CN115125157B - 一种拮抗作物病原微生物的链霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本本发明属于微生物领域，具体涉及一种拮抗作物病原微生物的链霉菌及其应用。本发明所述的链霉菌，为冠霉素链霉菌(Streptomyces Chrestomyceticuss)s‑24，保藏编号为CCTCC No：M 2017353。本发明所述的冠霉素链霉菌s‑24对多种病原菌有拮抗作用，尤其是对香蕉枯萎病菌4号小种拮抗作用显著，在防治防治香蕉枯萎病方面，具有广阔的发展空间，为植物病害的生物防治提供了备选资源。

Description

一种拮抗作物病原微生物的链霉菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种拮抗作物病原微生物的链霉菌及其应用。
背景技术
链霉菌是已知放线菌中最大的族群，可产生高达一千多种的抗生物质，在医药、饲料、农作物生产方面具有广泛的应用。
香蕉(Musa spp.)是热带、亚热带水果，是世界三大水果之一，属于芭蕉科(Musaceae)、芭蕉属(Musa)的单子叶草本植物。香蕉喜湿高温，广泛分布在亚洲、非洲和美洲等136个国家和地区[1]。在全球除了水稻、小麦和玉米，香蕉是世界第四粮食作物，是仅次于柑橘的第二大水果，更是世界水果贸易量最大的鲜果。香蕉枯萎病是目前威胁我国香蕉产业可持续发展的重大病害,该病是由尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusariumoxysporum f.sp.cubense race 4,FOC4)侵染而引起维管束坏死的土传真菌性病害。综合现有的研究和田间实际应用效果来看，生物拮抗菌的应用，不仅可以直接抑制病菌的生长蔓延，而且可以促进香蕉植株的生长，更重要的是能改变土壤中的微生物种类、结构和数量，因此生物拮抗菌是香蕉枯萎病一个十分重要的防控措施,研发用于防治香蕉枯萎病的微生物菌剂，在香蕉枯萎病的防治中具有广阔的前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种冠霉素链霉菌，对香蕉枯萎病菌等多种病原菌均具有良好的拮抗作用，在农作物病原微生物防治中具有广阔的发展空间，具有很好的开发应用前景。
本发明的第一个方面是提供一种拮抗作物病原微生物的链霉菌，其为冠霉素链霉菌(Streptomyces Chrestomyceticuss)s-24，保藏编号为CCTCC No：M 2017353。
本发明的第二个方面是提供如本发明第一个方面所述的链霉菌在拮抗香蕉枯萎病菌中的应用。
进一步地，所述链霉菌应用于拮抗香蕉枯萎病菌1号小种、和/或香蕉枯萎病菌4号小种。
本发明的第三个方面是提供如本发明第一个方面所述的链霉菌在防治香蕉枯萎病中的应用。
本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的链霉菌在拮抗小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、和/或香蕉长形斑病菌(Curvularia fallax)、和/或辣椒炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、和/或黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumF.spcucumerinum)、和/或板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、和/或菠萝疫霉病菌(Phytophthora cinnamomi Rands)、和/或芒果炭疽病菌(Colletotrichum musae)、和/或杨桃叶斑病菌(Pseudomonas syringae)中的应用。
本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的链霉菌在制备防治小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、和/或香蕉长形斑病菌(Curvularia fallax)、和/或辣椒炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、和/或黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumF.spcucumerinum)、和/或板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、和/或菠萝疫霉病菌(Phytophthora cinnamomi Rands)、和/或芒果炭疽病菌(Colletotrichum musae)、和/或杨桃叶斑病菌(Pseudomonas syringae)所致病害的生防制剂中的应用。
本发明的第六个方面是提供一种菌剂，其含有本发明第一个方面所述的链霉菌。
本发明的冠霉素链霉菌s-24对多种病原菌有拮抗作用，尤其是对香蕉枯萎病菌4号小种拮抗作用显著，在防治植物病害，特别是防治香蕉枯萎病方面，具有广阔的发展空间，为植物病害的生物防治提供了备选资源。
附图说明
图1为基于16S rDNA序列构建的菌株s-24与相关菌株的系统发育树；
图2为菌株s-24对香蕉枯萎病菌的拮抗效果；
图3为菌株s-24对香蕉盆栽苗生长的影响；
图4为不同处理组植株鲜重比较；
图5为不同处理组植株株高的比较；
图6为不同处理组植株SOD活性的比较；
图7为不同处理组植株CAT活性的比较。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
本发明提供了一种拮抗病原微生物的链霉菌，其为冠霉素链霉菌s-24(Streptomyces Chrestomyceticus s-24)，保藏编号为CCTCC No：M2017353，保藏日期为2017年6月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)。本发明的冠霉素链霉菌s-24从生长良好的蕉园土壤中分离得到。
1菌株鉴定
1.1 16S rDNA序列分析
选用细菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)建立PCR扩增体系进行扩增(PCR反应体系和反应条件见表1-2)。产物经纯化后测定基因序列；采用GenBank搜索序列相似性，选取相似性较高的模式菌株序列，用MEGA5.0中Neighbor-Joining法比较同源性，构建系统发育树图1所示。结果表明，该菌株为冠霉素链霉菌(Streptomyces Chrestomyceticus)，命名为冠霉素链霉菌s-24(Streptomyces Chrestomyceticus s-24)。系统发育树如图1所示。
表1 16s rDNA基因的PCR反应体系
Figure GDA0003823321480000031
Figure GDA0003823321480000041
表2 16s rDNA基因的PCR扩增反应条件
Figure GDA0003823321480000042
1.2菌株的分类鉴定
1.2.1形态与培养特征观察
采用不同的培养基28℃培养7～21d，观察菌株培养特征，包括生长情况、气生菌丝、基内菌丝、孢子丝特征等；酵母膏麦芽膏琼脂培养基上取灭菌的盖玻片以45°角斜插入划线处，28℃培养7～21d，观察盖玻片上气生菌丝、孢子丝及孢子形状。本实验所用的培养特征观察培养基见表3。
表3培养特征观察培养基
Figure GDA0003823321480000043
Figure GDA0003823321480000051
实验表明，冠霉素链霉菌s-24在6种供试培养基上生长良好，其菌落形态见表4。
表4冠霉素链霉菌s-24的培养特征
Figure GDA0003823321480000052
1.2.2生理生化特征
(1)H2S产生实验
实验培养基：蛋白胨10g，柠檬酸铁0.5g，pH7.2。H2S与柠檬酸铁反应生成FeS，呈黑色。菌株接种于上述培养基上，培养7～14d，若有黑色素产生，说明有H2S产生。以未接种的培养基作为对照。
(2)碳源利用实验
碳源利用基础培养基：(NH4)2HPO4 1g，NaCl 1g，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO40.5g，纯琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。将新鲜的待测菌株分别接入含有1％的半乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、木糖、肌醇、甘露醇、松二糖、果糖、乳糖、核糖、蜜二糖、麦芽糖、山梨糖、鼠李糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖的基础培养基上，培养7～14d，观察其生长情况。
(3)氮源利用实验
氮源利用基础培养基：D-葡萄糖10g，MgSO4·7H2O 5g，、NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，K2HPO4 0.1g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。将单一氮源按照0.5％的浓度加入氮源基础培养基中，以不加任何氮源的基础培养基作为空白对照，然后接入待测菌株，于28℃下培养7～14d，观察菌株的生长情况，生长优于对照的记录为阳性，表明该菌株具有利用该氮源的能力；相反，生长不如对照或差别不明显则为阴性，表明没有利用该氮源的能力。
(4)脲酶实验
配制脲酶培养基：蛋白胨1g，NaCl 0.5g，葡萄糖1g，KH2PO4 2g，酚红0.012g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 6.8-6.9。将待测菌株接种到脲酶培养基上，28℃倒置培养4d，观察培养基颜色变化。若培养基变成桃红色，则为阳性，不变色，则为阴性。
(5)脂酶(吐温-20、-40、-80)实验
配制脂酶培养基：蛋白胨1g，NaCl 5g，CaCl2·7H2O 0.1g，琼脂9g，蒸馏水1000mL，pH 7.4。将单独灭菌的吐温-20、-40、-80与培养基混合制板，将菌株接种于平板上，28℃倒置培养7～14d，若菌落周围产生晕圈，则为阳性，反之，则为阴性。
冠霉素链霉菌s-24生理生化特征见表5所示：
表5冠霉素链霉菌s-24的部分生理生化特征
Figure GDA0003823321480000061
Figure GDA0003823321480000071
“+”：结果为阳性；“－”：结果为阴性。
2.菌株s-24拮抗活性评价
待测病原菌：香蕉枯萎病1号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense Race 1)、香蕉枯萎病4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、香蕉长形斑病菌(Curvularia fallax)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumF.sp cucumerinum)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、菠萝疫霉病菌(Phytophthora cinnamomiRands)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、杨桃叶斑病菌(Pseudomonassyringae)。
2.1 PDA平板对峙法测定拮抗作用
采用PDA平板对峙法测定冠霉素链霉菌s-24对病原菌的拮抗作用。在平板四周离中心2cm处接入纯化后的菌株s-24，平板中央接入直径为5mm的待测病原菌菌饼，28℃对峙培养3～7d，以不接拮抗菌的平板为对照，每个处理三次重复，测量抑菌带宽度，分析衡量菌株对病原菌的抑制作用。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17-20g，ddH2O 1000mL，pH：7.0。
结果表明，菌株s-24对待测病原菌均有不同程度的拮抗作用(表5)，对于香蕉枯萎病4号小种抑制比较明显，抑菌带宽度为8.2mm(图2)。菌株S-24对各待测病原菌的抑菌带宽度见表6。
表6冠霉素链霉菌s-24对病原菌的抑制效果
Figure GDA0003823321480000072
Figure GDA0003823321480000081
2.2冠霉素链霉菌s-24对病原菌菌丝生长的抑制作用
冠霉素链霉菌s-24经大豆粉液体发酵培养基发酵培养3d后，发酵液6000rpm低速离心1min，取上清液与加热熔化的液体PDA培养基，按1：9的体积比充分混匀后倒入培养皿，(以无菌水与PDA培养基混合液为对照)。待PDA培养基凝固后，在平板中央接入直径为5mm的新鲜病原菌菌饼，病原菌菌丝面贴于培养基上，每个处理设置三个重复，28℃下培养3～5d后，运用十字交叉法测定病原菌生长直径，并计算抑制率。
抑制率(％)＝[(对照菌直径－处理菌直径)/(对照菌直径－菌饼直径)]×100％。
大豆粉液体发酵培养基：大豆粉10.0g，NaCl 2.5g，CaCO3 2.0g，蛋白胨3.0g，葡萄糖10.0g，pH 7.2～7.4。
结果表明，菌株s-24发酵液对待测病原菌的菌丝生长均有抑制效果(表7)。结果显示，冠霉素链霉菌s-24发酵液对香蕉枯萎病菌4号小种菌丝生长的抑制效果最显著，抑制率可以达到分别为47.4％。
表7冠霉素链霉菌s-24对病原菌菌丝生长的抑制效果
病原菌 抑制率(％)
Foc1 33.7
Foc4 47.4
小麦赤霉病菌 31.6
香蕉长形斑病菌 15.8
辣椒炭疽病菌 41.1
黄瓜枯萎病菌 42.1
板栗疫病菌 18.9
菠萝疫霉病菌 37.9
芒果炭疽病菌 32.6
杨桃叶斑病菌 40.0
2.3冠霉素链霉菌s-24对香蕉幼苗防治情况
制备病原菌孢子悬浮液:活化后的FOC4病原菌接种到YPD液体培养基里28℃，165rad/min振荡培养3d；无菌水稀释至孢子浓度为105CFU/mL的病原菌孢子悬浮液。
YPD液体培养基组成:1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖。
盆栽试验:统一选择株高25cm、四叶新片的幼苗移栽至塑料盆钵中。CK1组和S-24组选择易感品种巴西蕉，CK2组为抗性品种南天黄。实验开始前，各个组均采用伤根浸泡浓度为105CFU/mL的FOC4孢子悬浮液30min，接种病原菌。接种之后将各组幼苗栽好，立即浇灌不同的处理液：CK1和CK2浇灌清水，S-24组浇灌菌株s-24发酵液，每次每株均浇灌100mL，分别在0d、7d、14d、21d、28d施入，共计5次。每个处理各设3个重复，每个重复香蕉苗盆栽为10株。
在香蕉移栽后，第48天观察记录香蕉植株的发病情况，进行病情指数的统计。并且计算相对于CK1组的防治效果和相对防效。
病情指数分级标准参照Mak等方法，如表8及图3所示。
表8病情指数分级情况
Figure GDA0003823321480000091
Figure GDA0003823321480000092
Figure GDA0003823321480000093
Figure GDA0003823321480000094
Figure GDA0003823321480000095
统计各处理组防治效果，并且计算S-24和CK2相对于CK1的防治效果和相对防效，如表9和图3所示。
表9冠霉素链霉菌s-24对盆栽香蕉苗的防效
Figure GDA0003823321480000101
由统计数据可以看出，浇灌菌株S-24的发酵液，香蕉枯萎病的发病率仅为6.7％，低于两个对照组。防治效果可以达到93.3％，略高于抗病品种南天黄。S-24组的相对防效为92.51％，与南天黄(91.01％)相比，也有一定的提高。因此，浇灌菌株S-24可以有效抑制香蕉枯萎病的发病，说明菌株S-24可以有效抑制香蕉植株枯萎病的发病，对香蕉枯萎病具有显著的防治效果。
2.4香蕉植株生物量统计
第28d浇灌最后一次处理液之前，统计各个处理组香蕉苗的株高、茎围以及植株鲜重。
株高:盆土表面与香蕉植株新叶顶端的距离；
称植株鲜重:连根取出香蕉植株，清水冲洗干净并檫下后，称量记录其支柱的重量。
由图4-5可以看出，植株鲜重和株高两组数据，S-24组明显高于CK1组。说明菌株S-24组，香蕉幼苗生长良好，长势优于CK1组。
2.5相关防御酶活性测定
移栽当天记作第0天，移栽后取第0、7、14、21、28d取香蕉第二片新叶样品，液氮速冻样品，-20℃保存，进行生理生化测定。
测定方法：取置于-20℃冰箱中保存的样品，稍加解冻后切小块，液氮冷冻，用高速粉碎机碾磨成粉末状，装于离心管中做标记后备用。
称取0.1g叶片粉末置于2ml离心管中，加入1ml预冷的50mmol/L磷酸缓冲液(PBS)内含1.33mmol/LEDTA和1％PVPP缓冲液(PH7.8)，然后在冷冻离心机中12000rpm，4℃离心15分钟，置于0～4℃下保存待用。
(1)超氧化物歧化酶SOD活性测定
活性测定采用氮蓝四唑法(NBT)。以抑制50％NBT光还原的酶量定为1个酶活单位。比色皿中反应体系如下：
Figure GDA0003823321480000111
同时设置两支的对照管，以缓冲液代替酶提取液。其中一个对照混匀溶液后立刻避光处理，其余各管置于日光灯4000lx、25℃条件下光照20min。反应结束后用黑色袋子封住避光。以不照光的对照做参比调零，在560nm下测定各反应液的吸光值，并记录数据。
计算公式:
Figure GDA0003823321480000112
A0:照光对照光管的吸光度值；
As:样品管的吸光度值；
Vt:样品液体总体积；
Vs:测定时样品液体体积；
W：样品鲜重。
分别计算各天SOD活性，如图6所示。
由图6可知，实验期间，S-24组香蕉幼苗的SOD活性从第7d开始明显高于CK1，与CK2组相差不多，并且在第21d高于CK2组。说明：S-24可以诱导香蕉苗植株的SOD活性，作用效果明显高于CK1，并且在第21d高于CK2组。
(2)过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性测定
沸水浴1min以杀死酶液制作调零对照管，取粗提液0.2ml+PBS1.5ml+蒸馏水1.0ml，25℃条件下逐管加入0.3mL0.1 mol/L的H2O2，每隔1min测定一次OD240，共四次。结果计算：以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(U)。
由图7可以看出，盆栽实验期间，酶活性高于CK1组，第14天酶活性最强，高于CK1和CK2组。说明：菌株S-24发酵液对香蕉幼苗CAT酶活性具有诱导作用，可以提高香蕉幼苗CAT活性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (7)

1.一种拮抗作物病原微生物的链霉菌，其为冠霉素链霉菌（Streptomyces  Chrestomyceticuss）s-24，保藏编号为CCTCC No：M 2017353，保藏日期为2017年6月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
2.如权利要求1所述的链霉菌在制备拮抗香蕉枯萎病的病原菌的制剂中的应用，所述的香蕉枯萎病的病原菌为香蕉枯萎病1号生理小种、和/或香蕉枯萎病4号生理小种。
3.如权利要求1所述的链霉菌在制备防治香蕉枯萎病的制剂中的应用，所述的香蕉枯萎病的病原菌为香蕉枯萎病1号生理小种、和/或香蕉枯萎病4号生理小种。
4.如权利要求1所述的链霉菌在制备拮抗小麦赤霉病病原菌Fusarium graminearum、和/或香蕉长形斑病病原菌Curvularia fallax、和/或辣椒炭疽病病原菌Colletotrichumacutatum、和/或黄瓜枯萎病病原菌Fusarium oxysporumF.sp cucumerinum、和/或板栗疫病病原菌Cryphonectria parasitica、和/或菠萝疫霉病病原菌Phytophthora cinnamomiRands、和/或芒果炭疽病病原菌Colletotrichum musae、和/或杨桃叶斑病病原菌Pseudomonas syringae的制剂中的应用。
5.如权利要求1所述的链霉菌在制备抑制小麦赤霉病病原菌Fusarium graminearum、和/或香蕉长形斑病病原菌Curvularia fallax、和/或辣椒炭疽病病原菌Colletotrichumacutatum、和/或黄瓜枯萎病病原菌Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum、和/或板栗疫病病原菌Cryphonectria parasitica、和/或菠萝疫霉病病原菌Phytophthoracinnamomi Rands、和/或芒果炭疽病病原菌Colletotrichum musae、和/或杨桃叶斑病病原菌Pseudomonas syringae菌丝生长的制剂中的应用。
6.如权利要求1所述的链霉菌在制备防治小麦赤霉病病原菌Fusarium graminearum、和/或香蕉长形斑病病原菌Curvularia fallax、和/或辣椒炭疽病病原菌Colletotrichumacutatum、和/或黄瓜枯萎病病原菌Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum、和/或板栗疫病病原菌Cryphonectria parasitica、和/或菠萝疫霉病病原菌Phytophthoracinnamomi Rands、和/或芒果炭疽病病原菌Colletotrichum musae、和/或杨桃叶斑病病原菌Pseudomonas syringae所致病害的生防制剂中的应用。
7.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的链霉菌。
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