonies obtenues à l'issue de l'étape b) ; puis
- une étape d) de vérification de l'intégration correcte de la cassette de gènes dans le génome de la cellule de Clostridium.
Les différentes constructions et souches transformées sont typiquement vérifiées par PCR sur thermocycleur. Les conditions de température et les temps d'incubation sont adaptés en fonction des fragments à amplifier et des amorces utilisées. L'ADN des souches transformées de Clostridium est notamment obtenu après dépôt de 8 de culture sur plaque FTA. Ces plaques contiennent des agents qui lysent les cellules, dénaturent les protéines et protègent les acides nucléiques des nucléases, de l'oxydation et des UV. Pour les analyses, un poinçon peut être prélevé sur la plaque et utilisé directement après rinçage à l'eau.
De préférence, l'étape d) se fait par PCR, notamment par PCR multiples. En effet, après transformation du vecteur dans la cellule, l'intégration correcte de la cassette dans le génome doit être recherchée, notamment par différentes PCR.
A cette fin, on peut utiliser avantageusement les PCR suivantes :
- la PCR A: cette PCR utilise une amorce dont la séquence s 'hybride avec des portions endogènes, en 5' et en 3', extérieures auxdits gènes flanquants. Cette PCR A permet de vérifier l'intégration de la cassette dans le génome de la cellule ;
- les PCR B et C : ces PCR permettent de vérifier la présence de la cassette sur le vecteur.
Elles utilisent chacune deux amorces dont les séquences s'hybrident sur des portions d'acide nucléique de la cassette et sur une partie spécifique du vecteur (non intégré à terme dans le génome). Ces PCR B et C servent à vérifier la présence de vecteurs résiduels contenant la cassette non intégrée dans le génome des cellules de Clostridium.
De préférence, les amorces suivantes sont utilisées dans les PCR A à C :
PCR A: séquences SEQ ID NO: 24 et 25,
PCR B: séquences SEQ ID NO: 26 et 27,
PCR C: séquences SEQ ID NO: 28 et 29.
A l'issue du procédé selon l'invention, on obtient donc une cellule isolée de Clostridium transformée de façon stable par la cassette de gènes. Cette cellule est appelée souche plateforme. Par transformation ultérieure avec un vecteur adapté, notamment un plasmide, comprenant éventuellement un gène d'intérêt, puis par recombinaison homologue, la souche « fille » obtenue comprend in fine des modifications génétiques (délétion, insertion ou délétion et insertion) telles qu'elle ne contient plus ni marqueur de sélection (par exemple un gène de résistance à un antibiotique), ni aucun autre élément génétique ne correspondant pas aux modifications génétiques réalisées. La souche plateforme est donc un outil essentiel pour l'obtention de souches utilisables à l'échelle industrielle. La présente invention a également pour objet une cellule de Clostridium isolée susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention.
La présente invention vise également une cellule isolée de Clostridium comprenant dans son génome au moins la cassette de gènes selon l'invention, dans laquelle le gène de résistance à un antibiotique est sous le contrôle d'un promoteur endogène.
Plus précisément, la cellule isolée de Clostridium, qui comprend dans son génome au moins la cassette de gènes selon l'invention, est telle que le gène de résistance à un antibiotique et un gène endogène sont tous deux sous le contrôle d'un promoteur endogène unique.
Les expressions « sous le contrôle d'un promoteur » et « lié de façon fonctionnelle à un promoteur » qualifient un gène et sont équivalentes. Elles désignent le fait que le promoteur permet la transcription dudit gène. Un exemple d'une telle cellule isolée de Clostridium acetobutylicum est accessible auprès de la CNCM sous le numéro 1-4878.
Comme indiqué ci-avant, à l'issue du procédé selon l'invention, on obtient une cellule isolée de Clostridium transformée de façon stable par la cassette de gènes. Cette cellule est appelée souche plateforme.
Par transformation ultérieure avec un vecteur adapté, notamment un plasmide, comprenant éventuellement un gène d'intérêt, puis par recombinaison homologue, on obtient une souche « fille » comprenant in fine des modifications génétiques d'intérêt (délétion, insertion ou délétion et insertion). Cela est notamment exemplifié en exemple 3.
De préférence, la souche « fille » obtenue comprend l'insertion d'au moins un gène d'intérêt. De préférence, la souche « fille » obtenue est capable de produire de l'isopropanol. De préférence, la souche « fille » obtenue comprend l'insertion d'une cassette de gènes d'intérêt, notamment la cassette Ipa6. La cassette Ipa6 comprend les 4 gènes suivants, sous le contrôle d'un seul et unique promoteur, le promoteur thiolase (thlP) :
- sADH : gène codant l'alcool déshydrogénase secondaire ;
ctf A : gène codant la sous-unité A de la Coenzyme A transférase ;
ctfB : gène codant la sous-unité B de la Coenzyme A transférase ; et Adc : gène codant l'acétoacétate décarboxylase.
Une telle souche « fille » est stable sans antibiotique, et est capable de produire de ΙΒΕ (Isopropanol/Butanol/Ethanol) .
De préférence, l'invention a pour objet une cellule isolée de Clostridium acetobutylicum choisie parmi les cellules accessibles auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), déposées selon le Traité de Budapest le 26 août 2015, sous les numéros 1-5006, I- 5007, 1-5008 et 1-5009. De préférence, l'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une cellule isolée de Clostridium acetobutylicum comprenant au moins un gène hétérologue (souche « fille »), comprenant les étapes suivantes :
- transformation d'une cellule isolée de Clostridium acetobutylicum accessible auprès de la CNCM sous le numéro 1-4878, avec un vecteur adapté, notamment un plasmide, comprenant au moins un gène hétérologue, par exemple la cassette Ipa6,
- incubation du mélange obtenu, puis
- vérification de l'intégration du gène hétérologue dans le génome de la cellule de Clostridium par recombinaison homologue.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration des objets de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Schéma de la cassette EXy II (Erythromycine, xylR, ydcE II).
Figure 2. Schéma de la PCR A utilisée pour distinguer les souches C. acetobutylicum ATCC 824 ayant intégré la cassette EXy II de celles qui ne l'ont pas intégrée. Figure 3. Résultats de la PCR A effectuée sur certaines souches C. acetobutylicum ATCC 824 transfectées.
Il apparaît que les clones 1 et 25 ont intégré la cassette EXy IL
Les clones 14 et 22 ne l'ont pas intégrée, et sont identiques à la souche sauvage (WT).
Les clones 11 et 35 ont intégré en partie la cassette EXy IL
Figure 4. Schéma des PCR B et C utilisée pour identifier les souches C. acetobutylicum ATCC 824 ayant correctement intégré la cassette EXy IL
Les PCR B et C sont spécifiques de l'ADN plasmidique. Elles identifient donc les clones qui présentent la cassette dans le plasmide.
Figure 5. Résultats des PCR B et C effectuées sur certaines souches C. acetobutylicum ATCC 824 transfectées.
Il apparaît que tous les clones mentionnés sur la figure présentent la cassette EXy II dans le plasmide. Cela est particulièrement vrai pour le clone 11.6.
Figure 6 :
A) Schéma des PCR D et E utilisées pour identifier les souches C. acetobutylicum ATCC 824 ayant la cassette EXy II intégrée de manière stable dans leur génome.
B) Résultats des PCR D et E effectuées sur certaines souches C. acetobutylicum ATCC 824 EXy IL
Il apparaît que tous les clones mentionnés sur la figure présentent la cassette EXy II intégrée de manière stable dans leur génome, à l'exception du clone 33. Figure 7 :
Structure génétique Ipa6 permettant de produire de l'isopropanol.
Thlp : promoteur de la thiolase,
sADH : gène codant l'alcool déshydrogénase secondaire,
ctf A : gène codant la sous-unité A de la Coenzyme A transférase,
ctfB : gène codant la sous-unité B de la Coenzyme A transférase,
Adc : gène codant l'acétoacétate décarboxylase. EXEMPLE 1 : Construction de la cassette EXy II
Milieux de culture
Les souches d'E. coli et de Bacillus lichenijormis ont été cultivées sur milieu LB liquide et agar. Les milieux de culture ont pu être complémentés par des antibiotiques (ampicilline (10( g/mL) et ou chloramphénicol (30 μg/mL)) lorsque ceux-ci étaient recommandés.
Les souches de S. cerevisiae (W303 et ses transformants) ont été cultivées sur milieu CSM- URA.
Extraction de l'ADN génomique
Les ADN génomiques des souches cultivées ont été extraits en utilisant le kit "GenElute Bacterial Genomic" de Sigma Aldrich. Construction génétique
Les constructions génétiques (cassettes et plasmides), décrites ci-dessous, ont été réalisées par recombinaison homologue dans la souche de Saccharomyces cerevisiae W303.
Construction de pSEC500E, pSEC500C et pSEC501E
Les plasmides pSEC500E et pSEC500C sont dérivés des vecteurs E. colilClostridium plasmides pMTL500E et pMTL500C. Une cassette "Saccharomyces" contenant le gène URA3 et l'origine de réplication 2μ du plasmide pSR426 a été insérée dans ces deux plasmides. Pour chacun de ces plasmides, la cassette "Saccharomyces" peut être retirée aisément par digestion avec l'enzyme de restriction avril suivie d'une autoligation.
Le plasmide pSEC501E est un plasmide dérivé de pSEC500E. La séquence d'ADN allant du promoteur du gène ampr à l'origine de réplication ρΑΜβΙ a été amplifiée avec les couples d'oligonucléotides 13_ermB_amp_F/13_URA3_pAMpi_F. La séquence d'ADN de pSEC500C allant du promoteur du gène ermBr au gène URA3 a été amplifiée avec les oligonucléotides 13_amp_ermB_F et 13_pAMBl_URA3_R. Les deux fragments PCR ont été utilisés pour transformer S. cerevisiae W303. Le plasmide pSEC501E, à la différence de pSEC500E, contient un site de restriction spel entre les gènes ermBr et amPr Ainsi en digérant pSEC501E par Avril et spel, les gènes ermBr, URA3 et l'origine de réplication 2μ peuvent être excisés pour donner pMTL501.
Construction de la cassette EXy
Les plasmides et les amorces utilisés lors de ces expériences sont répertoriés dans les tableaux l et 2.
Tableau 1 :
Figure imgf000017_0001
Tableau 2 :
Figure imgf000017_0002
Le gène de l'érythromycine dépourvu de son promoteur a été amplifié à partir du plasmide pMTL500E avec les amorces 13_pAMBl_ermB_F (agctggcgaaagggggatgtg ctgcactgccgggcctcttgcgggatc, SEQ ID NO :20) et 13_xylR_ermB_R (ataaccctttaaattatacattcctttccaaa tttacaaaagcgactc, SEQ ID NO :21).
Le produit de PCR mesure 1100 bp. Le gène du régulateur XylR et le promoteur du gène xylB ont été synthétisés de novo par Eurofins mwg et introduits dans le plasmide pUC57. Le gène xylR et le promoteur du gène xylB ont été amplifiés par PCR à partir du plasmide pUC57_xylR avec les amorces 13_ermB_xylR_R et 13 ydcE_xylR_F. Le produit de PCR mesure 1463 bp.
L'ADN génomique de la souche B. licheniformis DSM 13 a été extrait à partir d'une culture nocturne. Le gène ydcE (ou ndoA) a été amplifié par PCR à partir de l'ADN génomique de B. licheniformis DSM 13 avec les amorces 13_xyl_ydcE_F et 13_426_ydcE_R. Le produit de PCR mesure 400 bp.
Le plasmide pSR426 a été linéarisé par xhol et bamHI et purifié sur gel. Un mix contenant de chaque PCR et 4μL· du plasmide pSR426 linéarisé a été utilisé pour transformer S. cerevisiae W303. Les cellules transformées ont été étalées sur une gélose de CSM-URA. L'ADN total est ensuite extrait des transformants de S. cerevisiae et utilisé pour transformer des E. coli compétentes ToplO et obtenir un plasmide pSR426 EXY (SEQ ID NO : 12). La cassette EXY une fois construite dans ce plasmide a été ensuite intégré par amplification PCR (colEl_hbd_f : gcggataacaatttcacacaggaaacagctgggaggtctgtttaatgaa SEQ ID NO :22 / 13_pAMB l_2706_R agctggcgaaagggggatgtgCTCGAGccaagtatctacaggaaatg SEQ ID NO :23) au sein du plasmide vecteur pEC500C (SEQ ID N : 10) pour former le plasmide pEC500C EXY (SEQ ID NO : 11).
Construction de la cassette d'insertion EXY II
Une partie de l'ORF Ca_C2707 et le gène hbd ont été amplifiés à partir de l'ADN génomique de C. acetobutylicum ATCC 824. Le couple d'oligonucléotides G_pAMB l_2707_F et G_ydcE-xR_2707_R a été utilisé pour le fragment Ca_C2707 et le couple d'oligonucléotides G_ermB_hbd_F et G_colEl_hbd_R pour le gène hbd. Des amplifications PCR sont réalisées avec les couples d'amorces G_2707_ydcE-xR_F / G_hbd_ermB_R pour amplifier la cassette EXy II à partir du plasmide pEC500C_EXy. Les amplifications PCR sont transformées dans S. cerevisiae W303 avec le plasmide pSEC500C (SEQ ID NO : 13) digéré par Pvul/Sapl. Une fois récupéré, ce plasmide est digéré par Avril et retransformé dans E. coli afin de récupérer le plasmide pEC500C_EXYII_2707.5 (SEQ ID NO :9). Obtention du plasmide
La cassette de sélection EXy II a donc été intégrée au sein d'un vecteur plasmidique nommé pEC500C_ExyII_2707.5 contenant : une origine de réplication E. coli (ColEl), un gène de résistance au chloramphenicol (CatP), une origine de réplication Clostridium (ρΑΜβΙ), la cassette de sélection EXy II insérée entre les gènes hbd et CAC_2707 du génome de Clostridium. Sélection par la cassette EXy II
Le plasmide pEC500C_EXyII_2707.5 est transformé dans la souche C. acetobutylicum ATCC 824. La croissance de la souche est ensuite observée. Les géloses utilisées contiennent toutes 25 μg/mL d'érythromycine. Seule la souche sauvage (WT) est inhibée par cet antibiotique, les souches contenant un plasmide (pEC500E ou pEC500C_EXyII_2707.5) ne le sont pas (données non montrées).
Cette observation montre que le gène de l'érythromycine de la cassette EXy II contenu dans le plasmide pEC500C_EXyII_2707.5 est fonctionnel. L'effet du xylose sur la croissance des souches est également observé. En effet, les souches ATCC 824(pEC500E) et ATCC824(pEC500C_EXyII_2707.5) montrent une croissance faible sur une gélose contenant uniquement du xylose comme source de carbone. Cette faible croissance ne permet pas d'observer l'effet du xylose sur la croissance de la souche ATCC 824 (pEC500C_EXyII_2707.5). La présence de glucose dans la gélose permet d'augmenter le taux de croissance des deux souches. Cultivée sur une gélose contenant 1 % de glucose et 4 % de xylose, la croissance de la souche ATCC 824 (pEC500E) n'est pas inhibée. La croissance de la souche C. acetobutylicum ATCC 824 (pEC500C_EXII_2707.5) cultivée dans les mêmes conditions est inhibée par le xylose. L'effet du xylose semble être fonction de la densité cellulaire de l'inoculum, avec un phénotype clairement visible pour des inocula de faibles densités. EXEMPLE 2 : Construction de la souche plateforme C. acetobut licum ATCC 824 EXY II 2707.5
Le plasmide pEC500C_EXyII_2707.5 est transformé dans la souche C. acetobutylicum ATCC 824. L'intégration de la cassette EXy II dans le génome de la souche entre les ORFs Ca_C2707 et Ca_C2708 (hbd) est ensuite recherchée par différentes PCR, les PCR A à C. Les amorces utilisées pour ces dernières sont décrites dans les Tableaux 3 à 5.
Une amplification PCR (PCR A) est tout d'abord réalisée sur les génomes des clones d'ATCC 824(pEC500C_EXyII_2707.5) générés (Figure 2). Des souches recombinantes d'ATCC 824(pEC500C_EXyII_2707.5) ont été obtenues et testées par amplification PCR A pour l'insertion de la cassette EXy IL Les clones 1 et 25 montrent une insertion de la cassette EXy II au bon emplacement (Figure 3). L'amplification PCR A effectuée sur l'ADN extrait des clones 11 et 35 montre qu'il existe pour ces clones une population mixte : avec et sans insertion de la cassette EXy IL
Pour définitivement vérifier l'intégration de la cassette il faut donc avoir recours à une série de repiquages sur boîte de sélection contenant de l'érythromycine suivie d'un contrôle de l'intégration de la cassette via les PCR B et C détaillées en Figure 4. L'analyse des PCRs B et C (Figure 5) confirme la présence de clones possédant la cassette présente au sein d'un plasmide circulaire (clones 11.6 et 34) ou d'un plasmide intégré dans le génome (clones 1, 13 et 22). Les clones 11.1 et 25 ne possèdent plus que la cassette intégrée dans le génome (absence d'amplification des PCR B et C correspondant au contrôle dit « plasmide »).
Tableau 3 :
Nom de l'amorce Séquence (5'->3') Tm SEQ ID
NO :
V_2706_2707_F ctctttgagggcttcttaacaca 58,9 24
V_etfa_hbd_R cagcatttagcaggtatgcaag 58,4 25
V_pamBl_2707_F ctaaaacgtcgaggggcag 58,8 26
V_ydce_2707_R gaaatgatggaaaaggtcaacg 56,5 27
V_ermb_hbd_F gacgcatggctttcaaaaac 55,3 28 V_colEl_hbd_R gggaaacgcctggtatcttt 57,3 29
Tableau 4 :
Figure imgf000021_0001
Tableau 5 : Amorces des 5 PCR (A à C) utilisées pour le screening de la cassette EXy II chez C. acetobutylicum ATCC 824
Figure imgf000021_0002
L'analyse des PCR D et E (Figure 6) confirme la présence de clones possédant la cassette EXYII intégrée de manière stable au sein du génome de la souche C. acetobutylicum ATCC824 (à l'exception du clone 33). Quelques souches recombinantes de type « plateforme » ont donc été retenues pour la phase suivante, à savoir la vérification de l'absence de croissance en condition Xylose. Sélection d'une souche « plateforme »
Après avoir vérifié le génotype des clones recombinants ATCC824 EXYII, leurs phénotypes ont été testés. Ces souches expriment la toxine YdcE uniquement dans un milieu de culture contenant du Xylose comme unique source de carbone.
Les premières cultures en présence de Glucose ou Xylose ont montré que la croissance de ces souches n'était pas totalement stoppée. La production de cette toxine est peut-être trop faible et n'entraîne qu'un simple retard de croissance. Mais, en comparant ces souches à la souche de base C. acetobutylicum ATCC824, cela suffit pour créer une pression de sélection suffisamment importante et forcer l'insertion des gènes d'intérêt de manière stable.
Pour sélectionner la meilleure souche, des cultures en microplaques ont été réalisées avec des dilutions successives d'une préculture sur milieu contenant du glucose (dilution de la préculture allant de 10° à 104). Dans des conditions de dilution suffisante, on observe que la toxine produite entraîne une faible croissance, voire une absence totale de croissance, sur milieu liquide contenant du Xylose. En milieu gélosé, le phénomène est encore plus net, même si les clones finissent tout de même par pousser après une incubation prolongée.
La souche plateforme Clostridium acetobutylicum IFP 950, déposée à la CNCM sous le numéro 1-4878, a ainsi été identifiée.
EXEMPLE 3 : Construction de la souche C. acetobutylicum ATCC 824 productrice d'isopropanol/butanol/éthanol (souche ATCC824 IBE+) La construction de la souche ATCC824 IBE+ a été faite à partir de la souche plateforme IFP 950 (CNCM 1-4878). En introduisant un plasmide codant Ipa6 (pEC750C Ipa6) par recombinaison homologue, la cassette EXYII est remplacée par le cluster de gènes d'intérêt Ipa6. Cette structure génétique comprend 4 gènes sous contrôle d'un seul et unique promoteur (Figure 7).
Pour construire le plasmide contenant le cluster de gènes Ipa6, un nouveau vecteur pEC750C a été créé, dans lequel l'origine de réplication pAMBl du pEC500C ipaô 2707.5 est remplacée par l'origine de réplication pIP404 issue du plasmide pJIR750ai. Au regard de la complexité du clonage (amplification PCR de l'origine de réplication impossible), il a été décidé de passer par un vecteur E. colilS. cerevisiae pour réaliser les différentes constructions. A) Construction du plasmide pEC750C Ipa6 2707.5 :
1. Construction de pEC750C (via S. cerevisiae) :
Le plasmide pJIR750ai est digéré par Xmnl et Nhel puis le fragment pIP404 de 2710 pb est récupéré.
Amplification sur pSEC500C :
- Fragment ColEI - CatP : 2253 pb
- Fragment 2μ - URA3 : 2880 pb
Transformation dans Saccharomyces cerevisiae W303 puis dans E.coli.
Plusieurs clones recombinants d'E. coli sont vérifiés par restriction (Ndel - Xbal). Sur l'un des clones présentant le bon profil, une digestion par Avril est ensuite réalisée pour éliminer la cassette 2μ-υ¾Α3 avant de refermer le plasmide par ligation et transformer une souche d' E.coli. Une fois vérifié, le plasmide est ensuite méthylé et vérifié par restriction Fnu4HI (sensible à la méthylation) avant transformation dans Clostridium. 2. Construction de pEC750C Ipa6 2707.5 (via S. cerevisiae) :
Le plasmide pSEC750C par Xbal - BamHI est digéré.
Amplification sur pEC500C Ipa6 2707.5 :
- Fragment HBD-adct : 1087 pb
Fragment ipaô : 2795 pb
- Fragment CAC-2707 : 849 pb
Transformation dans Saccharomyces cerevisiae W303 puis dans E.coli.
Les clones E.coli sont vérifiés à la fois par PCR (amplification Ipaô) et par restriction (Nhel).
Sur l'un des clones présentant le bon profil, une digestion par Avril est réalisée pour éliminer la cassette 2μ-υ¾Α3 avant de retransformer le plasmide dans E.coli. Le plasmide est ensuite méthylé et vérifié par restriction Fnu4HI avant transformation dans Clostridium.
Amorces Séquences Taille Produit
Figure imgf000024_0001
Tableau 6 : Liste des amorces ayant servi pour la construction des plasmides pEC750C et pEC750C Ipa6 2707.5
B) Construction de la souche C. acetobutylicum ATCC824 IBE+ :
Le plasmide pEC750C_Ipa6_2707.5 et le plasmide contrôle (pEC750C) ont été transformés dans la souche C. acetobutylicum IFP950. Après préparation des cellules compétentes et transformation, la première sélection des souches recombinantes a été réalisée sur des boîtes YTG contenant 25 μg/mL de Chloramphénicol. A l'issue de cette transformation, l'ensemble des souches recombinantes contenant le plasmide pEC750C Ipa6_2707.5 poussant sur CGM- Chloramphénicol a été isolé.
Après isolement sur YTG-Chloramphénicol, les souches recombinantes ont été repiquées sur YTG-Xylose (étape 1). Des différences de croissance sur milieu gélosé YTG-Xylose entre ces clones résistants au chloramphénicol et la souche plateforme IFP950 étaient clairement visibles et attendues. Mais des tests sur YTG-Chloramphénicol et YTG-Erythromycine ont montré que ces clones étaient toujours résistants aux deux antibiotiques, ce qui suggérait que la cassette EXY était toujours présente et que l'insertion ne s'était faite que d'un seul côté. Deux lignées ont ensuite été créées afin de pouvoir isoler un seul et unique type de clones du mélange de populations contenant le plasmide intégré par une simple recombinaison homologue.
Trois clones poussant sur YTG-Xylose (X) ont donc été étalés sur YTG-Chloramphénicol pour engendrer une lignée XC et les deux lignées X et XC ont donc été repiquées en parallèle (étape 2).
Pour forcer la recombinaison homologue, ces clones ont été repiqués sur des temps assez courts et sur milieu gélosé YTG-Xylose (étape 3) pour favoriser la sélection d'un clone ne possédant plus la cassette EXYII. Au final, les 5 clones IX, 2X, 3X, 1XC, 3XC ont été retestés pour la résistance aux antibiotiques. Les phénotypes obtenus montraient cette fois-ci une croissance systématique sur Chloramphénicol, mais une absence totale de croissance sur érythromycine pour l'ensemble des clones. Cette étape a donc permis d'isoler des clones ayant intégré le plasmide uniquement du côté hbd.
Une série de vérification PCR a donc été réalisée sur les clones avant et après cette étape de repiquage accéléré et avec des amorces permettant de tester l'intégration par recombinaison homologue ou non de la structure génétique Ipa6. Analyses PCR :
L'analyse PCR montre qu'à l'issue de l'étape 2, l'ensemble des souches contient à la fois le plasmide pEC750C Ipa6 et le cluster de gènes EXY. Ceci confirme que la toxine, une fois exprimée, ne permet qu'un retard de croissance, et que les souches sont capables de la tolérer après un temps de latence.
A l'issue de l'étape 3 comprenant la phase de repiquage accéléré, il a été possible d'isoler des clones ayant perdu l'insertion du cluster EXYII coté hbd (phénotype érythromycine sensible). Mais l'insertion du cluster Ipa6 n'est pas totale puisque l'on ne retrouve pas de bande positive sur les PCR contrôlant l'intégration par double recombinaison homologue. La présence du plasmide pEC750C Ipa6 dans l'ensemble des clones, même si l'amplification PCR est très faible, confirme que les souches IX, 2X, 3X, 1XC et 3XC ont un génotype intermédiaire EXYII/Ipa6. Une dernière série de PCR a été réalisée pour vérifier la présence de la cassette EXY ou du cluster Ipa6 stabilisé dans le génome (intégration totale). Par rapport à un clone contrôle issu de la première boîte de transformation, aucune amplification n'est visible dans les clones obtenus à l'issue de l'étape 3. Ceci peut s'expliquer par une intégration stable du plasmide dans le génome de la souche IFP950 et à la suite de la cassette EXYII.
Profils fermentaires / souches C. acetobutylicum ATCC824 IBE+ :
Les 5 clones, une fois la phase de repiquage accélérée sur YTG-Xylose, présentent un phénotype ERY-, Chloramphénicol+, ce qui suggère une intégration du plasmide entier du côté hbd (et à la suite du cluster EXYII). On retrouve sur PCR ces différents phénotypes.
Pour vérifier le phénotype de ces souches, une première série de croissance sur GAPES- Glucose a ensuite été réalisée (tableau 7).
Le milieu GAPES a la composition suivante :
Figure imgf000026_0001
L'analyse des acides et des solvants produits par les différents clones montre des traces d'acétone et une production d'isopropanol pour l'ensemble des clones testés.
On observe à 24h une bonne production d'acides avec une forte présence d'acide acétique. Après 96h, 40 g/L de glucose ont été consommés par les souches IX, 2X et 3X, alors que la souche 1XC a consommé plus de 55 g/L. Concentrations en solvants (g/L) Glucose résiduel
Clones Ac. Lactique Ac. Acétique : Ac. Butyrique isoproparîoS Butanol en g/L
Point à 20h Snl IXC n.a. 1.7 0,4 2,0 53.3
Snl lX 0,1 1,4 0,5 1,5 1,9 54,5
Snl 2X n.a. 2,6 1,1 0,2 0,8 61,3
Snl 3X n.a. 2,7 1,3 0fl 0,4 61,3
Point à 48h Sn2 IXC n.a. 0.2 0,1 7,7 10,5 7.8
Sn2 1X n.a. 1,0 1,0 4,7 6,8 21,7
Sn22X n.a. n.a. n.a. 7,2 9,3 12,4
Sn23X n.a. 0,1 0,2 7,3 9,1 15,2
Point à 96h Sn3 IXC n.a. 0.2 0,3 11,2 4,4
Sn3 IX n.a. 1,1 1,5 5,5 7,7 18,4
Sn3 2X n.a. n.a. n.a. 7,0 9,1 13,1
Sn3 3X n.a. 0,0 0,1 7,2 8,9 15,5
Tableau 7: Bilan de l'analyse des acides et des solvants produits en fioles GAP ES-
Glucose Le bilan montre que la souche IXC est performante. Une seconde série de fermentation a été réalisée pour définitivement confirmer les profils fermentaires des différents clones (tableau
8). Cette fois-ci, une pré-culture sur Calam suivie d'une culture en GAPES-Glucose a été réalisée (500μί d'inoculum issu des pré-cultures sur milieu Calam par fiole de 30 mL de milieu GAPES-Glucose).
¾Aooe acetsque
Figure imgf000028_0001
IX 2X 3X 1XC
Tableau 8 : Second test de fermentation IBE sur GAPES-Glucose à partir des souches IBE+
Dans ces essais, le clone 2X, renommé Ipa2, est celui qui présente les meilleures performances, avec au temps final une production totale de solvants approchant les 23 g/L, dont 13 g/L de butanol et 10 g/L d'isopropanol (productivité à 48h de 0,41 g/L/h). Les clones 3 et 1XC présentent des performances plus faibles (15 et 17 g/L de solvants) et le clone 1 ne dépasse pas les 10 g/L de solvants produits.
Dans toutes ces fermentations, on ne retrouve systématiquement que des traces d'acétone (<0,2 g/L en moyenne), ce qui signifie que l'on possède bien une souche stable sans antibiotique et capable de produire de l'isopropanol en lieu et place de l'acétone. Pour la suite des essais, l'ensemble de ces clones a été renommé Ipa selon la nomenclature suivante :
Numéro de dépôt CNCM
(en date du 26 août 2015)
Souche IFP955 (clone IX / Ipal) CNCM 1-5006
Souche IFP956 (clone 2X / Ipa2) CNCM 1-5007 Souche IFP957 (clone 3X / Ipa3) CNCM 1-5008
Souche IFP958 (clone 1XC / Ipa4) CNCM 1-5009
Bilan
Cet exemple décrit donc la construction de souches génétiquement améliorées pour la production d'Isopropanol/Butanol/Ethanol (IBE). Elles ont été créées à partir de la souche Clostridium acetobutylicum ATCC824, souche fermentaire ABE (Acétone/Butanol/Ethanol). Ces souches IBE+ sont stables et performantes.
Elles sont obtenues à partir d'une souche intermédiaire C. acetobutylicum ATCC824, dite «plateforme», contenant le système inductible d'expression d'une protéine toxique pour Clostridium (la cassette EXY II).
Par pression de sélection, il a été généré une souche IBE+ stable sans antibiotique.
Les analyses du phénotype et du génotype des souches finalement obtenues démontrent cependant une intégration complète du plasmide, sans double événement de recombinaison permettant d'éliminer le plasmide vecteur. Cette souche est cependant stable sans antibiotique, puisque seules des traces d'acétone sont produites par ces souches en milieu sans antibiotique.
Par ailleurs, des essais de fermentation ont montré des performances intéressantes sans usage d'antibiotique dans les fioles (jusqu'à 23 g/L d'IBE, dont 9,8 g/L d'isopropanol après 96h en fioles).

Claims

REVENDICATIONS
1. Cassette de gènes comprenant au moins un gène procaryote flanquant l'extrémité 5' et un gène procaryote flanquant l'extrémité 3', lesdits gènes étant choisis parmi deux gènes présents de façon adjacente dans un génome de Clostridium, et entre lesquels sont insérés au moins : un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur,
le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle d'un promoteur, et
le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xyl de Clostridium difficile ssp. 630,
le gène de résistance à l'antibiotique étant adjacent audit gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou audit gène procaryote flanquant l'extrémité 3' .
2. Cassette de gènes selon la revendication 1, caractérisée en ce que le gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou le gène procaryote flanquant l'extrémité 3' est adjacent au gène de résistance à un antibiotique, et en ce qu'il est présent dans le génome de Clostridium sous le contrôle d'un promoteur fort.
3. Cassette selon la revendication 1 ou 2, comprenant, dans le sens 5' à 3':
un gène procaryote flanquant l'extrémité 5',
un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur et adjacent au gène procaryote flanquant l'extrémité 5',
le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle de son propre promoteur,
le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xylB de Clostridium difficile ssp. 630, et
un gène procaryote flanquant l'extrémité 3' .
4. Cassette de gènes selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le gène de résistance à un antibiotique est le gène de résistance à l'érythromycine ermB de Clostridium difficile, de préférence de séquence SEQ ID NO :3.
5. Cassette de gènes selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend les séquences suivantes : SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :5, de préférence en ce qu'elle comprend la séquence SEQ ID NO :7.
6. Vecteur, de préférence plasmide, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette de gènes selon l'une des revendications 1 à 5.
7. Vecteur selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est le plasmide pEC500C_EXyII_2707.5 de séquence SEQ ID NO :9.
8. Procédé de préparation d'une cellule isolée de Clostridium, comprenant au moins une étape a) de transformation d'au moins une cellule de Clostridium avec un vecteur, de préférence un plasmide, selon la revendication 6 ou 7.
9. Procédé selon la revendication 8, comprenant, après l'étape a) :
- une étape b) d'incubation de Clostridium obtenue à l'étape a), pendant un temps suffisant pour que la recombinaison homologue s'effectue dans la cellule ;
- une étape c) de repiquage(s) des colonies obtenues à l'issue de l'étape b) ; puis
- une étape d) de vérification de l'intégration correcte de la cassette de gènes dans le génome de la cellule de Clostridium.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'étape d) se fait par PCR, de préférence par les PCR A à C qui utilisent les amorces suivantes :
PCR A: séquences SEQ ID NO: 24 et 25,
PCR B: séquences SEQ ID NO: 26 et 27,
PCR C: séquences SEQ ID NO: 28 et 29.
11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la cellule isolée de Clostridium est une cellule isolée de Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium beijerinckii ou de Clostridium butylicum.
12. Cellule isolée de Clostridium susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 9 à 11.
13. Cellule isolée de Clostridium comprenant dans son génome au moins la cassette de gènes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le gène de résistance à un antibiotique est sous le contrôle d'un promoteur endogène, de préférence un promoteur constitutif fort.
14. Cellule isolée de Clostridium acetobutylicum accessible auprès de la CNCM sous le numéro 1-4878.
15. Procédé d'obtention d'une cellule isolée de Clostridium acetobutylicum comprenant au moins un gène hétérologue, comprenant les étapes suivantes :
- transformation d'une cellule selon la revendication 14 avec un vecteur adapté, notamment un plasmide, comprenant au moins un gène hétérologue, par exemple la cassette Ipa6, - incubation du mélange obtenu, puis vérification de l'intégration du gène hétérologue dans le génome de la cellule de Clostridium par recombinaison homologue.
16. Cellule isolée de Clostridium acetobutylicum choisie parmi les cellules accessibles auprès de la CNCM sous le numéro 1-5006, 1-5007, 1-5008 et 1-5009.
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