CN102498209A - 转化体及其制造方法以及乳酸的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)为宿主、重组有乳酸脱氢酶基因、且编码所述粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活的转化体。
Description
技术领域
本发明涉及转化体及其制造方法以及乳酸的制造方法。
背景技术
乳酸广泛用于食品用途和医疗、化妆品等的化学原料用途。另外,使用乳酸而得到的聚乳酸作为在微生物等的作用下最终分解为二氧化碳和水的生物分解性塑料而受到关注。因此,需要廉价地以高生产率制造乳酸。
作为乳酸的制造方法,已知利用乳酸菌使糖发酵而进行制造的生物学方法。但是,由于乳酸菌的耐酸性低,因此为了以该方法获得高生产率,需要用碱中和发酵所产生的乳酸而形成乳酸盐。这种利用碱进行的中和需要从乳酸盐恢复成乳酸的步骤,因此制造步骤变得繁杂,制造成本也升高。
因此,作为不用碱进行中和而获得乳酸的方法,提出了:使用以酵母菌属的酵母等耐酸性微生物为宿主、在该耐酸性微生物中导入有编码乳酸脱氢酶的基因的转化体的方法(专利文献1);使用导入有编码乳酸脱氢酶的基因、且编码丙酮酸脱羧酶1的基因缺失或失活的酿酒酵母(出芽酵母)的方法(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2001-204464号公报
专利文献2:日本特开2008-48726号公报
发明内容
但是,专利文献1的方法即使在20~24小时的培养时间下也仅达到获得2~5%的乳酸的程度,生产率不充分。另外,专利文献2的方法在大量生产乳酸时需要用碱进行中和,因而不适合工业性的乳酸的大量生产。因此,期待不用碱进行中和即可以高生产率制造乳酸的方法。
因此,本发明的目的在于提供不需要用碱中和即可以高生产率生产乳酸的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的转化体及该转化体的制造方法。此外,本发明的目的还在于提供适于在高浓度的糖存在下产生乳酸、并且也适于高密度发酵的转化体及该转化体的制造方法。
另外,本发明的目的在于提供使用上述转化体、在不进行碱中和步骤的情况下以高生产率制造乳酸的方法。
需要说明的是,本发明中所说的乳酸是指利用生物学方法得到的L-乳酸。
本发明的转化体以粟酒裂殖酵母为宿主,重组有乳酸脱氢酶基因,且编码上述粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活。
另外,本发明的转化体中,上述缺失或失活的编码丙酮酸脱羧酶的基因优选为PDC2基因。上述乳酸脱氢酶基因优选为哺乳动物的乳酸脱氢酶基因。并且,上述乳酸脱氢酶基因优选重组到粟酒裂殖酵母的染色体中。
另外,本发明的转化体的制造方法为制造重组有乳酸脱氢酶基因且编码丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活的转化体的方法,其中,包括下述步骤:以粟酒裂殖酵母为宿主,使用具有包含在粟酒裂殖酵母内发挥作用的启动子、终止子和乳酸脱氢酶基因的表达盒的载体,将上述表达盒导入上述宿主中而得到转化体;和使用编码丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活的宿主作为上述宿主,或者使上述得到的转化体的编码丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活。
另外,优选上述载体还具有对粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组的重组位点,使用该载体将表达盒导入粟酒裂殖酵母的染色体中。并且,宿主的染色体中进行同源重组的靶位点优选为转座子基因Tf2。
另外,本发明的方法中,上述缺失或失活的编码丙酮酸脱羧酶的基因优选为PDC2基因。上述乳酸脱氢酶基因优选为哺乳动物的乳酸脱氢酶基因。
此外,本发明为一种乳酸的制造方法,其中,将上述转化体在培养液中进行培养,并从该培养液中获取乳酸。
另外,该乳酸的制造方法中,优选使用含有浓度为1~50质量%(更优选2~16质量%)的葡萄糖的培养液进行培养。另外,优选在通过由上述转化体产生的乳酸的作用使上述培养液的pH达到3.5以下后,进一步继续培养。
并且,上述培养液中的转化体的初始菌体浓度优选设定为0.1~50克(以干燥菌体换算)/升(更优选0.2~40克(以干燥菌体换算)/升)。另外,优选在不中和由上述转化体产生的培养液中的乳酸的情况下继续进行培养,并且,优选在不中和培养液中的乳酸的情况下从培养液中分离乳酸。
发明效果
本发明的粟酒裂殖酵母的转化体不需要用碱中和即可以高生产率产生乳酸。另外,适于在高浓度的糖、特别是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖的存在下产生乳酸,并且也适于高密度培养。此外,通过本发明的转化体的制造方法,能够简便地得到上述转化体。
另外,本发明的乳酸的制造方法能够在不进行碱中和步骤的情况下以高生产率制造乳酸。
具体实施方式
[转化体]
本发明的转化体为以粟酒裂殖酵母为宿主、重组有乳酸脱氢酶基因、且编码粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活的转化体。
<粟酒裂殖酵母>
作为宿主的粟酒裂殖酵母为属于裂殖酵母属的酵母(裂殖酵母),是与其他酵母相比耐酸性特别优良的微生物。本发明人发现:粟酒裂殖酵母与酿酒酵母等其他酵母相比,在高浓度葡萄糖下的乳酸的生产率优良,也适于高密度培养(使用大量酵母的培养),并且发现:通过使用粟酒裂殖酵母的转化体,能够以极高的生产率制造乳酸。
需要说明的是,粟酒裂殖酵母的染色体的全碱基序列作为“Schizosaccharomyces pombe Gene DB(http://www.genedb.org/genedb/pombe/)”收录、公开于桑格研究所的数据库“GeneDB”中。本说明书中记载的粟酒裂殖酵母的基因的序列数据可通过基因名或上述系统名从上述数据库中检索获得。
本发明中使用的粟酒裂殖酵母只要具有耐酸性则没有特别限定。
粟酒裂殖酵母可从公共或民间的保藏机构、即、美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC、马纳萨斯、VA、USA)、英国酵母菌种保藏中心(National Collection of YeastCultures)(NCYC、诺里奇、英国)、NITE生物资源中心(NBRC、日本千叶县木更津市)、酵母遗传资源中心(YGRC、日本大阪市立大学研究生院理学研究科内)等处获得。
<编码丙酮酸脱羧酶的基因>
粟酒裂殖酵母中编码丙酮酸脱羧酶的基因(丙酮酸脱羧酶基因、以下也称为“PDC基因”)簇有以下4种:编码丙酮酸脱羧酶1的基因(以下也称为“PDC1基因”)、编码丙酮酸脱羧酶2的基因(以下也称为“PDC2基因”)、编码丙酮酸脱羧酶3的基因(以下也称为“PDC3基因”)、编码丙酮酸脱羧酶4的基因(以下也称为“PDC4基因”)。其中,粟酒裂殖酵母中,PDC2基因和PDC4基因是具有主要功能的PDC基因。各PDC基因的系统名如下所示。
PDC1基因(Pdc1):SPAC13A11.06
PDC2基因(Pdc2):SPAC1F8.07c
PDC3基因(Pdc3):SPAC186.09
PDC4基因(Pdc4):SPAC3G9.11c
上述PDC基因的序列数据可通过基因名或系统名从上述粟酒裂殖酵母基因数据库中检索获得。
在野生型粟酒裂殖酵母中,通过糖酵解将葡萄糖代谢至丙酮酸,利用由前述的PDC基因所表达的丙酮酸脱羧酶将丙酮酸转变成乙醛,继而由醇脱氢酶将该乙醛转变成乙醇,由此进行乙醇发酵。另外,野生型粟酒裂殖酵母不具有具备功能的乳酸脱氢酶基因,因此不存在由丙酮酸生成乳酸的途径。
另一方面,由重组的乳酸脱氢酶基因所表达的乳酸脱氢酶通过将丙酮酸还原成乳酸而产生乳酸。因此,即使在野生型粟酒裂殖酵母中重组入乳酸脱氢酶基因以使其能够产生乳酸,在该状态下也会同时进行乙醇发酵和乳酸发酵,因此乳酸的生产率不能充分提高。
本发明的转化体具有编码上述丙酮酸脱羧酶的基因簇中部分缺失或失活的染色体。通过使转化体的PDC基因簇部分缺失或失活,转化体的乙醇发酵的效率降低,转变成乙醇的丙酮酸量减少,因此乳酸的生产率提高。但是,若使PDC基因簇完全缺失或失活,则将完全无法进行乙醇发酵而抑制生长,因此将缺失或失活设定为在PDC基因簇的一部分发生。
缺失或失活的PDC基因特别优选为PDC2基因。PDC2基因是具有特别主要功能的PDC基因。
如前所述,若使PDC基因完全缺失或失活,则该转化体无法进行乙醇发酵因而会抑制生长。因此,PDC基因的缺失或失活必须以保留生长所必需的乙醇发酵能力从而获得充分的转化体量、同时降低乙醇发酵能力从而提高乳酸的发酵效率的方式进行。针对该课题本发明人进行了研究,结果发现,若使PDC2基因缺失或失活,则PDC4基因会以某种程度活化,能够兼顾获得充分的转化体量的程度的乙醇发酵能力和高发酵效率的乳酸生产。
PDC基因的缺失或失活可利用公知的方法进行。例如,可通过使用Latour法(记载于Nucreic Acids Res杂志、2006年、34卷、e11页,国际公开第2007/063919号小册子等中)使PDC基因缺失。
另外,通过使PDC基因的碱基序列的一部分发生缺失、插入、取代、添加,也可以使该PDC基因失活。这些缺失、插入、取代、添加所致的突变,可以只发生其中的任意一种,也可以发生两种以上。
在PDC基因的一部分中导入上述突变的方法可以使用公知的方法。
例如,可以列举使用诱变剂的突变分离法(酵母分子遗传学实验法、1996年、学会出版中心)、利用PCR(聚合酶链式反应)的随机突变法(PCR Methods Appl.、1992年、第2卷、第28-33页)等。
另外,在其一部分中导入有突变的PDC基因可以是表达温度敏感突变型丙酮酸脱羧酶的PDC基因。温度敏感突变型丙酮酸脱羧酶是指在某一培养温度下显示出与野生型丙酮酸脱羧酶同等的活性、但达到特定的培养温度以上时可观察到活性的消失或降低的酶。
表达这种突变型丙酮酸脱羧酶的突变株,可以通过选择在活性不受限制的温度条件下显示出与野生型酵母同等的生长速度、在活性受到限制的特定的温度条件下生长速度显著降低的突变株而获得。
<宿主>
PDC基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母的突变体,可作为用于制造本发明的转化体的宿主而使用。此外,也可将除PDC基因以外进一步使PDC基因以外的特定基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母作为宿主。作为使除PDC基因以外的特定基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母宿主,例如,记载于国际公开第2002/101038号小册子、国际公开第2007/015470号小册子等中。通过使蛋白酶基因等缺失或失活,能够提高异种蛋白的表达效率,通过应用于本发明中的宿主中,可期待乳酸生产效率的提高。
并且,作为宿主使用的粟酒裂殖酵母,优选使用具有用于选择转化体的标记的粟酒裂殖酵母。例如,优选使用通过使某一基因缺失而使其生长需要特定营养成分的宿主。通过在载体中重组该缺失的基因(营养缺陷型互补标记),使转化体中宿主的营养缺陷性消失。利用该宿主与转化体的营养缺陷性的差异,能够区别出两者而得到转化体。
例如,以乳清酸核苷磷酸脱羧酶基因(ura4基因)缺失或失活而形成的尿嘧啶缺陷型粟酒裂殖酵母为宿主,利用具有ura4基因(营养缺陷型互补标记)的载体进行转化后,选择尿嘧啶缺陷性消失的转化体,由此能够得到重组有载体的转化体。对于宿主中通过缺失而导致营养缺陷性的基因而言,只要可用于转化体的选择则不限定于ura4基因,可以是异丙基苹果酸脱氢酶基因(leu1基因)等。
另外,也可以使用PDC基因簇既未缺失也未失活的粟酒裂殖酵母作为用于转化体制造的宿主。作为该情况下的宿主,可以使用除PDC基因以外的上述基因(营养缺陷型标记或蛋白酶基因等)缺失或失活的宿主。使用该宿主制造转化体后,使该转化体的PDC基因簇部分缺失或失活,能够得到本发明的转化体。
<乳酸脱氢酶基因>
本发明的转化体具有乳酸脱氢酶基因(编码乳酸脱氢酶的基因、以下也称为“LDH基因”)。如上所述,粟酒裂殖酵母本来不具有LDH基因。因此,利用基因工程的方法将粟酒裂殖酵母之外的生物的LDH基因导入粟酒裂殖酵母中,得到转化体。
本发明中的LDH基因没有特别限定,可以列举例如属于双歧杆菌属、乳杆菌属等的微生物来源的LDH基因、人等哺乳动物来源的LDH基因。其中,从粟酒裂殖酵母的乳酸产生效率优良的方面考虑,优选为哺乳动物来源的LDH基因。其中,更优选为人来源的LDH基因(文献:Tsujibo H,Tiano HF,Li SS-L.Nucleotide sequences of the cDNA andan intronless pseudogene for human lactate dehydrogenase-A isozyme.Eur.J.Biochem.(1985)147,9-15)。进一步优选为下述序列表的序列号1所示的LDH基因。
[转化体的制造]
本发明的转化体通过以PDC基因簇部分缺失或失活的粟酒裂殖酵母为宿主,利用基因工程的方法将LDH基因导入粟酒裂殖酵母中而得到。另外,以PDC基因簇既未缺失也未失活的粟酒裂殖酵母为宿主,利用基因工程的方法将LDH基因导入粟酒裂殖酵母中而得到转化体,然后使所得到的转化体的PDC基因簇部分缺失或失活,也能够得到本发明的转化体。在后述的实施例中,利用前一方法制造了目标转化体,但利用后一方法也能够制造大致等同的转化体。以下,以前一方法为例对转化体的制造方法进行说明。
作为利用基因工程的方法将LDH基因导入宿主中的方法,可以使用公知的方法。作为以粟酒裂殖酵母为宿主、向其中导入异种蛋白的结构基因的方法,可以使用例如日本特开平5-15380号公报、国际公开第95/09914号小册子、日本特开平10-234375号公报、日本特开2000-262284号公报、日本特开2005-198612号公报等中记载的方法。
LDH基因优选导入粟酒裂殖酵母的染色体中。通过向染色体中导入LDH基因,可获得传代中的维持稳定性优良的转化体。另外,也可以向染色体中导入多个LDH基因。通过导入多个LDH基因,能够提高LDH基因的表达效率,进而可提高乳酸的生产效率。本发明的转化体中,重组到染色体中的LDH基因个数优选为1~20,特别优选为1~8。
作为向染色体中导入LDH基因的方法,可以使用公知的方法。例如,可以通过上述日本特开2000-262284号公报中记载的方法,向染色体中导入多个LDH基因。另外,也可以通过该方法向染色体中导入一个LDH基因。另外,还可以如后所述在染色体的多个位置上导入一个或多个LDH基因。
作为将LDH基因导入粟酒裂殖酵母的染色体中的方法,优选:使用具有包含LDH基因的表达盒和重组位点的载体,利用同源重组法进行导入的方法。以下,对该方法中使用的载体和同源重组法进行说明。
<载体>
载体具有包含LDH基因的表达盒和重组位点。
表达盒是指表达乳酸脱氢酶所需要的DNA的组合,包含LDH基因、在粟酒裂殖酵母内发挥作用的启动子和在粟酒裂殖酵母内发挥作用的终止子。此外,还可以包含5’-非翻译区、3’-非翻译区中的任意一个以上。此外,还可以包含上述营养缺陷型互补标记。优选的表达盒为包含LDH基因、启动子、终止子、5’-非翻译区、3’-非翻译区、营养缺陷型互补标记的表达盒。表达盒中可以存在多个LDH基因。表达盒中的LDH基因个数优选为1~8,更优选为1~5。
在粟酒裂殖酵母内发挥作用的启动子和终止子,只要满足以下条件即可:即使因本发明的转化体使乳酸蓄积而成酸性(即使pH达到6以下),也能够在转化体内发挥作用而维持乳酸脱氢酶的表达。作为在粟酒裂殖酵母内发挥作用的启动子,可以使用粟酒裂殖酵母本来所具有的启动子(优选转录起始活性高的启动子)或粟酒裂殖酵母本来不具有的启动子(病毒来源的启动子等)。需要说明的是,载体内可存在两种以上的启动子。
作为粟酒裂殖酵母本来所具有的启动子,可以列举例如醇脱氢酶基因启动子、参与硫胺素代谢的nmt1基因启动子、参与葡萄糖代谢的果糖-1,6-二磷酸酶基因启动子、参与分解代谢物阻遏的转化酶基因的启动子(参考国际公开第99/23223号小册子)、热休克蛋白基因启动子(参考国际公开第2007/26617号小册子)等。
作为粟酒裂殖酵母本来不具有的启动子,可以列举例如日本特开平5-15380号公报、日本特开平7-163373号公报、日本特开平10-234375号公报中记载的动物细胞病毒来源的启动子,优选hCMV启动子、SV40启动子。
作为在粟酒裂殖酵母内发挥作用的终止子,可以使用粟酒裂殖酵母本来所具有的终止子或粟酒裂殖酵母本来不具有的终止子。需要说明的是,载体内可存在两种以上的终止子。
作为终止子,可以列举例如日本特开平5-15380号公报、日本特开平7-163373号公报、日本特开平10-234375号公报中记载的人来源的终止子,优选人脂皮素I的终止子。
载体的重组位点是具有能够对粟酒裂殖酵母的染色体中的同源重组的靶位点进行同源重组的碱基序列的位点。另外,靶位点是粟酒裂殖酵母的染色体内成为重组表达盒的标靶的位点。靶位点可以通过使载体的重组位点为对该靶位点进行同源重组的碱基序列而自由地设定。
上述重组位点的碱基序列与靶位点的碱基序列的相同性需要设定为70%以上。另外,从容易发生同源重组的观点考虑,重组位点的碱基序列与靶位点的碱基序列的相同性优选设定为90%以上,更优选为95%以上。通过使用具有这样的重组位点的载体,利用同源重组将表达盒重组到靶位点中。
重组位点的长度(碱基数)优选为20~2000bp。重组位点的长度为20bp以上时,容易发生同源重组。另外,重组位点的长度为2000bp以下时,容易防止因载体过长而难以发生同源重组。重组位点的长度更优选为100bp以上,进一步优选为200bp以上。另外,重组位点的长度更优选为800bp以下,进一步优选为400bp以下。
载体中除上述表达盒和重组位点以外可具有其他DNA区域。可以列举例如对于在大肠杆菌内复制所必需的称为“ori”的复制起始区或抗生素抗性基因(新霉素抗性基因等)。这些是使用大肠杆菌构建载体时通常所需要的基因。但是,上述复制起始区优选如后所述在将载体重组到宿主的染色体中时除去。
载体是具有环形DNA结构或线形DNA结构的载体,在导入到粟酒裂殖酵母的细胞中时优选以线形DNA结构导入。即,在通常使用的质粒DNA等具有环形DNA结构的载体的情况下,优选用限制性内切酶将载体切开为线形后导入粟酒裂殖酵母的细胞中。
该情况下,将具有环形DNA结构的载体的切开位置设定在重组位点内。由此,使被切开的载体的两端分别存在部分重组位点,通过同源重组将整个载体重组到染色体的靶位点中。
只要载体能够形成两端分别具有部分重组位点的线形DNA结构,也可以采用除了将具有环形DNA结构的载体切开的方法以外的方法进行构建。
作为载体,可以适合使用例如pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等大肠杆菌来源的质粒。
该情况下,用于同源重组时的质粒载体优选已将在大肠杆菌内复制所必需的称为“ori”的复制起始区除去。由此,将上述载体重组到染色体中时,能够提高其重组效率。
除去复制起始区的载体的构建方法没有特别限定,优选使用日本特开2000-262284号公报中记载的方法。即,优选:事先构建在重组位点内的切割部位插入有复制起始区的前体载体,在如前所述地形成线形DNA结构的同时,将复制起始区切除的方法。由此,能够简便地得到除去复制起始区的载体。
另外,也可以采用以下方法:应用日本特开平5-15380号公报、日本特开平7-163373号公报、国际公开第96/23890号小册子、日本特开平10-234375号公报等中记载的表达载体及其构建方法,构建具有表达盒及重组位点的前体载体,再利用通常的基因工程的方法从该前体载体中除去复制起始区,得到用于同源重组的载体。
<靶位点>
用于重组入载体的靶位点在粟酒裂殖酵母的染色体中可以仅存在于1处,也可以存在于2处以上。存在2处以上的靶位点时,可以使重组到粟酒裂殖酵母的染色体中的载体为2处以上。另外,表达盒中的LDH基因为多个的情况下,可以在靶位点的1个部位重组多个LDH基因。此外,也可以在2种以上的靶位点,使用具有与各靶位点对应的重组位点的2种以上的载体来重组入表达盒。通过这些方法,能够在粟酒裂殖酵母的染色体中重组入多个LDH基因,由此能够增大乳酸脱氢酶的表达量,提高乳酸的生产率。
在1处靶位点重组表达盒时,例如可以使用日本特开2000-262284号公报中记载的方法。使用具有不同重组位点的2种以上的载体,能够将载体分别重组到不同的靶位点中。但是,将载体重组到染色体的2处以上时,该方法较为繁杂。
若能够以染色体中多处存在的实质上彼此相同的碱基序列部分为靶位点、将载体分别重组到该多处的靶位点中,则能够使用1种载体将载体重组到染色体的2处以上。实质上彼此相同的碱基序列是指碱基序列的相同性为90%以上。靶位点之间的相同性优选为95%以上。另外,实质上彼此相同的碱基序列的长度为包含上述载体的重组位点的长度,优选为1000bp以上。与在1处靶位点重组有多个LDH基因的情况相比,即使LDH基因的重组数相同,当在多个存在的靶位点分散地重组有LDH基因时,转化体增殖时LDH基因曾经从染色体上脱落的情况减少,转化体在传代中的维持稳定性提高。
作为在染色体中多处存在的靶位点,优选转座子基因Tf2。已知Tf2是在粟酒裂殖酵母的3条(单倍体)染色体中分别合计存在13处的转座子基因,长度(碱基数)约为4900bp,这些基因间的碱基序列相同性为99.7%(参考下述文献)。
Nathan J.Bowen et al,“Retrotransposons and Their Recognition ofpol II Promoters:A Comprehensive Survey of the Transposable ElementsFrom the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe”,Genome Res.200313:1984-1997
可以仅在染色体中存在13处的Tf2中的1处重组入载体。该情况下,通过重组入具有2个以上LDH基因的载体,能够得到具有2个以上LDH基因的转化体。另外,通过在2处以上的Tf2中重组入载体,能够得到具有2个以上LDH基因的转化体。该情况下,通过重组入具有2个以上LDH基因的载体,能够得到具有更多LDH基因的转化体。若在所有13处Tf2中重组入载体,则可能会对转化体的生存和增殖造成过大负荷。优选在13处Tf2的8处以下重组入载体,更优选在5处以下重组入载体。
<转化方法>
作为利用同源重组法对粟酒裂殖酵母宿主进行转化的方法,可以使用公知的同源重组法。作为本发明的转化方法,优选以上述PDC基因簇部分缺失或失活的粟酒裂殖酵母为宿主、使用上述载体通过同源重组在宿主染色体中重组入表达盒的方法。根据该制造方法,能够简便地制造本发明的转化体。
本发明的转化法中,通常在进行同源重组后,对所得的转化体进行选择。作为选择的方法,例如,可以列举以下所示的方法。使用能够利用上述营养缺陷型标记对转化体进行选择的培养基进行筛选,从所得的菌落中选择多个菌落。然后,将这些菌落分别进行液体培养后,考察各培养液中的异种蛋白的表达量,选择异种蛋白的表达量更多的转化体。另外,利用脉冲场凝胶电泳法对这些选择出的转化体进行基因组分析,由此能够考察出染色体中重组的载体数和表达盒数。
染色体中重组的载体数可通过调节重组条件等进行某种程度的调节,但根据载体的大小(碱基数)、结构的不同,重组效率和重组数也会发生变化。
认为通过在粟酒裂殖酵母的染色体中重组多个LDH基因,能够增大乳酸脱氢酶的表达量,提高乳酸的生产率。但是,本发明的目的在于获得乳酸的生产效率高的转化体,其目的并不在于获得仅仅是表达盒的总数更多的转化体。一般而言,表达盒数越多,预测乳酸脱氢酶的表达效率越高,进而乳酸的生产效率越高。但是,表达盒数过多时,对细胞的生存和增殖的负荷增大,进而乳酸生产效率也降低。另外,载体变大时,重组到染色体中的概率降低,难以增加重组的载体数,进而获得转化体本身也变得困难。
[乳酸的制造方法]
本发明的乳酸的制造方法是在培养液中培养上述本发明的转化体,并从该培养液中获取乳酸的乳酸的制造方法。
通过将本发明的转化体在含糖的培养液中进行培养,由该糖经糖酵解而得到的丙酮酸被乳酸脱氢酶还原而产生乳酸,从培养液中获取产出于培养液中的乳酸,由此能够制造乳酸制造。
作为乳酸的制造中使用的培养液,可以使用含有糖的公知的酵母培养用培养基,并且只要是含有粟酒裂殖酵母可同化的氮源、无机盐类等、能够以良好的效率进行粟酒裂殖酵母的培养的培养基即可。作为培养液,可以使用天然培养基,也可以使用合成培养基。
作为碳源的糖,可以列举例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖。作为氮源,可以列举例如氨、氯化铵、乙酸铵等无机酸或无机酸的铵盐、蛋白胨、酪蛋白水解物、酵母提取物等。作为无机盐类,可以列举例如磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。可以进一步含有蛋白脂质等发酵促进因子等。
本发明的乳酸的制造方法中,特别优选使用含有葡萄糖作为糖的培养液。培养初期的培养液(100质量%)中的葡萄糖浓度优选为1质量%以上,更优选为1~50质量%,进一步优选为2~16质量%。由于葡萄糖浓度会随培养而降低,因此优选根据需要添加葡萄糖而继续进行培养。培养末期的葡萄糖浓度可变为1质量%以下。另外,在边分离乳酸边使培养液循环而进行连续培养的情况下,优选维持上述葡萄糖浓度。通过使葡萄糖浓度为2质量%以上,可进一步提高乳酸的生产率。另外,通过使培养液中的葡萄糖为16质量%以下,可进一步提高乳酸的生产率。
另外,为了提高乳酸制造的生产率,优选进行高密度培养。高密度培养时,优选使培养液中的转化体的初始菌体浓度以干燥菌体重量换算值表示为0.1~50克/升。更优选使培养液中的转化体的初始菌体浓度以干燥菌体重量换算值表示为0.2~40克/升。通过提高初始菌体浓度,能够在短时间内实现高生产率。另外,初始菌体浓度过高时,可能会产生菌体的凝聚或纯化效率的降低等问题。
需要说明的是,后述的实施例等中所示的菌体浓度是由利用日本分光公司制造的可见光紫外分光光度计V550测定的波长660nm的光的吸光度(OD660)换算得到的值。660nm下OD=1时相当于裂殖酵母干重的0.2g、湿重的0.8g。
培养可以使用公知的酵母培养方法,例如可通过振荡培养、搅拌培养等进行。
另外,培养温度优选为23~37℃。另外,培养时间可以适当决定。
另外,培养可以是分批培养,也可以是连续培养。例如,对于分批培养,在进行培养后,从培养液中分离出菌体,可以获得含有乳酸的培养液。另外,对于连续培养法,可以列举例如:从培养中的培养槽中抽出部分培养液,从抽出的培养液中分离乳酸,同时回收培养上清,向该培养上清中加入葡萄糖和新的培养液并将其返回到培养槽中,重复上述操作从而进行连续培养的方法。通过进行连续培养,可进一步提高乳酸的生产率。
在使用本发明的转化体的乳酸的制造方法中,即使因乳酸的蓄积而达到较低的pH(pH2~4左右),也能够在不进行中和的情况下生产乳酸。因此,在培养液的pH达到4以下之后也能通过进一步继续培养的连续培养来制造乳酸。培养末期的pH和连续培养中的pH优选为1~4,特别优选为1.5~3.5。为了提高乳酸的生产率,优选在培养液的pH达到3.5以下之后进一步继续培养。由于本发明的转化体的耐酸性优良,因此能够在不中和转化体所产生的培养液中的乳酸的情况下继续培养。
从培养液中获取乳酸可以使用公知的方法进行。特别优选在不中和培养液中的乳酸的情况下将培养液和乳酸分离而获取乳酸。可以列举例如:通过离心分离从培养结束后的培养液中分离菌体,将pH调节为1以下后用乙醚、乙酸乙酯等进行提取的方法;使其吸附于离子交换树脂上,洗涤后将其洗脱的方法;使用活性炭除去杂质的方法;在酸催化剂的存在下与醇反应后进行蒸馏的方法;使用分离膜进行分离的方法。另外,根据情况也可以在对培养液中的乳酸进行中和后将培养液与乳酸盐分离而获取乳酸。例如,通过将培养液中的乳酸转变成钙盐或锂盐并使该中和盐析出的方法也能够获取乳酸。
以上说明的本发明的乳酸的制造方法,由于使用了以耐酸性特别优良的粟酒裂殖酵母为宿主的转化体,因此即使不用碱进行中和也能够以高生产率简便地制造乳酸。另外,由于PDC基因簇部分缺失或失活而使乙醇发酵的效率降低,因此乳酸的对糖收率(乳酸的生产量相对于消耗的糖量的比例)提高。本发明中,能够容易地使乳酸的对糖收率为50质量%以上。根据情况,乳酸的对糖收率也可达到70质量%以上。另外,本发明的乳酸的制造方法也适合高浓度葡萄糖存在下及高浓度转化体的高密度培养。
实施例
以下,示出实施例及比较例详细地说明本发明。但是,本发明不受以下记载的限定。需要说明的是,本实施例中,若无特别说明,则“%”表示“质量%”。
[例1]
<粟酒裂殖酵母基因删除株的制作>
按照Latour法(记载于Nucleic Acids Res.杂志、2006年、34卷、e11页,国际公开第2007/063919号小册子)对粟酒裂殖酵母的尿嘧啶缺陷型株(ARC010、基因型:h-leu1-32ura4-D18、由东京大学研究生院理学系研究科附属基因实验设施的饭野雄一教授提供)进行转化,制作删除了丙酮酸脱羧酶(PDC)基因及醇脱氢酶(ADH)基因的删除株。
制作删除片段时,以利用DNeasy(QIAGEN公司制)由粟酒裂殖酵母的ARC032株(基因型:h-、由东京大学研究生院理学系研究科附属基因实验设施的饭野雄一教授提供)制备的全基因组DNA为模板,对于各个要删除的基因分别使用如下所示序列的8种合成寡聚DNA(オペロン公司制)。
1)用于制作pdc1(系统名:SPAC13A11.06)删除片段的寡聚DNA
UF:5’-AGGCAAATCGTGAACTCGG-3’(下述序列表的序列号2)
UR:5’-GCCAATTCCACTCTCAATAGCCCGAACGTTCCGTCTCG-3’(下述序列表的序列号3)
OF:5’-GCTATTGAGAGTGGAATTGGC-3’(下述序列表的序列号4)
OR:5’-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTACTGGTTTCCACATTGTTTGG-3’(下述序列表的序列号5)
DF:5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCGAGACGGAACGTTCGG-3’(下述序列表的序列号6)
DR:5’-TTACAATGCTGAGTGTGTATTCC-3’(下述序列表的序列号7)
FF:5’-TGAACTCGGTTGAAAAATGTCG-3’(下述序列表的序列号8)
FR:5’-TGAGTGTGTATTCCTTTTTCGC-3’(下述序列表的序列号9)。
(2)用于制作pdc2(系统名:SPAC1F8.07c)删除片段的寡聚DNA
UF:5’-CTCTCCAGCTCCATCCATAAG-3’(下述序列表的序列号10)
UR:5’-GACACAACTTCCTACCAAAAAGCCTTTCTGCCCATGTTTTCTGTC-3’(下述序列表的序列号11)
OF:5’-GCTTTTTGGTAGGAAGTTGTGTC-3’(下述序列表的序列号12)
OR:5’-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTGTATCCATTTCAGCCGTTTGTG-3’(下述序列表的序列号13)
DF:5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTGACAGAAAACATGGGCAGAAAG-3’(下述序列表的序列号14)
DR:5’-GTTCCTTAGAAAAAGCAACTTTGG-3’(下述序列表的序列号15)
FF:5’-CATAAGCTTGCCACCACTTC-3’(下述序列表的序列号16)
FR:5’-GAAAAAGCAACTTTGGTATTCTGC-3’(下述序列表的序列号17)。
(3)用于制作pdc3(系统名:SPAC186.09)删除片段的寡聚DNA
UF:5’-AAGGCATATTCGTTGATTAACCC-3’(下述序列表的序列号18)
UR:5’-GGTGGAAAGGTTTGTGCAATCCGTCAACTCATGATATTTCTTTATGG-3’(下述序列表的序列号19)
OF:5’-GATTGCACAAACCTTTCCACC-3’(下述序列表的序列号20)
OR:5’-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTCATCCCACATCTGTAATAATCACG-3’(下述序列表的序列号21)
DF:5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCCATAAAGAAATATCATGAGTTGACG-3’(下述序列表的序列号22)
DR:5’-TTTGAGAAGAAAATTTTATGTCCAGC-3’(下述序列表的序列号23)
FF:5’-CCATTTAGCAGTATAAGGGTCG-3’(下述序列表的序列号24)
FR:5’-AAGTAAAAATGTGAAAGCAATGTAGG-3’(下述序列表的序列号25)。
(4)用于制作pdc4(系统名:SPAC3G9.11c)删除片段的寡聚DNA
UF:5’-ACACACAAACACTTCCATTCC-3’(下述序列表的序列号26)
UR:5’-CCTAACAAAAGCATCATTTGAGAAGACGAATGAAATGACAGCAAC-3’(下述序列表的序列号27)
OF:5’-TTCTCAAATGATGCTTTTGTTAGG-3’(下述序列表的序列号28)
OR:5’-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTCTGGACAAGTCTACCTTGGAG-3’(下述序列表的序列号29)
DF:5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTGTTGCTGTCATTTCATTCGTC-3’(下述序列表的序列号30)
DR:5’-GATACAGGAGTACAACAAAACAC-3’(下述序列表的序列号31)
FF:5’-TCTCCATCCCTCCTCCC-3’(下述序列表的序列号32)
FR:5’-ACGCTACTTAAACAAGACAAGC-3’(下述序列表的序列号33)。
(5)用于制作adh1(系统名:SPCC13B11.01)删除片段的寡聚DNA
UF:5’-TCATTCCTCGATATTCAGTTC-3’(下述序列表的序列号34)
UR:5’-GCCAGTGGGATTTGTAGCTACTCTGATCGGCATTTTTTGG-3’(下述序列表的序列号35)
OF:5’-GTTTCGTCAATATCACAAGCTTCCCCAACCTCCCATTTCCTCC-3’(下述序列表的序列号36)
OR:5’-CTACGATCAGAAGAAGATCAATGAGACGCGGAAGGGGAGCGCC-3’(下述序列表的序列号37)
DF:5’-GGCGCTCCCCTTCCGCGTCTCATTGATCTTCTTCTGATCGTAG-3’(下述序列表的序列号38)
DR:5’-ATGCATTTCACTCTATTCCTC-3’(下述序列表的序列号39)
FF:5’-GCTATAGTTAAGTGTAAGAC-3’(下述序列表的序列号40)
FR:5’-TTGTCCACACCACTCATTCG-3’(下述序列表的序列号41)。
(6)用于制作adh4(系统名:SPAC5H10.06c)删除片段的寡聚DNA
UF:5’-ATCGTCGTCGATGCTGATTGG-3’(下述序列表的序列号42)
UR:5’-GCCAGTGGGATTTGTAGCTCAGCAGTCATTCTCATTCCG-3’(下述序列表的序列号43)
OF:5’-CGTCAATATCACAAGCTTGTCTCCCCTTCTATTGGGATTTGC-3’(下述序列表的序列号44)
OR:5’-GATTACCTGCAATCATGTTTCCGGCCTTTTGTGAAACCTGCC-3’(下述序列表的序列号45)
DF:5’-GGCAGGTTTCACAAAAGGCCGGAAACATGATTGCAGGTAATC-3’(下述序列表的序列号46)
DR:5’-GGAGAATGATGTATTGGTAAATAAC-3’(下述序列表的序列号47)
FF:5’-CCTTGGGAATGAGCGAATTC-3’(下述序列表的序列号48)
FR:5’-GGGTTGTGAAGAGCATACTG-3’(下述序列表的序列号49)。
(7)用于制作adhX(系统名:SPBC1773.06c)删除片段的寡聚DNA
UF:5’-GAAGGAGATTATGTGAAACAAGTTGAAATC-3’(下述序列表的序列号50)
UR:5’-AGCTTAGCTACAAATCCCACTCTGAGGGTAGTGTTCTTGCTACAAAAATCT-3’(下述序列表的序列号51)
OF:5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCATGACGGAAGATTCCGAGAAATTCCGTTT-3’(下述序列表的序列号52)
OR:5’-CAAAGCCATGCTTTTAATGTTAAAGTGAAT-3’(下述序列表的序列号53)
DF:5’-ATTCACTTTAACATTAAAAGCATGGCTTTGATCGATTGAGATTTTTGTAGCAAGAACACT-3’(下述序列表的序列号54)
DR:5’-GGAAATGGTTCATGTGGACTGGGTTTTATT-3’(下述序列表的序列号55)
FF:5’-CCTGCTCTTAAAATGACGAATGGTGTAGGC-3’(下述序列表的序列号56)
FR:5’-ATATAGTGCGATATGGATGAAGGAGAAGAG-3’(下述序列表的序列号57)。
(8)用于制作akrY(系统名:SPAC977.14c)删除片段的寡聚DNA
UF:5’-ATCATAACTTACTATATCGTGAAGAAGAGA-3’(下述序列表的序列号58)
UR:5’-AGCTTAGCTACAAATCCCACTTAGAATGAGTAATTCAACTTCTTAAACCAC-3’(下述序列表的序列号59)
OF:5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTTTAGCTTAAAAGTAATAAGCTTCTATGTGA-3’(下述序列表的序列号60)
OR:5’-TGAAGACATTTTATAAAACTTAAATAAAAA-3’(下述序列表的序列号61)
DF :5’-TTTTTATTTAAGTTTTATAAAATGTCTTCAGAAATTTAAATCTGTGGTTTAAGAAGTTGA-3’(下述序列表的序列号62)
DR:5’-ACTTTGTTTATTGTAGAAAGTCGAGCTTGA-3’(下述序列表的序列号63)
FF:5’-CAAAAGACAGGGGTCGGATTGATTCCTTGG-3’(下述序列表的序列号64)
FR:5’-TGTGCTGTTTTTCAAGTGGTCATGCGTTAC-3’(下述序列表的序列号65)。
对于各个要删除的基因,分别通过使用KOD-Dash(东洋纺公司制)的PCR法,以UF和UR制作UP区域,以OF和OR制作OL区域,以DF和DR制作DN区域,然后再以它们为模板,通过使用FF和FR的同样的PCR法分别制作全长的删除片段。制作全长的删除片段时,使用下述2种合成寡聚DNA(オペロン公司制)、以利用ARC032株同样制备的全基因组DNA为模板、通过同样的PCR法制备得到的ura4区域片段也一并作为模板使用。
5’-AGCTTAGCTACAAATCCCACT-3’(下述序列表的序列号66)
5’-AGCTTGTGATATTGACGAAACTT-3’(下述序列表的序列号67)
使用制作成的各删除片段而制作的删除株的株名、删除的基因示于表1。
[表1]
[例2]
<粟酒裂殖酵母乳酸脱氢酶生产株的制作>
根据Bahler等的方法(Yeast杂志、1998年、14卷、943-951页),用保持有乳酸脱氢酶基因表达盒的单位点整合(単座組込)型重组载体pXLT-HsLDH的限制性内切酶BsiWI消化产物,分别对粟酒裂殖酵母的尿嘧啶缺陷型株(ARC010)以及例1中制作的粟酒裂殖酵母的基因删除株进行转化。
pXLT-HsLDH通过如下所示的步骤制作。即,首先,将裂殖酵母用重组型载体pXL4(Idiris等、Yeast杂志、2006年、23卷、83-99页)用限制性内切酶进行双酶切,将所得片段平端化后进行连接,将所得的裂殖酵母用表达载体pXL1(delta-neo)再用限制性内切酶进行双酶切,所得片段平端化后,插入利用ARC010株基因组克隆的top2基因片段,制作序列(5’→3’、环形)如序列表的序列号68所示的pXLT(5558碱基对)。
接着,以重组到冈山载体(文献:Okayama,H.and Berg,P.:AcDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts inmammalian cells.Mol.Cell.Biol.3(1983)280-289.)中的人成纤维细胞cDNA文库为模板,使用5’-末端侧添加有限制性内切酶NcoI识别序列、3’-末端侧添加有限制性内切酶SalI识别序列的下述引物组
5’-GTCCATGGCAACTCTAAAGGATCAG-3’(No.4620)(下述序列表的序列号69)、
5’-CAGTCGACTTAAAATTGCAGCTCCTTTTG-3’(No.4621)(下述序列表的序列号70),
通过PCR对文献(Tsujibo等、Eur.J.Biochem.杂志、1985年、147卷、9-15页)中记载的编码人L-乳酸脱氢酶结构基因(HsLDH-ORF)的基因片段进行扩增。所得的扩增片段用限制性内切酶NcoI及SalI进行双酶切后,重组到日本特开2000-262284号公报记载的多克隆载体pTL2M5的AflIII-SalI之间,制作LDH表达载体pTL2HsLDH。进而,通过使用限制性内切酶SpeI及Bst1107I的双酶切从pTL2HsLDH中切出表达盒,重组到pXLT中,制作pXLT-HsLDH。
<培养试验>
将所得的各转化体接种到YPD12液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖12%)中,在温度32℃、振荡速度100rpm的条件下培养4.5小时。使用BioFlow(王子计测机器制)测定此时培养液中的乳酸浓度。进而在相同条件下继续培养总计20小时。同样地测定培养20小时后的培养液中的乳酸浓度。
表2中示出转化体株名、宿主株名、培养4.5小时后的乳酸浓度、培养20小时后的乳酸浓度。
[表2]
[例3]
<粟酒裂殖酵母乳酸脱氢酶高产株的制作>
由于例1中制作的IGF543株(h-leu1-32ura4-D 18pdc2-D23)生长速度较慢,因此,为恢复其生长速度,将IGF543株划线于YES皿(酵母提取物0.5%/葡萄糖3%/SP补充剂)上并在25℃下培养,将所得的菌落传代于YPD培养基(酵母提取物1%/蛋白胨2%/葡萄糖2%)中在25℃下培养,使用充分生长后的培养液制作甘油储存液,在-80℃保存。重复上述操作直到获得适当的生长速度,从而制作生长速度得到恢复的菌株(名称沿用IGF543)。
将pTL2HsLDH(例2)用限制性内切酶SpeI及Bst1107I双酶切,将所得的片段(hCMV启动子/LDH-ORF/LPI终止子)插入到通过下述步骤制作的Tf2多位点整合(多座組込)型载体pTf2MCS-ura4的限制性内切酶NheI-KpnI(平端化)识别序列间,制作重组型L-乳酸脱氢酶基因表达载体pTL2HsLDH-Tf2。
pTf2MCS-ura4的制作步骤如下所述。即,使用从细胞中抽提全基因组DNA的试剂盒(QIAGEN公司制DNeasy),纯化出粟酒裂殖酵母的全基因组DNA,以其中1μg为模板,使用5’末端侧导入有限制性内切酶BsiWI的识别序列(CGTACG)的下述引物对:
5’-AAGGCCTCGTACGTGAAAGCAAGAGCAAAACGA-3’(下述序列表的序列号71)、
5’-AAGGCCTCGTACGTGCTTTGTCCGCTTGTAGC-3’(下述序列表的序列号72),
通过PCR法扩增粟酒裂殖酵母的Tf2-2(GeneDB收录的系统名:SPAC167.08基因)的DNA片段(约3950碱基对)。用限制性内切酶BsiWI对扩增DNA片段的两末端进行处理,并通过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化,制备插入片段。
然后,将染色体重组用载体pXL4(Idiris等、Yeast杂志、23卷、83-99页、2006年)用相同的限制性内切酶BsiWI进行消化,得到包含氨苄青霉素抗性基因(ApR)和大肠杆菌的复制起点(pBR322ori)的区域(约2130碱基对)。该DNA片段进一步用脱磷酸化酶(宝生物公司制CIAP)进行脱磷酸化处理,并通过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化,制备载体片段。
将上述插入片段与载体片段用连接试剂盒(宝生物公司制DNALigation Kit ver.2)连接后,对大肠杆菌DH5(东洋纺公司制)进行转化,制作重组质粒pTf2-2(6071碱基对)。
以0.1μg上述构建载体pTf2-2为模板,使用下述引物对:
5’-GGGGTACCAAGCTTCTAGAGTCGACTCCGGTGCTACGACACTTT-3’(5’末端具有限制性内切酶KpnI、HindIII、XbaI、SalI的识别序列)(下述序列表的序列号73)、
5’-GGGGTACCAGGCCTCTCGAGGCTAGCCATTTCCAGCGTACATCCT-3’(5’末端具有限制性内切酶KpnI、StuI、XhoI、NheI的识别序列)(下述序列表的序列号74),
通过PCR法扩增全长,得到6060碱基对的片段。将其两末端用KpnI消化,通过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化后,使用连接试剂盒使其自身环化,制作在转座子基因Tf2-2序列的内部还具有多克隆位点(MCS)的6058碱基对的载体pTf2(MCS)。
用限制性内切酶KpnI及NheI将上述构建载体pTf2(MCS)进行双酶切,通过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化出6040碱基对的片段。进而,制作利用PCR法在粟酒裂殖酵母的尿嘧啶缺陷型标记ura4(GeneDB收录的系统名:SPCC330.05c、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因)的两端添加有限制性内切酶KpnI及NheI的识别序列的片段,使用限制性内切酶KpnI及NheI进行双酶切,通过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化出2206碱基对的片段。使用连接试剂盒将这两条片段连接,制作在转座子基因Tf2-2序列的内部还具有多克隆位点(MCS)的8246基对的载体pTf2(MCS)-ura4。
使用上述制作的载体,根据冈崎等人的方法(Okazaki等、NucleicAcids Res.杂志、1990年、18卷、6485-6489页)转化IGF543株(生长速度恢复株),并涂布到选择培养基MMA+Leu皿上。将所得的多个单菌落接种到YPD16(酵母提取物1%/蛋白胨2%/葡萄糖16%)培养基中,在32℃培养72小时后,仅以培养上清为试样,使用BF-4及BF-5(王子计测机器)进行葡萄糖、乙醇、L-乳酸浓度以及培养基的pH的测定。基于其结果,从其中再次挑选L-乳酸生产率高的菌株,进一步在YPD12(酵母提取物1%/蛋白胨2%/葡萄糖12%)培养基中培养(20小时、44小时、66.5小时、80小时、176小时)后,同样地测定培养上清中的葡萄糖、乙醇、L-乳酸浓度以及培养基的pH,挑选L-乳酸的生产率最高的菌株,命名为ASP2782(基因型:h-leu1-32ura4-D18pdc2-D23Tf2<HsLDH-ORF/ura4+)。
按照同样的步骤制作ARC010株的转化体,得到ASP2767株。
[例4](参考例)
<使用粟酒裂殖酵母乳酸脱氢酶高产株的经时培养试验>
将例3中得到的转化体ASP2767株接种到YPD6液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖6%)中,在温度32℃、振荡速度100rpm的条件下进行24小时培养。培养结束后,通过离心分离(2000g、10分钟)回收菌体。接着,将上述回收菌体接种到5ml的YPD12L液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖12%、蛋白脂质1%)中使其达到5.2克(以干燥菌体换算)/升的浓度(OD660为26),在温度32℃、振荡速度100rpm的条件下进行24小时培养,随时间推移而测定培养液中的乙醇、乳酸浓度及pH。结果示于表3。
当使用导入有乳酸脱氢酶基因的粟酒裂殖酵母时,在乳酸蓄积而使培养液的pH达到2.9以下的4小时至7小时的过程中,pH从2.8进一步降低至2.5,且乳酸的浓度升高,即使在pH3以下的酸性条件下也能够在不进行碱中和的情况下生产乳酸。
[表3]
[例5](参考例)
<使用粟酒裂殖酵母乳酸脱氢酶高产株的高密度培养试验>
将例3中得到的转化体ASP2767接种到YPD6液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖6%)中,在温度32℃、振荡速度100rpm的条件下进行24小时培养。培养结束后,通过离心分离(2000g、10分钟)回收菌体。接着,将上述菌体接种到5ml的YPD12L液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖12%、蛋白脂质1%)中使其达到0.4、5.2、18.2、31.8、48.0克(以干燥菌体换算)/升的浓度(OD660分别为2、26、91、159、240),分别在温度32℃、振荡速度100rpm的条件下进行培养,结束后,测定培养液中的葡萄糖、乙醇及乳酸浓度。结果以及根据该测定结果计算的乳酸的对糖收率和生产速度示于表4。
[表4]
[例6]
<使用粟酒裂殖酵母乳酸脱氢酶高产株(pdc2删除株)的高密度培养试验>
将例3中得到的转化体ASP2782接种到YPD6液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖6%)中,在温度32℃、振荡速度100rpm的条件下进行24小时培养。培养结束后,通过离心分离(2000g、10分钟)回收菌体。接着,将上述菌体接种到5ml的YPD12L发酵培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖12%、蛋白脂质1%)中使其达到0.2、3.8、15.0、23.8、31.6、46.8克(以干燥菌体换算)/升的浓度(OD660分别为1、19、75、119、158、234),分别在温度32℃、振荡速度100rpm下进行培养,结束后,测定培养液中的葡萄糖、乙醇及乳酸浓度。结果以及根据该测定结果计算的乳酸的对糖收率和生产速度示于表5。
[表5]
通过使用PDC2缺失的ASP2782株,能够以高对糖收率生产乳酸。另外,如初始菌体浓度为15.0克(以干燥菌体换算)/升以上的例子所示,通过进行高密度培养,可大幅提高对糖收率。由该对糖收率的升高可知,在PDC2缺失的粟酒裂殖酵母中导入乳酸脱氢酶基因而得到的转化体具备高度优化的高表达体系。
如上述表4所示,在使用未缺失PDC2的转化体ASP2767的例5中,与该例6相比对糖收率较低,收率最高的也仅为50%左右。认为这是由于未使PDC2缺失,因此乙醇发酵与乳酸发酵同时进行。
[例7]
<使用粟酒裂殖酵母乳酸脱氢酶高产株(pdc2删除株)的高密度重复培养试验>
将例3中得到的转化体ASP2782接种到YPD6液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖6%)中,在温度32℃、振荡速度100rpm的条件下进行24小时培养。培养结束后,通过离心分离(2000g、10分钟)回收菌体。接着,将上述菌体接种到5ml的YPD12L液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖12%、蛋白脂质1%)中使其达到约30克(以干燥菌体换算)/升的浓度,在温度32℃、振荡速度100rpm的条件下进行培养,测定培养液中的乳酸和乙醇的浓度。培养结束后,通过离心分离(2000g、10分钟)回收培养上清及菌体。将回收的菌体再次加入到相同的液体培养基中进行培养。进而,将该一系列操作进行6次。总计7次的培养中的各接种浓度和培养时间、培养结束时的葡萄糖、乙醇及乳酸浓度的测定结果以及根据该测定结果计算的乳酸的对糖收率示于表6。
在使用ASP2782株的连续培养中,即使重复多次培养也能够高度维持乳酸的对糖收率,确认能够在不用碱进行中和的情况下稳定地以高生产率生成乳酸。
[表6]
[例8]
<培养基的最少化>
将例3中得到的转化体ASP2782接种到YPD6液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖6%)中,在温度32℃、振荡速度100rpm的条件下进行24小时培养。培养结束后,通过离心分离(2000g、10分钟)回收菌体。接着,将上述菌体接种到5ml的YPD12L液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖12%、蛋白脂质1%)或D12液体培养基(葡萄糖12%)中使其达到44.0克(以干燥菌体换算)/升,在温度32℃、振荡速度100rpm的条件下进行培养,随时间推移而测定乳酸和乙醇的浓度。两种培养基中的培养时间、培养液中的葡萄糖浓度、乙醇浓度、乳酸浓度及根据该测定结果计算的乳酸的对糖收率示于表7。
[表7]
[例9]
<使用粟酒裂殖酵母乳酸脱氢酶高产株的乳酸生产结果>
将ASP2767株接种到5ml的YPD24L液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖24%、蛋白脂质1%)中使菌体浓度达到0.2克(以干燥菌体换算)/升,在32℃下进行47小时培养。培养结束后的乳酸生产量为124.2g/L。将ASP2767株接种到5ml的YPD12LA液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖12%、蛋白脂质1%、CSL-AST1%)中使菌体浓度达到74.6克(以干燥菌体换算)/升,在32℃下进行1小时发酵。发酵结束后的乳酸生产量为58.6g/L,生产速度为58.6g/小时。
将ASP2782株接种到5ml的YPD12L液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖12%、蛋白脂质1%)中使菌体浓度达到31.6克(以干燥菌体换算)/升,在32℃下进行9小时发酵。发酵结束后的乳酸生产量为99.2g/L,对糖收率为83%。将ASP2782株接种到5ml的YPD12液体培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖12%)中使菌体浓度达到44.0克(以干燥菌体换算)/升,在32℃进行6小时发酵。发酵结束后的乳酸生产量为85.7g/L,对糖收率为88%。
由以上结果表明,删除了pdc2基因的ASP2782株比未删除pdc2基因的ASP2767株具有更优良的生产率。
参考特定的实施方式对本发明进行了详细的说明,但对本领域技术人员显而易见的是,在不脱离本发明的精神与范围的前提下可进行各种变更和修正。
本申请基于2009年8月21日提交的日本专利申请2009-192271,其内容以参考的形式并入本说明书中。另外,本说明书中记载的文献的内容以参考的形式并入本说明书中。
产业实用性
本发明的转化体及使用该转化体的乳酸的制造方法,即使在低pH下也能够在不进行碱中和的情况下以高生产率生产乳酸,因此能够适合作为乳酸的工业性制造方法使用。
Claims (15)
1.一种转化体,其以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)为宿主,重组有乳酸脱氢酶基因,且编码所述粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活。
2.如权利要求1所述的转化体,其中,缺失或失活的编码丙酮酸脱羧酶的基因为PDC2基因。
3.如权利要求1或2所述的转化体,其中,所述乳酸脱氢酶基因为哺乳动物的乳酸脱氢酶基因。
4.如权利要求1~3中任一项所述的转化体,其中,所述乳酸脱氢酶基因重组到粟酒裂殖酵母的染色体中。
5.一种转化体的制造方法,所述转化体为重组有乳酸脱氢酶基因且编码丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活的转化体,所述制造方法中,包括下述步骤:
以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)为宿主,使用具有包含在粟酒裂殖酵母内发挥作用的启动子、终止子和乳酸脱氢酶基因的表达盒的载体,将所述表达盒导入所述宿主中而得到转化体,和
使用编码丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活的宿主作为所述宿主,或者使所述得到的转化体的编码丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活。
6.如权利要求5所述的转化体的制造方法,其中,所述载体还具有对粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组的重组位点,使用该载体将表达盒导入粟酒裂殖酵母的染色体中。
7.如权利要求6所述的转化体的制造方法,其中,宿主的染色体中进行同源重组的靶位点为转座子基因Tf2。
8.如权利要求5~7中任一项所述的转化体的制造方法,其中,以编码丙酮酸脱羧酶的基因PDC2基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母作为宿主。
9.如权利要求5~8中任一项所述的转化体的制造方法,其中,所述乳酸脱氢酶基因为哺乳动物的乳酸脱氢酶基因。
10.一种乳酸的制造方法,其中,将权利要求1~4中任一项所述的转化体在培养液中进行培养,并从该培养液中获取乳酸。
11.如权利要求10所述的乳酸的制造方法,其中,使用含有浓度为1~50质量%的葡萄糖的培养液进行培养。
12.如权利要求10或11所述的乳酸的制造方法,其中,在通过由所述转化体产生的乳酸的作用使所述培养液的pH达到3.5以下后,进一步继续培养。
13.如权利要求10~12中任一项所述的乳酸的制造方法,其中,使所述培养液中的转化体的初始菌体浓度以干燥菌体换算为0.1~50克/升。
14.如权利要求10~13中任一项所述的乳酸的制造方法,其中,在不中和由所述转化体产生的培养液中的乳酸的情况下继续进行培养。
15.如权利要求10~14中任一项所述的乳酸的制造方法,其中,在不中和由所述转化体产生的培养液中的乳酸的情况下从培养液中分离乳酸。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120613 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |