CN104046698B - 同步检测苹果属上三种检疫性疫霉的四重pcr引物及其扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同步检测苹果属植物上三种检疫性疫霉的四重PCR引物及其扩增方法与用途，涉及4套引物，即疫霉属通用引物、冬生疫霉特异引物、丁香疫霉特异引物和栗黑水疫霉特异引物，其中通用引物用于菌丝基因组DNA的质量控制，建立的四重PCR分子检测，经琼脂糖凝胶电泳观察，疫霉属菌株均应出现884bp的扩增片段，冬生疫霉还应出现232bp特异片段，丁香疫霉还应出现683bp特异片段，栗黑水疫霉还应出现314bp特异片段，四套引物可有效用于三种疫霉的菌丝基因组DNA四重PCR特异扩增。
Description
技术领域
本发明设计PCR技术检测寄生于苹果属水果中冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物及其扩增方法和用途，属于苹果属冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉病菌检测领域。
背景技术
苹果属（Malus Mill.）是蔷薇科中经济价值较高的植物，包括如苹果、垂丝海棠、山定子、湖北海棠、西府海棠等是重要的园林树种，在北温带，亚洲、欧洲以及北美洲均有分布。苹果是世界上五大果树（柑橘、苹果、香蕉、葡萄、梨）之一，目前，苹果生产已成为许多国家主要的农事活动，全球约有80多个国家和地区从事苹果生产，年产量超过或接近100万吨的主产国有12个，按产量排，依次为中国（46%）、美国（9%）、土耳其（6%）、意大利（5%）、法国（5%）、波兰（5%）、德国（3%）俄罗斯（3%）等。我国是世界上最大的苹果生产国和消费国，苹果种植面积和产量均占世界总量的40%以上，在世界苹果产业中占有重要地位。
疫霉属（phytophthora spp）真菌是苹果属果树上一类非常重要的病害，常多种疫霉侵染柑橘属果树，复合侵染现象十分严重，侵染后出现脚腐、根腐、冠腐（流胶现象）、果腐和叶疫等多种病害，为害植株的根、颈、叶、花、果实，具有流行性和毁灭性，可导致植物大量减产，甚至绝产、死亡，给柑橘生产带来很大损失。据报道，全世界为害苹果的疫霉约9种，不同国家或不同地区，疫霉种有所不同。其中冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉侵染苹果是我国植物检疫性病原菌，目前在我国尚未发生。冬生疫霉是在澳大利亚西部的柑橘果实上首次发现的，随后在美国、法国等多个国家和地区均有报道。该病菌主要为害柑橘属（Citrus L.）植物，引起果实褐腐。还可以侵染苹果（Malus pumola Mill.）、玫瑰(Rosa rugosa)等，造成枯萎、根腐或溃疡。丁香疫霉2007年被列入我国进境植物检疫性有害生物名单，2011年国内首次截获。丁香疫霉可引起寄主的根、茎、叶、果实的多种病害，可引起苹果的果腐病（fruit rot）和颈腐病（collarrot），丁香疫霉仅在欧洲西北部为苹果的主要病原,引起裙腐,但造成严重损失的是引起贮藏期果实腐烂。受感染的植株长势衰弱，出现茎枯，叶片褪绿萎蔫，严重时整株死亡，果实产量减少和品质下降。栗黑水疫霉寄主范围广泛，主要引起栗树黑水病，侵染树干基部和较大的根，引起树干和根腐烂，还在许多果树上引起根、茎腐烂病。
苹果是世界上最重要的水果之一，在国际农产品贸易中占有非常重要的地位，随着苹果的大量进口，有害生物随之传入我国风险很大。因此，急需加强进境苹果上携带有害生物快速、准确的检测鉴定，有效保护和促进我国苹果产业健康发展。冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的常规生物学检测方法是形态学鉴定，通过分离培养观察真菌病害菌落、分生孢子器、分生孢子等的形状、颜色进行鉴定。由于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉病菌形态鉴定费力耗时，且较难准确、快速、有效鉴定三种病原菌，易造成漏检和误检，不能满足口岸“快验快放”的要求，导致病菌在我国传播。目前常规检疫方法是根据病原菌形态特征、生物学特性等方面存在的差异进行水果带菌检测。迄今，针对丁香疫霉与近似种检测鉴定的研究不多，目前可行的方法仍是依据形态学来区分丁香疫霉及其近似种，而疫霉的分离纯化比较困难，有性态和无性态形态特征的测定需要 20d 以上的时间，且疫霉的形态特征变化较大，此种情况下不仅耗时费力，且很难根据菌落形态准确、快速、有效地鉴定出两种病原菌，从而造成检疫人员的漏检和误检，且不能满足口岸“快验快放”的要求，从而错过病害最佳防治时期，导致病害在田间肆虐发展。因此，加强对口岸进境柑橘携带有害生物快速、准确的检测显得极为重要，对保护和促进我国柑橘产业健康发展具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明索要解决的技术问题是：设计同步检测苹果属水果上冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物，包括冬生疫霉的特异性引物、丁香疫霉的特异性引物和栗黑水疫霉的特异性引物，与自行设计的通用引物18SF/18SR，建立同步检测柑橘属上冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物及其扩增方法和用途。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种同步检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物，实现三种检疫性真菌病害同步分子检测的特异引物，序列如下：
冬生疫霉的特异引物：
PHSF：CTT TGC TCG AAA AGC ATA ATG GAA
PHSR：CCA CTC TAC TTC ACA CAA CAT CCT
丁香疫霉的特异引物：
PSSF：AGG AGG AAG GCG AGA AGG CC
PSSR：GTA GTA GAT GCC GGG CTG CG
栗黑水疫霉的特异引物：
PCSF：CAA GCT CCA GAT TGT GCG TG
PCSR：CGA ATC AAA GCG GTC CAA CC
所述PHSF/PHSR扩增片段为232bp，PSSF/PSSR扩增片段为683bp，PCSF/PCSR扩增片段为314bp，特异引物用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的菌丝基因组DNA特异四重PCR扩增。还包括检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的通用引物，序列如下：
18SUF：CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A
18SUR：AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C
所述引物用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉菌丝基因组DNA扩增，扩增片段为884bp，作为提取和扩增过程的质量检测。
一种同步检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物的扩增方法，包括下述的扩增体系和扩增程序：
（1）扩增体系
建立20μL的扩增体系为，包括10×Buffer 2.0μL（其中含终浓度为1.5mmol/L的MgCl2)；2.5mmol/L dNTPs 为2.0μL；0.4μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)；浓度为10μmol/L的引物18SUF/18SUR、PCSF/PCSR、PSSF/PSSR和PHSF/PHSR依次为0.2μL/0.2μL、0.6μL/0.6μL、0.8μL/0.8μL、1.0μL/1.0μL；DNA模板1μL（约为20ng)，余量为双蒸水；
（2）反应程序
设立反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，63℃复性20s，72℃延伸40s，40个循环；72℃延伸7min。
上述同步检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物在检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉方面的应用。
发明的有益效果是：建立了方法简便、重现性好的P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora的四重PCR引物，能将P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora区别开来。采用引物检测试验过程，避免假阴性。实现了在同一PCR管中4组引物检测P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora，该四重PCR检测体系的建立简化和方便了对P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora的检测，节约了试剂盒时间，检测快速、可靠，可有效在口岸检测中推广应用。
附图说明
图1是本发明菌丝基因组DNA三四重PCR扩增。
具体实施方式
本发明的同步检测检疫性真菌病害冬生疫霉P.hibernalis和丁香疫霉P.syringae和栗黑水疫霉P.cambivora的四重PCR引物，实现了同时检测P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora。
（1）设计冬生疫霉和丁香疫霉的各自的特异性引物，引物序列如下：
冬生疫霉的特异引物：
PHSF：CTT TGC TCG AAA AGC ATA ATG GAA
PHSR：CCA CTC TAC TTC ACA CAA CAT CCT
丁香疫霉的特异引物：
PSSF：AGG AGG AAG GCG AGA AGG CC
PSSR：GTA GTA GAT GCC GGG CTG CG
栗黑水疫霉的特异引物：
PCSF：CAA GCT CCA GAT TGT GCG TG
PCSR：CGA ATC AAA GCG GTC CAA CC
PHSF/PHSR扩增片段为232bp，PSSF/PSSR扩增片段为683bp，PCSF/PCSR扩增片段为314bp，这三套特异引物用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的菌丝基因组DNA特异四重PCR扩增。
（2）自行设计的冬生疫霉和丁香疫霉的通用引物，序列如下：
18SUF：CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A
18SUR：AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C
上述引物用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉菌丝基因组DNA扩增，扩增片段为884bp，作为提取和扩增过程的质量检测。
本发明建立检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物及其扩增方法，包括扩增体系的建立及反应程序的设立。
（1）扩增体系
建立20μL的扩增体系为，包括10×Buffer 2.0μL（其中含终浓度为1.5mmol/L的MgCl2)；2.5mmol/L dNTPs 为2.0μL；0.4μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)；浓度为10μmol/L的引物18SUF/18SUR、PCSF/PCSR、PSSF/PSSR和PHSF/PHSR依次为0.2μL/0.2μL、0.6μL/0.6μL、0.8μL/0.8μL、1.0μL/1.0μL；DNA模板1μL（约为20ng)，余量为双蒸水；
（2）反应程序
经过优化，设立反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，63℃复性20s，72℃延伸40s，40个循环；72℃延伸7min。
本发明设计合成了四套引物，包括P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora的特异引物PHSF/PHSR、PSSF/PSSR和PCSF/PCSR，通用引物18SUF/18SUR，对所有实验材料菌丝DNA进行质量检测，避免假阴性，四套引物对P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora进行四重PCR扩增。
所述同步检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物在检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉方面的应用。
本发明建立了简便快速、特异性强、灵敏度高、准确可靠的P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora的四重PCR分子检测方法，能将P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora区别开来。该方法的建立为三种检疫性真菌病害的同步分子检测提供了特异可行的方法，节约了试剂和时间，检测快速、可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
实施例1：实验材料菌丝的培养
本实验供试菌株为P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora同属菌株，共计11个菌株（见表1）。实验涉及的材料包括5株ATCC菌株购买于美国菌种保藏中心，2株CBS菌株购买于荷兰菌种保藏中心，2株ACCC菌株购买于中国农业微生物菌种保藏中心，Ljf2012-4、Ljf2012-9供试菌株为天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心从美国、澳大利亚柑橘上截获，供试材料的相关信息见表1.
表1 供试材料
挑取P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora菌丝置于V8培养基，12h光照黑暗交替，25℃恒温保湿培养7d。培养7d后手机大量菌丝供DNA提取。
实施例2：菌丝基因组DNA的提取
采用美国QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit提取菌丝DNA，提取的菌丝DNA溶于100μL 1×TE缓冲液中，其余菌丝DNA置于-70℃保存。
PCR扩增相关试剂为大连宝生物（TaKaRa）工程公司产品。
3.1反应混合液的配置
建立20μL的扩增体系为，包括10×Buffer 2.0μL（其中含终浓度为1.5mmol/L的MgCl2)；2.5mmol/L dNTPs 为2.0μL；0.4μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)；浓度为10μmol/L的引物18SUF/18SUR、PCSF/PCSR、PSSF/PSSR和PHSF/PHSR依次为0.2μL/0.2μL、0.6μL/0.6μL、0.8μL/0.8μL、1.0μL/1.0μL；DNA模板1μL（约为20ng)，余量为双蒸水；以丁香疫霉（ATCC34002）的18SUF/18SUR引物扩增片段克隆质粒为阳性对，无菌水为阴性对照。
3.2 PCR反应程序
94℃预变性4min；94℃变性30s，63℃复性20s，72℃延伸40s，40个循环；72℃延伸7min。2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色及成像观察目的条带。
3.3 结果分析
同一PCR管中4组引物18SUF/18SUR、PCSF/PCSR、PSSF/PSSR和PHSF/PHSR对11个菌株的菌丝DNA进行扩增，通过2%琼脂糖凝胶电泳能够明确的区分P.hibernalis、P.syringae和P.cambivora这三种寄生于柑橘属上的检疫性真菌病害。泳道P为P.syringae的引物18SUF/18SUR的884bp扩增片段作为质量监控；泳道1为P.hibernalis（ATCC56353）18S区域884bp扩增片段和ITS区域232bp的特异片段；泳道2和3分别为P.syringae（ATCC34002和Ljf2012-4）18S区域884bp扩增片段和HSP90区域683bp 特异片段； 泳道4和5分别P.cambivora （ATCC36228和ATCC38811）18S区域884bp扩增片段和Ypt1区域314bp特异片段；泳道6-11为3种疫霉同属菌株；泳道N为阴性对照；泳道M为DL2000bp marker。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所做的同等变化和修饰，仍落在本发明的专利范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
<120> 同步检测苹果属上冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物
及其扩增方法和用途
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
CTT TGC TCG AAA AGC ATA ATG GAA 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
CCA CTC TAC TTC ACA CAA CAT CCT 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
AGG AGG AAG GCG AGA AGG CC 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
GTA GTA GAT GCC GGG CTG CG 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
CAA GCT CCA GAT TGT GCG TG 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
CGA ATC AAA GCG GTC CAA CC 20
Claims (4)
1.一种同步检测检疫性真菌病害冬生疫霉P.hibernalis、丁香疫霉
P.syringae和栗黑水疫霉P.cambivora的四重PCR引物，引物序列如下：三种疫霉的通用引物：
18SUF：CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A
18SUR：AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C
冬生疫霉的特异引物：
PHSF：CTT TGC TCG AAA AGC ATA ATG GAA
PHSR：CCA CTC TAC TTC ACA CAA CAT CCT
丁香疫霉的特异引物：
PSSF：AGG AGG AAG GCG AGA AGG CC
PSSR：GTA GTA GAT GCC GGG CTG CG
栗黑水疫霉的特异引物：
PCSF：CAA GCT CCA GAT TGT GCG TG
PCSR：CGA ATC AAA GCG GTC CAA CC
所述引物18SUF/18SUR用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉菌丝基因组DNA扩增，扩增片段为884bp，作为提取和扩增过程的质量控制，PHSF/PHSR扩增片段为232bp，PSSF/PSSR扩增片段为683bp，PCSF/PCSR扩增片段为314bp，这四套特异引物用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的菌丝基因组DNA特异四重PCR扩增。
2.一种同步检测检疫性真菌病害冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR扩增体系：总体积为20μL，包括MgCl2终浓度为1.5mmol/L的10×Buffer 2.0μL，2.5mmol/L dNTPs为2.0μL，浓度为5U/μL的Taq DNA 聚合酶0.4μL，权利要求1所述的引物，各引物浓度为10μmol/L的引物18SUF/18SUR、PCSF/PCSR、PSSF/PSSR和PHSF/PHSR依次为0.2μL/0.2μL、0.6μL/0.6μL、0.8μL/0.8μL、1.0μL/1.0μL，浓度为20ng/μL DNA模板1μL，余量为双蒸水。
3.一种同步检测检疫性真菌病害冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR扩增方法，使用权利要求2所述的扩增体系，反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，63℃复性20s，72℃延伸40s，40个循环；72℃延伸7min。
4.权利要求1所述同步检测检疫性真菌病害冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物，及权利要求2、3所述的扩增体系和扩增方法在特异检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉方面的应用。
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| Rapid identification of Phytophora ramorum using PCR-SSCP analysis of ribosomal DNA ITS-1;P.Kong et al;《letters in Applied Microbiology》;20041231;第38卷;433-439 * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Ying Inventor after: Huang Guoming Inventor after: Guo Jingze Inventor after: Lin Yu Inventor after: Hu Jiaxu Inventor after: Liao Fang Inventor after: Zhu Linhui Inventor after: Luo Jiafeng Inventor after: Liu Yueting Inventor after: Li Guanrong Inventor before: Liu Yueting Inventor before: Cui Tiejun Inventor before: Guo Jingze Inventor before: Liao Fang Inventor before: Zhu Linhui Inventor before: Luo Jiafeng Inventor before: Li Guanrong Inventor before: Huang Guoming |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170222 Termination date: 20170708 |