CN102703362B

CN102703362B - 一种链霉菌新菌株及dna鉴定方法

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Publication number: CN102703362B
Application number: CN 201210207384
Authority: CN
Inventors: 温志强; 刘新锐; 李兵兵; 邓优锦; 谢宝贵
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2012-06-21
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2032-06-21
Also published as: CN102703362A

Abstract

本发明涉及一种链霉菌新菌株(Streptomyces fujianensis sp简称Js-1^T)及其DNA鉴定方法，Js-1^T对真菌、细菌的生长有很强的抑制作用，经测定，Js-1^T对大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、稻瘟病、核盘菌、木霉、根霉、疣孢霉等的抗性很强，具有很好的开发应用前景。Js-1^T的DNA鉴定方法具有真实可靠，一目了然的特点，操作简单，检测时间短，比经典的形态鉴定误差小，判断更直观。

Description

一种链霉菌新菌株及DNA鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种放线菌及其鉴定方法，具体涉及一种链霉菌新菌株及DNA鉴定方法。

背景技术

链霉菌是放线菌中最占优势、数量最大、应用最广的一类。迄今为止，关于放线菌的研究多数是围绕着链霉菌展开的，绝大多数抗生素也是由链霉菌产生的，据统计，世界上所知道的数千种抗生素中70％是由链霉菌产生的。

吉林农业大学《生物物理学硕士论文》, 2008．隋丽等发表“放线菌769对水稻抗稻瘟病的诱导抗性研究”介绍了放线菌对大肠杆菌、高梁散黑穗、构巢曲霉菌、禾谷镰刀病原菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、番茄灰霉病原菌、小麦赤霉病菌、烟草赤星病菌、大豆霜霉病原菌、黄瓜黑星病菌、玉米穗腐病原菌、大豆灰斑病菌、番茄叶霉病原菌、分枝杆菌、番茄炭疽病菌、葡萄霜霉病原菌、辣椒黑斑病原菌、玉米人斑、番茄早疫病原菌、玉米弯孢病菌等病原菌具有抗性。

发明内容

本发明的目的是提供一种链霉菌新菌株及DNA鉴定方法，为进一步开发利用打下基础。

本发明的一种链霉菌新菌株 (Streptomyces fujianensis sp简称Js-1^T)，是2009年10月9日在福州市食用菌场于银耳菌筒病害研究中从银耳菌筒上分离培养纯化，通过诱变和筛选，获得的菌株，2011年10月31日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学），菌株保藏号为CCTCC NO：M2011365。Js-1^T对真菌、细菌的生长有很强的抑制作用，经测定，Js-1^T对大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、稻瘟病、核盘菌、木霉、根霉、疣孢霉等的抗性很强，具有很好的开发应用前景。

Js-1^T（CCTCC NO：M2011365）的培养基为马铃薯葡萄糖培养基，即培养基PDA：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂条20g，水1000mL；培养条件为常规的链霉菌培养，无特殊要求。

Js-1^T（CCTCC NO：M2011365）的DNA鉴定方法，包括菌株活化、菌丝培养与收集、CTAB法提取基因组DNA、NRPS合成酶基因的扩增、目的基因片段的克隆和目的基因片段的测序；其特征在于测序的结果如下：

CCCACGATGATCAGGATGCTGGTGCCACCGATCGAGTTGCCCGCACCGCCATAGCTCGCCAACGCCACCGTCGGCGCGAGAGCGATCAGCCCCAGGTACAGCGAACCCGGCCACGTGATCCGGTTGAGCACGTAGCTCAGGTACTCAGCGGTCGGACGACCGGCGCGAATACCTGGGATGAAGCCACCATACTTCTTCATATTGTCGGCCACTTCCTCGGGGTTGAACGAGATCGCCACGTAGAAGAAGGCGAAGAACACGATCAACAGGAAGTAGGCCGTCACGTAGTACGGGTGGTCACCCTTGACGAAGTTGTCCTGGATCCAGGTCTTCCAACCCGAGGTGGAGCTGGAGAACTGCGCGATCAGCGCGGGGATGTACAGCAGCGAAGAGGCGAAGATGACCGGGATCACACCGGCCTGGTTCACCTTGAGGGGGATGTACGTCGAGGTCCCGCCGTAGGAGCGACGGCCGATCATCCGCTTCGCGTACCGCACGGGTGACGTGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG。

DNA序列是一个物种最直接的特征，具有特异性，是区别其它特种的本质所在。

本发明具有以下优点：

1、Js-1^T对真菌、细菌的生长有很强的抑制作用，具有很好的开发应用前景。

2、Js-1^T的DNA鉴定方法具有真实可靠，一目了然的特点，比经典的形态鉴定误差小，判断更直观。

3、Js-1^T的DNA鉴定方法操作简单，检测时间短，经典的形态鉴定需要检测的指标多，时间长且需要综合起来分析。

附图说明

图1为Js-1^T (CCTCC NO：M2011365)的NRPS电泳图；图中：M为分子量是DL2000的DNA Mark，左侧是具体的分子量，H0表示样品为Js-1^T，H0上的条带为750bp；

图2为Js-1^T (CCTCC NO：M2011365)对Ⅰ类疣孢霉的防治效果，防效达68.77%；

图3为Js-1^T (CCTCC NO：M2011365)对Ⅱ类疣孢霉的防治效果，防效达83.84%；

图4为Js-1^T (CCTCC NO：M2011365)对Ⅲ类疣孢霉的防治效果，防效达85.62%；

图5为对照CK的发病情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1、Js-1^T (CCTCC NO：M2011365)的DNA鉴定方法，包括以下步骤：

1.材料选择

菌株来源：链霉菌菌株编号H0，分离自银耳“杨霉霜菌”发病菌筒，即链霉菌Js-1^T。

培养基：PDA斜面培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20 g，蒸馏水1000mL。

Bennett液体培养基：葡萄糖10g，酵母浸膏1g，牛肉浸膏1g，酵母水解酪素（casein）2g,琼脂粉15g，蒸馏水1000mL。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH 7。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂20 g，蒸馏水1000mL，pH 7。

试剂与仪器：

CTAB抽提液：100 mmol/L Tris-HCl， 2.0% CTAB，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，pH 8.0;

CTAB 沉淀液：50 mmol/L Tris-HCl，1.0% CTAB，10 mmol/L EDTA，pH 8.0;

CTAB/NaCl：0.7 mol/L NaCl， 10% CTAB；

氯仿异戊醇：体积比氯仿比异戊醇为24比1；

TE缓冲液：10 mmol/L Tris HCl ，1 mmol/L EDTA；

0.5×TBE：44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3、1 mmol/L EDTA;

上样缓冲液：0.1％溴酚蓝, 40% 蔗糖；

EB：10 mg/mL溴化乙锭；

PCR扩增试剂及酶均购自大连宝生物公司。

主要仪器：

SW-CJ-1FB型单人水平垂直两用净化工作台：苏州净化设备有限公司

灭菌锅：上海三申

HYG-A全温摇瓶柜：太仓市实验室

冷冻离心机：Sigma 3K30

PCR扩增仪：Eppendorf AG22331 Hamburg

掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机

SDC-6节能型智能恒温槽：宁波新芝生物科技股份有限公司

凝胶成像系统：TANON-2008

2鉴定方法

2.1菌株活化使用接种环将Js-1^T菌株划线接种于PDA斜面上，28℃培养7-10天。

2.2菌丝培养与收集

（1）将步骤2.1获得的再生菌株转接含100mL Bennett液体培养基的250 mL广口三角瓶中；

（2）放置于28℃培养箱，静置培养7～10 d；

（3）用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；

（4）称取0.5～1.3g菌丝,用滤纸包好，保存于-20℃备用。

2.3 CTAB法提取基因组DNA

（1）取步骤2.2（4）保存备用的菌丝0.5～1.3g放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7mL的离心管；

（2）加2.5 mL 65℃预热的抽提液，同时加入50 μL巯基乙醇,上下震荡,使蛋白质变性沉淀；

（3）65℃水浴1h，每隔10min振荡1次；

（4）加入2.5 mL的氯仿异戊醇混匀，除去蛋白质；

（5）8000 r/min,4℃离心10min,取上清到7mL管；

（6）加1/5体积65℃预热的CTAB/NaCl混匀，加入2.5 mL的氯仿异戊醇混匀；

（7）10000r/min, 4℃离心10min，取上清；

（8）加入2.5 mL 65℃预热的CTAB沉淀液，颠倒混匀，65℃水浴1h；

（9）12000r/min,4℃离心10min后，去除上清液；

（10）用0.5mL TE溶液或无菌水溶解沉淀10min；

（11）加入0.25mL饱和酚和0.25mL氯仿异戊醇,混匀；

（12）12000 r/min，4℃离心10min，取上清，加入2倍体积在4℃预冷的无水乙醇，混匀；

（13）放置-20℃冰箱1h或过夜；

（14）12000 r/min，4℃离心10 min，弃上清；

（15）自然风干沉淀，用30 μL TE溶液或无菌去离子水溶解沉淀， -20℃保存备用。

2.4 NRPS合成酶基因的扩增

NRPS-PCR扩增反应体系：1μL 含量50～100 ng的DNA，2.5μL 10×PCR buffer，2μL 浓度为2.5 m mol/L的 dNTP，1μL 浓度为10μmol/L的A3, A3序列为5’-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3’，1μL浓度为10μmol/L的A7R，A7R序列为5’-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3’，0.3 μL酶活为5 U/uL 的Taq DNA Polymerase,17.2 μL ddH₂O。

NRPS-PCR扩增反应体系：95℃预变性5 min；95℃变性30s，59℃退火2min，72℃延伸1min, 35个循环；72℃延伸10min。

2.5 电泳检测

经NRPS-PCR的扩增产取8μL与2μL上样缓冲液混匀，点样于重量比为1.2%的琼脂糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳50min；经电泳检测，如图1所示，得到一个750bp的DNA片段。

2.6 目的基因片段的克隆

2.6.1连接

将经电泳检测的NRPS-PCR扩增的DNA片段，连接到载体pMD 18-T Vector上，操作方法按TaKaRa公司提供的pMD 18-T Vector说明书操作。

2.6.2转化

（1）每管感受态细胞100μL中加入10μL连接产物，混匀，在冰中放置30 min；

（2）离心管在42℃静止水浴1～2min；

（3）将离心管转移到冰浴中，冷却2 min；

（4）加入890μL LB液体培养基，37℃ 120rpm摇床培养45min～1h，使细菌复苏；所述LB液体培养基为胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g,pH7，蒸馏水1L。

（5）将融化的LB固体培养基在无菌操作下倒进已灭菌过的培养皿中，每200mL LB加200μL 100mg/mL氨苄青霉素，使其终浓度为100μg/mL；

（6）吸取200μL已转化的感受态细胞到凝固的LB平板上，涂布均匀，封口膜封口；

（7）平板室温静置10 min至液体被吸收，将培养皿倒置于37℃培养箱中培养12 h-16h至菌落可见。

2.6.3阳性菌落的筛选

1、待“2.6.2”的“（7）”中的培养皿上出现菌落直径小于等于1mm时，用接种环挑取边缘齐整的单菌落，划线至新的LB平板上37℃培养，并做好编号。新菌落长出后，用接种环刮一环到20μL无菌双蒸馏水中，混匀后取其中的2μL作为PCR扩增的模板，用通用引物进行PCR验证，若PCR产物大小比750bp大150bp，则挑取的菌落为阳性菌落。

菌落PCR扩增体系：2μL 菌液，2.5μL 10×PCR buffer，2μL 浓度为2.5 m mol/L的 dNTP，1μL 浓度为10μmol/L的RV-M，RV-M序列为5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’，1μL浓度为10μmol/L的M13-47，M13-47序列为5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，0.3 μL酶活为5 U/uL 的Taq DNA Polymerase,17.2 μL ddH₂O。

菌落PCR扩增程序：95℃预变性7 min；95℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min, 35个循环；72℃延伸10min。

2.7.1 目的基因片段的测序

用接种环挑起一环经过验证得到的阳性克隆菌体接种到含有1mL液体LB培养基的离心管中振荡培养4～6小时后送DNA测序公司进行测序。

用DNAMAN V6软件对测序结果进行拼接，并截去两端pMD 18-T上的序列，余下的序列即为Js-1^T的鉴别序列。

2.7.2 测序结果如下：

CCCACGATGATCAGGATGCTGGTGCCACCGATCGAGTTGCCCGCACCGCCATAGCTCGCCAACGCCACCGTCGGCGCGAGAGCGATCAGCCCCAGGTACAGCGAACCCGGCCACGTGATCCGGTTGAGCACGTAGCTCAGGTACTCAGCGGTCGGACGACCGGCGCGAATACCTGGGATGAAGCCACCATACTTCTTCATATTGTCGGCCACTTCCTCGGGGTTGAACGAGATCGCCACGTAGAAGAAGGCGAAGAACACGATCAACAGGAAGTAGGCCGTCACGTAGTACGGGTGGTCACCCTTGACGAAGTTGTCCTGGATCCAGGTCTTCCAACCCGAGGTGGAGCTGGAGAACTGCGCGATCAGCGCGGGGATGTACAGCAGCGAAGAGGCGAAGATGACCGGGATCACACCGGCCTGGTTCACCTTGAGGGGGATGTACGTCGAGGTCCCGCCGTAGGAGCGACGGCCGATCATCCGCTTCGCGTACCGCACGGGTGACGTGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG

实施例2、Js-1^T (CCTCC NO：M2011365)抑制细菌和真菌试验，包括以下步骤：

1、供试菌株

供试菌株：Js-1^T菌株分离自银耳菌袋，现保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏号：CCTCC NO：M2011365）。

指示细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

指示真菌：有害疣孢霉菌(Mycogone Perniciosa Magn)、稻瘟菌(Pyricularia grisea)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、根霉(Rhizopus spp.)，镰刀菌（Fusarium spp.）、菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、香蕉枯萎病菌天蓝一号(Banana vasicular wilt)。

2、培养基

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂条20g，蒸馏水1000mL。

液体LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH 7；

3、主要仪器：

pH计：UB-7型；

隔水式恒温培养箱：Gsp-9160MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

生化培养箱：Spx-250B-Z，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

洁净工作台：VS-1300L-u，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；

4、试验方法

4.1 Js-1^T菌株培养

将Js-1^T菌接种于直径为9cm装有PDA培养基的平皿，置于28℃恒温培养箱培养12-14天，备用。

4.2 Js-1^T菌株对细菌的抑制作用

1、用接种环分别取一环大肠杆菌、枯草芽孢杆菌接种到不同的装有10mL液体LB培养基的试管内，在160r/min，37℃的恒温摇床中培养24h，备用。

2、融化90mL固体PDA培养基，待冷却至40℃时，快速加入5mL“1”中培养好的菌液，混合均匀后倒平板。待培养基凝固后在平板中心位置接种直径为1cm的Js-1^T菌株的菌块，每种细菌设置3个重复，37℃培养48h后测量透明圈即抑菌圈的大小。

4.3 Js-1^T菌株对真菌的抑制作用

1、把指示真菌的菌株接种于9cm装有PDA培养基的平皿，置于25℃恒温培养箱培养7-10天，

2、用直径为1cm的打孔器在“1”的平板上打取菌块。

3、在直径为9 cm装有PDA培养基的平皿中央画“十”字形，重复3皿，

4、用直径为1cm的打孔器在步骤4.1培养好的Js-1^T菌株平皿打取菌块，取菌块接种到 “3”中平皿“十”交叉的位置，

5、同时把“2”中打取的菌块接种到“3”中“十”字线两端距离中心3cm处，置于25℃下培养，

6、把“2”中的菌块接种到装有PDA培养基的平皿中央，置于25℃下培养，作为对照组，重复3皿，

7、待对照组“6”中的指示真菌接近长满培养皿时开始测量菌落直径，记为D1，同时测量“3”中指示真菌的菌落直径，记为D2，

8、抑菌圈大小为D1减去D2。

5、试验结果：

5.1 Js-1^T菌株对细菌的抑制作用

将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别混入PDA培养基中倒平板，培养结束时菌落会布满整个平板而使平板呈不透明状态。接有Js-1^T菌块的平板，在Js-1^T菌块周围两种细菌均不能够生长，出现不同大小的透明圈。说明Js-1^T菌株对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都具有抑制作用，对大肠杆菌的抑菌圈为2.76cm，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈为1.26cm。

菌株对真菌的抑制作用

Js-1^T菌株对真菌的抑制作用如表1所示，Js-1^T菌株对核盘菌、有害疣孢霉菌的抑制作用最显著，对峙培养时两类病原真菌基本不能生长；对木霉、根霉、香灰菌、稻瘟菌也具有较明显的抑制作用，产生的抑菌圈直径均不小于2.90cm，Js-1^T对镰刀菌和香蕉枯萎病菌也具有抑制作用，使两种致病菌的菌落形态发生变异，致使镰刀菌产生的红色素减少、香蕉枯萎病菌菌丝变稀薄，但是抑菌圈不够显著。

表1 Js-1^T菌株对真菌的抑制作用

Figure 2012102073845100002DEST_PATH_IMAGE001

5.3 Js-1^T菌株对三个类群疣孢霉的田间防治效果

Js-1^T菌株发酵液对有害疣孢霉(Mycogone Perniciosa Magn)的三个类群，疣孢霉Ⅰ类、疣孢霉Ⅱ类和疣孢霉Ⅲ类，侵染引起的栽培中双孢蘑菇2796的疣孢霉病进行防治试验，试验用Js-1^T菌株发酵液处理供试被有害疣孢霉菌感染的双孢蘑菇覆土，每处理20m²进行正常的出菇管理，10天后按5点取样法统计新长出双孢蘑菇子实体的病菇和健菇的数目，计算发病率和防治效果，结果见表2。田间实验结果显示Js-1^T菌株发酵液对三个类群疣孢霉Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类引起的栽培中双孢蘑菇2796的疣孢霉病的防治效果显著，如图2、3、4、5所示，与对照CK比较，防治效果分别达68.77%、83.84%、85.62%。

表2 Js-1^T菌株发酵液对三类疣孢霉菌引起双孢蘑菇病害防治效果

Figure 2012102073845100002DEST_PATH_IMAGE002

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

<110> 福建农林大学

<120> 一种链霉菌新菌株及DNA鉴定方法

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 574

<212> DNA

<213> Streptomyces fujianensis sp

<400> 1

cccacgatga tcaggatgct ggtgccaccg atcgagttgc ccgcaccgcc atagctcgcc 60

aacgccaccg tcggcgcgag agcgatcagc cccaggtaca gcgaacccgg ccacgtgatc 120

cggttgagca cgtagctcag gtactcagcg gtcggacgac cggcgcgaat acctgggatg 180

aagccaccat acttcttcat attgtcggcc acttcctcgg ggttgaacga gatcgccacg 240

tagaagaagg cgaagaacac gatcaacagg aagtaggccg tcacgtagta cgggtggtca 300

cccttgacga agttgtcctg gatccaggtc ttccaacccg aggtggagct ggagaactgc 360

gcgatcagcg cggggatgta cagcagcgaa gaggcgaaga tgaccgggat cacaccggcc 420

tggttcacct tgagggggat gtacgtcgag gtcccgccgt aggagcgacg gccgatcatc 480

cgcttcgcgt accgcacggg tgacgtgaat ctctagagga tccccgggta ccgagctcga 540

attcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtg 574

Claims

1.一种链霉菌新菌株，其特征在于该菌株为链霉菌(Streptomyces fujianensis sp)，CCTCC NO：M2011365，简称Js-1^T。

2.一种如权利要求1所述的Js-1^T(CCTCC NO：M2011365)的DNA鉴定方法，包括菌株活化、菌丝培养与收集、CTAB法提取基因组DNA、NRPS合成酶基因的扩增、目的基因片段的克隆和目的基因片段的测序；其特征在于测序的结果如下：