CN110184366A - 一种鉴别发酵生产辅酶a过程中的菌种种属的试剂盒、方法和引物对 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的试剂盒、方法和引物对。所述的试剂盒包括PCR反应体系，所述PCR反应体系至少包括一种引物对，所述的引物对针对停滞棒杆菌的16srDNA设计；所述引物对的正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。利用本发明的试剂盒通过PCR扩增反应及电泳检测、分析等一系列步骤准确地鉴别直接发酵生产辅酶A中菌种的种属来源，特别能够直接区分出是否为停滞棒杆菌，检测发酵中间体的菌种鉴定PCR方法，具有操作简便、成本低、准确性高以及重复性好等优点，极其便于推广应用。

Description

一种鉴别发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的试剂盒、方法和 引物对

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴别发酵生产辅酶A过程中 的菌种种属的试剂盒、方法和引物对。

背景技术

辅酶A系由泛酸、腺嘌呤、核糖、半胱氨酸及磷酸组成。它是体内乙酰 化反应的辅酶，对糖、脂肪及蛋白质的代谢起着非常重要的影响，因此是一 重要的生物化学药物，其临床应用范围较广，主要用于白细胞减少症，血小 板减少性紫癜，慢性肾机能不全所引起的急性无尿、肾病综合症、尿毒症、 初生儿缺氧、糖尿病酸中毒等。近年来，国内外主要的生产辅酶A的方法为 产氨短杆菌直接发酵法。2015版药典中在“生物制品生产鉴定用菌毒种管理 规程”表示生产和检定用菌毒种，包括DNA重组工程菌菌种，来源途径应 合法，并经药品监督管理部门批准。生物制品生产用菌毒种应采用种子批系 统，原始种子应验明其历史、来源和生物学特性。从原始种子传代和扩增后 保存的为主种子批。从主种子批传代和扩增后保存的为工作种子批，工作种 子批用于生产疫苗。工作种子批的生物学特性应与原始种子一致，每批主种 子批和工作种子批均应按各论要求保管、检定和使用。菌毒种的传代及检定 实验室应符合国家生物安全的相关规定，应建立生产用菌毒种主种子批全基 因序列的背景资料，减毒活疫苗主种子批应进行全基因序列测定。

微生物的菌种鉴定常规的鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包 括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代 谢反应、酶反应和血清学反应等。还有自动鉴定系统，是以微生物对不同碳 源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对 应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。

目前应用最广泛的还是基于分子生物学的基因鉴定。然而现有技术中并 没有关于鉴定发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的引物对以及试剂盒等的 记载。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏在发酵生产辅 酶A过程中对停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)进行有效检测的PCR 方法的缺陷，提供一种鉴别发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的试剂盒、方 法和引物对。利用本发明的试剂盒通过PCR扩增反应及电泳检测、分析等 一系列步骤准确地鉴别直接发酵生产辅酶A中菌种的种属来源，能够直接区 分出是否为停滞棒杆菌，检测发酵中间体的菌种鉴定PCR方法，具有操作 简便、成本低、准确性高以及重复性好等优点，极其便于推广应用。

本发明建立了一个菌落快速PCR的体系，生产中发酵摇瓶菌种可无需 微生物基因组的提取，直接挑取部分菌体处理后，直接加入PCR反应体系 中，迅速快捷，实验结果与提取基因组后再PCR的结果相比，完全可用。经 本发明人诸多试验和研究，在产辅酶A的停滞棒杆菌16srDNA序列中挑选 出的特异性DNA分子量小，结构简单稳定。进一步地，又针对该基因序列 设计并筛选出了特定引物对。尝试不同常规PCR和菌落PCR的体系，找到 特异性强，灵敏度高的体系，进行普通PCR达到最佳效果。

本发明提供一种鉴别发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的试剂盒，其包 括PCR反应体系，所述PCR反应体系至少包括一种引物对；

所述引物对的正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示， 反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述正向引物和所述反向引物在所述的PCR反应体系中的终浓度可为 本领域常规。较佳地，在所述的PCR反应体系中，所述正向引物和所述反向 引物的终浓度均为0.2～1μM，优选0.3～0.5μM，更优选0.4μM。

如上所述的PCR反应体系较佳地还包括PCR反应缓冲液、2’-脱氧核 苷三磷酸和DNA聚合酶；其中：

所述PCR反应体系中Mg²⁺的终浓度可为本领域常规，优选2mM。

所述dNTP中，dATP、dGTP、dTTP和dCTP的浓度均优选0.2mM。

所述聚合酶优选Taq酶，所述DNA聚合酶的活力优选0.025U/μl。

如上所述的反应体系较佳地包括1μL浓度为10μM的上游引物、1μL 浓度为10μM的下游引物、12.5μL 2×premix Taq以及9.5μL双蒸水。

为提高检测结果的准确性，所述的试剂盒较佳地还包括阳性对照和/或阴 性对照；其中，所述的阳性对照优选停滞棒杆菌基因组DNA；所述的阴性对 照优选双蒸水。

如上所述的菌种较佳地选自直接发酵产辅酶A的菌种中的一种或者多 种，所述菌种包括停滞棒杆菌。

本发明还提供一种鉴别发酵产辅酶A过程中的菌种种属的引物对，所述 引物对针对停滞棒杆菌的16srDNA设计，所述引物对的正向引物的核苷酸 序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种如上所述的引物对在鉴别发酵产辅酶A过程中的菌 种种属的试剂盒或者试剂中的应用；

较佳地，所述菌种选自直接发酵产辅酶A的菌种中的一种或者多种，所 述菌种包括停滞棒杆菌。

本发明还提供一种鉴别发酵产辅酶A中菌种种属的方法，其包括以下步 骤：

1)提取待检样品中的DNA；

2)利用如上所述的试剂盒中的PCR反应体系扩增上述DNA；

3)电泳检测PCR产物。

其中，所述步骤2)中所述扩增的PCR反应程序优选为：(1)95℃预变 性1～5min，优选3min；(2)95℃变性15～60s，优选30s：(3)59℃退火15～60s， 优选30s；(4)72℃延伸60～120s，优选90s；(5)步骤(2)～(4)循环25～35 次，30次；(6)72℃延伸5～15min，优选10min；(7)4℃终止。

步骤3)中所述的电泳优选为琼脂糖凝胶电泳。

所述琼脂糖凝胶电泳的质量百分比浓度较佳地为0.8～1.2％，更佳地为 1％。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

利用本发明的试剂盒通过PCR扩增反应及电泳检测、分析等一系列步 骤准确地鉴别直接发酵生产辅酶A中菌种的种属来源，特别是能够直接区分 出是否为停滞棒杆菌，检测发酵中间体的菌种鉴定PCR方法，具有操作简 便、成本低、准确性高以及重复性好等优点，其中，成本仅为2元/样品，极 其便于推广应用。为监督发酵工艺药品的规范生产，保证安全用药提供了技 术支持。

附图说明

图1为停滞棒杆菌源性引物对停滞棒杆菌基因组DNA PCR扩增产物的 电泳图；图中M为DNA标准分子量，1～2分别为停滞棒杆菌基因组样1、 样2。

图2为停滞棒杆菌源性引物对停滞棒杆菌基因组DNA PCR扩增的最佳 退货温度电泳图；图中M为DNA标准分子量，1～8分别为退火温度50℃、 53℃、55℃、57℃、59℃、60℃、61℃和62℃。

图3为停滞棒杆菌源性引物对产辅酶A发酵液中菌种的基因组DNA PCR扩增产物的电泳图；图中M为DNA标准分子量，1～2分别为产辅酶A 发酵液中的基因组样1、样2。

图4为停滞棒杆菌源性引物对产辅酶A发酵液中菌种的直接菌体PCR 扩增产物的电泳图；图中M为DNA标准分子量，1～2分别为产辅酶A发酵 液中的菌体样1、样2。

图5为停滞棒杆菌源性引物对停滞棒杆菌，大肠杆菌基因组DNA PCR 扩增产物的电泳图；图中M为DNA标准分子量，1～4分别为大肠杆菌基因 组样1、样2，停滞棒杆菌基因组样1、样2。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

细胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶以及DNA吸附柱均来自Ezup柱式细 菌基因组DNA抽提试剂盒，该试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公 司；

用于提取发酵液中菌种的基因组DNA的试剂盒为Ezup柱式细菌基因 组DNA抽提试剂盒B518255-0050，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

用于PCR扩增反应的Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液以及脱氧核 糖核苷三磷酸均购自大连宝生物有限公司。

实施例1菌液中的基因组DNA的提取

(1)取1ml过夜培养的发酵菌种菌液，加入1.5ml离心管中，室温 8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体；(2)加入溶菌酶溶液180μL(事 先将相应的溶解酶加入到Enzymatic lysis buffer中，配制成20mg/ml的溶解 酶溶液)后重悬菌体，37℃水浴60min；(3)水浴结束后，再加入20μL Proteinase K溶液，震荡混匀，56℃水浴30min至细胞完全裂解；(4)水浴 结束后加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀，并70℃水浴10min；(5)加 入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀；(6)将吸附柱放入收集管中，用移液器 将溶液全部加入吸附柱中，静置2min，再12000rpm室温离心1min，倒掉收 集管中废液；(7)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液1(使 用前按标示比例加入异丙醇)，10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；(8)将 吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液2(使用前按标示比例加入 无水乙醇)，10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；(9)将吸附柱重新放回 收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的洗液2，将吸附柱打开 盖子于室温中放置20min，以彻底晾干吸附材料中残留的洗液2；(10)取出 吸附柱，放入一个新的离心管中，加入50μL洗脱液静置3min，12000rpm室 温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃ 保存。

实施例2PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

(1)引物设计

设计停滞棒杆菌种属特异性引物：

针对停滞棒杆菌16srDNA特定基因设计引物对：

正向引物：5’-TGGCGAACGGGTGAGTAAC-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物：5’-GGCTTCGGGTGTTACCAACT-3’(SEQ ID NO.2)。

(2)PCR扩增

a.PCR反应体系

以实施例1所得待测样品的菌体基因组DNA为模板，采用上述设计 的停滞棒杆菌种属特异性引物分别进行PCR扩增，反应体系表1：

表1.反应体系

DNA模板	1μL
		正向引物(10μmol/L)	1μL
反向引物(10μmol/L)	1μL
		2×premix Taq(Ex Taq version 2.0)	12.5μL
双蒸水	至25μL

b.PCR扩增程序

①95℃预变性3min；②95℃变性30s：③59℃退火30s；④72℃延伸1 min 30s；⑤步骤②～④循环30次；⑥72℃延伸10min；⑦4℃终止。

(3)琼脂糖凝胶电泳检测

取5μL上述PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、 0.25％二甲苯苯胺以及60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶 电泳，电压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察。

若待检样品扩增出1319bp的DNA条带，则判定为停滞棒杆菌菌种。

实施例3停滞棒杆菌源性引物分别对停滞棒杆菌基因组DNA进行 PCR扩增。

停滞棒杆菌基因组DNA为上述试剂盒中自提，作为DNA模板；设置 空白对照，用1μL双蒸水代替DNA模板。

(1)PCR扩增

采用实施例1中的引物、PCR体系以及扩增程序进行PCR扩增。

(2)琼脂糖凝胶电泳检测

取10μL PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、0.25％ 二甲苯苯胺、60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，电 压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察，结果见图1。

结果显示本发明设计的停滞棒杆菌16srDNA特定鉴别引物对相应物种 的基因组DNA进行扩增，且可得到分子量大小为1300bp左右的扩增条带， 与1319bp的停滞棒杆菌特异性扩增条带吻合。

实施例4停滞棒杆菌源性引物分别对停滞棒杆菌基因组DNA的检测 最佳退火温度实验

PCR体系不变，分别选择50℃、53℃、55℃、57℃、59℃、60℃、61℃ 和62℃为退火温度。

(1)PCR扩增：采用实施例1中的引物、PCR体系以及扩增程序进行 PCR扩增。

(2)琼脂糖凝胶电泳检测：

取5μL PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、0.25％ 二甲苯苯胺、60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，电 压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察，结果见图2。

结果显示本发明设计的停滞棒杆菌特异性引物对停滞棒杆菌基因组 DNA的最佳退火温度为59℃。

实施例5产辅酶A发酵液中菌种源性的检测

1、产辅酶A发酵液中停滞棒杆菌基因组DNA的提取

(1)取1ml过夜培养的发酵菌种菌液，加入1.5ml离心管中，室温 8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体；(2)加入溶菌酶溶液180μL(事 先将相应的溶解酶加入到Enzymatic lysis buffer中，配制成20mg/ml的溶解 酶溶液)后重悬菌体，37℃水浴60min；(3)水浴结束后，再加入20 μLProteinase K溶液，震荡混匀，56℃水浴30min至细胞完全裂解；(4)水 浴结束后加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀，并70℃水浴10min；(5) 加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀；(6)将吸附柱放入收集管中，用移液 器将溶液全部加入吸附柱中，静置2min，再12000rpm室温离心1min，倒掉 收集管中废液；(7)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液 1(使用前按标示比例加入异丙醇)，10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；(8) 将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液2(使用前按标示比例加入无水乙醇)，10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；(9)将吸附柱重新放 回收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的洗液2，将吸附柱打 开盖子于室温中放置20min，以彻底晾干吸附材料中残留的洗液2；(10)取 出吸附柱，放入一个新的离心管中，加入50μL洗脱液静置3min，12000rpm 室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃ 保存。

2、PCR扩增：采用实施例1中的引物、PCR体系以及扩增程序进行 PCR扩增。

3、琼脂糖凝胶电泳检测：

取5μL PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、0.25％ 二甲苯苯胺、60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，电 压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察，结果见图3。

结果显示使用本发明设计的种属特异性引物检测产辅酶A发酵液中菌 种为停滞棒杆菌，无大肠杆菌源性成分污染。

效果实施例试剂盒的应用

效果实施例1停滞棒杆菌源性引物对产辅酶A的发酵液菌种直接菌落 PCR，检测特异性实验

(1)取200μL过夜培养的发酵菌种菌液，加入1.5ml离心管中，室温 8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体，加入200ul纯化水重悬，煮沸10min， 室温8000rpm离心1min，取上清液作为PCR体系的DNA模板。

(2)PCR扩增：采用实施例1中的引物、PCR体系以及扩增程序进行 PCR扩增。

(3)琼脂糖凝胶电泳检测：

取5μL PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、0.25％ 二甲苯苯胺、60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，电 压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察，结果见图4。

结果显示本发明设计的停滞棒杆菌特异性引物对发酵液菌直接菌体 PCR，得到一条1300bp左右的条带，与实施例5结果相同，扩增条带，与 1319bp的停滞棒杆菌特异性扩增条带吻合。

菌体PCR省去细菌基因组提取的步骤，快速且便捷。

效果实施例2停滞棒杆菌源性引物分别对停滞棒杆菌、大肠杆菌菌种 基因组DNA进行PCR扩增。

停滞棒杆菌、大肠杆菌菌种基因组DNA为上述试剂盒中自提，作为 DNA模板；设置空白对照，用1μL双蒸水代替DNA模板。

(1)PCR扩增

采用实施例1中的引物、PCR体系以及扩增程序进行PCR扩增。

(2)琼脂糖凝胶电泳检测

取10μL PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、0.25％ 二甲苯苯胺、60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，电 压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察，结果见图5。

结果显示本发明设计的停滞棒杆菌16srDNA特定鉴别引物仅对相应物 种的基因组DNA进行扩增，对另外物种无扩增，且可得到分子量大小为1300 bp左右的扩增条带，与1319bp的停滞棒杆菌特异性扩增条带吻合。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海上药第一生化药业有限公司

<120> 一种鉴别发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的试剂盒、方法和引物对

<130> P19011156C

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物

<400> 1

tggcgaacgg gtgagtaac 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物

<400> 2

ggcttcgggt gttaccaact 20

Claims (10)

1.一种鉴别发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的试剂盒，其包括PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系至少包括一种引物对；

所述引物对的正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在所述的PCR反应体系中，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0.2～1μM，优选0.3～0.5μM，更优选0.4μM。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应体系还包括PCR反应缓冲液、dNTP和DNA聚合酶；其中：

所述PCR反应体系中Mg²⁺的终浓度优选2mM；

所述dNTP中，dATP、dGTP、dTTP和dCTP的浓度均优选0.2mM；

所述DNA聚合酶优选Taq酶，所述DNA聚合酶的活力优选0.025U/μl。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述反应体系包括1μL浓度为10μM的上游引物、1μL浓度为10μM的下游引物、12.5μL 2×premix Taq以及9.5μL双蒸水；

较佳地，所述的试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照；所述的阳性对照优选停滞棒杆菌基因组DNA，所述的阴性对照优选双蒸水。

5.如权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述菌种选自直接发酵产辅酶A的菌种中的一种或者多种，所述菌种包括停滞棒杆菌。

6.一种鉴别发酵产辅酶A过程中的菌种种属的引物对，其特征在于，所述引物对针对停滞棒杆菌的16srDNA设计，所述引物对的正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

7.如权利要求6所述的引物对在鉴别发酵产辅酶A过程中的菌种种属的试剂盒或者试剂中的应用；

较佳地，所述菌种选自直接发酵产辅酶A的菌种中的一种或者多种，所述菌种包括停滞棒杆菌。

8.一种鉴别发酵产辅酶A中菌种种属的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

1)提取待检样品中的DNA；

2)利用权利要求1～5任一项所述试剂盒中的PCR反应体系扩增上述DNA得PCR产物；

3)电泳检测所述PCR产物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中所述扩增的PCR反应程序为：(1)95℃预变性1～5min，优选3min；(2)95℃变性15～60s，优选30s：(3)59℃退火15～60s，优选30s；(4)72℃延伸60～120s，优选90s；(5)步骤(2)～(4)循环25～35次，优选30次；(6)72℃延伸5～15min，优选10min；(7)4℃终止。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤3)所述电泳为琼脂糖凝胶电泳；优选质量百分比浓度为0.8～1.2％，更优选质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳。