CN101215524A - 一种高产衣康酸菌株的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高产衣康酸菌株的培育方法，选取生产衣康酸的菌种作为出发菌种，经培养、分离纯化后，放入恒温培养箱培养，选取变色圈大的菌落，将其中的孢子挑取到试管斜面上培养，得到成熟孢子，将成熟孢子通过摇床进行筛选，筛选出高产衣康酸菌株。利用本方法培育出的菌种，在生产衣康酸时，糖酸转化率可达到65％，发酵法产酸可达到9.01g/100ml，提高了衣康酸的产率，降低了发酵液中的残糖含量，从而更有利于发酵液的过滤等后续提取工序的进行，同时，产酸率的提高，也提高了原料的利用率，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物的培育方法。
背景技术
衣康酸是一种用途较广的二元不饱和有机酸，自然界存在较少，1837年世界首次从柠檬酸热解产物中分离得到衣康酸。1929年以后各国研究人员先后发现了用土曲霉能够发酵葡萄糖生产衣康酸，从此开始了发酵法制备衣康酸的研究历史。我国从1985年以来，许多科研单位先后对发酵法生产衣康酸的工艺和菌种进行了长期的研究，由于未获得理想的菌种而使研究工作进展缓慢。
目前，一般衣康酸生产厂家多以传统的方式对菌种进行筛选、扩大培养。各层次筛选混杂在一次摇床实验中，对生产菌种实行年度常规筛选，对保藏菌种进行优选，去处性能不佳的个体，然后应用于生产，发酵罐产酸8.0g/100ml以下，糖酸转化率最高达55％，发酵罐产酸率和糖酸转化率都较低。
发明内容
本发明的任务在于提供一种高产衣康酸菌株的培育方法，采用此方法培育出的菌株具有产酸率高和糖酸转化率高的优点。
其技术解决方案是：
一种高产衣康酸菌株的培育方法，以发酵生产衣康酸的发酵罐中分离得来的菌种为出发菌种，在培养基中培养后，取生长正常，菌丝均匀，孢子丰满的斜面作为分离纯化对象，经传统的平板分纯技术分纯后，进行溴甲酚绿菌种筛选培养基平板培养涂布，经20-50W紫外灯20-40cm距离垂直照射20-40秒钟后，迅速移入恒温培养箱，30-50℃相对湿度20-40％培养3-5天，待生长出的菌落中心有少量灰褐色孢子出现时，选取变色圈直径大的菌落，将其中的孢子挑取到试管斜面上，在30-35℃相对湿度20-40％的条件下避光培养5-7天，得到成熟孢子。
将上述成熟孢子进行摇床筛选，在筛选过程中，精确控制初糖在同一数值，在同一筛选条件下，进行初次筛选、复筛选、第二次复筛选、第三次复筛选，使各层次的菌种在完全一致的控制条件中进行筛选。筛选出的菌种保藏温度控制在3-4℃，在菌种培养间装设无菌通风系统和加湿器以保持培养间充足的氧气和湿度，并保持30℃的稳定培养温度，培育出高产衣康酸菌种。
本发明的有益效果是：利用本方法培育出的菌种，在生产衣康酸时，糖酸转化率可达到65％，发酵法产酸可达到9.01g/100ml，提高了衣康酸的产率，降低了发酵液中的残糖含量，从而更有利于发酵液的过滤等后续提取工序的进行，同时，产酸率的提高，也提高了原料的利用率，降低了生产成本。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合实施例来更加详细的描述本发明。然而这些实施例只是起到说明的作用，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：以300m3发酵罐发酵生产衣康酸产酸值达到7.5g/100ml的发酵罐中分离得来的菌种为出发菌种，在C6H12O6·H2O含量为1.5％，琼脂含量为1％，无机盐MgSO4·7H2O含量为0.25％，(NH4)2SO4含量为0.3％，K2HPO4含量为0.02％，FeSO4含量为0.002％的培养基中培养后，取生长正常，菌丝均匀，孢子丰满的斜面作为分离纯化对象，经平板分纯后，取10-3稀释度进行溴甲酚绿菌种筛选培养基平板培养涂布，经20W紫外灯20cm距离垂直照射20秒钟后，迅速移入恒温培养箱，30℃相对湿度20％培养3天，待生长出的菌落中心有少量灰褐色孢子出现时，选取变色圈与菌落直径比值大的菌落，将其中的孢子挑取到试管斜面上，在30℃相对湿度20％的条件下避光培养5天，得到成熟孢子。
将上述成熟孢子进行摇床筛选，在筛选过程中，精确控制初糖在同一数值，确保筛选条件一致，然后进行初次筛选、复筛选、第二次复筛选、第三次复筛选，使各层次的菌种在完全一致的控制条件中进行筛选。筛选出的菌种保藏温度控制在3-4℃，在菌种培养间装设无菌通风系统和加湿器以保持培养间充足的氧气和湿度，并保持30℃的稳定培养温度，培育出高产衣康酸菌种。
经测试在摇床温度32℃、湿度60％，转速为260r/min的条件下，在C6H12O6·H2O含量为14％，无机盐MgSO4·7H2O含量为0.6％，(NH4)2SO4含量为0.5％，Na2MoO4·H2O含量为0.0010％，PH为3.2的培养基中，本发明菌种产酸达9.25g/100ml。用摇床反复培养此菌种稳定后，转入发酵罐生产，在发酵罐压0-1MPa，温度20℃，溶解氧10％，在C6H12O6·H2O初始含量为12％，无机盐MgSO4·7H2O含量为0.13％，(NH4)2SO4含量为0.32％，Na2MoO4·H2O含量为0.0015％，ZnSO4含量为0.002％，玉米浆含量为0.18％的条件下进行发酵，当发酵周期在10小时的时候开始流加葡萄糖使其总含量达到13.8％，在发酵周期达48小时的时候发酵结束，产酸为9.01g/100ml。
实施例2：以300m3发酵罐发酵生产衣康酸产酸值达到7.0g/100ml的发酵罐中分离得来的菌种为出发菌种，在C6H12O6·H2O含量为1.5％，琼脂含量为2％，无机盐MgSO4·7H2O含量为0.5％，(NH4)2SO4含量为0.3％，K2HPO4含量为0.01％，FeSO4含量为0.003％的培养基中培养后，取生长正常，菌丝均匀，孢子丰满的斜面作为分离纯化对象，经平板分纯后，取10-4稀释度进行溴甲酚绿菌种筛选培养基平板培养涂布，经40W紫外灯30cm距离垂直照射30秒钟后，迅速移入恒温培养箱，40℃相对湿度30％培养4天，待生长出的菌落中心有少量灰褐色孢子出现时，选取变色圈与菌落直径比值大的菌落，将其中的孢子挑取到试管斜面上，在33℃相对湿度30％的条件下避光培养6天，得到成熟孢子。
将成熟孢子进行摇床筛选。在筛选过程中初次筛选、复筛选、第二次复筛选、第三次复筛选分别进行，所有初糖用糖量计精确控制在同一标准，确保筛选条件一致，尽量使各层次的菌种在完全一致的控制条件中进行筛选，筛选出高产衣康酸菌种。
经测试在摇床温度33℃、湿度70％，转速为260r/min的条件下，在C6H12O6·H2O含量为14％，无机盐MgSO4·7H2O含量为0.6％，(NH4)2SO4含量为0.5％，Na2MoO4·H2O含量为0.0010％，PH为3.5的培养基中，本发明菌种产酸达9.28g/100ml。用摇床反复培养此菌种稳定后，转入发酵罐生产，在发酵罐压0-1MPa，温度30℃，溶解氧30％，在C6H12O6·H2O初始含量为12％，无机盐MgSO4·7H2O含量为0.13％，(NH4)2SO4含量为0.32％，Na2MoO4·H2O含量为0.0015％，ZnSO4含量为0.002％，玉米浆含量为0.18％的条件下进行发酵，当发酵周期在20小时的时候开始流加葡萄糖使其总含量达到13.8％，在发酵周期达48小时的时候发酵结束，产酸为9.06g/100ml。
实施例3：以300m3发酵罐发酵生产衣康酸产酸值达到7.2g/100ml的发酵罐中分离得来的菌种为出发菌种，在C6H12O6·H2O含量为2％，琼脂含量为1.5％，无机盐MgSO4·7H2O含量为0.6％，(NH4)2SO4含量为0.5％，K2HPO4含量为0.01％，FeSO4含量为0.003％的培养基中培养后，取生长正常，菌丝均匀，孢子丰满的斜面作为分离纯化对象，经平板分纯后，取10-5稀释度进行溴甲酚绿菌种筛选培养基平板培养涂布，经50W紫外灯40cm距离垂直照射40秒钟后，迅速移入恒温培养箱，50℃相对湿度40％培养5天，待生长出的菌落中心有少量灰褐色孢子出现时，选取变色圈与菌落直径比值大的菌落，将其中的孢子挑取到试管斜面上，在35℃相对湿度40％的条件下避光培养6天，得到成熟孢子。
将成熟孢子进行摇床筛选。在筛选过程中初次筛选、复筛选、第二次复筛选、第三次复筛选分别进行，所有初糖用糖量计精确控制在同一标准，确保筛选条件一致，尽量使各层次的菌种在完全一致的控制条件中进行筛选，筛选出高产衣康酸菌种。
经测试在摇床温度32℃、湿度80％，转速为260r/min的条件下，在C6H12O6·H2O含量为14％，无机盐MgSO4·7H2O含量为0.6％，(NH4)2SO4含量为0.5％，Na2MoO4·H2O含量为0.0010％，PH为3.9的培养基中，本发明菌种产酸达9.32g/100ml。用摇床反复培养此菌种稳定后，转入发酵罐生产，在发酵罐压0-1MPa，温度40℃，溶解氧50％，在C6H12O6·H2O初始含量为12％，无机盐MgSO4·7H2O含量为0.13％，(NH4)2SO4含量为0.32％，Na2MoO4·H2O含量为0.0015％，ZnSO4含量为0.002％，玉米浆含量为0.18％的条件下进行发酵，当发酵周期在30小时的时候开始流加葡萄糖使其总含量达到13.8％，在发酵周期达48小时的时候发酵结束，产酸为9.08g/100ml。
Claims (5)
1.一种高产衣康酸菌株的培育方法，选取生产衣康酸的菌种作为出发菌种，经培养基培养、分离纯化后，放入恒温培养箱培养，选取变色圈大的菌落，将其中的孢子挑取到试管斜面上培养，得到成熟孢子，将成熟孢子通过摇床进行筛选，筛选出高产衣康酸菌株。
2.根据权利要求1所述的高产衣康酸菌株的培育方法，其特征在于在放入恒温培养箱培养前，先进行溴甲酚绿菌种筛选培养基培养涂布，经20W-50W紫外灯20-40cm距离垂直照射20-40秒。
3.根据权利要求1所述的高产衣康酸菌株的培育方法，其特征在于恒温培养箱内的温度为30-50℃，相对湿度为20-40％，菌种在恒温培养箱内培养3-5天。
4.根据权利要求1所述的高产衣康酸菌株的培育方法，其特征在于在试管斜面上培养孢子时，温度为30-35℃，相对湿度为20-40％，培养时间为5-7天。
5.根据权利要求1所述的高产衣康酸菌株的培育方法，其特征在于在通过摇床进行筛选时，筛选条件一致的情况下分别进行初次筛选、复筛选、第二次复筛选、第三次复筛选。
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| CNA2007101163256A CN101215524A (zh) | 2007-12-29 | 2007-12-29 | 一种高产衣康酸菌株的培育方法 |
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| CN105274153A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-01-27 | 江南大学 | 一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法 |
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2007
- 2007-12-29 CN CNA2007101163256A patent/CN101215524A/zh active Pending
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| CN105274153B (zh) * | 2015-11-20 | 2020-02-18 | 江南大学 | 一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法 |
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