KR20170031924A - 초고온성 고세균의 세포고정화 방법 및 이를 이용한 연속적인 수소 생산 방법 - Google Patents

초고온성 고세균의 세포고정화 방법 및 이를 이용한 연속적인 수소 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고농도 배양이 어려운 초고온성 고세균의 세포고정화 배양 방법 및 이를 이용한 수소 생산 공정에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포 표면에 대한 친화성이 높고 자력으로 분리 가능한 아민-자성 세포 고정화 담체에 초고온성 고세균을 부착하고, 입자에 부착된 초고온성 고세균을 반응기에서 유출되지 않도록 고정화한 다음 배양함으로써 연속적인 세포 고농도 배양을 구현하고, 이를 통하여 일산화탄소를 비롯한 다양한 기질로부터 수소를 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다.

Description

초고온성 고세균의 세포고정화 방법 및 이를 이용한 연속적인 수소 생산 방법 {Method for Cell Immobilization of Hyperthermophilic Archaebacteria and Continuous H2 Production Method therewith}
본 발명은 표면이 개질된 자성 나노입자의 표면에 수소를 생산하는 초고온성 고세균의 세포고정화 배양 방법 및 이를 이용한 수소 생산 공정에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 초고온성 고세균을 효과적으로 부착할 수 있는 동시에 배양액과의 분리가 용이한 표면이 개질된 자성나노 입자를 아민-자성 세포 고정화 담체로 사용하여 초고온성 고세균을 고정화하고, 이를 통해 일산화탄소를 비롯한 다양한 탄소원로부터 수소를 반복적이고 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
미생물을 이용해 수소를 만드는 방법은 통상적으로 미생물의 광합성 과정을 이용한다. 녹색 식물에서 일어나는 일반적인 광합성은 태양 에너지를 이용해 이산화탄소와 물을 산소와 탄화수소 화합물(포도당과 탄수화물 등)로 바꾸는 과정인데, 일부 미생물의 경우에는 이러한 과정에서 수소를 만들기도 한다. 즉, 미생물을 이용하면 태양광을 직접 이용해 수소를 만들 수 있는 데, 이와 같이 수소가 만들어지는 이유는 녹색 식물에는 없는 수소생산효소(hydrogenase)가 일부 수소 생산 미생물에 존재하기 때문이다.
수소생산효소는 고대 미생물에서 유래하는 효소이며, 지구 생성 초기에 안 좋은 자연 조건에서 양성자를 수소 분자로 전환시키는 역할을 수행하였는데, 최근들어 수소 생산과 관련된 에너지 자원으로 관심을 모으고 있다.
수소생산효소는 활성 부위에 금속 이온인 니켈과 철, 셀레늄이 붙어있기 때문에 효소의 외부에서 내부로 전자를 옮기는 것으로 알려져 있으며, 효소 구조는 아미노산이 길게 붙어 있는 물질 형태로 되어 있다. 이때 아미노산은 자신이 갖고 있는 구조나 전하에 의해 접히기 때문에 일부는 나선형으로 꼬이고, 또 다른 부위는 길게 늘어지는 구조를 갖는다. 이 구조물의 중심에 활성 부위가 있는데, 이 효소의 경우 금속 이온이 있어서 전자를 이동하게끔 하는 환경을 제공한다.
이와 같은 구조물은 효소에 따라 다르지만 몇 개가 서로 모여 친수성 작용이 있는 곳에서는 수소를 옮기는 통로 역할을 하는 것으로 밝혀졌으나, 아직도 밝혀지지 않은 미세한 작용들이 서로 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, 이런 반응은 백금 촉매로 물을 분해하는 화학 반응과는 전혀 다른 메커니즘으로 인식되고 있다.
이러한 광합성은 식물에서와 같이 공기 중의 이산화탄소를 흡수하여 이용하기 때문에 이산화탄소를 적극적으로 줄이는 기술에 해당하는데, 미생물의 광합성 과정을 탄소의 이동 관점에서 보면, 광합성은 공기 중의 이산화탄소(CO2)가 형태를 바꿔 광합성 미생물의 체내에 영양분[CH2On]으로 저장되는 과정이다. 즉, 이산화탄소 중의 탄소원자가 미생물 내의 포도당이나 탄수화물을 구성하는 탄소로 형태를 바꾸는 것으므로, 이러한 원리를 이용할 경우 공기 중의 이산화탄소량을 줄일 수 있게 된다.
고세균(Archaea, 古細菌)은 단세포로 되어 있는 미생물의 한 종류로, 핵이 존재하는 진핵생물과는 달리, 핵이 없는 원핵생물에 포함되는 생물군이지만 일반적으로 우리가 원핵생물로 취급하는 세균과는 본질적으로 다른 계통에 속하므로, 고세균과 구분되어 일반적인 세균은 진정세균(眞正細菌)이라고 불리운다.
이러한 고세균은 워즈(C. R. Woese)가 1977년에 처음 도압한 개념으로, 고세균은 일반적인 세균과는 달리 높은 온도나 높은 염도의 환경에서 잘 생식하며 메테인을 생합성하는 세균도 있는 등, 오랜 옛날의 지구 환경과 비슷한 환경에서 자라는 종이 있기 때문에 시원세균(始原細菌)이라고 부르기도 한다.
고세균은 핵이 없고 그 크기가 작은 등 기본적으로는 원핵생물에 속하지만, 세균과 근본적으로 다른 여러 가지 차이점을 가지고 있으며, 진핵생물과도 확연히 다른 특성이 있기 때문에 이 둘 중 어느 쪽에도 속하지 않는 새로운 생물군으로 분류되기도 한다.
고세균이 가지는 가장 큰 특징은 주로 세포막을 구성하는 지질의 구성에 있다. 고세균의 지질은 아이소프레노이드(isoprenoid)가 다중결합을 이루고 있는 알코올로 구성되어 있으며 이 알코올이 글리세롤과 에테르 결합을 이룬다. 이는 일반적인 진핵생물, 세균의 지질이 지방산과 글리세롤이 결합한 에스터 결합으로 되어 있는 것과 다른 점이며, 글리세롤에 알코올이 결합하는 위치가 서로 다른 방향성을 가지고 있어서, 광학이성질체 L-형의 방향성으로 결합하고 있다.
이러한 고세균은 세균과 세포벽의 구성에도 큰 차이가 존재하는데, 세균은 펩티도글리칸(peptidoglican)이라는 당단백질로 세포벽이 구성되어 있는 반면, 고세균은 변형된 펩티도글리칸인 슈도펩티도글리칸(pseudopeptidoglican)이나 S층(S-layer)이라고 하는 단백질 막으로 세포벽이 구성되어 있다.
이러한 차이점이 세균과 고세균을 구별해 주는 가장 큰 차이점이 된다. 종마다의 차이가 존재하지만, 대개 고세균은 분자생물학적으로도 세균과 많은 차이가 있고, 이런 점에서는 진핵생물과 유사점을 보이는 부분도 많다. 일반적인 고세균은 tRNA의 서열이 세균과 다르고 tRNA가 형성될 때 인트론(intron)이 잘려 나가는 과정이 수반된다. 또한 단백질합성(translation)이 시작되는 유전암호가 진핵생물과 같이 메싸이오닌이다.
그리고 DNA에서 RNA를 전사(transcription)할 때 이용되는 RNA중합효소의 구조가 세균보다 복잡하며 진핵생물에 더 가깝다. DNA가 히스톤 단백질에 감겨 있는 염색질 구조가 발견되기도 하며 이 역시 진핵생물 염색체의 특징이다.
고세균은 5계 구조(five kingdom system)를 포기한 현대 계통분류학에서 진핵생물, 세균과 함께 하나의 도메인으로 취급된다. 그 하부는 4개의 문으로 구성되며 각각 유리아케오타(Euryarchaeota), 크렌아케오타(Crenarchaeota), 코르아케오타(Korarchaeota), 나노아케오타(Nanoarchaeota)문이다.
유리아케오타 문에는 메테인균, 고농도균 등이 속하며 크렌아케오타문에는 고온균이 속한다. 이러한 분류의 기준은 일반적으로 리보솜(ribosome)의 16S 구조체를 구성하는 rRNA 서열 분석을 통하여 이루어진다. 고세균은 세균과 다른 여러 분자생물학적 특징 때문에 심해, 극지방, 화산 속, 석유층 등과 같이 생물이 살기 힘든 환경에서도 살 수 있다.
또한, 인간을 비롯한 동물의 소화 기관 내부에도 고세균이 기생하는 것으로 알려져 있지만 이들이 특별히 일으키는 질환이 있는지는 아직 알려져 있지 않다. 분자생물학적 방법을 이용하여 고세균을 조사한 결과 이러한 극한 환경뿐만이 아니라 일반적인 환경에서도 고세균의 흔적은 검출되고 있지만, 아직 일반적인 환경에서 검출한 고세균을 배양하지 못하고 있기 때문에 극한 환경이 아닌 장소에 생식하는 고세균에 대해서는 아직 명확하게 밝혀져 있지 않다.
고세균은 극한 환경에 산다는 특성 때문에 여러 활용 방법이 연구되고 있다. 우선 PCR법(polymerase chain reaction)을 사용하기 위해서는 고온에서도 활동하는 DNA중합효소가 필요하기 때문에, 여기에 고세균의 DNA중합효소를 활용하고 있다. 또한, 일반적으로 분해되지 않는 메테인 계열의 석유 물질 등을 분해하는 고세균이 있다는 점을 활용하여 환경 정화나 토양 개량에 활용하는 방안도 연구되고 있다. 하지만, 아직 이들의 생태에 대한 연구가 부족하여, 어떻게 배양하여 효소를 추출하는가에 대한 방법이 완전히 확립되지 않았기 때문에 고세균 활용에 대한 연구는 향후 많은 발전 가능성이 존재하는 기술분야이다.
본 발명에서 주목하고 있는 초고온성 고세균의 일종인 써모코커스속 균은 일산화탄소, 개미산 등 이용 기질의 범위가 넓고, 단위 세포 당 수소 생산 효율이 우수하여 청정 에너지원인 수소를 생산하기에 적합한 특성이 있는 것으로 알려져 있으나, 대장균 등의 세균과 달리 고농도 배양이 어려워 수소 생산성 증가에 한계가 있는 문제점이 여전히 존재한다.
일반적으로 미생물 등의 생촉매를 사용하여 바이오연료를 비롯한 유용물질을 생산할 때에는 반응기 내에 생촉매의 양을 높게 유지하는 것이 바람직하다. 그러나, 미생물은 크기가 작고 밀도가 배양액과 유사하여 배양액과의 분리가 용이하지 않으므로 회분이 반복되거나 연속식 배양 시 배양액의 교체에 따라 유출되어 고농도로 유지하기가 어렵다.
미생물 세포의 고농도 배양을 위한 방법으로 세포고정화 배양 방법이 있다. 세포고정화 배양 방법은 미생물 세포를 특정 담체에 부착하여 반응기 내에 고정시킴으로써 미생물 세포의 유출을 방지할 수 있어 고농도 배양이 가능하게 된다. 고정화 배양을 위하여 다양한 방법들이 제안된 바 있으며, 대표적인 방법들로는 고분자 캡슐 등에 세포를 포획하는 방법, 섬유상 담체에 세포를 부착하여 이동을 제한하는 방법, 균사 형성 미생물을 다공성 입자에 부착하는 방법 등이 있다. 고분자 캡슐에 세포를 포획하는 방법은 미생물이 상대적으로 큰 입자에 부착되어 있으므로 막이나 체 등을 이용하여 손쉽게 배양액과 미생물 촉매의 분리가 가능하여 고농도 배양을 구현할 수 있다.
그러나 미생물이 캡슐 내에 포획되어 있으므로 세포 농도의 유지는 가능하지만 증가는 상대적으로 어려워 고정화 전에 미리 다량의 세포를 확보해야 하는 문제점이 존재한다. 섬유상 담체에 세포를 부착하는 방법은 섬유상에서 세포의 증식이 가능한 장점은 있으나, 미생물 세포와 섬유상과의 접착력이 상대적으로 약하므로 배양액에서의 유출 현상을 막기 어렵다. 한편, 균사 형성 미생물의 경우 다공성 입자 내에 균사 형성 전의 포자를 접종하고, 이들이 번식하면서 균사를 형성함으로써 고정화 배양을 실시할 수 있으나 특정 미생물에만 적합하다는 한계가 존재한다.
Nature 2010 vol. 467. No. 7313. 352-355
본 발명의 목적은 앞서 살펴본 종래 기술의 문제점인, 초고온성 고세균을 이용하여 수소를 생산하는 과정 중에 있어서, 생촉매인 미생물의 반응기 내 농도가 낮아 수소 생산성을 높게 유지하기 어려운 문제점을 해결하기 위한 것으로, 아민-자성 세포 고정화 담체를 사용하여 고농도 배양이 어려운 초고온성 고세균을 배양기 내에서 고농도로 유지할 수 있도록 담체에 고정화된 상태에서 배양이 동시에 이루어지도록 함으로써, 효율적이고 연속적인 수소 생산이 가능한 초고온성 고세균의 세포고정화 방법 및 고정화 세포를 이용한 수소 생산 방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 초고온성 고세균을 이용한 수소 생산 방법은, 아민 화합물에 의해 표면 개질된 자성 나노입자를 세포 고정화 담체로 사용하여 수소를 생산하는 초고온성 고세균을 고정화하는 단계; 및 상기 고정화된 초고온성 고세균을 이용하여 반복적으로 수소를 생산하는 단계;를 포함한다.
상기 초고온성 고세균을 고정화하는 단계는, 직경이 10 ~ 100 nm인 자성 나노 입자의 표면을 하기 구조식 (1)의 아민 화합물로 개질하는 단계; 초고온성 고세균 배양액을 표면이 개질된 자성 나노 입자와 혼합하여 상기 초고온성 고세균을 표면이 개질된 자성 나노 입자의 표면에 고정하는 단계; 및 자기장을 가하여 초고온성 고세균이 고정화된 자성 나노 입자를 분리하는 단계;를 포함한다.
Figure pat00001
구조식 (1)
(여기서, R1, 내지 R3는 서로 독립적으로 C1-C3 알킬기이거나 C1-C3 알콕시기이며; R4 및 R5는 서로 독립적으로, 수소(H), C1-C7알킬기, C6-C20아릴기 또는 C6-C20아르C1-C7알킬기이거나, 상기 R4 및 R5가
Figure pat00002
로 연결되어 고리를 형성할 수 있고, R4 및 R5의 알킬기, 아릴기 또는 아르알킬기는 아미노기, 하이드록시기, 비닐기, 니트로기, 트리 C1-C3 알킬실릴기, 트리C1-C3알콕시실릴기 및 아미노 카보닐기 중에서 선택된 하나 이상의 치환기로 더 치환될 수 있음)
또한, 본 발명의 초고온성 고세균을 이용한 수소 생산 방법에서 상기 고정화된 초고온성 고세균을 이용하여 반복적으로 수소를 생산하는 단계는, 초고온성 고세균이 고정화된 자성 나노 입자를 담체로 사용하고 배양액을 포함하는 배지를 공급하여 배양함으로써 수소를 생산하는 단계; 자기장을 가하여 상기 담체를 회수하고 배양액과 배지를 제거하는 단계; 및 회수된 담체를 사용하여 상기 수소를 생산하는 단계와 담체 회수 및 배지 제거를 반복하는 반복 배양 단계;를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 초고온성 고세균은, 써모코커스 온누리뉴스(Thermococcus onnurineus) NA1을 사용하는 것이 바람직하고, 자성 나노 입자의 표면 개질에 사용되는 상기 아민 화합물은, (N, N-디메틸아미노프로필)트리에톡시실란, [3-(디에틸아미노)프로필]트리메톡시실란, 트리메톡시[3-메틸아민]프로필실란, [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란, N1-(3-트리메톡실릴프로필)디에틸렌트리아민, (3-아미노프로필)트리에톡시실란, 3-[비스(2-하이드록시에틸)아미노]프로필-트리에톡시실란, N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]-N'-(4-비닐벤질)에틸렌디아민, 트리에톡시-3-(2-이미다졸린-1-릴)프로필실란, 비스[3-(트리메톡실릴)프로필]아민, N-[3-(트리메톡실릴)프로필]아닐린 및 1-[3-(트리메톡시실릴)프로필]우레아으로 이루어진 군중에서 하나 이상 선택되는 것이 바람직하다.
표면이 개질된 자성 나노 입자는 배지 100중량부를 기준으로 0.1 내지 20중량부의 범위로 포함되는 것이 바람직하고, 상기 반복 배양 단계는 복수의 재배양 배지를 순차적으로 교체하여 복수 회 반복 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명의 초고온성 고세균의 생장 및 수소 생산 과정 중에서 탄소원으로서 일산화탄소, 일산화탄소를 포함하는 합성가스, 일산화탄소를 포함하는 제철소 부생가스, 개미산 또는 이들의 혼합물이 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 아민-자성 세포 고정화 담체를 이용한 초고온성 고세균의 세포고정화 방법 및 고정화 세포를 이용한 수소 생산 방법은 고농도 배양이 어려운 초고온성 고세균을 배양기 내에서 고농도로 유지할 수 있으므로 효율적이고 연속적인 수소 생산이 가능한 효과가 있다.
또한, 본 발명은 미생물 표면과 친화성을 가지면서도 배양액과 쉽게 분리되어 고농도의 배양이 가능하도록 아민-자성 세포 고정화 담체를 사용하면서, 동시에 상기 담체에 고정화된 상태에서 초고온성 세균이 성장이 동시에 같이 이루어짐으로써 연속적인 수소 생산이 가능한 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 아민-자성 세포 고정화 담체를 이용한 초고온성 고세균의 세포고정화 배양 방법 및 이를 이용한 수소 생산 방법을 나타낸 도면이다.
도 2는 아민-자성 세포 고정화 담체에 고정화된 초고온성 고세균을 이용한 반복 회분식 배양에서 회분 당 수소 생산속도를 나타낸 그래프이다.
본 발명을 좀 더 상세하게 설명하면, 미생물 표면과 친화성을 가지고 배양액으로부터 쉽게 분리가 되어 고농도 배양을 가능하게 하는 아민-자성 세포 고정화 담체와 이를 이용한 세포 고정화 방법에 관한 것으로, 이러한 고정화 방법을 통해 초고온성 고세균에 의한 연속적인 수소 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 도 1에 도식적으로 제시된 바와 같이, (A) 수소 생산 미생물인 써모코커스 온누리뉴스 NA1 균 배양액을 아민-자성 세포 고정화 담체와 혼합하여 상기 써모코커스 온누리뉴스 NA1 균을 상기 세포 고정화 담체에 고정화시킨 후, 상기 써모코커스 온누리뉴스 NA1 균이 고정화된 자성 담체에 자기장을 가하여 분리하는 고정화 단계; 및 (B) 분리된 써모코커스 온누리뉴스 NA1 균이 고정화된 자성 담체에 배양액을 포함하는 배지를 공급하여 배양함으로써 수소를 생산하는 수소 생산 단계; 자기장을 가하여 써모코커스 온누리뉴스 NA1 균이 고정화된 자성 담체를 회수하고 배지를 제거하는 단계; 새로운 배지를 가하여 상기 수소 생산 단계를 반복함으로써, 써모코커스 온누리뉴스 NA1 균을 이용한 수소 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 아민-자성 세포 고정화 담체는, 아민계 화합물이 표면에 공유결합된 자성 나노입자를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세포 고정화 담체는 직경이 10 nm 내지 100 nm이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 20 nm 내지 80 nm인 입자는 제한 없이 사용될 수 있으며, 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 망간, 비스무스(Mn, Bi)에서 하나 이상 선택된 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 포함할 수 있다.
상기 세포 고정화 담체 입자의 표면 개질에 사용되는 적어도 하나 이상의 아민기를 포함하는 아민계 화합물은 제한 없이 사용 가능하지만, 하기 구조식(1)을 갖는 아민계 화합물 중에서 하나 이상을 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.
Figure pat00003
구조식 (1)
상기 구조식 (1)에서, R1, 내지 R3는 서로 독립적으로 C1-C3 알킬기이거나 C1-C3 알콕시기이며; R4 및 R5는 서로 독립적으로, 수소(H), C1-C7알킬기, C6-C20아릴기 또는 C6-C20아르C1-C7알킬기이거나, 상기 R4 및 R5가
Figure pat00004
로 연결되어 고리를 형성할 수 있고, R4 및 R5의 알킬기, 아릴기 또는 아르알킬기는 아미노기, 하이드록시기, 비닐기, 니트로기, 트리C1-C3 알킬실릴기, 트리C1-C3알콕시실릴기 및 아미노카보닐기 중에서 선택된 하나 이상의 치환기로 더 치환될 수 있다.
상기 화학식(1)의 구체적인 일례로는, 다음의 화학식들 (1) 내지 (12)과 같은, (1) (N, N-디메틸아미노프로필)트리에톡시실란{(N, N-Dimethylaminopropyl) trimethoxysilane},(2) [3-(디에틸아미노)프로필]트리메톡시실란{[3-(Diethylamino)propyl]trimethoxy silane}, (3) 트리메톡시[3-메틸아민]프로필실란{Trimethoxy[3-(methylamino)propyl] silane}, (4) [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란{ [3-(2-Aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane}, (5) N1-(3-트리메톡실릴프로필)디에틸렌트리아민{{N1-(3-Trimethoxysilylpropyl) diethylenetriamine}, (6) (3-아미노프로필)트리에톡시실란 {(3-Aminopropyl)triethoxysilane}, (7) 3-[비스(2-하이드록시에틸)아미노]프로필-트리에톡시실란{3-[Bis(2-hydroxyethyl)amino]propyl-triethoxysilane}, (8) N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]-N'-(4-비닐벤질)에틸렌디아민{N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]-N'-(4-vinylbenzyl)ethylenediamine}, (9) 트리에톡시-3-(2-이미다졸린-1-릴)프로필실란 {Triethoxy-3-(2-imidazolin-1-yl)propylsilane}, (10) 비스[3-(트리메톡시실릴)프로필]아민 {Bis[3-(trimethoxysilyl)propyl]amine}, (11) N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]아닐린 {N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]aniline}, (12) 1-[3-(트리메톡시실릴)프로필]우레아 {1-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]urea} 등을 들 수 있다.
Figure pat00005
본 발명에서 자성 나노 입자의 표면 개질에 사용되는 상기 아민계 화합물은, 상기 자성 나노입자 100 중량부에 대하여 100 내지 2,000 중량부가 사용되는 것이 바람직하다. 이렇게 표면 개질된 상기 자성 나노입자는 수용액 상에서 양전하를 띄고 있으므로 표면에 음전하를 나타내는 초고온성 고세균을 보다 용이하게 부착할 수 있다.
본 발명의 아민-자성 세포 고정화 담체를 이용한 초고온성 고세균의 고정화 방법(S1)은, 도 1을 참조하여 구체적으로 살펴보면, 초고온성 고세균 배양액(a)과 상기 아민-자성 세포 고정화 담체(b)를 혼합 및 교반하여 고정화 세포(a’+b)를 제조하는 단계(S01);와 자력으로 상기 고정화 세포를 침전시키고, 초고온성 고세균이 제거된 상등액(a-a’)을 제거하여 고정화 세포를 고농도로 수득하는 단계(S02);를 포함한다.
상기 단계(S01)에서의 교반 강도는 특별히 한정되지 아니하지만, 아민-자성 세포 고정화 담체와 초고온성 고세균이 충분히 접촉할 정도이면 충분하다. 또한 상기 단계(S01)에서 배양액의 pH는 4 내지 8 정도가 바람직한데, 상기 pH가 4보다 낮은 경우에는 초고온성 고세균의 표면 음전하가 약해서 나노 입자와의 부착력이 감소하고, pH가 8보다 높은 경우에는 나노 입자 표면의 전하가 사라져 초고온성 고세균에 대한 친화력이 없어지기 때문이다. 또한, 초고온성 고세균인 써모코커스 온누리뉴스 NA1 균의 생장을 위한 최적 pH가 6.5이므로, 별도의 pH 조절 없이 나노입자 첨가만으로 고정화가 가능한 장점이 있다.
본 발명의 아민-자성 나노입자에 고정화된 초고온성 고세균을 이용한 반복적이고 연속적인 수소 생산 방법(S2)은, 단계(S1)를 통하여 상기 써모코커스속 균이 고정화된 담체에 배지(c)를 공급하고 배양하는 배양 단계(S03); 및 일정한 배양 시간이 경과한 후 배양액과 고정화 세포를 분리하는 단계(S04);를 포함하고, 사용된 배지(c’)를 제거한 후, 새로운 배지를 공급하여 상기 배양 단계(S03)와 분리 단계(S04)를 반복하게 된다. 이러한 반복 과정(재배양 단계) 중에서 상기 써모코커스속 균이 고농도 상태로 유지되고, 지속적 또는 연속적으로 수소를 생산할 수 있다.
상기 아민-자성 나노입자의 함량은 배양액 100 중량부에 대하여 0.1 내지 20 중량부의 범위로 사용하는 것이 바람직한데, 아민-자성 나노입자의 함량이 0.1 중량부 이하인 경우에는 세포 부착량에 한계가 있고, 20 중량부 이상인 경우에는 아민-자성 나노입자 자체적으로 응집이 발생하는 등의 문제점이 발생하여, 세포 부착 효과에 비해 나노입자 사용량이 과다하게 필요하기 때문에 바림직하지 않다.
상기 재배양단계는 복수의 재배양 배지를 순차적으로 교체하여 복수 회 반복배양할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 반복배양은 2~100 회 수행될 수 있다. 상기 재배양단계에서 배지의 교체 방법은 세포 고정화 방법과 마찬가지로 자력을 이용하여 고정화 세포를 침전시켜 배양액과 분리하고, 사용된 배양액을 제거한 후, 새로운 재배양 배지를 공급함으로써 실시할 수 있으며, 상기 재배양 단계의 배양온도는 70 ~ 90 ℃의 범위가 바람직하다.
상기 재배양 단계에서 수소를 생산하는데 사용하는 원료는 일산화탄소, 일산화탄소를 포함하는 합성가스, 일산화탄소를 포함하는 제철소 부생가스, 개미산 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
이하에서는, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이러한 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 자성 나노입자 제조
염화 제일철(FeCl24H2O)과 염화 제이철(FeCl34H2O)수용액을 이용하여 자성을 띠는 나노 크기의 사삼산화철을 제조하였다.
4.3g의 염화제일철과 11.68g의 염화제이철을 200㎖의 증류수와 혼합하여 수용액으로 만든 후에 두 용액을 혼합하고, 이를 교반하는 과정을 수행하였다. 혼합된 수용액을 질소를 흘리면서 약 85℃ 정도로 30분 동안 가열시킨 후에 수산화암모늄 (NH4OH 28.8%) 28㎖를 혼합하여 침전 시켰다. 침전물들을 과량의 물과 알코올로 3회 세척한 후에 자석을 이용하여 회수하였다. 상기와 같은 제조 방법으로 10 내지 30nm의 크기를 갖는 자성 나노입자인 사삼산화철을 합성하였다.
실시예 2. 아민 -자성 세포 고정화 담체 제조
상기 실시예 1을 통해 제조된 자성 나노입자인 사삼산화철을 이용하여 아민-자성 세포 고정화 담체를 제조하였다.
약 5g의 자성 나노입자인 사삼산화철을 200g의 에탄올에 아민 화합물인 아미노프로필트리에톡시실란(Aminopropyltriethoxysilane) 10g과 함께 혼합한 다음 25℃의 온도에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 아민 화합물의 코팅 후, 알코올로 3회 세척하고 자력으로 아민-자성 세포 고정화 담체를 수득하였다.
비교예 1. 소수성 관능기를 갖는 자성 세포 고정화 담체 제조
실시예 1을 통해 제조된 자성 나노입자인 사삼산화철을 이용하여 소수성 관능기를 갖는 자성 세포 고정화 담체를 제조하였다.
약 5g의 자성 나노입자인 사삼산화철을 200g의 에탄올에 소수성 관능기를 갖는 트리에톡시옥틸실란(Triethoxy(octyl)silane) 10g과 함께 혼합한 다음 25℃의 온도에서 12시간 동안 섞어주었다. 실란 화합물의 코팅 후, 알코올로 3회 세척하고 자력으로 소수성 관능기를 갖는 자성 세포 고정화 담체를 회수하였다.
비교예 2. 아민 관능기와 소수성 관능기를 동시에 갖는 자성 세포 고정화 담체 제조
실시예 1을 통해 제조된 자성 나노입자인 사삼산화철을 이용하여 아민 관능기와 소수성 관능기를 동시에 갖는 자성 세포 고정화 담체를 제조하였다.
약 5g의 자성 나노입자인 사삼산화철을 200g의 에탄올에 아민 화합물인 아미노프로필트리에톡시실란(Aminopropyltriethoxysilane) 5g과 소수성 관능기를 갖는 트리에톡시옥틸실란(Triethoxy(octyl)silane) 5g과 함께 혼합한 다음 25℃의 온도에서 12시간 동안 섞어주었다. 실란 화합물의 코팅 후, 알코올로 3회 세척하고 자력으로 아민 관능기와 소수성 관능기를 동시에 갖는 자성 세포 고정화 담체를 회수하였다.
실시예 3. 일산화탄소를 기질로 이용한 초고온성 고세균의 배양 방법
NaCl 35g/L, KCl 0.7g/L, CaCl22H2O 0.4g/L, NH4Cl 0.3g/L, NaHCO3 0.5g/L, cysteine-HCl 0.5g/L, 효모추출물 1g/L, MgSO4 3.9g/L, Na2HPO4 0.15g/L, Na2SiO3 0.003g/L와 기타 미량원소를 포함한 초고온성 고세균 배양 배지를 제조하였다.
150mL 용량의 시럼병(serum bottle)에 상기 배지를 50mL 주입하고, 써모코커스 온누리뉴스 NA1{한국해양과학기술원에서 입수, 공지의 방법에 의해 분리, 동정함(Nature 2010 vol. 467. No. 7313. 352-355} 배양액 2.5mL을 접종하였다. 배지와 써모코커스 온누리뉴스 NA1이 포함된 시럼병에 일산화탄소를 공급하여 시럼병 내에 포함된 산소 성분을 완전히 제거하는 동시에 일산화탄소로 치환한 다음 12시간 동안 교반하며 배양을 실시하였다. 배양액의 초기 pH는 6.5이고 배양온도는 섭씨 80도를 유지하였다.
실시예 4. 아민 -자성 세포 고정화 담체 이용 초고온성 고세균 고정화
상기 실시예 3에서 배양한 OD 0.684의 써모코커스 온누리뉴스 NA1 배양액 50 ㎖에 실시예 2, 비교예 1, 비교예 2에서 제조한 세포 고정화 담체를 넣고 교반하여 혼합하였다. 고정화 담체 투입량은 전체 용액 대비 25,000 ppm 정도로 조절하였다. 혼합 후 써모코커스 온누리뉴스 NA1 배양액-세포 고정화 담체 혼합액 하부에 자력을 가하여 침전을 유도하였다. 자력을 가한 후 1~3분 정도 지나면 침전이 완료된다.
고정화 효율을 평가하기 위하여 써모코커스 온누리뉴스 NA1 세포와 세포 고정화 담체가 제거된 상등액에 대하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 다음의 표 1의 결과에서 확인할 수 있듯이 실시예 1과 비교실시예 2에서 제조한 세포 고정화 담체를 사용할 경우에는 고정화 효율이 85%에 달하여 아민-자성 세포 고정화 담체에 써모코커스 온누리뉴스 NA1 세포를 효과적으로 고정화시킬 수 있었다.
고정화 담체 투입 농도
(g/L)		 배양액 흡광도
(OD600)		 상등액 흡광도
(OD600)		 세포고정화 효율 (%)
실시예 1 24.94 0.684 0.0964 85.91
비교예 1 26.16 0.684 0.715 0
비교예 2 25.38 0.684 0.103 84.91
실시예 5. 일산화탄소를 기질로 하는 고정화 세포 이용 수소 생산 방법
상기 실시예 1과 상기 비교예 2에서 제조한 담체에 상기 실시예 4의 방법을 사용하여 써모코커스 온누리뉴스 NA1이 고정화된 입자를 제조하였다. NaCl 35g/L, KCl 0.7g/L, CaCl22H2O 0.4g/L, NH4Cl 0.3g/L, NaHCO3 0.5g/L, cysteine-HCl 0.5g/L, 효모추출물 1g/L, MgSO4 3.9g/L, Na2HPO4 0.15g/L, Na2SiO3 0.003g/L와 기타 미량원소를 포함한 초고온성 고세균 배양 배지를 제조하였다.
150mL 용량의 시럼병(serum bottle)에 상기 배지를 50mL 주입하고, 상기 고정화 세포를 접종하였다. 비교를 위하여 동일한 용량의 시럼병에 상기 배지를 50mL 주입하고 실시예 3에서 제조한 써모코커스 온누리뉴스 NA1 배양액을 2.5mL 접종하였다.
배지와 고정화 세포가 포함된 시럼병에 일산화탄소를 공급하여 시럼병 내에 포함된 산소 성분을 완전히 제거하는 동시에 일산화탄소로 치환한 다음 6시간 동안 교반하며 배양을 실시하였다.
배양액의 초기 pH는 6.5이고 배양온도는 섭씨 80도를 유지하였다. 6시간 배양 후 시럼병 헤드스페이스(headspace)의 가스를 샘플링하고 수소 함량을 측정하였다. 고정화 세포에서 유리된 현탁 세포의 농도를 측정하기 위하여 자력을 이용하여 배양액과 고정화 세포를 분리한 다음 상등액의 흡광도를 측정하였다.
아래의 [표 2]의 결과에서 확인할 수 있듯이, 상등액의 흡광도 분석 결과 유리된 세포의 농도가 높지 않아 대부분의 수소 생산은 고정화 세포에 의하여 이루어지고 있으며, 본 발명의 아민-자성 세포 고정화 담체를 이용하여 고정화된 써모코커스 온누리뉴스 NA1이 높은 수소 생산 활성을 유지하고 있음을 알 수 있다.
상등액 흡광도
(OD600)		 수소 생산 속도
(mmol/L/h)
실시예 1 0.0331 10.21
비교예 1 0.1071 7.77
현탁세포 배양 0.2011 8.86
실시예 6. 일산화탄소를 기질로 하는 고정화 세포 이용 반복적 수소 생산 방법
상기 실시예 4의 방법을 사용하여 써모코커스 온누리뉴스 NA1이 고정화된 입자를 제조하였다. NaCl 35g/L, KCl 0.7g/L, CaCl22H2O 0.4g/L, NH4Cl 0.3g/L, NaHCO3 0.5g/L, cysteine-HCl 0.5g/L, 효모추출물 1g/L, MgSO4 3.9g/L, Na2HPO4 0.15g/L, Na2SiO3 0.003g/L와 기타 미량원소를 포함한 초고온성 고세균 배양 배지를 제조하였다.
150mL 용량의 시럼병(serum bottle)에 상기 배지를 50mL 주입하고, 상기 고정화 세포를 접종하였다. 비교를 위하여 동일한 용량의 시럼병에 상기 배지를 50mL 주입하고 실시예 3에서 제조한 써모코커스 온누리뉴스 NA1 배양액을 2.5mL 접종하였다.
배지와 고정화 세포가 포함된 시럼병에 일산화탄소를 공급하여 시럼병 내에 포함된 산소 성분을 완전히 제거하는 동시에 일산화탄소로 치환한 다음 6시간 동안 교반하며 배양을 실시하였다.
배양액의 초기 pH는 6.5이고 배양온도는 섭씨 80도를 유지하였다. 6시간 배양 후, 자력을 이용하여 고정화 세포와 액상 배지를 고액분리하여 사용된 배지를 폐기하고, 상기 배지와 동일하게 제조한 재배양배지로 배지를 교체한 것을 제외하고 동일 조건에서 배양하였다. 상기와 같은 방법으로 총 4회의 반복 회분식 배양을 실시하였다. 각 회분이 종료된 후 시럼병 헤드스페이스(headspace)의 가스를 샘플링하고 수소 함량을 측정하였다.
각 회분의 수소 생산 속도를 측정한 결과를 도 2에 도시하였다. 상기 도 2의결과에서 확인되듯이, 세포 고정화 배양을 통하여 세포 농도를 고농도로 유지함으로써, 현탁 세포 배양보다 높은 수소 생산성을 획득할 수 있었다. 또한, 회분이 반복됨에 따라 수소 생산성이 꾸준히 증가함을 감안할 때, 고정화된 세포가 담체에서 지속적으로 증식됨을 확인할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (8)

  1. 아민 화합물에 의해 표면 개질된 자성 나노입자를 세포 고정화 담체로 사용하여 수소를 생산하는 초고온성 고세균을 고정화하는 단계; 및
    상기 고정화된 초고온성 고세균을 이용하여 반복적으로 수소를 생산하는 단계;를 포함하는 초고온성 고세균을 이용한 수소 생산 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 초고온성 고세균을 고정화하는 단계는,
    직경이 10 ~ 100 nm인 자성 나노 입자의 표면을 하기 구조식 (1)의 아민 화합물로 개질하는 단계;
    초고온성 고세균 배양액을 표면이 개질된 자성 나노 입자와 혼합하여 상기 초고온성 고세균을 표면이 개질된 자성 나노 입자의 표면에 고정하는 단계; 및
    자기장을 가하여 초고온성 고세균이 고정화된 자성 나노 입자를 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 초고온성 고세균을 이용한 수소 생산 방법.

    Figure pat00006
    구조식 (1)
    (여기서, R1, 내지 R3는 서로 독립적으로 C1-C3 알킬기이거나 C1-C3 알콕시기이며; R4 및 R5는 서로 독립적으로, 수소(H), C1-C7알킬기, C6-C20아릴기 또는 C6-C20아르C1-C7알킬기이거나, 상기 R4 및 R5가
    Figure pat00007
    로 연결되어 고리를 형성할 수 있고, R4 및 R5의 알킬기, 아릴기 또는 아르알킬기는 아미노기, 하이드록시기, 비닐기, 니트로기, 트리 C1-C3 알킬실릴기, 트리C1-C3알콕시실릴기 및 아미노 카보닐기 중에서 선택된 하나 이상의 치환기로 더 치환될 수 있음)
  3. 제1항에 있어서,
    상기 고정화된 초고온성 고세균을 이용하여 반복적으로 수소를 생산하는 단계는,
    초고온성 고세균이 고정화된 자성 나노 입자를 담체로 사용하고 배양액을 포함하는 배지를 공급하여 배양함으로써 수소를 생산하는 단계;
    자기장을 가하여 상기 담체를 회수하고 배양액과 배지를 제거하는 단계; 및
    회수된 담체를 사용하여 상기 수소를 생산하는 단계와 담체 회수 및 배지 제거를 반복하는 반복 배양 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 초고온성 고세균을 이용한 수소 생산 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 초고온성 고세균은, 써모코커스 온누리뉴스(Thermococcus onnurineus) NA1인 것을 특징으로 하는, 초고온성 고세균을 이용한 수소 생산 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 아민 화합물은, (N, N-디메틸아미노프로필)트리에톡시실란, [3-(디에틸아미노)프로필]트리메톡시실란, 트리메톡시[3-메틸아민]프로필실란, [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란, N1-(3-트리메톡실릴프로필)디에틸렌트리아민, (3-아미노프로필)트리에톡시실란, 3-[비스(2-하이드록시에틸)아미노]프로필-트리에톡시실란, N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]-N'-(4-비닐벤질)에틸렌디아민, 트리에톡시-3-(2-이미다졸린-1-릴)프로필실란, 비스[3-(트리메톡실릴)프로필]아민, N-[3-(트리메톡실릴)프로필]아닐린 및 1-[3-(트리메톡시실릴)프로필]우레아으로 이루어진 군중에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 초고온성 고세균을 이용한 수소 생산 방법.
  6. 제2항에 있어서,
    표면이 개질된 자성 나노 입자는 배지 100중량부를 기준으로 0.1 내지 20중량부의 범위로 포함되는 것을 특징으로 하는, 초고온성 고세균을 이용한 수소 생산 방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 반복 배양 단계는 복수의 재배양 배지를 순차적으로 교체하여 복수 회 반복 배양하는 것을 특징으로 하는, 초고온성 고세균을 이용한 수소 생산 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    초고온성 고세균의 생장 및 수소 생산 과정 중에서 탄소원으로서 일산화탄소, 일산화탄소를 포함하는 합성가스, 일산화탄소를 포함하는 제철소 부생가스, 개미산 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 초고온성 고세균을 이용한 수소 생산 방법.
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Nature 2010 vol. 467. No. 7313. 352-355

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