CN107586750A - 一株产腈水合酶的菌株及用于生产对羟基苯乙酰胺的方法 - Google Patents
一株产腈水合酶的菌株及用于生产对羟基苯乙酰胺的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株产腈水合酶的菌株及用于生产对羟基苯乙酰胺的方法，属于生物技术领域，所述菌株分类命名为阿氏芽孢杆菌Jn‑102，已于2017年9月26日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号：CGMCC No.14668。本发明提供的产腈水合酶的阿氏芽孢杆菌Jn‑102遗传稳定性好，培养成本低，产生的腈水合酶酶活力高，适用底物谱较宽，可直接利用该菌株直接转化对羟基苯乙腈合成对羟基苯乙酰胺，催化合成时无需加入表面活性剂、有机溶剂等透膜剂，避免引入外源杂质，有利于提取分离操作，工业应用具有优势。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一株生产腈水合酶的菌株，以及利用该菌株生产的腈水合酶催化制备对羟基苯乙酰胺的方法。
背景技术
腈是一类重要的化合物，它广泛存在于自然界的植物中，它的水解反应被广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成，在有机合成中占有极其重要的地位。腈水解的方法主要有化学水解法和生物转化法。腈的化学水解因其需要强酸或强碱、高温、高压等反应条件，而且副产物多、产量低、环境污染严重，而大大地限制了它在工业上的应用。相反，生物转化法具有条件温和、环境污染小，并能实现化学选择性、区域选择性和对映选择性等优点。生物转化法涉及的酶系主要有腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。腈水合酶(Nitrilehydratase)是由α-亚基和β-亚基构成的多亚基金属酶，可以催化腈类物质转化成相应的酰胺类物质，在有机合成工业具有较大的应用潜力。
腈水合酶广泛存在于微生物群体内，在红球菌(Rhodococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、节杆菌(Arthrobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、棒杆菌(Corynebacterium)及短杆菌(Brevibacterium)等微生物中均有发现，研究较为广泛。N itto公司先后分别用产NHase的微生物菌株Rhodococcus sp.N-771、Pseudomonas chlororaphis B23、Rhodococcusrhodochrous J 1来生产丙烯酰胺，其产量不断提高。但在生产过程中，微生物NHase受到底物和产物的抑制作用，其半衰期较短。赵爱民等已筛选到一株产NHase活性较高的马红球菌Rhodococcus equi SHB2121，并研究了该菌形成NHase的最适条件、纯化及性质，酶活比初筛时提高95倍。马士忠等筛选出一株产NHase的诺卡氏菌KY1023，并发现该酶具有广谱性，不仅能高效地催化丙烯腈水解，而且能催化乙腈水解，分别生成对应的酰胺，转化率都达到98％以上。目前，微生物NHase在工业上仅限于丙烯酰胺和烟酰胺的生产，但极大地促进了NHase的应用研究。由于NHase可以以非天然化合物为底物，因此可通过NHase生物转化获得非天然产物。对羟基苯乙酰胺是合成β-肾上腺素受体阻滞药阿替洛尔的关键中间体，具有好的市场应用前景，目前国内外主要采用化学法合成，存在步骤复杂、污染严重等问题，生物酶法是不错的替代方案。蔡谦等以对羟基苯乙腈为底物筛选到1株红色红球菌，具有转化生产对羟基苯乙酰胺的能力，但酶活不高，且存在严重的底物抑制现象。通过筛选具有新特性的微生物NHase或采用蛋白质工程技术改造现有微生物NHase的特性等方法可解决以上问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供从土壤中分离得到的一株高效生产腈水合酶的菌株，并应用该菌株产生的腈水合酶酶法制备对羟基苯乙酰胺的方法。本发明所提供的产腈水合酶的菌株是从济宁地区农田土壤中分离得到，这是一株腈水合酶分泌能力极高的菌株，培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以直接用于酶法制备对羟基苯乙酰胺。
本发明的技术方案如下：
一株产腈水合酶的菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2017年9月26日，分类命名为阿氏芽孢杆菌Jn-102(Bacillus aryabhattai)，保藏编号为：CGMCC No.14668。
进一步，该菌株的16S rRNA基因序列如SEQ.NO.1。
本发明还提供所述菌株的腈水合酶的发酵生产及用于催化制备对羟基苯乙酰胺的方法如下：
1、菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒温培养箱28～30℃培养14～20h；
2、液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，纱布封口，于26-37℃，160～200r/min摇床振荡培养12～24h，得液体种子；
3、液体发酵：按体积比5～10％接种量向发酵培养基接入步骤2制备的液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～50％，pH7.0～7.5，温度26～37℃，通气培养24～48h，得到腈水合酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体细胞；
4、催化制备对羟基苯乙酰胺：将10-30g的对羟基苯乙腈加入1L 50mM、pH6.0～8.0的磷酸缓冲液中，搅拌均匀，加入步骤3收集的菌体细胞10～30g，温度20～30℃，维持转速在50～100r/min，反应1～5h。
进一步，所述的固体保藏培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；
进一步，所述的液体种子培养基：酵母浸粉1～10g/L，蛋白胨5～10g/L，NaCl 1～5g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；
进一步，所述的发酵培养基：葡萄糖10g/L，对羟基苯乙腈5g/L，蛋白胨5-20g/L，酵母浸粉1～5g/L，MgSO4 0.1～0.5g/L，硫酸铵2～7g/L，KH2PO4 0.1～1g/L，CoCl2 50～100mg/L，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明与现有技术相比的有益效果：
1、本发明提供的阿氏芽孢杆菌Jn-102，不同于以往的腈水合酶酶产生菌种，尚未有该菌株产腈水合酶的报道，拓宽了产腈水合酶的菌种渠道；
2、本发明所提供的阿氏芽孢杆菌Jn-102遗传稳定性好，培养基成分简单原料成本低，产生的腈水合酶酶活力高，可水合底物谱较宽，可直接利用该菌株发酵液直接转化生产酰胺化合物，工业应用具有优势。
3、阿氏芽孢杆菌具有良好的细胞膜通透性，有利于底物透过，催化合成酰胺化合物无需加入表面活性剂、有机溶剂等透膜剂，避免引入外源杂质，有利于提取分离操作。
具体实施方式
为阐明对本项发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1：阿氏芽孢杆菌菌株分类
1)菌种特性
在保藏培养基上菌落呈乳白或微黄色，近圆形、表面光滑湿润凸起、边缘不规则；通过显微镜观察，菌体呈杆状，有芽孢、能运动，革兰氏阳性；生理生化指标如表1所示。
表1菌株Jn-102生理生化特征
2)菌株鉴定
经DNA提取、PCR扩增和测序获得的16S rRNA基因序列长度为1382bp，在GenBank上进行BLAST比对，得出该菌株与Bacillus aryabhattai(EF114313)碱基相似性达99％，结合生理生化指标，将Jn-102菌株鉴定为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)。16S rRNA序列信息如下：
gcttctatgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaataccggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttacagatgggcccgcggtgcattagctagttggtggggtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccgacctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacgagagtaactgctcgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaactctagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggagtaaccgtaagga。
3)腈水合酶底物特异性
考察了阿氏芽孢杆菌Jn-102NHase的底物特异性。由表2中可见，NHase能够较好地水合芳香族腈化合物，具有较宽的底物谱，尤其是能够高效水合3-氰基吡啶、4-氰基吡啶等芳香族腈化合物为相应的酰胺。
表2底物特异性
4)遗传稳定性
采用划线法将阿氏芽孢杆菌Jn-102在固体培养基上连续传代50次，测定菌体形态、生长速度及转化对羟基苯乙腈的速度和转化率，与原代菌株无明显差异，遗传稳定性良好。
5)菌种保藏
本项发明所述的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)Jn-102，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.14668，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2菌株培养与对羟基苯乙酰胺合成
1)菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；划线接种于恒温培养箱30℃培养20h；
2)液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，液体种子培养基组分：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；八层纱布封口，于30℃，200r/min摇床振荡培养18h，得液体种子；
3)液体发酵：按5％接种量向组成成分为葡萄糖10g/L，对羟基苯乙腈5g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，MgSO4 0.3g/L，硫酸铵2g/L，KH2PO4 0.3g/L，CoCl2 50mg/L pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min制备的发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～30％，pH7.0，温度30℃，通气培养36h，得到腈水合酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体细胞；
4)催化制备对羟基苯乙酰胺：将10g的对羟基苯乙腈加入1L 50mM、pH6.8的磷酸缓冲液中，搅拌均匀，加入步骤3)收集的菌体细胞20g，温度25℃、维持转速在50r/min，反应5h，HPLC测定对羟基苯乙酰胺含量为11.3g/L，对对羟基苯乙腈摩尔转化率为99.5％。液相色谱条件为C18色谱柱(250mm×4.6mm,10μm)，柱温25℃；检测波长：254nm；流动相：甲醇：水：四氢呋喃：乙酸(35:65:1:1，v/v)流速：1mL/min。
实施例3菌株培养与对羟基苯乙酰胺合成
1)菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，于恒温培养箱30℃培养20h；
2)液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，液体种子培养基组分：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；八层纱布封口，于30℃，200r/min摇床振荡培养18h，得液体种子；
3)液体发酵：按体积比5％接种量向组成成分为葡萄糖10g/L，对羟基苯乙腈5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，MgSO4 0.1g/L，硫酸铵2g/L，KH2PO4 0.15g/L，CoCl2 50mg/L pH7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min制备的发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～30％，pH7.0，温度30℃，通气培养36h，得到腈水合酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体；
4)催化制备对羟基苯乙酰胺：将20g的对羟基苯乙腈加入1L 50mM、pH7.0磷酸缓冲液中，搅拌均匀，加入步骤3)收集的菌体25g，温度25℃、维持转速在100r/min，反应5h，HPLC测定对羟基苯乙酰胺含量为22.4g/L，对对羟基苯乙腈摩尔转化率为98.7％。液相色谱条件同实施例2。
实施例4菌株培养与对羟基苯乙酰胺合成
1)菌株活化：挑取菌种至固体保藏培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，划线接种于恒温培养箱30℃培养20h；
2)液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，液体种子培养基组分：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；八层纱布封口，于30℃，200r/min摇床振荡培养18h，得液体种子；
3)液体发酵：按10％接种量向组成成分为葡萄糖10g/L，对羟基苯乙腈5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，MgSO4 0.1g/L，硫酸铵2g/L，KH2PO4 0.15g/L，CoCl2 60mg/L pH7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min制备的发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～30％，pH7.0，温度30℃，通气培养36h，得到腈水合酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体；
4)催化制备对羟基苯乙酰胺：将30g的对羟基苯乙腈加入1L 50mM、pH7.5的磷酸缓冲液中，搅拌均匀，加入步骤3)收集的菌体30g，温度25℃、维持转速在80r/min，反应5h，HPLC测定对羟基苯乙酰胺含量为33.5g/L，对对羟基苯乙腈摩尔转化率为98.4％。液相色谱条件同实施例2。
序列表
<110> 山东阳成生物科技有限公司
<120> 一株产腈水合酶的菌株及用于生产对羟基苯乙酰胺的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1382
<212> DNA
<213> 阿氏芽孢杆菌 Jn-102(Bacillus aryabhattai Jn-102)
<400> 1
gcttctatga cgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggcaacctgc ctgtaagact 60
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cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtggag taaccgtaag 1380
ga 1382
Claims (6)
1.一株产腈水合酶的菌株，其特征在于所述菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2017年9月26日，分类命名为阿氏芽孢杆菌Jn-102，保藏编号为：CGMCCNo.14668。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于所述菌株的16S rRNA基因序列如SEQ.NO.1。
3.利用权利要求1所述菌株发酵生产的腈水合酶催化制备对羟基苯乙酰胺的方法如下：
1)菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒温培养箱28～30℃培养14～20h；
2)液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，纱布封口，于26-37℃，160～200r/min摇床振荡培养12～24h，得液体种子；
3)液体发酵：按体积比5～10％接种量向发酵培养基接入步骤2)制备的液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～50％，pH7.0～7.5，温度26～37℃，通气培养24～48h，得到腈水合酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体细胞；
4)催化制备对羟基苯乙酰胺：将10-30g的对羟基苯乙腈加入1L 50mM、pH6.0～8.0的磷酸缓冲液中，搅拌均匀，加入步骤3)收集的菌体细胞10～30g，温度20～30℃，维持转速在50～100r/min，反应1～5h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的固体保藏培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的液体种子培养基的成分及终浓度：酵母浸粉1～10g/L，蛋白胨5～10g/L，NaCl 1～5g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基的成分及终浓度：葡萄糖10g/L，对羟基苯乙腈5g/L，蛋白胨5-20g/L，酵母浸粉1～5g/L，MgSO4 0.1～0.5g/L，硫酸铵2～7g/L，KH2PO4 0.1～1g/L，CoCl2 50～100mg/L，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A strain producing nitrile hydratase and a method for producing p-hydroxyphenylacetamide Effective date of registration: 20220530 Granted publication date: 20200421 Pledgee: Shandong juancheng Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Plaza sub branch Pledgor: SHANDONG YANGCHENG BIOTECH Co.,Ltd. Registration number: Y2022980006642 |
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