CN102041311B - 干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)鉴定的PCR方法及其特异引物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种特异鉴定干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)的PCR方法及其特异引物。通过DNA提取、特异性PCR反应和琼脂糖凝胶电泳检测，就能有效地将干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)和其他几个外形特征很相似的革菌以及干巴菌伴生菌区分开来，同时为巴菌菌种的分离纯化提供了快速准确的鉴定方法。具有高效、快速、特异性强和重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)鉴定的PCR方法及其特异引物，属于利用分子生物学方法检测食用菌的技术领域。
背景技术
野生食用菌是一种重要的森林资源，在绿色食品开发、生物制药、环境保护等行业发挥着重要的作用，特别是分布在林区的一些野生食用菌，如松口蘑(Tricholomamatsutake)，橙盖鹅膏(Amanita caesarea)，变绿红菇(Russula virescens)，美味牛肝菌(Boletus edulis)，干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)等的食药用价值很高，近年来，市场售价看涨。在这些野生食用菌的分类及其菌丝体分离物的鉴定方面，人们主要根据野生食用菌子实体的形态学、解剖学等特征来确定菌种。野生食用菌不产生子实体或尚未找到子实体时，就无法进行野生食用菌菌种的鉴定。即使是从野生食用菌的子实体上分离到纯菌种，为避免伴生菌和杂菌的污染所产生的误导，也应遵循柯赫法则进行回接试验，产生相同子实体的鉴定方法是最令人信服的。遗憾的是现在很多珍贵的野生食用菌，尚无法进行人工栽培出菇，在这种情况下就很难断定分离菌株的真伪。
干巴菌为革菌属(Thelephora)多种可食真菌的云南地方名称，是具有特殊香气与口味的云南重要名贵的商品真菌。干巴菌在分类地位上长期较混乱，人们平常所习称的干巴菌实则包括了革菌属的四个种，即干巴菌(T.ganbajunZang)、掌状革菌(Thelephorapalmaata Scop.：Fr.)，莲座草菌(T.viali Show.)和橙黄革菌(T.aurantiotinctaCorner)。这几个种均可食用，外形特征很相似，凭肉眼难以区分。干巴菌(T.ganbajunZang)子实体内混有植被凋落物并伴生着多种真菌，给干巴菌菌种的分离和鉴定造成了干扰，这给鉴定和分类带来了极大的困难，同时对干巴菌的利用和开发造成不便。DNA作为遗传物质能客观和真实地反映物种之间的亲缘关系，对于菌种鉴定是一种有力的依据和补充。以DNA分子为基础的特异性PCR技术是一种对分离纯培养的菌株鉴别的高效、快速而又可靠的方法，已广泛地应用在真菌分离纯培养物的真伪鉴定方面。
干巴菌为一种共生真菌，目前尚不能进行人工栽培所有市售商品均来自野生资源，而且由于市场价格较高，导致了对野生资源的掠夺性开发，野生资源正面临着很大压力，对干巴菌资源保护与合理利用已成为迫在眉睫的问题。国内外对干巴菌的研究与其它高经济价值野生食用菌相比还很少，目前已有的资料不多，且多集中在分类、菌种分离、营养成分测定和生态学等方面，有关干巴菌鉴定的PCR方法及其特异引物方面未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)鉴定的PCR方法及其特异引物，是对干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)子实体和分离纯培养的菌株进行鉴别的高效、快速而又可靠的方法。
一种鉴定干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)的特异PCR引物Tg1，Tg2，其DNA序列为：
Tg1：5’-ACCTGTGCACCCTCTGTAGTTCC-3’
Tg2：5’-GTCCAAGCTCATCATGGCA-3’
一种特异PCR引物鉴定干巴菌的方法，由以下步骤组成：
(1)样品DNA提取；
(2)以上述DNA为模板，用特异引物Tg1，Tg2进行PCR反应，扩增条件为：95℃预变性4分钟；然后94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共32次循环；最后72℃延伸10分钟；
(3)取上述PCR反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪检测扩增片段的大小。如果检测到分子量为330bp的单一DNA条带，即可确定所检测样品为干巴菌材料。
本发明的方法采用特异性引物，通过PCR反应就能有效地将干巴菌(Thelephoraganbajun Zang)和其他几个外形特征很相似的革菌区分开来，同时为干巴菌菌种的分离纯化提供了快速准确的鉴定方法。具有高效、快速、特异性强和重复性好等优点。
附图说明
图1为干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)子实体、近缘种和伴生菌ITS区间DNA片段扩增及干巴菌特异性DNA片段扩增的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
图1中，M为DNA Marker 2000，其余编号同下表1。
实施例1：
干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)子实体、干巴菌纯培养物、近缘种、伴生菌收集，见表1。
表1干巴菌子子实体、干巴菌纯培养物、近缘种和伴生菌
实施例2：
特异性引物设计。
在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中搜索革菌属(Thelephora)真菌转录间隔区(ITS)序列，用ClustalX1.8进行序列比对，根据变异区设计干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)特异性引物如下：Tg1：5’-ACCTGTGCACCCTCTGTAGTTCC-3’；Tg2：5’-GTCCAAGCTCATCATGGCA-3’
实施例3：
DNA提取
取表1所列真菌样品约0.1g(长好的菌丝体或子实体)，转入1.5ml离心管中，加入0.30g白石英砂(Sigma)和60℃的2×CTAB缓冲液[2％CTAB(w/v)；100mM Tris-HCl；1.4 M NaCl；20mM EDTA，pH 8.0]1ml，用塑料槌充分研磨；置60℃水浴中1小时，然后用酚∶氯仿(1∶1)反复抽提，离心，直至获得澄清透亮的液体提取物；采用4℃100％乙醇沉淀DNA，70％的冷乙醇(4℃)洗涤DNA沉淀，真空离心系统干燥DNA沉淀，将DNA沉淀重新悬浮于100μl TE缓冲液中；取5μl DNA溶液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测基因组DNA的纯度和完整性；最后，将所得DNA样品置4℃保存。
实施例4：
ITS区间DNA片段的扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
以上述DNA为模板，用真菌转录间隔区通用引物ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)，ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR反应，扩增反应体系为Milli Q water 34.7μl，10XPCR buffer(含15mmol/L MgCl2)5μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，10mmol/L Tg1 1.5μl，10mmol/L Tg2 1.5μl，Template DNA 2-5μl，5U/μl Taq Polymerase 0.3μl。上述试剂除Milli Q water和Template DNA外，其余均为Amersham Pharmacia Biotech公司产品。扩增条件为：95℃预变性4分钟；然后94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共32次循环；最后72℃延伸10分钟。取2μlPCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪检测，结果见图1。干巴菌子实体、干巴菌纯培养物、近缘种和伴生菌均能扩增出600bp左右的片段。
实施例5：
干巴菌特异性DNA片段的扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
以上述DNA为模板，用特异引物Tg1，Tg2进行PCR反应，扩增反应体系为Milli Qwater 34.7μl，10XPCR buffer(含15mmol/L MgCl2)5μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，10mmol/L Tg1 1.5μl，10mmol/L Tg2 1.5μl，Template DNA 2-5μl，5U/μl Taq Polymerase 0.3μl。上述试剂除Milli Q water和Template DNA外，其余均为Amersham Pharmacia Biotech公司产品。扩增条件为：95℃预变性4分钟；然后94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共32次循环；最后72℃延伸10分钟。取2μlPCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪检测，结果见图1。只有干巴菌子实体及干巴菌纯培养物扩增出330bp大小的片段，而近缘种和伴生菌没有扩增条带。
Claims (2)
1.一种鉴定干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)的特异PCR引物Tg1，Tg2，其DNA序列为：
Tg 1：5’-ACCTGTGCACCCTCTGTAGTTCC-3’
Tg2：5’-GTCCAAGCTCATCATGGCA-3’。
2.一种权利要求1所述的特异PCR引物鉴定干巴菌的方法，其特征在于由以下步骤组成：
(1)样品DNA提取；
(2)以上述DNA为模板，用权利要求1所述的特异引物Tg1，Tg2进行PCR反应；
(3)取上述PCR反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪检测扩增片段的大小；
所述的步骤(2)中PCR反应扩增条件为：95℃预变性4分钟；然后94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共32次循环；最后72℃延伸10分钟；
所述的步骤(3)中检测到分子量为330bp的单一DNA条带。
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Granted publication date: 20130417 |
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