CN111154814B - 竹子糖液绿色生产γ-聚谷氨酸的工艺方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于新型生物高分子材料制备领域，具体涉及竹子糖液绿色生产γ‑聚谷氨酸的工艺方法。解决了利用传统碳源生产γ‑PGA成本高的问题，以可大量再生资源竹子为一种全新碳源运用于聚谷氨酸的工业化生产中，以此替代传统碳源，这不仅降低在聚谷氨酸生产过程中的成本，同时提供了一种竹子高值化的全新思路，解决大量竹子废料以及其副产品堆积的问题，为当地政府与农民减轻环保压力。

Description

竹子糖液绿色生产γ-聚谷氨酸的工艺方法

技术领域

本发明属于新型生物高分子材料制备领域，具体涉及农业废弃物综合利用， 以及γ-聚谷氨酸的生产。

背景技术

聚谷氨酸(γ-PGA)，又称纳豆菌胶、多聚谷氨酸，是一种生物可降解的，具 有粘性的，对人体无毒无害的新型生物高分子材料。它最初在纳豆发酵混合物中 发现的。γ-PGA是一种特殊的阴离子聚合物，是由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体通 过γ-酰胺键聚合组成的，其分子量在5万到2百万道尔顿不等。聚谷氨酸不仅是 一种优良的环保型高分子材料，同时也具备其他各项良好的性质，如水溶性、吸水性。因此γ-PGA作为吸水保湿剂、重金属吸附剂、食品增稠剂、稳定剂，免疫 促进剂、抗肿瘤剂等，被广泛的应用于食品、农业、医药、化妆品和环境等领域。

在食品领域，γ-PGA可作为食品及饮料类的增稠剂，同时还可以改善饮料的 味道；添加在冰淇淋中，可以提高其稳定性；作为食品添加剂还可以使面包或面 条避免老化的同时能改善食品质地并维持其外观形状；还可以作为防冻剂应用于 食品的冷冻过程。

在农业领域，由于聚谷氨酸拥有良好的保湿吸水特性，混入少量的聚谷氨酸 到土壤中，不仅可以提高土壤的保水性与透气性，同时还改善了土壤质量。良好 的吸水性能还为沙漠及干旱地区的绿化提供了新思路，利用γ-PGA处理种子使其 在种子周围形成一种保湿膜，以帮助种子锁住水分，又不会像传统高分子材料对环境造成负担。

在化妆品领域，聚谷氨酸有待成为保湿剂的“明星”。γ-PGA是一种亲水性且可 生物降解性高分子，具有较高的粘度，可用于制造增稠剂和保湿剂。作为化妆品 中的保湿剂，γ-PGA可以替代透明质酸(HA)。透明质酸是一种碳水化合物，更确 切地说，是一种天然存在于人体各处的粘多糖。HA可以称为“自然的保湿霜”，但 它非常昂贵。有研究对γ-PGA与HA的吸湿保湿效果进行了比较并开发了一种 γ-PGA-维生素C结合物，作为化妆品的功能性成分。研究结果显示，γ-PGA不仅 比透明质酸保湿效果更好，而且能帮助皮肤自我修护锁水。

在卫生保健方面，它可以帮助骨质疏松症者促进对钙的吸收；同时有研究指 出它是一种有效且有显著效果的免疫促进剂和抗肿瘤剂。

虽然γ-PGA作为一种新型高分子材料具有巨大的发展潜力，但在实际应用中 还存在一些问题。因枯草芽孢杆菌发酵可利用碳源主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖、 麦芽糖和甘油，而几乎不能利用木糖和木寡糖作为碳源，见“李晶博，李丁，邓 毛程.γ-聚谷氨酸的特性、生产及应用[J].化工进展,2008,27(11):1789-1792.”，导 致其最主要的问题就是它的造价比目前使用的传统材料高几十至100倍，见“石 冬霞.γ-聚谷氨酸的微生物合成、分离纯化及性质与应用研究[D].哈尔滨商业大学, 2010.3”。

近几年来，由于人们环境意识的增强，发展对环境友好的材料和开发改善环 境问题的产品成为一种产业上的趋势，同时这也成为了推动了聚谷氨酸产业化发 展的重要力量。

发明内容

组成γ-PGA碳骨架是来源于发酵液中的所提供碳，还是来自谷氨酸中的碳？ 有学者通过¹³C标记葡萄糖，对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA分子链中的碳骨架进 行了跟踪分析，发现葡萄糖作为碳源大部分用于能量代谢和菌体合成，只有少部 分参与了γ-PGA合成，而谷氨酸则为γ-PGA单体的主要碳源来源，具体参见“马 敏，姚国伟，邓玉林.阿奇霉素合成中硼酸酯水解的研究[J].精细化工,2006, 23(6):558-560.”；另外研究显示，用¹³C标记柠檬酸和谷氨酸作为培养基碳源，通 过核磁共振技术对该菌合成γ-PGA的代谢途径进行了研究，发现柠檬酸和谷氨酸 均作为前体参与了γ-PGA碳骨架的合成，具体参见“BuescherJ.M.,Margaritis A.Microbial biosynthesis of polyglutamic acid biopolymer andapplications in the biopHarmaceutical,biomedical and food industries[J].Critical Reviews in Biotechnology,2007,27(1):1-19.”；另外，在Bacillus subtilisMR-141中，除了35％ 的外源¹⁴C谷氨酸整合人γ-PGA，还有6％的¹⁴C葡萄糖也整合入γ-PGA。由此可 知，在发酵γ-PGA中，提供不同的培养基碳源，其γ-PGA碳骨架来源有所不同，这一现象有助于为γ-PGA合成的培养基成分的设计提供理论依据。

植物纤维是世界上最为丰富的可再生资源，以植物纤维为原料生产多种副产 品(如乙醇)具有巨大潜力，特别是农业与林业废弃物，如稻草、玉米秸秆、竹 屑等，以它们为原料生产各类副产品，不仅可以增加农民收入，提高其附加值， 而且可以减少因为处置处理不当而造成的环境污染。竹材是一种优良的纤维原料， 其主要化学组分是纤维素、半纤维素和木质素。木质纤维素的结构复杂且牢固，目前主要的预处理方法包括物理法、化学法、物理化学法或生物法等多种方法和 技术。

为了解决利用传统碳源生产γ-PGA成本高的问题，基于上述因素，本发明提 供一种利用生物质竹子提取糖液生产γ-聚谷氨酸的工艺方法。以可大量再生资源 竹子为一种全新碳源运用于聚谷氨酸的工业化生产中，以此替代传统碳源，这不仅降低在聚谷氨酸生产过程中的成本，同时提供了一种竹子高值化的全新思路， 解决大量竹子废料以及其副产品堆积的问题，为当地政府与农民减轻环保压力。

本发明的技术解决方案是提供一种竹子糖液绿色生产γ-聚谷氨酸的工艺方法，包括以下步骤：

步骤一、竹粉制糖；

步骤1.1、碱法预处理竹粉；

步骤1.2、酶水解步骤1.1预处理后的竹粉：用有机酸溶液或气体二氧化碳中 和预处理后的竹粉，使pH呈弱酸性后在设定温度下糖化，每隔设定时间分别加入 纤维素酶、木聚糖酶以及木糖异构酶；过滤获得糖液；竹糖渣干燥，作为饲料载 体备用；

步骤1.3、将步骤1.2获得的糖液浓缩并干燥，获得固体竹糖；

步骤二、聚谷氨酸发酵；

步骤2.1、液体培养基调配：将固定比例的培养基原料加入到调配罐中后，加 热，使其溶解，搅拌混合均匀之后泵入发酵罐内；所述培养基原料包括固体竹糖、 有机氮源、谷氨酸钠、NH₄Cl、K₂HPO₄ ^.3H₂O和MgSO₄ ^.7H₂O；

步骤2.2、杀菌：在发酵罐内通入高压蒸汽灭菌；

步骤2.3、种子扩大培养：在生化实验室对菌种进行活化以及种子的一级扩大 培养；后续转入种子罐进行二级扩大培养，获得菌液；上述菌种为枯草芽孢杆菌 G-1；

步骤2.4、接种：按照计算的接种量向发酵罐中加入菌液；

步骤2.5、发酵：在发酵罐内发酵，通入无菌空气，获得发酵液；

步骤三、干燥成品；

步骤3.1、菌体离心：利用离心机，将菌体从发酵液中分离，然后低温干燥后 作为微生物饲料添加剂原料使用，与步骤1.2的饲料载体复配，生产混合型饲料添 加剂产品；

步骤3.2、有机溶剂沉淀：在混合罐中加入乙醇，与菌体分离后的发酵液充分 混合；

步骤3.3、成品离心：将与乙醇充分混合的发酵液离心，得到淡黄色黏性固体， 经冷冻干燥后获得γ-聚谷氨酸原料成品；离心液经乙醇回收工序回收乙醇后回用， 剩余的水通入厌氧消化系统进行回收处理。

进一步地，上述步骤1.1具体为：向竹粉中按固液比1:8加入质量分数为10％ NaOH溶液，混合完全后在搅拌作用下70℃预处理1d。

进一步地，上述步骤1.2中，所述有机酸为柠檬酸，柠檬酸溶液的浓度为0.1 mol/L；二氧化碳中和时，采用市售工业级或食品级液态二氧化碳通过常规设备通 入反应体系中；中和后的pH位于5.5-6.5之间；糖化温度为50℃；转速为150r/min， 每隔24h向糖化溶液中分别加入纤维素酶、木聚糖酶以及木糖异构酶，纤维素酶、 木聚糖酶以及木糖异构酶的添加量均为0.03g，按每公斤竹原料计，酶活均为10万u/g。

进一步地，较佳的，培养基原料中固体竹糖、有机氮源、谷氨酸钠、NH₄Cl、 K₂HPO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O的浓度分别为60-80g/L、6-8g/L，60-100g/L、3g/L、 2g/L、0.25g/L。

进一步地，从产率及经济角度考虑，培养基原料中固体竹糖、有机氮源、谷 氨酸钠、NH₄Cl、K₂HPO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O的浓度分别为：80g/L、8g/L，80g/L、 3g/L、2g/L、0.25g/L；

所述固体竹糖、有机氮源、谷氨酸钠、NH₄Cl、K₂HPO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O 质量比为：6641:53.13:531.3:19.92:13.28:1.70。

进一步地，步骤2.1加热温度为：70℃-90℃左右；步骤2.2在115℃下灭菌 30min。

进一步地，步骤2.4中接种量为2％。

进一步地，步骤2.5中发酵温度为37℃，pH为7.0～7.2，搅拌速度为120rpm， 发酵时间为48小时。

进一步地，步骤3.1及步骤3.3中离心条件均为8000r/min，20分钟。

进一步地，步骤3.2中加入3倍体积的乙醇；

为了对废液废渣进行回收再利用，步骤3.1中分离出的菌体经过高温灭菌后作 为菌体蛋白，磨粉后掺入动物饲料中；

本发明的有益效果是：

1、本发明将可大量再生资源竹子及其加工废弃物作为一种全新碳源运用于聚 谷氨酸的工业化生产中，以此替代传统碳源，这不仅降低了聚谷氨酸的生产成本， 同时也提供了一种竹子高值化的全新思路，解决大量竹子废料以及其副产品堆积 的问题，为当地政府与农民减轻环保压力。

2、本发明将竹糖作为碳源，其除了作为碳源，还可以促进了菌体生长以及聚 谷氨酸的产生，与其他传统的碳源相比，具有较高的聚谷氨酸发酵产量；

3、本发明通过在试验中加入木糖异构酶，显著提高γ-PGA产量；

4、本发明通过大量的实验，获得最优的培养基组分及发酵条件，试验结果表 明，碳源的种类、碳源的浓度、有机氮源的浓度以及前体谷氨酸钠的浓度都显著 影响聚谷氨酸发酵最终的浓度；正交试验的结果显示在竹糖浓度为80g/L，有机氮 源浓度为8g/L，谷氨酸钠浓度为80g/L的条件下发酵，得到γ-PGA产量为35.31g/L， 所得样品中γ-PGA的纯度为86.3％。

附图说明

图1为碳源种类对γ-PGA产量的影响示意图；

图2为葡萄糖浓度对γ-PGA产量的影响示意图；

图3为有机氮源浓度对γ-PGA产量的影响示意图；

图4为谷氨酸钠浓度对γ-PGA产量的影响示意图；

图5为谷氨酸钠标准曲线；

图6为γ-PGA的生产工艺流程图。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明作进一步的描述。

实施例一

本实施例提供后续实施例的基础实验方法，包括竹粉制糖及聚谷氨酸发酵的 方法。

1.1、竹粉制糖方法如下：

1.1.1、碱法预处理

称取10g干燥竹粉，加入80mL质量分数为10％的NaOH溶液，放入微波 炉中，处理条件：700W，6min。然后水浴摇床70℃，24h，120r/min。

1.1.2、酶水解

用0.1mol/L的柠檬酸溶液调节预处理后的竹粉，使pH为5.5-6.5之间，于50℃、150r/min糖化72h，每隔24h分别加入纤维素酶、木聚糖酶以及木糖异构酶，添加 量均为0.03g，按每公斤竹原料计。结束后进行DNS还原糖分析，通过DNS还原 糖分析，测得所制得的竹子糖液还原糖质量浓度含量在(16.48±3.8)g/L。其中各 物料的量在其他实施例中可等比例变化。

1.1.3、糖液浓缩

利用旋转蒸发仪将糖液浓缩，利于后续聚谷氨酸发酵。竹糖渣干燥，作为饲 料载体备用。

1.2、聚谷氨酸发酵方法如下：

培养基和培养条件：

(1)活化培养：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L， PH 7.0～7.2。121℃，灭菌20min。250ml锥形瓶装液量50ml，温度37℃，转速 150r/min，置于摇床上培养24h。

(2)发酵摇瓶培养：葡萄糖40g/L，酵母膏6g/L，谷氨酸钠30g/L，NH4Cl 3g/L，K2HPO4.3H2O 2g/L，MgSO4.7H2O 0.25g/L，PH 7.0～7.2，121℃，灭菌20min。 接种量1ml，250ml三角瓶装液量为50ml，转速150r/min，温度37℃，置于摇床上培养48h。

1.3、产物产率的测定方法如下：

γ-PGA采用称重法检测，取5mL发酵液8000r/min离心20min除去菌体， 取上清加入15mL乙醇沉淀，在8000r/min转速下离心20min，将沉淀置于40℃ 恒温干燥箱烘干后称重。

茚三酮比色法测纯度

γ-PGA是由单一的谷氨酸组成的，且一般不含游离的氨基酸。因此可以通过 测定γ-PGA的水解物-谷氨酸的含量来确定样品γ-PGA的纯度。

本次实验使用茚三酮比色法测定γ-PGA的纯度。在一定的pH条件下氨基酸 与茚三酮共热可生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸含量呈现一定的线性 关系，因此采用茚三酮比色法来测定谷氨酸的含量以确定γ-PGA的纯度是可行的。

具体实验操作如下：

⑴制备谷氨酸标准溶液：称取0.2000g干燥的谷氨酸，溶解后定容至100mL； 混匀后量取10mL，定容至100mL，即得200μg/m L的标准谷氨酸溶液。

⑵制备发酵样品溶液：取0.1gγ-PGA样品溶于10mL 6mol/L的HCl溶液中， 在110℃条件下水解24h，冷却后调PH至6.5，定容至100mL。充分混匀后取10mL， 再用50mL容量瓶定容至刻度，混匀后备用(相当于200μg/m L的样品溶液)。

⑶在50ml的容量瓶中分别加入0，1，2，3，4，5ml的谷氨酸钠标准溶液， 再使用蒸馏水补足至8ml，分别加入2ml茚三酮溶液和2ml磷酸盐缓冲液，晃动 试管充分混匀后，放入90℃的水浴锅加热20min，用流动水冷却，用蒸馏水定容 至50ml。静置15min后，以加入0ml谷氨酸钠标准溶液的为空白对照，使用分 光光度计测定在570nm处的吸光度。

实施例二

本实施例以碳源、氮源、谷氨酸钠为主要研究对象，进行单因素初步优化， 获得最优的培养基成分。

单因素试验方法：一共进行四组单因素实验。固定其他培养基组分，分别改 变碳源种类(竹糖，葡萄糖，蔗糖，柠檬酸可溶性淀粉)、碳源浓度(葡萄糖添加 量0g/L，20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L)、有机氮源浓度(酵母膏添加量 0g/L，2g/L，4g/L，6g/L，8g/L，10g/L以及谷氨酸钠浓度(谷氨酸钠添加量0g/L， 20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L)。每组实验进行三次重复。

2.1、不同碳源对γ-PGA产率的影响

分别使用添加量均为2％的竹糖，葡萄糖，蔗糖，柠檬酸，可溶性淀粉为碳源， 固定实施例一中培养基其他组分进行试验。

从图1中可以看出，在同样的添加量下，利用不同的碳源发酵，其γ-PGA产 量有明显区别。相比其他传统的碳源，利用竹糖发酵所得的聚谷氨酸产量最高， 为27.62g/L。这说明竹糖中可能含有除了碳源外，其他再菌体生长中所需的微量 元素和生长因子。这些微量元素和生长因子可能促进了菌体生长以及聚谷氨酸的 产生。初步认为，使用竹糖代替传统碳源不仅是可行的，同时也增加聚谷氨酸的 产量。

2.2、碳源浓度对γ-PGA产率的影响

依次添加葡萄糖浓度分别为：0g/L，20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L， 固定培养基其他组分及基体条件进行试验，结果如图2所示，由图2可以看出， 在一定的浓度范围内，葡萄糖浓度的增加能够促进γ-PGA的生成，但是当浓度超 过这个范围则会抑制其产量的增加，当葡萄糖的浓度超过60g/L，γ-PGA的产量增 加开始变缓慢。当葡萄糖的浓度为80g/L的时候，γ-PGA产量达到最大为19.51g/L； 当葡萄糖的浓度为100g/L的时候，γ-PGA产量下降至16.71g/L。因此初步可以认 为在碳源浓度为80g/L的时候有最大γ-PGA产量，初步选用80g/L为初步的最佳 碳源添加量。

2.3、有机氮源浓度对γ-PGA产率的影响

有机氮源中不仅含有许多的蛋白质、多肽和游离的氨基酸，而且还有糖类、 无机盐、脂肪、维生素及部分生长因子。单一的无机氮源通常不能合成较高产量 的γ-PGA。

因此本实施例在以无机氮源NH₄Cl 3g/L的基础上，其他培养基条件不变的条 件下改变酵母膏浓度进行单因素实验，酵母膏取量依次为：0g/L，2g/L，4g/L，6g/L， 8g/L，10g/L。经过实验得出结果如图3所示。从图3中可以看出，随着培养基中 加有机氮源的量的增加，γ-PGA产量也在不断增加，但达到一定的量后，γ-PGA 的产量反而随着有机氮源的增加而降低。在酵母膏的浓度为6g/L的时候，γ-PGA 产量达到最高；酵母膏的浓度超过6g/L后，γ-PGA产量下降并有趋于平衡的趋势。 因此，初步选择6g/L的酵母膏作为发酵培养基的有机氮源。

2.4、前体物谷氨酸钠浓度对γ-PGA产率的影响

γ-PGA是由微生物通过谷氨酸聚合酶合成的，谷氨酸是其合成的前提物质。 细胞内谷氨酸的合成途径主要有三种：α-酮戊二酸通过转氨酶与谷氨酰胺合成谷氨 酸；α-酮戊二酸通过谷氨酸水解酶与氨生产谷氨酸；α-酮戊二酸利用转氨酶与丙氨 酸合成D-谷氨酸。胞外氨基酸可以生成谷氨酰胺，通过转氨作用与α-酮戊二酸合 成细胞内谷氨酸；也可以分解成氨供菌体合成代谢，最终生成谷氨酸。所以添加 的谷氨酸钠非常重要，因为它既可能作为一种氮源被菌体利用，也可能是γ-PGA 的前体物质。

本实施例通过改变谷氨酸钠的浓度来研究其对γ-PGA产量的影响，结果如图 4所示。发现培养基中未加谷氨酸钠时，γ-PGA产量很低，仅为2.94g/L。但随着 加入谷氨酸钠量的增加，γ-PGA产量逐渐提高。说明该枯草芽孢杆菌自身合成谷 氨酸的能力并不强，产生不了太多的谷氨酸用于γ-PGA的合成。当谷氨酸钠的浓 度达到60g/L的时候，γ-PGA产量的增加开始变缓，在谷氨酸钠的浓度为100g/L 时，有最大γ-PGA产量，为29.27g/L。出于经济的角度，初步选择谷氨酸钠浓度 80g/L为最佳。

通过本实施例可以得出：较优的培养基组分为：竹糖60-80g/L、有机氮源6-8 g/L、谷氨酸钠60-100g/L，NH₄Cl 3g/L、K₂HPO₄ ^.3H₂O2g/L、MgSO₄ ^.7H₂O0.25 g/L； 最佳的培养基组分为：竹糖80g/L、有机氮源6g/L，谷氨酸钠80g/L、NH₄Cl 3g/L、 K₂HPO₄ ^.3H₂O 2g/L、MgSO₄ ^.7H₂O 0.25g/L。

实施例三

本实施例通过单因素试验选择的合适因素与水平进行了L₉(3⁴)的正交试验设 计，确定了最优的发酵工艺条件。正交试验因素水平设置如表1所示，其正交试 验结果如表2所示。

表1因素水平安排表

表2正交试验结果表

由表2可以看出，各因素对聚谷氨酸发酵生产影响的主次关系依次为：D＞A ＞B＞C，即谷氨酸钠浓度＞碳源种类＞碳源浓度＞有机氮源浓度。由正交试验得 出最优方案为：A₁B₃C₃D₃。因此可以认为聚谷氨酸发酵的最佳碳源种类为竹糖， 碳源浓度80g/L，有机氮源浓度8g/L，谷氨酸钠浓度80g/L，NH₄Cl，K₂HPO₄ ^.3H₂O 和MgSO₄ ^.7H₂O适量。

再次验证并重复正交试验所得的最优方案，结果如下表3。

表3最优方案验证结果

由结果可知，在最佳的方案条件下聚谷氨酸的产量平均可以达到35.31g/L。

通过茚三酮比色法测纯度

表4茚三酮比色法结果

根据表4的数据，可以做出谷氨酸标准曲线如下图5。求得待测样品的平均光 密度为0.782，依据所求得的标准曲线计算出发酵水解样品中谷氨酸的量约等于 690.7μg，所以谷氨酸的含量为(690.7/800)×100％＝86.3％，即发酵所得样品中 γ-PGA的纯度为86.3％。符合工艺生产的要求。

通过本实施例确定的最佳聚谷氨酸发酵生产工艺方案，培养基组分：竹糖80 g/L，有机氮源浓度8g/L，谷氨酸钠浓度80g/L，NH4Cl 3g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L， MgSO₄·7H₂O0.25g/L。接种量为2％，培养条件为pH 7.0～7.2，温度37℃，培养 48h。同时，利用茚三酮与氨基酸共热可生成蓝紫色化合物的性质，本文通过茚三 酮比色法间接测定发酵所得得聚谷氨酸的纯度，测得得聚谷氨酸纯度为86.3％，符 合工厂生产的要求。

实施例四

本实施例在实施例三优化结果的基础上确定生产工艺流程，以年产量90t为 目标进行计算，考虑到节假日休息等，全年生产时间定为300d。计划每日生产量 ＝年产量/全年生产天数＝90t/300＝0.3t＝300kg。

由于设备生产能力有限，为高效利用生产设备，降低产品的生产成本进而提 高利润率，采用两班制，每班工作12h，产品成品率按98％计，因此：

实际每班生产量＝计划每班生产量/成品率＝150kg/98％＝153.10kg。

具体流程如图6所示，主要包括以下过程：

4.1、竹粉制糖阶段

碱法预处理：按固液比1:8向竹粉中加入质量分数为10％NaOH溶液，混合 完全后在搅拌作用下70℃预处理1d。

中和：采用柠檬酸溶液中和至PH为5.3～5.5，充分搅拌。

加酶：中和后，分别加入纤维素酶、木聚糖酶以及木糖异构酶在50℃、搅拌 作用下进行酶解。酶解共3d，即72h，为保持酶解过程中酶的活力，每24h补充 一次等量的酶。

过滤：所得滤液以无肉眼可见固形物为宜。滤液即为竹子糖液。

喷雾干燥：竹子糖液进行喷雾干燥，得到固体竹糖。

4.2、发酵阶段

液体培养基调配：按照实施例三获得的最佳培养基组分配比配置培养基，并 加入到调配罐中后，适当加热，使其溶解，搅拌混合均匀后泵入发酵罐。

杀菌：在发酵罐内通入高压蒸汽在115℃下，灭菌30min。

种子扩大培养：在生化实验室对菌种即枯草芽孢杆菌G-1进行活化以及种子 的一级扩大培养。后续转入种子罐进行二级扩大培养。

接种：依照工艺条件计算，按照发酵液中接种量为2％的比例加入种子罐的菌 液。

发酵：在发酵罐内，37℃，120rpm搅拌发酵2天，通入无菌空气。

4.3、干燥成品阶段

菌体离心：利用高速离心机，将菌体与液体分离，离心条件：8000r/min，20 分钟。

有机溶剂沉淀：在混合罐中加入3倍体积的乙醇，与菌体离心后的液体充分 混合。

成品离心：将与乙醇充分混合的液体离心，得到淡黄色黏性固体。使用高速 离心机，离心条件：8000r/min，20分钟。

实施例五

本实施例对整个工艺过程中的物料进行衡算。

5.1、竹粉制糖阶段物料衡算

5.1.1、竹粉用量

由实验可知每10g竹粉平均可得到2g竹糖；又根据平均30g/L的产量计算， 每2g竹糖可得1.5g成品(乙醇沉淀后)；设计成品在干燥过筛过程中损失率均为 2％，则可计算出加入乙醇沉淀后可得到162.71kg的聚谷氨酸。

因此：m竹粉＝(162.71×1000/0.75)×5＝1084.73kg

5.1.2、碱液用量

依据设定预处理工艺条件固液比1:8计算，则所用碱液质量为：

m碱液＝1084.73×8＝8677.84kg；

因此，V碱液＝m/ρ＝8677.84/1100＝7889L＝7.9m³。

所以，碱(NaOH)的用量为：m碱＝8677.84×10％＝867.78kg；

去离子水的用量：m水＝8677.84×90％＝7810.1kg；V水＝8677.84/1000＝7.8m³；

5.1.3、中和所用柠檬酸用量

由实验经验总结，中和10g竹粉预处理液平均需要215g一水柠檬酸，50ml 去离子水。根据比例可以计算得：一水柠檬酸的用量为：

m柠檬酸＝(1084.73×1000/10)×215＝23321.7kg；

去离子水的用量：V水＝(1084.73×1000/10)×50＝5423.7L＝5.42m³

5.1.4、使用酶量

根据工艺要求，一共需要加入三种酶，实验中采用酶活为10万u/g的纤维素 酶、木聚糖酶以及木糖异构酶。根据实验结果显示，每10g竹粉三种酶分别加入 0.09g。因此，m纤维素酶＝m木聚糖酶＝m木糖异构酶＝(1084.73×1000/10)×0.09＝ 9.76kg。

5.1.5、过滤前后所得竹子糖液量

由于竹粉吸水等原因，10g竹粉经预处理、中和以及酶解后最终平均可得约 为60mL提取液，以此为依据计算所得竹子糖液量，则过滤后所得竹子糖液量为：

V竹子糖液(过滤后)＝(1084.73×1000/10)×60＝6508.4L＝6.51m³

由于竹子糖液以水为主，因而近似将水的密度作为竹子糖液的密度进行计算：

m竹子糖液＝V竹子糖液×ρ竹子糖液＝6.51×1000＝6510kg。

设计过滤过程滤液体积损失2％，因此：V竹子糖液(过滤前)＝6641.2L＝6.64 m³。

5.2、发酵以及成品阶段物料衡算

5.2.1、发酵液量

由上述已知，每班要生产153.10kg的成品，即在加入乙醇沉淀后应得到162.71 kg的聚谷氨酸。设计成品在离心过程中损失率为2％，因此发酵后应得到166.03kg 的聚谷氨酸。因此发酵液的体积为：V发酵液＝166.03/35＝4743.71L＝4.74m³

5.2.2、有机氮源用量

根据优化所得最佳工艺，使用的有机氮源浓度为8g/L。因此有机氮源用量为： m有机氮源＝6641.2L×8＝53.13kg。

5.2.3、谷氨酸钠用量

根据优化所得最佳工艺，使用的谷氨酸钠浓度为80g/L。因此谷氨酸钠用量为： m有机氮源＝6641.2L×80＝531.30kg。

5.2.4、其他物料用量

根据实验总结，其余物料浓度为NH₄Cl 3g/L，K₂HPO₄ ^.3H₂O 2g/L，MgSO₄ ^.7H₂O 0.25g/L；中和50ml发酵液平均使用0.02g HCL。

因此NH₄Cl用量为：mNH₄Cl＝6641.2L×3＝19.92kg；

K₂HPO₄ ^.3H₂O用量为：mK₂HPO₄ ^.3H₂O＝6641.2L×2＝13.28kg；

MgSO₄ ^.7H₂O用量为：mMgSO₄ ^.7H₂O＝6641.2L×0.25＝1.70kg；

HCL用量为：mHCL＝(6641.2/0.05)×0.02＝2.66kg

5.2.5、水的用量

依照工艺条件计算，50ml发酵液中水的质量分数为82.6％。

因此水的用量为：m水＝(6641.2/0.05)×0.826＝109.71kg

V水＝109.71/1000＝0.11m³；

5.2.6、接种菌液用量

依照工艺条件计算，50ml发酵液中接种量为2％，即50ml发酵液中接种1ml 菌液。因此接种菌液的用量为：V接种菌液＝6641.2×2％＝133L＝0.13m³

5.2.7、乙醇用量

依照工艺条件计算，所加入乙醇的体积是发酵液的3倍。因此，V乙醇＝6641.2 ×3＝19923.6L＝19.92m³

5.2.8物料衡算汇总表

表5物料衡算汇总表

实施例六

本实施例主要介绍生产聚谷氨酸的过程中对废液及废渣的处理。

废液处理

由于在生产聚谷氨酸的过程中，主要是成品离心过程中产生废弃发酵液。污 水的主要污染物是有机物，其中的有机污染物主要是乙醇和糖；同时污水的水质 波动较大，生产中废液直接排放将对环境造成巨大污染。

由于废液中含有较多的乙醇，因此选择蒸馏的方法对废液中的乙醇进行回收， 再将蒸馏后的废液利用生物法处理。一般需预先调整其营养成分及酸碱度，以适 应微生物的生长需求。国外多以活性污泥法处理为主，本实施例采用厌氧消化系 统处理污水，整个流程包括一个粗滤系统(去泥土、沙子等物)、两个缓冲池(调节pH及氮、磷等营养物)、一个UASB和一个好氧池组成。UASB反应器的有机 负荷为10-17kgCOD/(m³·d),COD去除率达80％-900％。

污水处理站的平面布置原则：

(1)水处理站应远离生产主要车间，处于夏季时主导风向下方；

(2)利用地形，尽可能使废水和污泥自流，避免重复提升，节约劳动力。

(3)布置应紧凑，可选用方形构筑物，利用公共墙壁以减少占地；

(4)按流程顺序布置，避免管线迂回，并应设置超越管道。

废渣处理

在聚谷氨酸生产过程中产生的废物主要是菌体，未酶解的竹纤维，都需要进 行相应处理。其中菌体经过高温灭菌后可以作为菌体蛋白，磨粉后掺入动物饲料 中；未酶解的竹纤维可以按比例掺入新的一轮竹粉原料，再次进行预处理酶解， 不仅使得到的糖液还原糖量得到提升，还可以循环利用物料，减少对环境的污染。

实施例七

本实施例对本发明的技术经济进行分析。

7.1、水电成本核算

7.1.1、用水估算

每班工艺用水量为：水＝7810.1+5420+109.71＝13339.81kg，其他用水按1t计算，则：每班用水量为：13339.81+1000＝14339.81kg＝14.4t，所以年用水量为： 14.4×2×300＝8640t。

每吨水2元，则年水费为1万7280元。

7.1.2用电估算

表6主要设备用电情况表

每班用电量为：5×(2+1+2+1)+7.5×2+(3×12+2)×(15+10+9+9+10+3)×1×8＝1968kw·h因此年用电量为：1968×2×300＝1180800kw·h。电价为0.75元/千瓦 时，因此年电费为53万1360元。

7.2、成本核算

7.2.1、原料

新鲜优质竹粉批发价约3元每公斤，每天需要1084.73kg，成本是3254元/天， 每年竹粉的成本是97.62万元/年。

7.2.2、辅料

表7辅料成本表

7.2.3、劳动成本

人均年薪8万元，车间员工20人，维修人员、管理人员和采购人员共5人， 总共25人。每年的劳动成本是200万元。

表8产品直接成本一览表

7.3、投资估算及经济效益分析

表9全厂总投资估算

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表10资金来源

7.4、产品销售额核算

聚谷氨酸价格：1000元/kg，则年销售额为：90t×1000＝9000万元

7.5、年利润

(1)年毛利润＝销售额-成本＝9000-5070＝3930万元

(2)净利润

销售费用：按销售额的1％计算，则销售费用是3930×1％＝39.3万元；

商检费用：按销售额的0.5％计算，则商检费用为3930×0.5％＝19.65万元；

财务费用：共300万元的贷款额度，按照5.8％年息计算，则贷款费用是 300×5.8％＝17.4万元；

管理费用：按照每年50万元来计算管理费用；

税收：占销售额的10％，则年税收为3930×10％＝393万元；

因此每年净利润为3930-(39.3+19.65+17.4+50+393)＝3410万元，生产运营回 本时间(5070+700)/3410＝1.7年。

Claims (8)

1.一种竹子糖液绿色生产γ-聚谷氨酸的工艺方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、竹粉制糖；

步骤1.1、碱法预处理竹粉；向竹粉中按固液比1:8加入质量分数为10％的NaOH溶液，混合完全后在搅拌作用下70℃预处理24h；

步骤1.2、酶水解步骤1.1预处理后的竹粉：用有机酸溶液或气体二氧化碳中和预处理后的竹粉，使pH呈弱酸性后在设定温度下糖化，每隔设定时间分别加入纤维素酶、木聚糖酶以及木糖异构酶；过滤获得糖液；竹糖渣干燥，作为微生物饲料载体备用；

步骤1.3、将步骤1.2获得的糖液浓缩并干燥，获得固体竹糖；

步骤二、聚谷氨酸发酵；

步骤2.1、液体培养基调配：将固定比例的培养基原料加入到调配罐中后，加热，使其溶解，搅拌混合均匀之后泵入发酵罐内；所述培养基原料包括固体竹糖、有机氮源、谷氨酸钠、NH₄Cl、K₂HPO₄ ^.3H₂O和MgSO₄ ^.7H₂O；培养基原料中固体竹糖、有机氮源、谷氨酸钠、NH₄Cl、K₂HPO₄ ^.3H₂O、MgSO₄ ^.7H₂O的浓度分别为60-80g/L、6-8g/L，60-100g/L、3g/L、2g/L、0.25g/L；

步骤2.2、杀菌：在发酵罐内通入高压蒸汽灭菌；

步骤2.3、种子扩大培养：在生化实验室对菌种进行活化以及种子的一级扩大培养；后续转入种子罐进行二级扩大培养，获得菌液；所述菌种为枯草芽孢杆菌G-1；

步骤2.4、接种：按照计算的接种量向发酵罐中加入菌液；

步骤2.5、发酵：在发酵罐内发酵，通入无菌空气，获得发酵液；

步骤三、干燥成品；

步骤3.1、菌体离心：利用离心机，将菌体从发酵液中分离，然后低温干燥后作为微生物饲料添加剂原料使用；将分离菌体的发酵液加入混合罐中；

步骤3.2、有机溶剂沉淀：在混合罐中加入乙醇，与菌体分离后的发酵液充分混合；

步骤3.3、成品离心：将与乙醇充分混合的发酵液离心，得到淡黄色黏性固体，经冷冻干燥后获得γ-聚谷氨酸原料成品；离心液经乙醇回收工序回收乙醇后回用，剩余的水通入厌氧消化系统进行回收处理。

2.根据权利要求1所述的竹子糖液绿色生产γ-聚谷氨酸的工艺方法，其特征在于：步骤1.2中，所述有机酸为柠檬酸，柠檬酸溶液的浓度为0.1mol/L；二氧化碳中和时，采用市售工业级或食品级液态二氧化碳通过常规设备通入反应体系中；中和后的pH位于5.5-6.5之间；糖化温度为50℃；转速为150r/min，每隔24h向糖化溶液中分别加入纤维素酶、木聚糖酶以及木糖异构酶，纤维素酶、木聚糖酶以及木糖异构酶的添加量均为0.03g，按每公斤竹原料计，酶活均为10万u/g。

3.根据权利要求2所述的竹子糖液绿色生产γ-聚谷氨酸的工艺方法，其特征在于：培养基原料中固体竹糖、有机氮源、谷氨酸钠、NH₄Cl、K₂HPO₄ ^.3H₂O、MgSO₄ ^.7H₂O的浓度分别为：80g/L、8g/L，80g/L、3g/L、2g/L、0.25g/L；

所述固体竹糖、有机氮源、谷氨酸钠、NH₄Cl、K₂HPO₄ ^.3H₂O、MgSO₄ ^.7H₂O质量比为：6641:53.13:531.3:19.92:13.28:1.70。

4.根据权利要求3所述的竹子糖液绿色生产γ-聚谷氨酸的工艺方法，其特征在于：步骤2.1加热温度为70℃-90℃；步骤2.2在115℃下灭菌30min。

5.根据权利要求4所述的竹子糖液绿色生产γ-聚谷氨酸的工艺方法，其特征在于：步骤2.4中接种量为2％。

6.根据权利要求5所述的竹子糖液绿色生产γ-聚谷氨酸的工艺方法，其特征在于：步骤2.5中发酵温度为37℃，pH为7.0～7.2，搅拌速度为120rpm，发酵时间为48小时。

7.根据权利要求6所述的竹子糖液绿色生产γ-聚谷氨酸的工艺方法，其特征在于：步骤3.1及步骤3.3中离心条件均为8000r/min，20分钟。

8.根据权利要求7所述的竹子糖液绿色生产γ-聚谷氨酸的工艺方法，其特征在于：步骤3.2中加入3倍体积的乙醇；

步骤3.1中分离出的菌体经过高温灭菌后作为菌体蛋白，磨粉后掺入动物饲料中。

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