CN101962687B

CN101962687B - 利用分子标记技术鉴定茶树菇Ag·c0003的方法

Info

Publication number: CN101962687B
Application number: CN201010543985A
Authority: CN
Inventors: 邓优锦; 杨开耀
Original assignee: SHANGHAI BAIRONG VELVET MUSHROOM CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI BAIRONG VELVET MUSHROOM CO Ltd
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2010-11-15
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2030-11-15
Also published as: CN101962687A

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种利用分子标记技术鉴定茶树菇Ag.c0003的方法，包括一个培养与收集待检测茶树菇菌种的菌丝的步骤，一个提取待检测茶树菇菌种DNA的步骤，一个对待检测的茶树菇菌种的DNA进行SCAR-PCR扩增的步骤，一个对SCAR-PCR扩增的产物进行凝胶电泳的步骤，反应结束后根据凝结电泳判定结果，本发明的检测方法的灵敏度高，所需要的DNA用量少，与常规检测方法相比，本发明的检测方法所需时间只需要2－3天，时间短、准确性高、容易判断、重复性好等优点。

Description

利用分子标记技术鉴定茶树菇Ag·c0003的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种茶树菇的鉴定方法，具体来说是一种利用分子标记技术鉴定茶树菇Ag.c0003的方法。

背景技术

茶树菇(Agrocybe cylindracea) 又称茶新菇、杨树菇。菇薄柄脆，美味在柄，香淳脆嫩。茶树菇的营养丰富，所含蛋白质中有18种氨基酸（8种为人体必须氨基酸），含有丰富的B族维生素，茶树菇中镁含量高，镁是能量代谢、组织形成和骨骼发育的重要物质；同时富含锌、铁等矿物质。茶树菇中含有的茶树菇多糖，是深受广大市民欢迎的菇菌食品。

我国食用菌资源丰富，品种比较多，但是食用菌的管理比较混乱。部分生产者有意或无意的改名，使茶树菇不同栽培菌种“异种同名、同种异名”现象普遍存在。这种情况已极大地损害了育种者和生产者的利益，不但给科学研究和学术交流带来障碍，而且对规范生产和产品质量标准的制定带来很大困难。

优质菌种在茶树菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了茶树菇菌种在茶树菇产业中的重要地位。我国于1999年签署了《国际植物新品种保护法》，2000年、颁布了《中华人民共和国种子法》，并于2004年进行了修订，中华人民共和国农业部第62号令颁布了《食用菌菌种管理办法》，这些法律、法规的实施，增强了我们对品种知识产权的保护意识，有力地推动了我国食用菌良种选育和知识产权保护工作。然而这些法律的有效实施，需要强有利的技术作支撑，就要求我们对现有的种质资源进行清查，进一步加快菌种鉴定技术的研究。同时随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对茶树菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。本专利可为茶树菇种质资源的利用和新品种的登记工作引进更为有效的菌种鉴定体系，以及加强对我国茶树菇种质资源的保护工作都具有重要意义。

现有技术中茶树菇的鉴定方法通常是采用形态学检测、拮抗试验和出菇试验方法。常规的拮抗试验中，拮抗表现形式至少有3种，甚至更多，有时表现形式不明显，还受培养环境的影响，拮抗表现不仅在种内的不同品种之间会出现，同时在种间的菌株之间也会表现出来，给准确判断造成困难；出菇试验更容易受到环境、时间等各方因素的影响，重复性差，加大了检测困难；形态学检测在同一属种内的不同品种之间可区别的特征少，有些甚至没有什么差异，同时还需要判断者具有丰富的知识与经验，方可做出准确的判断。因此上述的鉴定方法需要很大的人力和物力，当品种多时可能使得认定工作无法进行。常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，常规形态学检测和出菇试验则需要至少2个月的时间。

发明内容

本发明提供了一种利用分子标记技术鉴定茶树菇Ag.c0003的方法，所述的这种利用分子标记技术鉴定茶树菇Ag.c0003的方法要解决现有技术中鉴定茶树菇的方法复杂、需要大量的人力和物力、鉴定时间长的技术问题。

本发明提供了一种利用分子标记技术鉴定茶树菇Ag.c0003的方法，包括一个培养与收集待检测茶树菇菌种的菌丝的步骤，一个提取待检测茶树菇菌种DNA的步骤，一个对待检测的茶树菇菌种的DNA进行SCAR-PCR扩增的步骤，一个对SCAR-PCR扩增的产物进行凝胶电泳的步骤，反应结束后根据凝结电泳判定结果，在所述的一个对待检测的茶树菇菌种的DNA进行SCAR-PCR扩增的步骤中，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示（SEQ ID NO：1），所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示（SEQ ID NO：2）。

进一步的，在所述的一个对待检测的茶树菇菌种的DNA进行SCAR-PCR扩增的步骤中，SCAR-PCR扩增的反应条件为：94℃ 1min；94℃ 45second，64℃ 45second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。

本发明还提供了一种鉴定茶树菇Ag.c0003的引物，述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示（SEQ ID NO：1），所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示（SEQ ID NO：2）。

本发明的检测方法以基因组DNA为材料，DNA是稳定的遗传物质，不易受外界因素等的影响，同时它的639bp的显性标记使的判断一目了然，减少人为判断的偏差，大大提高了准确性。本发明的方法得到的显性标记可减少茶树菇新品种认定的工作量，检测时该方法只需要1个阳性菌株和1个阴性菌株对照便可快速比较。

本发明和已有技术相比，其技术效果是显著的。本发明的检测方法的灵敏度高，所需要的DNA用量少，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，本发明的检测方法所需时间只需要2－3天，时间短、准确性高、容易判断、重复性好等优点。

附图说明

图1是采用AG.C0003专用检测引物1（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）对茶树菇菌株进行SCAR－PCR扩增图谱。

其中M～M为泳道编号；右侧的数字表示DNA片段的分子量，第3号泳道的639bp 的特异DNA条带，为茶树菇菌种AG.C0003的标志。

具体实施方式

实验试剂：

1、CTAB抽提液(pH 8.0)：100 mmol/L Tris-HCl， 2.0% CTAB，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl;

2、CTAB 沉淀液(pH8.0)：50 mmol/L Tris-HCl，1.0% CTAB，10 mmol/L EDTA;

3、CTAB/NaCl：0.7 mol/L NaCl， 10% CTAB；

4、TE缓冲液：10 mmol/L Tris HCl ，1 mmol/L EDTA；

5、0.5×TBE：44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO₃、1 mmol/L EDTA;

6、6×溴酚蓝上样缓冲液：0.15％溴酚蓝, 40% 蔗糖；

7、EB：10 mg/ml溴化乙锭。

实施例1 茶树菇菌丝培养与收集

用接种耙耙碎含菌丝的PDA培养基，转接入250 ml三角瓶（含100 ml PDA液体）培养基中；

放置在25℃摇床上，转速90~130 r/min培养7~10 d；

用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；

称取0.8~1.3g菌丝,用滤纸包好，保存于-20℃备用。

实施例2 茶树菇基因组DNA的提取（对菌丝体和子实体均适用）

1、取保存备用的菌丝1包或0.8~1.3g的子实体，放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7ml的离心管；

2、加2.5mL 65℃预热的抽提液，同时加入50μl巯基乙醇,上下震荡,使蛋白质变性沉淀；

3、65℃水浴1h，每隔10min振荡1次；

4、加入2.5 ml的（氯仿：异戊醇=24:1）混匀，除去蛋白质；

5、8000 r/min,4℃离心10min,取上清到7ml管；

6、加1/5体积65℃预热的CTAB/NaCl混匀，加入2.5 ml的（氯仿：异戊醇=24:1）混匀；

7、10000r/min, 4℃离心10min，取上清；

8、加入2.5 ml 65℃预热的CTAB沉淀液，颠倒混匀，65℃水浴1h至沉淀可见（可过夜）；

9、12000r/min,4℃离心10min后，小心去除上清液；

10、用0.5ml TE溶液（或无菌水）溶解沉淀10min；

11、加入0.25ml饱和酚和0.25m L（氯仿：异戊醇=24:1）,混匀；

12、12000 r/min，4℃离心10min，取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀；

13、放置-20℃冰箱1h(可过夜)；

14、12000 r/min，4℃离心10 min，弃上清；

15、（可选做）加0.5～1 mL 70％乙醇洗涤, 12000 r/min，4℃离心8min,弃上清；重复一次

16、自然风干沉淀，用30μl TE溶液（或无菌去离子水）溶解沉淀， -20℃保存备用。

实施例3 SCAR-PCR扩增

SCAR-PCR扩增体系：SCAR-PCR扩增体系为10×PCR buffer 2.5 μl， 25mmol/L MgCL₂1 μl， 2.5 m mol/L dNTP 2 μl，5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 μl，10μmol/L检测引物各1 μl，1ng～10ng/μl模板DNA（茶树菇AG.C0003提取的DNA）和实施例2提取的待检测菌种DNA 1μl，ddH₂O 16.2 μl；

SCAR-PCR反应条件为94℃ 1min；94℃ 45second，64℃ 45second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。

实施例4 PCR扩增产物检测

法一：取PCR扩增产物8 μl加上1.5μl 6×溴酚蓝上样缓冲液，混匀, 在1.0%琼脂糖凝胶（含Goldview^TMDNA染料）进行电泳，5V/cm恒压电泳50 min，通过紫外凝胶成像系统观察并照像。

法二：取PCR扩增产物8μL，与1.5μL 6×溴酚蓝上样缓冲液混匀，点样于1%的琼醋糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm恒压电泳0.5～1h，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。

结果：只有茶树菇AG.C0003菌株能扩增出分子量为639bp特有的DNA条带（如图1中箭头标注所示）。如果扩增出的DNA条带的大小为639bp，则表示该菌株为茶树菇AG.C0003，反之则为其它菌株。

<110> 上海百茸食用菌有限公司

<120> 一种利用分子标记技术鉴定茶树菇Ag.c0003的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgagctgtcc gtaatgc 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagggaaggt ccgagaa 17

Claims

1.一种利用分子标记技术鉴定茶树菇Ag.c0003的方法，其特征在于：包括一个培养与收集待检测茶树菇菌种的菌丝的步骤，一个提取待检测茶树菇菌种DNA的步骤，一个对待检测的茶树菇菌种的DNA进行SCAR-PCR扩增的步骤，一个对SCAR-PCR扩增的产物进行凝胶电泳的步骤，以及一个反应结束后根据凝胶电泳判定结果的步骤，在所述的对待检测的茶树菇菌种的DNA进行SCAR-PCR扩增的步骤中，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的一种利用分子标记技术鉴定茶树菇Ag.c0003的方法，其特征在于：在所述的对待检测的茶树菇菌种的DNA进行SCAR-PCR扩增的步骤中，SCAR-PCR扩增的反应条件为：94℃ 1min；94℃ 45second，64℃ 45second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。

3.一种鉴定茶树菇Ag.c0003的引物，其特征在于：所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。