CN101358240B

CN101358240B - 香菇L03、Cr02或沪农1号的分子特异性标记引物及检测方法

Info

Publication number: CN101358240B
Application number: CN2008101205713A
Authority: CN
Inventors: 魏海龙; 李海波; 吴学谦; 付立忠; 吴庆其; 贺亮; 程俊文
Original assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Current assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Priority date: 2008-08-25
Filing date: 2008-08-25
Publication date: 2010-11-17
Anticipated expiration: 2028-08-25
Also published as: CN101358240A

Abstract

本发明提供了一种香菇L03、Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，以及利用该引物对香菇L03、Cr02和沪农1号菌种进行鉴别和检测的方法。所述引物序列为：上游引物：5＇-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3＇，下游引物：5＇-TGCCGAAGTATATCAAG-3＇。本发明有益效果主要体现在：本发明检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点；本发明方法检测所需时间只要1～3天，而常规的拮抗试验所需要的时间至少两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间。

Description

香菇L03、Cr02或沪农1号的分子特异性标记引物及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及香菇L03、Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，以及利用该引物对香菇L03、Cr02或沪农1号菌种进行鉴别和检测的方法。

(二)背景技术

香菇Lentinula edodes因其美味和具有重要的食、药用价值而倍受国内外消费者的喜爱，是我国商业化生产规模最大和世界上产量仅次于双孢蘑菇的食用菌。但长期以来，由于我国食用菌菌种鉴定与检测技术研究的落后和菌种行政管理机构与法规的不健全，无法适应近十几年来代料香菇生产的迅猛发展，香菇主产地菌种生产、销售极为混乱，“异种同名、同种异名”现象普遍存在，假种、劣种充斥市场，已极大地损害了香菇育种者和生产者的利益。我国是世界人工栽培香菇的发源地和香菇产量最大的国家，有着丰富的香菇种质资源，随着日本《种苗修正案》的出台，建立起一套香菇菌种的快速鉴定检测技术势在必行，这不仅有利于我国香菇种质资源的发掘与利用，更好地为选育具有我国自主知识产权的优良香菇品种服务，而且也是规范现阶段混乱的香菇菌种市场的迫切需要。

传统的香菇菌种鉴别以子实体形态、生长特性以及生理生化反应特征为依据，但由于易受环境因素和生理状况的影响，对形态差异较小的种间及种内菌株难以鉴别，而且很难在短时间内对处于菌丝体状态的菌种进行鉴定和检测。分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的菌种鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region，特征性片段扩增区域)标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一对18-24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点。

(三)发明内容

本发明目的提供香菇L03、Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，以及一种能对香菇L03、Cr02或沪农1号菌种进行快速鉴定的方法。

本发明采用的技术方案是：

香菇L03、Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，所述引物序列为：

上游引物5′-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3′；

下游引物5′-TGCCGAAGTATATCAAG-3′。

该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，采用RAPD标记为引物获得香菇L03、Cr02和沪农1号菌种的特异性DNA片段，将该片段克隆测序，以得到DNA序列为基础，所设计的特异性扩增引物，以该引物对香菇L03、Cr02或沪农1号菌种进行PCR扩增，均可获得493bp大小的特异性片段。

本发明还涉及对香菇L03、Cr02或沪农1号菌种进行鉴定和检测的方法，所述方法为：提取待测香菇菌种基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现493bp的DNA条带，则待测菌种为香菇L03、Cr02或沪农1号菌种中的一种；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物5′-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3′

下游引物5′-TGCCGAAGTATATCAAG-3′。

所述方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

优选的，本发明所述PCR反应体系组成如下：

PCR Buffer 终浓度为1×

dNTPs 1mmol/L

MgCl₂ 2.5mmol/L

Taq DNA酶 2.5U

上、下游引物各1.25μM

模板DNA 60ng

余量为ddH₂O；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；92℃变性40s，52℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

PCR Buffer终浓度为1×，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCRBuffer。10×PCR Buffer成分为：100mM Tris-HCl(pH8.5)、500mM KCl、25mM MgCl₂和1.0％Triton-X-100，溶剂为ddH₂O。

具体的，本发明所述方法如下：

(1)取待测香菇菌种，接种至PDA斜面，25℃培养14d，转接至PD液体培养基中，25℃下振荡培养14d，收集菌丝，以SDS-CTAB法提取待测香菇菌种基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR反应体系每20μL组成如下：

10×PCR Buffer 2μL

10mmol/L dNTPs 2μL

25mmol/L MgCl₂ 2μL

5U/μL Taq DNA酶 0.5μL

25μM上、下游引物各1μL

20ng/μL模板DNA 3μL

ddH₂O补足至20μL；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；92℃变性40s，52℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAB缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，通常在含0.5μg/ml EB的水溶液中染色30分钟，再于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现493bp的DNA条带，则待测菌种为香菇L03、Cr02或沪农1号菌种中的一种。

本发明有益效果主要体现在：本发明检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点，为进一步的检测作好了准备；本发明方法检测所需时间只要1～3天，而常规的拮抗试验所需要的时间至少两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间。

(四)附图说明

图1为对香菇菌种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；C为阴性对照；箭头所指为从编号为12、17、20的香菇L03、Cr02和沪农1号菌种扩增出的分子量为493bp的特殊DNA条带；其余编号为其它常用的香菇生产菌种。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

(1)菌丝培养和基因组DNA的提取：将低温保藏的香菇菌种转接到PDA斜面(PDA斜面培养基：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液加水补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，121℃灭菌30分钟，冷却得斜面)上，25℃下培养。14d后接到100ml PD液体培养基(PD液体培养基：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液加水补足至1000毫升，加葡萄糖20克，121℃灭菌30分钟，冷却即得PD液体培养基)中，25℃下100r/min振荡培养14d，收集菌丝，放入-20℃冰箱保藏备用。基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，并使用DNA纯化试剂盒(杭州博日科技有限公司)对提取的DNA进行纯化。纯化的基因组DNA先用1.5％的琼脂糖凝胶电泳定性检测，再用DNA/RNA紫外分光光度计定量检测。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为5′-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3′和5′-TGCCGAAGTATATCAAG-3′，由上海生物工程技术有限公司合成。

(3)SCAR分子标记的PCR扩增：10×PCR Buffer 2μl，10mmol/LdNTPs 2μl，25mmol/L MgCl₂ 2μl，5U/μl Taq DNA酶0.5μl，25mM特异引物对各1μl，20ng/μl模板DNA 3μl，ddH₂O补足至20μl。扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。94℃预变性6min后；92℃变性40s，54.5℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5ul，与1ul 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAB缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5μg/ml EB的水溶液中染色30分钟，然后在培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。

按照上述方法，分别对多种香菇菌种(编号1～23代表香菇菌种依次为：1：申香2号；2：申香4号3：申香6号；4：申香9号；5：申香7号；6：申香8号；7：申香10号；8：申香12；9：苏香；10：武香；11：L26；12：L03；13：L66；14：241；15：241-4；16：庆科20；17：Cr02；18：Cr04；19：闽丰1号；20：沪农1号；21：浙香939-9；22：浙香939-6；23：香九)进行检测，以无菌水为阴性对照，电泳结果见图1。其中编号为12、17、20分别为香菇L03、Cr02和沪农1号菌种，均扩增出分子量为394bp的特殊DNA条带，其余编号为其他常用的香菇生产菌种，未见有394bp的特殊DNA条带产生。

序列表_ST25

SEQUENCE LISTING

<110>浙江省林业科学研究院

<120>香菇L03、Cr02或沪农1号的分子特异性标记引物及检测方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

Claims

1.香菇L03、Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，所述引物序列为：

上游引物5′-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3′；

下游引物5′-TGCCGAAGTATATCAAG-3′。

2.一种用权利要求1所述的分子特异性标记引物对香菇L03、Cr02或沪农1号菌种进行鉴定和检测的方法，所述方法为：提取待测香菇菌种基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现493bp的DNA条带，则待测菌种为香菇L03、Cr02或沪农1号菌种中的一种；所述

分子特异性标记引物序列为：

上游引物5′-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3′

上游引物5′-TGCCGAAGTATATCAAG-3′。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述PCR反应体系组成如下：

PCR Buffer 终浓度为1×

dNTPs 1mmol/L

MgCl₂ 2.5mmol/L

Taq DNA酶 2.5U

上、下游引物各1.25μM

模板DNA 60ng

余量为ddH₂O；

PCR反应条件如下：

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下：

PCR反应体系每20μL组成如下：

10×PCR Buffer 2μL

10mmol/L dNTPs 2μL

25mmol/L MgCl₂ 2μL

5U/μL Taq DNA酶 0.5μL

25μM上、下游引物各1μL

20ng/μL模板DNA 3μL

ddH₂O补足至20μL；

PCR反应条件如下：

(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAB缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后用EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现493bp的DNA条带，则待测菌种为香菇L03、Cr02或沪农1号菌种中的一种。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述EB染色为在含0.5μg/ml EB的水溶液中染色30分钟。