CN104031849A - 甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilumoxytropis的定向分离及鉴定方法。从甘肃棘豆中分离内生真菌Undifilumoxytropis时，不可避免的会分理出其他种属的菌株，影响分离效率。本发明用蒸馏水、乙醇、无菌水和次氯酸钠依次清洗甘肃棘豆的茎和成熟种子，再将组织剪成小块置于PDA平板上，平板中充满CO₂并用保鲜膜密封，光照下室温培养，待切口处长出菌丝后，挑取顶端菌丝转接至培养基上纯化，刮取菌丝，随后将菌株接种至试管斜面冷藏；提取分离菌株的基因组DNA，在GeneBank中进行序列比对。本发明从疯草中只分离得到一种菌，减少其他种属内生真菌的干扰，方法简便易行，保存过程中菌株不易发生变异或菌株活性减低。

Description

甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法。

背景技术

内生真菌（fungal endophyte）是指生活史或其中某一段时期生活在活的植物组织内，对植物组织不引起明显病害症状的真菌，包括腐生真菌、潜伏性病原真菌和菌根菌。目前研究发现，疯草毒素与疯草内生真菌关系密切。一方面疯草内生真菌协助疯草产生毒素，从而增强了疯草的毒性，减少了动物对疯草的采食；另一方面，内生真菌可以提高疯草的抗逆性，这使得疯草在干旱半干旱的草原上生命力显得极其顽强，加大了防治的难度。

最初，人们认为疯草毒素苦马豆素是疯草在生长过程中自身合成的代谢产物，但深入研究发现，苦马豆素是由疯草携带的内生真菌合成的。人们对疯草中苦马豆素的来源认识有了更新，认为疯草内苦马豆素的含量与内生真菌的种类、数量及定植部位等关系密切。现已证实，能合成苦马豆素的真菌主要有豆类丝核菌属（Rhizoctonia leguminicola）、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）和埃里砖格孢属（Embellisia，现已更名为Undifilum），尤其是内生真菌Undifilum oxytropis合成力最优。

在对疯草进行内生真菌分离时，不仅会分离得到内生真菌Undifilum oxytropis，还会不可避免的得到其他种属的菌株，如下表1，严重影响了分离效率，造成了时间和精力上的损失。

表1 分离疯草携带的内生真菌的多样性

发明内容

本发明的目的是提供一种甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法, 解决现有技术存在的分离率低、分离其他内生真菌造成损失的问题。

本发明所采用的技术方案是：

甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：分离：

将甘肃棘豆的茎和成熟种子用蒸馏水冲洗干净，经质量分数为75%的乙醇溶液漂洗30 s、无菌水冲洗3次、有效氯的质量百分含量为2%的次氯酸钠溶液漂洗3 min、无菌水冲洗3-5次后，再将组织剪成5mm×5mm小块，分别置于PDA平板上，平板中充满CO₂并用保鲜膜密封，在光照条件下于室温培养，待切口处长出菌丝后，挑取顶端菌丝转接至PDA培养基上纯化2-3次，刮取菌丝，随后将菌株接种至试管斜面，4℃冰箱保存备用。

步骤二：ITS序列比对：

（1）刮取新鲜菌丝80mg，用去离子水冲洗干净后，再用无菌水冲洗一次，用滤纸将菌丝表面水吸干后放入1.5mL离心管内，加入液氮迅速研磨至粉末；

（2）向管内加入预热65℃的2×CTAB缓冲液500μL，振荡混匀，置于65℃水浴锅中温育30min，中间摇晃2-3次；

（3）放置至室温后，加入500μL的萃取混合液，振荡混匀后，室温静置5min，期间持续轻摇；

（4）4℃，12000 r/min，离心15min；

（5）吸取上清，再加入500μL的CTAB提取液，混匀，于65℃再温育15min；

（6）加入500μL的萃取混合液，振荡混匀，12000 r/min，4℃离心15min；

（7）取上清加入1/10体积、pH5.2、摩尔体积浓度为3mol/L 的NaAC，再加入500μL的异戊醇，轻摇即出现沉淀，-20℃放置30min以上；4℃，13000 r/min，离心15min；弃上清，用质量分数为75%的冷乙醇溶液100μL洗涤沉淀两次，室温下风干；

（8）用pH8.0的TE缓冲液或灭菌的双蒸水溶解，于4℃贮存；以真菌rDNA扩增的通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3’）为上、下游引物，扩增其核糖体rDNA-ITS保守序列；

进行扩增的PCR反应体系为50μL：TaKaRa Taq DNA聚合酶2.5U、10×PCR Buffer 5μL、MgCl₂ 3ΜL、Dntp 4μL、ITS1和 ITS4引物各2μL、模板DNA 0.5μL，加双蒸水至50μL；

反应条件为：95℃预变性5min；

（9）95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min使其完全反应；

（10）将PCR产物加入质量体积分数为15g/L的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中进行分析，真菌5.8S rDNA-ITS序列的长度一般为500-700bp，对扩增产物进行测序，将测定的5.8S rDNA-ITS序列用BLAST与GenBank中的5.8S rDNA-ITS序列进行同源性比较，应用Clustal X 1.83 version 和MEGA 5.0 软件，分别采用邻接法和最大简约法构建系统进化树进行种属归类，自展法检测进化树，自展数据集为1000次。

步骤一中，所述的PDA培养基的配方如下：

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

步骤二的（3）和（6）中，所述萃取混合液由质量比为25:24:1的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合而成。

本发明具有以下优点：

1. 从疯草中只分离得到一种菌，大大减少了其他种属内生真菌的干扰；

2. 本发明提供的分离方法简便易行，在保存菌种的过程中菌株不易发生变异或菌株活性减低，也可以在最短的时间内重新从自然界疯草植物中分离得到；

3. 本发明提供的内生真菌的分离方法，可以有效解决国内抗肿瘤药物研发过程中苦马豆素来源途径狭窄的现状，为进一步扩大规模生产提供了坚实的基础。

附图说明

图1为内生真菌Undifilum oxytropis的形态和显微（1000×）图片。

图2为NJ法构建的甘肃棘豆内生真菌Undiflium oxytropis发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及的甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法，由以下步骤实现：

步骤一：分离：

将甘肃棘豆的茎和成熟种子用蒸馏水冲洗干净，依次经质量分数为75%的乙醇溶液漂洗30 s、无菌水冲洗3次、有效氯的质量百分含量为2%的次氯酸钠溶液漂洗3 min、无菌水冲洗3-5次，完成表面清洗消毒；

再将组织剪成5mm×5mm小块，分别置于PDA平板上，平板中充满CO₂并用保鲜膜密封，在光照条件下于室温培养，待切口处长出菌丝后，挑取顶端菌丝转接至PDA培养基上纯化2-3次，刮取菌丝，随后将菌株接种至试管斜面，4℃冰箱保存备用。

PDA培养基的配方如下：

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

为检查表面清洗消毒是否彻底，取最后一次无菌水作无菌水和组织印迹检测，结果若对照平板无任何菌生长，证明表面消毒效果良好，所分离获得的是内生真菌而非表面附生菌。

步骤二：ITS序列比对：

（1）刮取新鲜菌丝80mg，用去离子水冲洗干净后，再用无菌水冲洗一次，用滤纸将菌丝表面水吸干后放入1.5mL离心管内，加入液氮迅速研磨至粉末；

（2）向管内加入预热65℃的2×CTAB缓冲液500μL，振荡混匀，置于65℃水浴锅中温育30min，中间摇晃2-3次；

（3）放置至室温后，加入500μL的萃取混合液，振荡混匀后，室温静置5min，期间持续轻摇；

（4）4℃，12000 r/min，离心15min；

（5）吸取上清，再加入500μL的CTAB提取液，混匀，于65℃再温育15min；

（6）加入500μL的萃取混合液，振荡混匀，12000 r/min，4℃离心15min；

（7）取上清加入1/10体积、pH5.2、摩尔体积浓度为3mol/L 的NaAC，再加入500μL的异戊醇，轻摇即出现沉淀，-20℃放置30min以上；4℃，13000 r/min，离心15min；弃上清，用质量分数为75%的冷乙醇溶液100μL洗涤沉淀两次，室温下风干；

（8）用pH8.0的TE缓冲液或灭菌的双蒸水溶解，于4℃贮存；以真菌rDNA扩增的通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3’）为上、下游引物，扩增其核糖体rDNA-ITS保守序列；

进行扩增的PCR反应体系为50μL：TaKaRa Taq DNA聚合酶2.5U、10×PCR Buffer 5μL、MgCl₂ 3ΜL、Dntp 4μL、ITS1和 ITS4引物各2μL、模板DNA 0.5μL，加双蒸水至50μL；

反应条件为：95℃预变性5min；

（9）95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min使其完全反应；

（10）将PCR产物加入质量体积分数为15 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中进行分析，真菌5.8 S rDNA-ITS序列的长度一般为500-700 bp，对扩增产物进行测序，登录http//:www.ncbi.nlm.nih.gov，将测定的5.8S rDNA-ITS序列用BLAST与GenBank中的5.8S rDNA-ITS序列进行同源性比较，应用Clustal X 1.83 version 和MEGA 5.0 软件，采用邻接法（neighbor-joining, NJ）构建系统进化树进行种属归类，自展法检测进化树，自展数据集为1000次。

（3）和（6）中，所述萃取混合液由质量比为25:24:1的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合而成。

经鉴定，所分离的真菌ITS测序结果为SEQ ID No. 1:

GCTGGATCCCCCTCAGCCGTGCGTTGCTGTACGGCGTGCGCGGCTGGGGCCAGCGTTGCTGAATTATTCACCCGTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTGGGTGGGTTCGCCCACCACCAGGACCAACCACCAAACCTTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACCAACATAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCCAGTTCGCTGGGGACTCGCCTTAAAGTCATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTTTTCCAGCCAAGGTCAGCGTCCACCAAGCCACATTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA.

分析表明该菌与内生真菌Undifilum oxytropis（FJ357318）相似性为100%，且菌落形态及孢子形态均与国外报道的Undifilum oxytropis相似。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 西北农林科技大学

<120> 甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定

向分离及鉴定方法

<130> 2014-01

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 555

<212> DNA

<213> 内生真菌Undifilum oxytropis

<400> 1

gctggatccc cctcagccgt gcgttgctgt acggcgtgcg cggctggggc

cagcgttgct 60

gaattattca cccgtgtctt ttgcgtactt cttgtttcct gggtgggttc

gcccaccacc 120

aggaccaacc accaaacctt tttgtaattg caatcagcgt cagtaaccaa

cataataatt 180

acaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag

cgaaatgcga 240

taagtagtgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca

cattgcgccc 300

tttggtattc caaagggcat gcctgttcga gcgtcatttg taccctcaag

ctttgcttgg 360

tgttgggcgt cttgtctcca gttcgctggg gactcgcctt aaagtcattg

gcagccggcc 420

tactggtttc ggagcgcagc acaagtcgcg ctcttttcca gccaaggtca

gcgtccacca 480

agccacattt tcaacttttg acctcggatc aggtagggat acccgctgaa

cttaagcata 540

tcaataagcg gagga

555

Claims (3)

1.甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：分离：

将甘肃棘豆的茎和成熟种子用蒸馏水冲洗干净，经质量分数为75%的乙醇溶液漂洗30 s、无菌水冲洗3次、有效氯的质量百分含量为2%的次氯酸钠溶液漂洗3 min、无菌水冲洗3-5次后，再将组织剪成5mm×5mm小块，分别置于PDA平板上，平板中充满CO₂并用保鲜膜密封，在光照条件下于室温培养，待切口处长出菌丝后，挑取顶端菌丝转接至PDA培养基上纯化2-3次，刮取菌丝，随后将菌株接种至试管斜面，4℃冰箱保存备用；

步骤二：ITS序列比对：

（1）刮取新鲜菌丝80mg，用去离子水冲洗干净后，再用无菌水冲洗一次，用滤纸将菌丝表面水吸干后放入1.5mL离心管内，加入液氮迅速研磨至粉末；

（2）向管内加入预热65℃的2×CTAB缓冲液500μL，振荡混匀，置于65℃水浴锅中温育30min，中间摇晃2-3次；

（3）放置至室温后，加入500μL的萃取混合液，振荡混匀后，室温静置5min，期间持续轻摇；

（4）4℃，12000 r/min，离心15min；

（5）吸取上清，再加入500μL的CTAB提取液，混匀，于65℃再温育15min；

（6）加入500μL的萃取混合液，振荡混匀，12000 r/min，4℃离心15min；

（7）取上清加入1/10体积、pH5.2、摩尔体积浓度为3mol/L 的NaAC，再加入500μL的异戊醇，轻摇即出现沉淀，-20℃放置30min以上；4℃，13000 r/min，离心15min；弃上清，用质量分数为75%的冷乙醇溶液100μL洗涤沉淀两次，室温下风干；

（8）用pH8.0的TE缓冲液或灭菌的双蒸水溶解，于4℃贮存；以真菌rDNA扩增的通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3’）为上、下游引物，扩增其核糖体rDNA-ITS保守序列；

进行扩增的PCR反应体系为50μL：TaKaRa Taq DNA聚合酶2.5U、10×PCR Buffer 5μL、MgCl₂ 3ΜL、Dntp 4μL、ITS1和 ITS4引物各2μL、模板DNA 0.5μL，加双蒸水至50μL；

反应条件为：95℃预变性5min；

（9）95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min使其完全反应；

（10）将PCR产物加入质量体积分数为15g/L的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中进行分析，真菌5.8S rDNA-ITS序列的长度一般为500-700bp，对扩增产物进行测序，将测定的5.8S rDNA-ITS序列用BLAST与GenBank中的5.8S rDNA-ITS序列进行同源性比较，应用Clustal X 1.83 version 和MEGA 5.0 软件，分别采用邻接法和最大简约法构建系统进化树进行种属归类，自展法检测进化树，自展数据集为1000次。

2.根据权利要求1所述的甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法，其特征在于：

步骤一中，所述的PDA培养基的配方如下：

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

3.根据权利要求2所述的甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法，其特征在于：

步骤二的（3）和（6）中，所述萃取混合液由质量比为25:24:1的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合而成。