CN102994588B - 一种细菌纤维素连续增厚的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，在细菌纤维素静置培养过程中，通过调节培养容器的密闭空间和透氧材料下方的空气压力与氧气体积浓度，并在所述密闭空间的内部上方均匀喷淋发酵培养液，实现细菌纤维素厚度的连续增长，明显提高纤维素的产率，制备过程简便，绿色环保，并能够降低规模化生产时的成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌纤维素的培养方法，特别是涉及一种细菌纤维素连续增厚的培养方法。
背景技术
对于纤维素生物合成的研究有着诸多报道，其中通过革兰氏阴性，原核细胞类的木醋杆菌生物合成得到的纤维素具有产率高、纯度高的优点而被选为细菌纤维素发酵培养的模板菌种。木醋杆菌生物合成纤维素的过程可以分为细胞内小分子聚合形成β-1,4-葡萄糖大分子链与细胞外微纤丝逐步、层次化“自组装”形成纤维素network网状结构两个过程。细菌纤维素独特的生物合成过程使其在内部结构上具有“层次化”的特点：首先，纤维素丝束（断面直径600nm～1μm）中的晶区微纤丝（断面直径7nm）之间的缝隙相当于一根根极细的毛细管，能够源源不断地将亲水小分子吸入细菌纤维素内部，在晶区之间形成无定型区。这赋予了细菌纤维素超强的吸湿能力，能够吸收自重700倍甚至更多的水分；其次，由刚性的β-1,4-葡萄糖大分子链通过分子内与分子间氢键结晶形成的微纤丝使细菌纤维素具有良好的力学强度。通过碱液与丝束内部无定型区的水在高浓度向低浓度渗透作用下，使微纤丝分子内分子间氢键的重排，再经过热压干燥处理，使得丝束内部的晶区增大，微纤丝之间氢键结合位点明显增加，能够大大提高BC薄膜的力学强度，杨氏模量最高可达15GPa；第三，木醋杆菌具有极强的氧气依赖特性，纤维素network结构形成于氧气与培养液气液两相界面处。利用这种生物特性，能够通过静置培养得到一系列不同形状的细菌纤维素材料。这三大结构上的特征，使细菌纤维素能够作为基材制成伤口敷料、造纸、声学振膜、透明材料等产品，在生物医学、食品、半导体、日用品等多个领域获得广泛的应用。
但是，细菌纤维素在静置培养阶段的产率较低，规模化制备成本高昂是目前细菌纤维素产业化面临的主要瓶颈。关于提高细菌纤维素产量的研究，至今已取得了许多成果。日本科学家提出“两步法”高效制备椰果产品：通过前期动态培养，使细菌细胞体积浓度在短时间内上升两个数量级，随后将高密度的菌液转接入浅盘进行静置培养，大大缩短了培养周期，同时得到的椰果果片表面平整，脱水收缩的现象也大有改善。研究人员受此启发，设计了例如气升式、转鼓式、转盘式等一系列动态培养装置来培养细菌纤维素。据文献报道，现有细菌纤维素动态培养得到的产量能够达到12.6g/7天。动态培养的方式在产量上能够弥补静态培养的不足，但是所得到的细菌纤维素外形多为絮状、团簇状、球形、星形等形状，直接利用价值较低。此外，通过转盘式发酵罐得到的细菌纤维素均质性（Homogeneity）较差，培养后期随着细菌纤维素膜厚度增加，会从转盘上脱落，培养液中的丝絮状纤维素会缠绕在转动轴上，使机器无法转动。
从根本上说，“两步法”依然属于静态培养范畴，提高的只是单批次细菌纤维素膜的产量，批次与批次之间存在着较长的“零产量”时间（也称为“Dead time”）。由于发酵培养液上方空气对于细菌纤维素内部network结构的扩散作用，使得细菌纤维素内部存在着有氧区（aerobiczone），该区域很小，厚度不超过1mm，但是80%的纤维素是由处于有氧区内部的细菌所生物合成的。细菌纤维素膜下方的培养液在“毛细作用”趋势，不断被吸入细菌纤维素内部，形成“碳源区”。“有氧区”与“碳源区”产生重叠，则细菌纤维素得以连续形成。随着细菌纤维素膜的厚度增加，下方培养液不足以向上渗透至靠近上表面的“有氧区”，宏观上体现为纤维素产量逐渐下降并最终停止生长。因此，如何有效的延长“有氧区”与“碳源区”产生重叠的时间，是细菌纤维素连续生产的关键。本发明通过调节与细菌纤维素上表面和下表面相接触的空气压力与氧气体积浓度，同时在培养过程中向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液，在细菌纤维素的上表面和下表面分别形成“有氧区”与“碳源区”的重叠，并延长有效重叠的时间，实现了细菌纤维素连续增厚培养。
发明内容
本发明涉及一种细菌纤维素连续增厚的培养方法。在现有技术的基础上，通过增加与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力，增强气体对细菌纤维素膜的扩散作用，使细菌纤维素内部靠近上表面的有氧区增大；同时在容器底部采用透氧材料向细菌纤维素下表面进行供氧，氧气渗透通过透氧材料与细菌纤维素下表面相接触并产生扩散，使细菌纤维素下表面也存在“有氧区”。本发明通过双面供氧的方式，将细菌纤维素内部“有氧区”提高至现有公开技术的两倍以上，能够明显提高纤维素的产率。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，所述的细菌纤维素是由木醋杆菌在静置培养条件下，与细胞内通过在酶的催化作用下，将小分子葡萄糖以β-1,4-糖苷键相互键合，聚合形成β-1,4-葡萄糖大分子链，由细胞体侧面的“终端合成物（Terminal complex）”挤出细胞体外。β-1,4-葡萄糖大分子链在分子内与分子间氢键作用下，聚集并结晶形成纤维素微纤丝（纤维素微晶，断面直径约7nm），微纤丝进一步形成丝带（Ribbon，断面直径约125nm）、丝束（Bundle，断面直径约600nm～1μm）。在细菌细胞无规则折线形运动与细胞分裂两种现象同时存在的情况下，纤维素丝束交织形成纤维素network网状结构，最终形成细菌纤维素。
本发明还提供一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，包括以下步骤：
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2～5，蛋白胨0.05~0.5，酵母膏0.05~0.5，柠檬酸0.01~0.1，磷酸氢二钠0.02~0.2，磷酸二氢钾0.01~0.1，余量为水；
发酵培养液的pH为4.0～6.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×105～2×107个/ml。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，液面高度不宜超过5cm，放置于恒温培养环境内，28～32℃静置培养；
通过在培养过程中调节与细菌纤维素上表面相接触的空气压力与氧气体积浓度以及与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力与氧气体积浓度，结合在静置培养过程中向细菌纤维素上表面均匀喷淋调配好的发酵培养液来实现细菌纤维素的厚度连续增长；
所述的连续增长分为三个阶段：
a.细菌纤维素生长诱导期
控制与细菌纤维素上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力在上限不超过1.1个标准大气压，下限高于1个标准大气压范围内，同时保持空气流通，直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽，培养液上表面与透氧材料上表面均出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速增长期
控制与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为10～15%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力在上限不超过1.2个标准大气压，下限高于1个标准大气压范围内，氧气体积浓度为10～15%。直至培养液上表面与透氧材料上表面的细菌纤维素薄膜厚度达到0.5～1.5mm；
c.细菌纤维素平稳增长期
平稳生长期分为两个阶段：
第一阶段：维持与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触空气压力在上限不超过1.2个标准大气压下限高于1个标准大气压范围内，氧气体积浓度为10～15%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力在上限不超过1.2个标准大气压，下限高于1个标准大气压范围内，氧气体积浓度为10～15%，直至静置培养阶段容器内的培养液收干；
第二阶段：同时打开所有喷淋器，向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液；每个喷淋器每分钟喷淋培养液体积控制在1～10mL范围内；
喷淋培养液的程度需进行控制：喷淋每5～10分钟暂停一次，暂停时间为5～10分钟。
控制与容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力上限不超过1.2个标准大气压，下限高于1个标准大气压范围内，氧气体积浓度为10～15%。保持细菌纤维素厚度增长速率稳定在2±0.5mm/12h；
细菌纤维素厚度增长速率下降并稳定在1±0.5mm/12h时，停止向容器底部透氧材料的供氧。同时保持向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液为每5～10分钟暂停一次，暂停时间为5～10分钟；加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力至上限不超过1.5个标准大气压，下限高于1.2个标准大气压的范围内；当细菌纤维素厚度增长速率上升并稳定在2±0.5mm/12h，直至细菌纤维素厚度达到要求时，停止培养，将其取出；
所述的加压是指在30分钟内将容器内压力提升至上限不超过1.5个标准大气压，下限高于1.2个标准大气压范围内；
4）后处理
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1～10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2～10小时，用纯净水清洗至pH为7.0。
如上所述的一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，其特征在于，所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述培养基置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。
如上所述的一种三明治结构的细菌纤维素液体吸收性材料的制备方法，其特征在于，所述的通纯氧是指将医用氧以1L/min的速度通入上述的培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4℃下试管中的菌种，并转移至上述的发酵培养基中；所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养基于28～32℃下摇床培养8～24小时。
有益效果：
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）利用透氧材料对培养容器底部的细菌纤维素下表面进行供氧，使静置培养过程中，细菌纤维素内部靠近上表面处与内部靠近下表面处均存在“有氧区”。
（2）通过增加与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力以及增加与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力增强氧气对于细菌纤维素膜上下表面的扩散作用，使“有氧区”扩大。（1）与（2）相结合，能够明显提高静置培养过程中，细菌纤维素的产率。
（3）通过由上往下喷淋发酵培养液，能够使靠近细菌纤维素上表面的“有氧区”始终保持与碳源相接触，实现细菌纤维素厚度的连续增加。避免了传统静置培养过程中，随着细菌纤维素膜厚度增加，下方培养液无法渗透至细菌纤维素膜上表面附近的“有氧区”，导致纤维素产率下降并最终停止生长。
（4）本发明制备过程简便，绿色环保，在规模化生产细菌纤维素时，能够大大减少培养批次之间细菌纤维素膜收集、培养容器消毒、重新洒盘培养等准备时间，降低生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨0.05，酵母膏0.05，柠檬酸0.01，磷酸氢二钠0.02，磷酸二氢钾0.01，余量为水；
发酵培养液的pH为4.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×105个/ml。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，液面高度不宜超过5cm，放置于恒温培养环境内，28℃静置培养。
通过在培养过程中调节与细菌纤维素上表面相接触的空气压力与氧气体积浓度以及与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力与氧气体积浓度，结合在静置培养过程中向细菌纤维素上表面均匀喷淋调配好的发酵培养液来实现细菌纤维素的厚度连续增长。
所述的连续增长分为三个阶段：
a.细菌纤维素生长诱导期
控制与细菌纤维素上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时保持空气流通，直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽，培养液上表面与透氧材料上表面均出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速增长期
控制与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为10%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为10%。直至培养液上表面与透氧材料上表面的细菌纤维素薄膜厚度达到0.5mm；
c.细菌纤维素平稳增长期
平稳生长期分为两个阶段：
第一阶段：维持与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为10%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为10%，直至静置培养阶段容器内的培养液收干；
第二阶段：同时打开6个喷淋器，向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液。每个喷淋器每分钟喷淋培养液体积控制在10mL。
喷淋培养液的程度需进行控制：喷淋每5分钟暂停一次，暂停时间为5分钟。
控制与容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为10%。保持细菌纤维素厚度增长速率稳定在1.5mm/12h。
细菌纤维素厚度增长速率下降并稳定在0.5mm/12h时，停止向容器底部透氧材料的供氧。同时保持向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液为每5分钟暂停一次，暂停时间为5分钟。加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力至1.2个标准大气压。当细菌纤维素厚度增长速率上升并稳定在1.5mm/12h。直至细菌纤维素厚度达到要求时，停止培养，将其取出。
所述的加压是指在30分钟内将容器内压力提升至1.2个标准大气压。
4）后处理
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0。
实施例2
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，余量为水；
发酵培养液的pH为6.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/ml。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，液面高度不宜超过5cm，放置于恒温培养环境内，32℃静置培养。
通过在培养过程中调节与细菌纤维素上表面相接触的空气压力与氧气体积浓度以及与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力与氧气体积浓度，结合在静置培养过程中向细菌纤维素上表面均匀喷淋调配好的发酵培养液来实现细菌纤维素的厚度连续增长。
所述的连续增长分为三个阶段：
a.细菌纤维素生长诱导期
控制与细菌纤维素上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，同时保持空气流通，直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽，培养液上表面与透氧材料上表面均出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速增长期
控制与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为15%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.2个标准大气压，氧气体积浓度为15%。直至培养液上表面与透氧材料上表面的细菌纤维素薄膜厚度达到1.5mm；
c.细菌纤维素平稳增长期
平稳生长期分为两个阶段：
第一阶段：维持与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触空气压力为1.2个标准大气压，氧气体积浓度为15%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.2个标准大气压，氧气体积浓度为15%，直至静置培养阶段容器内的培养液收干；
第二阶段：同时打开12个喷淋器，向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液。每个喷淋器每分钟喷淋培养液体积控制在1mL。
喷淋培养液的程度需进行控制：喷淋每10分钟暂停一次，暂停时间为10分钟。
控制与容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.2个标准大气压，氧气体积浓度为15%。保持细菌纤维素厚度增长速率稳定在2.5mm/12h。
细菌纤维素厚度增长速率下降并稳定在1.5mm/12h时，停止向容器底部透氧材料的供氧。同时保持向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液为每10分钟暂停一次，暂停时间为10分钟。加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力至1.5个标准大气压。当细菌纤维素厚度增长速率上升并稳定在2.5mm/12h，直至细菌纤维素厚度达到要求时，停止培养，将其取出。
所述的加压是指在30分钟内将容器内压力提升至1.5个标准大气压。
4）后处理
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7.0。
实施例3
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，余量为水；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/ml。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，28℃静置培养。
通过在培养过程中调节与细菌纤维素上表面相接触的空气压力与氧气体积浓度以及与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力与氧气体积浓度，结合在静置培养过程中向细菌纤维素上表面均匀喷淋调配好的发酵培养液来实现细菌纤维素的厚度连续增长。
所述的连续增长分为三个阶段：
a.细菌纤维素生长诱导期
控制与细菌纤维素上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，同时保持空气流通，直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽，培养液上表面与透氧材料上表面均出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速增长期
控制与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为10%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为10%。直至培养液上表面与透氧材料上表面的细菌纤维素薄膜厚度达到1mm；
c.细菌纤维素平稳增长期
平稳生长期分为两个阶段：
第一阶段：维持与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为10%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为10%，直至静置培养阶段容器内的培养液收干；
第二阶段：同时打开8个喷淋器，向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液。每个喷淋器每分钟喷淋培养液体积控制在1mL。
喷淋培养液的程度需进行控制：喷淋每5分钟暂停一次，暂停时间为5分钟。
控制与容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为10%。保持细菌纤维素厚度增长速率稳定在2mm/12h。
细菌纤维素厚度增长速率下降并稳定在1mm/12h时，停止向容器底部透氧材料的供氧。同时保持向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液为每5分钟暂停一次，暂停时间为5分钟。加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力至1.5个标准大气压。当细菌纤维素厚度增长速率上升并稳定在2mm/12h，直至细菌纤维素厚度达到要求时，停止培养，将其取出。
所述的加压是指在30分钟内将容器内压力提升至1.5个标准大气压。
4）后处理
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持4小时，用纯净水清洗至pH为7.0。
实施例4
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇3，蛋白胨0.3，酵母膏0.3，柠檬酸0.05，磷酸氢二钠0.1，磷酸二氢钾0.05，余量为水；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/ml。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，28℃静置培养。
通过在培养过程中调节与细菌纤维素上表面相接触的空气压力与氧气体积浓度以及与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力与氧气体积浓度，结合在静置培养过程中向细菌纤维素上表面均匀喷淋调配好的发酵培养液来实现细菌纤维素的厚度连续增长。
所述的连续增长分为三个阶段：
a.细菌纤维素生长诱导期
控制与细菌纤维素上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.05个标准大气压，同时保持空气流通，直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽，培养液上表面与透氧材料上表面均出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速增长期
控制与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为11%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为11%。直至培养液上表面与透氧材料上表面的细菌纤维素薄膜厚度达到1.1mm；
c.细菌纤维素平稳增长期
平稳生长期分为两个阶段：
第一阶段：维持与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为11%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为11%，直至静置培养阶段容器内的培养液收干；
第二阶段：同时打开7个喷淋器，向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液。每个喷淋器每分钟喷淋培养液体积控制在2mL。
喷淋培养液的程度需进行控制：喷淋每6分钟暂停一次，暂停时间为6分钟。
控制与容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为11%。保持细菌纤维素厚度增长速率稳定在2mm/12h。
细菌纤维素厚度增长速率下降并稳定在1mm/12h时，停止向容器底部透氧材料的供氧。同时保持向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液为每6分钟暂停一次，暂停时间为6分钟。加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力至1.2个标准大气压。当细菌纤维素厚度增长速率上升并稳定在2mm/12h，直至细菌纤维素厚度达到要求时，停止培养，将其
取出。
所述的加压是指在30分钟内将容器内压力提升至1.2个标准大气压。
4）后处理
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持4小时，用纯净水清洗至pH为7.0。
实施例5
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇4，蛋白胨0.4，酵母膏0.4，柠檬酸0.06，磷酸氢二钠0.15，磷酸二氢钾0.06，余量为水；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/ml。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，28℃静置培养。
通过在培养过程中调节与细菌纤维素上表面相接触的空气压力与氧气体积浓度以及与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力与氧气体积浓度，结合在静置培养过程中向细菌纤维素上表面均匀喷淋调配好的发酵培养液来实现细菌纤维素的厚度连续增长。
所述的连续增长分为三个阶段：
a.细菌纤维素生长诱导期
控制与细菌纤维素上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，同时保持空气流通，直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽，培养液上表面与透氧材料上表面均出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速增长期
控制与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为12%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为12%。直至培养液上表面与透氧材料上表面的细菌纤维素薄膜厚度达到1.2mm；
c.细菌纤维素平稳增长期
平稳生长期分为两个阶段：
第一阶段：维持与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为12%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.2个标准大气压，氧气体积浓度为12%，直至静置培养阶段容器内的培养液收干；
第二阶段：同时打开8个喷淋器，向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液。每个喷淋器每分钟喷淋培养液体积控制在3mL。
喷淋培养液的程度需进行控制：喷淋每8分钟暂停一次，暂停时间为8分钟。
控制与容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为12%。保持细菌纤维素厚度增长速率稳定在2mm/12h。
细菌纤维素厚度增长速率下降并稳定在1mm/12h时，停止向容器底部透氧材料的供氧。同时保持向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液为每8分钟暂停一次，暂停时间为8分钟。加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力至1.2个标准大气压。当细菌纤维素厚度增长速率上升并稳定在2mm/12h，直至细菌纤维素厚度达到要求时，停止培养，将其取出。
所述的加压是指在30分钟内将容器内压力提升至1.2个标准大气压。
4）后处理
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持4小时，用纯净水清洗至pH为7.0。
实施例6
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.05，磷酸氢二钠0.1，磷酸二氢钾0.05，余量为水；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/ml。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，28℃静置培养。
通过在培养过程中调节与细菌纤维素上表面相接触的空气压力与氧气体积浓度以及与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力与氧气体积浓度，结合在静置培养过程中向细菌纤维素上表面均匀喷淋调配好的发酵培养液来实现细菌纤维素的厚度连续增长。
所述的连续增长分为三个阶段：
a.细菌纤维素生长诱导期
控制与细菌纤维素上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，同时保持空气流通，直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽，培养液上表面与透氧材料上表面均出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速增长期
控制与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为13%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.1个标准大气压，氧气体积浓度为13%。直至培养液上表面与透氧材料上表面的细菌纤维素薄膜厚度达到1.3mm；
c.细菌纤维素平稳增长期
平稳生长期分为两个阶段：
第一阶段：维持与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触空气压力为1.2个标准大气压，氧气体积浓度为13%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.2个标准大气压，氧气体积浓度为13%，直至静置培养阶段容器内的培养液收干；
第二阶段：同时打开9个喷淋器，向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液。每个喷淋器每分钟喷淋培养液体积控制在4mL。
喷淋培养液的程度需进行控制：喷淋每9分钟暂停一次，暂停时间为9分钟。
控制与容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力为1.2个标准大气压，氧气体积浓度为13%。保持细菌纤维素厚度增长速率稳定在2mm/12h。
细菌纤维素厚度增长速率下降并稳定在1mm/12h时，停止向容器底部透氧材料的供氧。同时保持向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液为每9分钟暂停一次，暂停时间为9分钟。加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力至1.3个标准大气压。当细菌纤维素厚度增长速率上升并稳定在2mm/12h，直至细菌纤维素厚度达到要求时，停止培养，将其取出。
所述的加压是指在30分钟内将容器内压力提升至1.3个标准大气压。
4）后处理
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持4小时，用纯净水清洗至pH为7.0。
Claims (7)
1.一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，其特征在于，所述的连续增厚的培养方法包括以下具体步骤：
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2～5，蛋白胨0.05～0.5，酵母膏0.05～0.5，柠檬酸0.01～0.1，磷酸氢二钠0.02～0.2，磷酸二氢钾0.01～0.1，余量为水；
发酵培养液的pH为4.0～6.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×105～2×107个/ml；
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，液面高度不宜超过5cm，放置于恒温培养环境内，28～32℃静置培养；培养容器为上部是密闭空间且底部是透氧材料的容器；
通过在培养过程中调节与细菌纤维素上表面相接触的空气压力与氧气体积浓度以及与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力与氧气体积浓度，结合在静置培养过程中向细菌纤维素上表面均匀喷淋调配好的发酵培养液来实现细菌纤维素的厚度连续增长；
所述的连续增长分为三个阶段：
a.细菌纤维素生长诱导期
控制与细菌纤维素上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力在上限不超过1.1个标准大气压，下限高于1个标准大气压范围内，同时保持空气流通，直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽，培养液上表面与透氧材料上表面均出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速增长期
控制与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，氧气体积浓度为10～15%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力在上限不超过1.2个标准大气压，下限高于1个标准大气压范围内，氧气体积浓度为10～15%；直至培养液上表面与透氧材料上表面的细菌纤维素薄膜厚度达到0.5～1.5mm；
c.细菌纤维素平稳增长期
平稳生长期分为两个阶段：
第一阶段：维持与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触空气压力在上限不超过1.2个标准大气压下限高于1个标准大气压范围内，氧气体积浓度为10～15%；控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力在上限不超过1.2个标准大气压，下限高于1个标准大气压范围内，氧气体积浓度为10～15%，直至静置培养阶段容器内的培养液收干；
第二阶段：同时打开所有喷淋器，向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液；每个喷淋器每分钟喷淋培养液体积控制在1～10mL范围内；
喷淋培养液的程度需进行控制：喷淋每5～10分钟暂停一次，暂停时间为5～10分钟；
控制与容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力上限不超过1.2个标准大气压，下限高于1个标准大气压范围内，氧气体积浓度为10～15%；保持细菌纤维素厚度增长速率稳定在2±0.5mm/12h；
细菌纤维素厚度增长速率下降并稳定在1±0.5mm/12h时，停止向容器底部透氧材料的供氧；同时保持向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液为每5～10分钟暂停一次，暂停时间为5～10分钟；加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力至上限不超过1.5个标准大气压，下限高于1.2个标准大气压的范围内；当细菌纤维素厚度增长速率上升并稳定在2±0.5mm/12h，直至细菌纤维素厚度达到要求时，停止培养，将其取出；
所述的加压是指在30分钟内将容器内压力提升至上限不超过1.5个标准大气压，下限高于1.2个标准大气压范围内；
4）后处理
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1～10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2～10小时，用纯净水清洗至pH为7.0。
2.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，其特征在于，所述的透氧材料是指在常温常压下的氧气透过速率为100～1000mL.m-2.s-1，孔隙均一度偏差<±0.3的材料。
3.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，其特征在于，所述的均匀喷淋是指将调配好的发酵培养液经喷淋器喷淋至细菌纤维素上表面；经喷淋器喷出的液滴初始速度方向与细菌纤维素上表面所在平面方向平行，喷淋器个数为6～12个。
4.根据权利要求3所述的一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，其特征在于，所述的喷淋器是指每分钟能够喷淋1～10ml发酵培养液，同时液滴直径在0.5～6μm范围内，其中占喷淋发酵培养液总体积的85%以上的液滴直径小于4μm。
5.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，其特征在于，所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述培养基置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。
6.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，其特征在于，所述的通纯氧是指将医用氧以1L/min的速度通入上述的培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4℃下试管中的木醋杆菌菌种，并转移至上述的发酵培养基中；所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养基于28～32℃下摇床培养8～24小时。
7.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，其特征在于，所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物，包括：木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。
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