CN108587974B - 一种贝莱斯芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法 - Google Patents

一种贝莱斯芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌、应用及其发酵液制备方法，所述贝莱斯芽孢杆菌为抗烟草黑胫病病菌的拮抗菌株，该贝莱斯芽孢杆菌已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018004。通过本发明提供的所述贝莱斯芽孢杆菌，能有效拮抗烟草黑胫病病菌，进而达到防治烟草黑胫病的作用。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，尤其涉及一种贝莱斯芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法。
背景技术
我国烟区辽阔，自然条件迥异，烟草本身可塑性强，容易受环境影响而变异，经过人们长期的栽培和选择，形成了各具特色的众多品种，加之不断地从国外引进新品种，形成了类型俱全、数量丰富的烟草资源。虫害和病害是影响烟草农艺性状和经济性状的威胁因子，如烟草黑胫病(Phytophtora parasitica var.nicotianae Tucker)，分布面积广，危害严重。烟草黑胫病是由烟草疫霉菌引起，有关调查统计显示，烟草黑胫病发病率为5％～12％，发病严重的地区最高可达75％；我国每年烟草黑胫病平均发病面积约为10万hm2，产量损失高达3000万kg，产值损失超过1.23亿元人民币。传统的化学防治方法对抗烟草黑胫病的效果不佳，并且连年使用化学药剂，不仅使黑胫病病菌的抗药性有所增强，而且对环境造成巨大污染。
因此，有必要提供一种生物防治烟草黑胫病病菌的方法。
申请内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种贝莱斯芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法，以解决现有烟草黑胫病采用化学药剂防治，致使污染环境的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：提供一种贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌为抗烟草黑胫病病菌的拮抗菌株，所述贝莱斯芽孢杆菌已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018004。
优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌的16s rDNA如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌为抗稻瘟病病菌的拮抗菌株。
优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌为抗金黄色葡萄球菌的拮抗菌株。
本发明还提供了一种如前述的贝莱斯芽孢杆菌在防治烟草黑胫病、水稻稻瘟病、金黄色葡萄球菌上的应用。
本发明还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法：
步骤一，挑取如前述的贝莱斯芽孢杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤二，将所述步骤一中的种子液接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，所述种子液在LB液体培养基中的浓度为5％，在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养24h～48h，制备得到所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB液体培养基包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为9～11g/L，所述酵母提取物的浓度为4～6g/L，所述氯化钠的浓度为0.8～1.2g/L。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的所述贝莱斯芽孢杆菌能有效抑制烟草黑胫病病菌的生长，并在一定时间段内，持续具有显著的抑制作用，为防治烟草黑胫病病菌提供了新的选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的拮抗菌株在LB固体培养基培养后的菌落形态图；
图2为本发明提供的拮抗菌株的芽孢形态图；
图3为本发明提供的拮抗菌株PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌在PDA固体培养基上与烟草黑胫病病菌的拮抗实验图；
图5为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌在NB固体培养基上与烟草黑胫病病菌的拮抗实验图；
图6为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌在PDA固体培养基上与稻瘟病病菌的拮抗实验图；
图7为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液的除菌滤液在PDA固体培养基上与稻瘟病病菌的拮抗实验图；
图8为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液的除菌滤液在LB固体培养基上与金黄色葡萄球菌的拮抗实验图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
为描述方便，以下将本发明提供的拮抗菌株命名为BV1。本领域技术人员可以理解的是，以下实施例中的所述BV1与所述拮抗菌株为同一菌株。
本发明提供一种拮抗烟草黑胫病的微生物菌株的筛选方法，具体包括以下步骤：
分离纯化：称取多年施用于烟草田间的饼肥5g于50ml离心管中，加入15ml无菌水中，用震荡器充分震荡，2000rpm离心2min，取菌悬液10μl，加入无菌水，依次稀释成浓度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分别涂布于LB(Luria-Bertani)固体培养基和PDA固体培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上，倒置放置于30℃下培养，待其长出微生物，对平板上长出的单菌落进行划线分离纯化，得到待选菌株，加甘油，于-80℃保存；
拮抗实验：将烟草黑胫病病菌加入PDA固体培养基中进行活化，待长出菌丝后，用打孔器打一菌饼置于另一新鲜的PDA固体培养基平板中央，倒置放置于30℃下继续培养。将分离出的所述待选菌株接种于菌饼周围，每个平板接种4个，30℃恒温下培养，根据有无抑菌带和/或抑菌圈的大小来判断其拮抗效果；
二次拮抗实验：参照前述拮抗实验，对具有拮抗作用的待选菌株进行第二次拮抗实验，筛选出一株拮抗能力较强的菌株，命名为BV1。
本发明采用以下方法对BV1进行鉴定。
请参阅图1，图1为本发明提供的拮抗菌株在LB固体培养基培养后的菌落形态图。具体为将BV1接种于LB固体培养基上，进行划线培养，倒置于30℃条件下，培养14～16小时。由图1可看出，BV1的菌落大小中等，呈白色，不透明，边缘不整齐，扁平，表面干燥形成褶皱。请参阅图2，图2为本发明提供的拮抗菌株的芽孢形态图，在400倍放大下，观察到反光的芽孢。对BV1进行生理生化鉴定，具体BV1的生理生化特性如表1所示。
表1菌株BV1的生理生化鉴定结果表
项目 结果
革兰氏染色 阳性
蔗糖 阴性
甲基红实验 阴性
可溶性淀粉 阳性
H<sub>2</sub>S 阳性
淀粉水解实验 阳性
麦芽糖 阳性
对BV1进行分子实验鉴定。
挑取一个单菌落，放入预先装有10μL无菌水的PCR管中，枪头吸打混匀，作为PCR扩增所用的菌液模板。参照以下扩增体系进行PCR扩增。
其中2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)购至北京全式金生物技术有限公司，其中预含有DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液、电泳缓冲液等PCR扩增所需的常用试剂，本领域技术人员可根据需要直接选择其他PCR扩增试剂盒，或是根据需要自行采用独立的DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液进行PCR扩增。本实施例中，上下游引物采用27F和1492R，上下游引物的具体序列为：
27F：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
1492R：5′-CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3′。
扩增条件为：
98℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，重复30个循环；72℃10min。
请参阅图3，图3为本发明提供的拮抗菌株PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。经过PCR扩增得到的扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，在1500bp附近有明显的条带。对扩增产物进行双向测序，测序得到的基因序列，即16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。将测序得到的基因序列与NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的核苷酸序列进行比对，结果显示，BV1与菌株Bacillus velezensis LBUM288相似性高达100％。
结合BV1的形态结构特征及生理生化特性，确定BV1具体为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis BV1)。所述贝莱斯芽孢杆菌为抗烟草黑胫病病菌的拮抗菌株，所述贝莱斯芽孢杆菌已于2018年01月02日在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018004。
对BV1抗烟草黑胫病病菌的拮抗能力进行测定。
将烟草黑胫病病菌接种在PDA固体培养基上活化，长出菌丝后用打孔器取一个菌饼接种在新鲜PDA固体培养基的中央，取BV1的单菌落在距离烟草黑胫病菌饼2cm处划线，形成平行线，30℃下培养。设置3个重复试验，分别在第4天、第6天测量抑菌带的长短，然后计算平均值。请参阅图4，图4为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌在PDA固体培养基上与烟草黑胫病病菌的拮抗实验图，其中，右图为拮抗平板，同时接种了BV1和烟草黑胫病病菌；左图为空白平板，仅接种了烟草黑胫病病菌，由图4和表2可观察到，BV1对烟草黑胫病病菌具有良好的拮抗作用，并且BV1对烟草黑胫病病菌的抑制能力在一周内都保持较高的水平。
表2BV1在PDA固体培养基上拮抗烟草黑胫病病菌的抑制距离值
实验一 实验二 实验三 平均值
第一次测量(mm) 8 7 7 7.3
第二次测量(mm) 6 6 5 5.7
将烟草黑胫病病菌接种在PDA固体培养基上活化，待长出菌丝后用打孔器打一个菌饼，将菌饼接种在新鲜NB固体培养基的中央，其中，NB固体培养基包括蛋白胨1％(W/V)，牛肉膏0.3％(W/V)，氯化钠0.5％(W/V)，调整pH值为7.0～7.2。将BV1的单菌落在距离黑胫菌饼2cm处划线，形成平行线，30℃下培养。设置3个重复试验，分别在第4天、第6天测量抑菌带的长短，然后计算平均值。请参阅图5，图5为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌在NB固体培养基上与烟草黑胫病病菌的拮抗实验图，其中，平皿A为划有一条BV1单菌落和烟草黑胫病菌饼的拮抗平板；平皿B为空白平板，仅设有烟草黑胫病菌饼；平皿C为划有二条BV1单菌落和烟草黑胫病菌饼的拮抗平板，由图5和表3，可得到BV1对于烟草黑胫病病菌具有较好的拮抗作用，BV1对烟草黑胫病病菌的抑制在一周内都保持更高的水平，两次测量的抑菌带大小几乎一致。
表3BV1在NB固体培养基上拮抗烟草黑胫病病菌的抑制距离值
实验一 实验二 实验三 平均值
第一次测量(mm) 11 11 10 10.7
第二次测量(mm) 11 10 10 10.3
对BV1抗稻瘟病病菌的拮抗能力进行测定。
稻瘟病是由半知菌亚门真菌的稻梨孢(Phyricularia grisea(Cooke)Sacc.)寄生所引起，病害的扩展靠分生孢子在空气中传播。
将稻瘟病病菌接种在PDA固体培养基上活化，待长出菌丝后用打孔器取一个菌饼，制成稻瘟病病菌拮抗试验平板。BV1的单菌落在距离稻瘟病菌饼2cm处划线，形成平行线，30℃下培养。设置3个重复试验，分别在第4天、第6天测量抑菌带的长短，然后计算平均值。请参阅图6，图6为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌在PDA固体培养基上与稻瘟病病菌的拮抗实验图，其中，平皿A为划有二条BV1单菌落和稻瘟病菌饼的拮抗平板；平皿B为划有一条BV1单菌落和稻瘟病菌饼的拮抗平板；平皿CK为空白平板，仅设有稻瘟病菌饼。由图6和表4，可得到BV1对于稻瘟病病菌具有较好的拮抗作用，BV1对稻瘟病病菌的抑制在一周内都保持更高的水平，两次测量的抑菌带大小几乎一致。
表4BV1在PDA固体培养基上拮抗稻瘟病病菌的抑制距离值
实验一 实验二 实验三 平均值
第一次测量(mm) 17 18 16 17
第二次测量(mm) 16.5 17 16 16.5
挑取BV1的单菌落于装有15ml LB液体培养基的50ml的三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养48h，制成BV1菌悬液；取2ml BV1菌悬液，10000rpm离心1min，然后用22mm一次性细菌过滤器过滤，得到的滤液放于-20℃备用。将稻瘟病病菌接种在PDA固体培养基上活化，长出菌丝后用打孔器取一个菌饼接种在新鲜PDA固体培养基的中央，制成稻瘟病病菌拮抗试验平板。在距离菌饼2cm处用打孔器打三个孔，然后取所述滤液100μl加入孔内，形成三个重复。置于30℃培养，分别在第4天、第6天测量抑菌圈的大小。请参阅图7，为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液的除菌滤液在PDA固体培养基上与稻瘟病病菌的拮抗实验图，其中，CK2平皿为空白平板，仅设有稻瘟病菌饼；CK1平皿为空白平板，仅设有稻瘟病菌饼和无菌水；A平皿为拮抗平板，设有稻瘟病菌饼和BV1菌悬液的除菌滤液。由图7和表5，可得到BV1菌悬液的除菌滤液对于稻瘟病病菌同样具有较好的拮抗作用，所述贝莱斯芽孢杆菌为抗稻瘟病病菌的拮抗菌株。
表5BV1菌悬液的除菌滤液拮抗稻瘟病病菌的抑菌圈大小
实验一 实验二 实验三 平均值
第一次测量(mm) 17 18 16 17
第二次测量(mm) 16.5 17 16 16.5
对BV1抗金黄色葡萄球菌的拮抗能力进行测定。
将纯化后的BV1拮抗菌，单菌落接种在LB固体培养基上，30℃培养一天；挑取BV1单菌落于装有15ml LB液体培养基的50ml的三角瓶中，30℃，180r/min振荡恒温培养48h，制成菌悬液；取2ml菌悬液，10000rpm离心1min，然后用一次性细菌过滤器过滤，得滤液备用。活化金黄色葡萄球菌，挑取单菌落于LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养，直至OD600值在0.6～0.8之间，取50μl金黄色葡萄球菌菌液加1ml无菌水稀释制成稀释菌液备用，按照20μl稀释菌液配45mlLB固体培养基的比例倒板，制成金黄色葡萄球菌拮抗平皿。在金黄色葡萄球菌拮抗平皿的中央打孔，每孔滴加滤液100μl，三个重复。置于30℃培养，分别在第4天、第6天测量抑菌圈的大小。请参阅图8，为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液的除菌滤液在LB固体培养基上与金黄色葡萄球菌的拮抗实验图，其中，A平皿、B平皿和C平皿为金黄色葡萄球菌拮抗平板，在含有金黄色葡萄球菌的LB固体培养基上加入BV1菌悬液的除菌滤液，CK平皿为空白平板，仅含有金黄色葡萄球菌的LB固体培养基。由图8和表6，可得到BV1菌悬液的除菌滤液对金黄色葡萄球菌具有较好的拮抗作用，所述贝莱斯芽孢杆菌为抗金黄色葡萄球菌的拮抗菌株。
表6BV1菌悬液的除菌滤液拮抗金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小
实验一 实验二 实验三 平均值
抑菌直径(mm) 34/34 35/35 35/35 34.7/34.7
菌饼直径(mm) 8/8 9/9 8.5/8.5 8.5/8.5
抑菌圈(mm) 13 13 13.3 13.1
抑菌圈＝抑菌直径/2-菌饼直径/2
本发明还提供了一种如前述的贝莱斯芽孢杆菌在防治烟草黑胫病、稻瘟病、金黄色葡萄球菌的应用。
具体地，可制成含有该拮抗菌株的生物药剂、生物土壤或生物肥料等。
本发明还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法：
步骤S1，挑取如前述的贝莱斯芽孢杆菌的单菌落于装有15～30ml的LB液体培养基的三角瓶中，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
具体地，挑取如前述的贝莱斯芽孢杆菌的单菌落于装有15ml的LB液体培养基的三角瓶中，在温度为30℃下，180r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤S2，将所述步骤S1中的种子液接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，所述种子液在LB液体培养基的中的浓度为5％，在温度为30℃下，180r/min恒温培养24h～48h，制备得到所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB液体培养基包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为10g/L，所述酵母提取物的浓度为5g/L，所述氯化钠的浓度为1g/L。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 一种贝莱斯芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> Bacillus velezensis BV1
<400> 1
tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180
ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360
gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420
gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720
gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960
tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080
ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140
tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200
caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260
gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380
cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag ccagccgccg aa 1422

Claims (3)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)为抗烟草黑胫病病菌、抗稻瘟病病菌和抗金黄色葡萄球菌的拮抗菌株，所述贝莱斯芽孢杆菌已在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018004。
2.一种如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在防治烟草黑胫病、稻瘟病、金黄色葡萄球菌上的应用。
3.一种贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
步骤一，挑取如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤二，将所述步骤一中的种子液接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，所述种子液在LB液体培养基中的浓度为5％，在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养24h～48h，制备得到所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB液体培养基包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为9～11g/L，所述酵母提取物的浓度为4～6g/L，所述氯化钠的浓度为0.8～1.2g/L。
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