CN108660104A - 外源褪黑素在提高莱茵衣藻抗盐能力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了褪黑素在增加植物细胞中抗氧化酶活性的应用。为探索褪黑素在莱茵衣藻抗盐机制的抗氧化防御体系中的可能作用奠定了基础。

Description

外源褪黑素在提高莱茵衣藻抗盐能力中的应用

技术领域

本发明属于生物科技技术领域，具体涉及外源褪黑素在提高莱茵衣藻抗盐能力中的应用。

背景技术

盐胁迫是世界上主要的农业问题之一，它影响植物的生长和发育，并导致作物生产力下降。土壤盐渍化可能是由于自然原因造成的，如咸雨，沿海水域或母岩和海水盐的污染。过度的盐会降低植物细胞的养分吸收或运输，增加钠离子(Na⁺)的积累，对细胞器造成损伤，减少土壤渗透势，并抑制光合作用，从而对植物生理造成不利影响。值得注意的是，盐分诱导的光合电子传递抑制会导致有毒活性氧(ROS)如O^2·-，H₂O₂和·OH的过度积累以及细胞氧化还原稳态的破坏。此外，作为强氧化剂，高浓度的ROS可以通过脂质过氧化损伤膜，破坏DNA链并使各种重要的酶失活。面对这些挑战，植物对盐度的综合生理反应涉及多种保护机制，主要包括相容性溶质的合成和积累，离子稳态控制，植物组织内水分吸收和分布的调节，氧化损伤的减少以及光合作用的维持。在一些关于藻类中盐胁迫的研究可观察到类似于植物胁迫耐受性的自我保护机制。例如，盐胁迫会降低淡水藻类中光合色素，碳水化合物，蛋白质和K+的含量，但脯氨酸和抗氧化酶活性会显著增加，从而提高耐盐性。此外，有报道称当莱茵衣藻暴露于某些应激剂时，会形成被称为“palmelloid”或“coenobium”的多细胞聚集体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种褪黑素的应用。探索褪黑素在莱茵衣藻抗盐机制的抗氧化防御体系中的可能作用奠定了基础。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，褪黑素在增加植物细胞中抗氧化酶活性的应用。

进一步地，该植物细胞所在的为盐胁迫的环境。

进一步地，该植物为单细胞植物。

进一步地，该褪黑素中有效成分的浓度为0.1～1μM。

进一步地，该单细胞植物为莱茵衣藻。

进一步地，在植物细胞的培养过程中添加褪黑素。

本发明还公开了一种植物细胞中抗氧化酶活性的促进剂，其有效成分为褪黑素。

本发明具有如下优点：外源MT的应用影响莱茵衣藻的生长和细胞内抗氧化酶的活性，这些结果为探索MT在莱茵衣藻抗盐机制的抗氧化防御体系中的可能作用奠定了基础。

附图说明

图1是本发明用于测试褪黑素处理对莱茵衣藻细胞对NaCl胁迫的响应的实验设计图；

图2为本发明中褪黑素对盐或非盐胁迫下莱茵衣藻细胞生长的影响趋势图；

图3为本发明中不同TAP条件下的莱茵衣藻的光学显微镜的形态观察图；

图4外源褪黑素对莱茵衣藻处于盐或非盐胁迫时对其细胞SOD活性的影响；

4a为外源褪黑素对莱茵衣藻处于非盐胁迫时对其细胞SOD活性的影响比较图；

4b为外源褪黑素对莱茵衣藻处于盐胁迫时对其细胞SOD活性的影响比较图；

图5外源褪黑素对莱茵衣藻处于盐或非盐胁迫时对其细胞CAT活性的影响；

5a为外源褪黑素对莱茵衣藻处于非盐胁迫时对其细胞CAT活性的影响统计图；

5b为外源褪黑素对莱茵衣藻处于盐胁迫时对其细胞CAT活性的影响统计图；

图6外源褪黑素对莱茵衣藻处于盐或非盐胁迫时对其细胞POD活性的影响比较图；

6a外源褪黑素对莱茵衣藻处于非盐胁迫时对其细胞POD活性的影响；

6b外源褪黑素对莱茵衣藻处于盐胁迫时对其细胞POD活性的影响；

图7外源褪黑素对莱茵衣藻处于盐或非盐胁迫时对其细胞MDA含量的影响比较图；

7a外源褪黑素对莱茵衣藻处于非盐胁迫时对其细胞MDA含量的影响比较图；

7b外源褪黑素对莱茵衣藻处于盐胁迫时对其细胞MDA含量的影响比较图。

具体实施方式

本发明公开了褪黑素在增加植物细胞中抗氧化酶活性的应用。该植物细胞所在的为盐胁迫的环境。进一步地，该植物为单细胞植物。该褪黑素中有效成分的浓度为0.1～1μM。该单细胞植物为莱茵衣藻。在植物细胞的培养过程中添加褪黑素。

本发明还公开了一种植物细胞中抗氧化酶活性的促进剂，其有效成分为褪黑素。

整个实验流程图如图1所示。其中，CK表示相应体积水；

首先，将莱茵衣藻细胞在含有1LTAP培养基的2L锥形瓶中于上述条件下培养直至它们达到对数生长后期，此时，OD在750nm处为0.8。在预培养3～4d后，将藻液分配到四个新实验组：(i)对照：具有相应体积水(CK)的300mL藻液；(ii)盐处理：补充有100mM NaCl(ST)的300mL藻液；(iii)褪黑素(用MT表示)处理：补充有0.1μM，1μM，10μM或100μM MT(分别用MT_{0.1，1，10，100}表示)的300mL藻液；(iv)MT和盐处理：补充有100mM NaCl和0.1μM，1μM，10μM或100μM MT(分别用ST+MT_0.1,1,10,100表示)的300mL藻液。在预培养第4天上午9:00(记为0h)开始实验，实验处理48小时。由于MT见光易分解，因此胁迫处理期间都是在暗光下进行实验处理。在处理0h，1h，3h，6h，12h，24h，36h和48h时收集藻液样品。取样过程为：收获40mL的莱茵衣藻细胞在4℃下离心10分钟，随后将沉淀悬浮在1mL 1倍磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后在6797×g，4℃下离心2分钟。最后将沉淀物转移到新鲜的1.5mL EP管中，将样品(鲜重约0.1g～0.2g)在液氮中冷冻，-80℃保存。通过测量光密度(OD)检测衣藻的生长。所有实验均独立重复三次。

为了测量藻类生长，将750nm处的OD作为培养物密度的量度。吸光度值用紫外可见分光光度计测定，使用1cm比色皿，并使用TAP作为空白。测量时间与采样时间相同，并将三次平行测定结果的平均值作为终值。

在倒置显微镜下进行单细胞莱茵衣藻的形态观察。为了观察衣藻细胞分别在高盐和低盐胁迫下的形态变化是否显著不同以及确定外源MT对其形态变化是否有影响，进行了以下几组实验：0mM NaCl(CK)，100mM NaCl(ST₁₀₀)，300mM NaCl(ST₃₀₀)，1μM MT(MT₁)，100mMNaCl+1μM MT(ST₁₀₀+MT₁)和300mM NaCl+1μM MT(ST₃₀₀+MT₁)。在预培养第4天上午9:00(0h)开始进行实验处理，衣藻的形态观察时间间隔为0h，12h，24h和48h。取样过程为：使用移液管吸取1ml藻液转移到1.5ml EP管中，并在室温下以3824×g离心1min。然后用新鲜的TAP洗涤沉淀物两次，并将沉淀重悬于1ml新鲜的TAP中。准备观察时，取30μl重悬细胞样品滴到玻璃载玻片上，并在100倍放大率的油镜下明场观察。

提取抗氧化酶的具体步骤为：取出储存于-80℃的样品并置于冰上。接下来，将800μl pH＝7的磷酸盐缓冲液加入到样品中，使样品的匀浆介质过量4倍(样品重量(g)：缓冲液体积(ml)＝1:4)。将样品转移到研钵中进行冰浴研磨，然后将匀浆转移到新的EP管中。将所制备的20％匀浆样品在1699×g的冷却低速离心机中离心10～15min，收集上清液，用于测定超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性。使用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒-WST-1方法测量SOD活性，使用过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒-可见光测量CAT活性，使用过氧化物酶测定试剂盒测量POD活性。这些酶的活性是以蛋白质含量为基础测定的。使用改善的的BCA蛋白质测定试剂盒测定上清液的总蛋白质含量。所有测定(包括酶活性)都是在25℃下使用紫外可见分光光度计或酶标仪进行的。

提取膜脂质过氧化产物之一-丙二醛(MDA)时，材料的预处理同“提取抗氧化酶”部分所述。根据制造商的说明，使用丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA方法)测量样品的MDA水平。

所有数据均表示为至少三次重复测量的均值标准差(SD)。使用SPSS统计软件进行统计分析。通过单因素方差分析中的Duncan多重比较检验对组间差异进行分析。P<0.05(小写拉丁字母)或P<0.01(大写拉丁字母)水平上的差异被认为具有统计学显著性。

检测结果如下：

1.褪黑素对莱茵衣藻在盐或非盐胁迫下细胞生长的影响：

图2显示了莱茵衣藻细胞的生长曲线变化。将衣藻细胞预培养3～4天，直至OD在750nm处约为0.8。此时，细胞处于对数生长后期。由于在0小时将相应体积的水或盐水溶液加入到TAP培养基中，培养基中的细胞密度被稀释，使得OD值的初始值约为0.69。整个实验过程中，MT组和CK组的细胞生长速度均快于ST组和ST+MT组。不管是对照组还是实验组的细胞生长速度在12h前总呈现出直线上升的趋势，并且细胞数量都在第12h时达到了峰值。之后，所有的细胞生长速度都在逐渐下降，细胞数量在48h达到最低值。

MT、CK处理组的细胞在试验期间的前24h都没有显著性差异，在36h的OD值测定时，MT_0.1、CK都与MT₁₀₀呈现出极显著差异，这可能说明MT₁₀₀处理组中过高MT的添加没有对衣藻细胞的生长产生积极影响。在第48h时，MT_0.1组的细胞生长与CK组呈现出了显著性差异，这说明0.1μM MT的添加可以促进细胞生长，使细胞具有更加旺盛的生命力。

ST、ST+MT处理组细胞的生长在实验处理1h时没有显示出非常显著的差异。从3h到6h，ST、ST+MT_0.1、ST+MT₁的细胞都与ST+MT₁₀，ST+MT₁₀₀均呈现出极显著差异，并且这种差异一直延续到了第48h。这说明在ST+MT₁₀和ST+MT₁₀₀两组中，10μM和100μM MT的添加并没有起到缓解盐胁迫的作用，反而对细胞造成了一定的胁迫，最终导致细胞生长率下降。在第48h时，ST+MT_0.1和ST+MT₁细胞的生长与ST组呈现出极显著差异，这说明0.1μM和1μM MT的添加可能在一定程度上缓解NaCl对细胞的不良影响，帮助细胞抵御这种不良环境。

2.褪黑素对莱茵衣藻在盐胁迫或非盐胁迫下形态变化的影响：

图3展示了莱茵衣藻分别在不同环境下随着处理时间延长的细胞形态变化。在0h时，可观察到细胞的大小是均一化的，鞭毛清晰可见，并且细胞的运动速度非常快，细胞呈现出旺盛的生命活力。CK组在12h观察时，在整个视野范围内细胞的大小没有明显变化，可以清晰的看到有极少数的二细胞聚集体或四细胞聚集体出现，这可能是由于实验处理期间的暗培养所造成的；24h时，四细胞聚集体的数量明显增多；48h时，细胞的生长状态一般，并观察到有细胞聚集体溶解的现象。与之相对应的MT₁组，可以看到细胞在12h时细胞体积明显增大，这是由于褪黑素是通过增大细胞体积来促进细胞生长的。与此同时，视野范围内是几乎没有细胞聚集体出现的，并且在12h之后的实验周期中，也只是出现了二细胞聚集体。与CK细胞相比，MT₁细胞的生长状态更旺盛，表明MT的加入可以减轻应激对细胞的影响并增强细胞的生长。

在100mM NaCl处理组中，ST₁₀₀组和ST₁₀₀+MT₁组中都有大量的四细胞聚集体甚至多细胞聚集体出现。在24h之前，ST₁₀₀+MT₁组的四细胞聚集体的生长状态要比ST₁₀₀组更好。在48h时，ST₁₀₀组可以观察到多细胞聚集体溶解，并伴有细胞内溶物质流出到培养基中的现象；而ST₁₀₀+MT₁组仍然有很多的完整四细胞聚集体，并且没有细胞聚集体溶解的现象。这表明褪黑素的添加可以维持莱茵衣藻在100mM NaCl下四细胞聚集体的形态，以协助它抵抗这种不良的环境。

在高盐处理组中，无论是ST₃₀₀组还是ST₃₀₀+MT₁组在整个实验期间都极少出现细胞聚集体的现象，这可能是由于高盐这种过激胁迫直接引起了细胞的死亡；同时可以明显观察到细胞的生命力显著下降，运动速度也变得缓慢，大多数细胞失去鞭毛，因此它们的运动性受损，并且细胞密度也明显降低。在12h时，ST₃₀₀组和ST₃₀₀+MT₁组的许多细胞体积都明显变大。在48h时，ST₃₀₀组的大部分细胞出现萎缩，并且细胞色素数量减少，表明细胞正在趋向死亡。而ST₃₀₀+MT₁组中观察到的细胞状态稍强于ST₃₀₀组。

3.褪黑素对莱茵衣藻在盐或非盐胁迫下细胞内抗氧化酶活性的影响：

图4显示了实验期间莱茵衣藻细胞内SOD酶活的变化。在MT、CK处理组中，细胞内的SOD酶活从1h逐渐升高，在第12h达到最大值，之后逐渐下降并于48h降到最低值。值得注意的是，48h的SOD酶活仍然要比0h高。在0h到24h，MT₁组相对于CK组在P<0.01水平上一直都极显著地提高了细胞内的SOD酶活性。24h到36h，1μM MT在P<0.05水平上可以显著提高细胞内SOD酶活性。MT_0.1组细胞内的SOD酶活性在P<0.05的水平上也是显著高于CK组。MT₁₀和MT₁₀₀组细胞内的SOD酶活性与CK组相比无显著性差异，但MT₁₀₀组细胞内的SOD酶活性一直都是低于CK组，并且从1h后一直处于下降趋势。从以上描述我们可发现低浓度的MT可以刺激细胞提高产生SOD酶来保护细胞免受暗光培养的不适；高浓度的MT如100μM MT本身就是直接的抗氧化剂，所以没有增高细胞内的SOD酶活性。在ST、ST+MT处理组中，细胞内达到最高SOD酶活性的时间是提前于MT、CK处理组的。衣藻培养基中添加100mM NaCl后，细胞可能是受到盐胁迫环境的刺激作用使得细胞内的SOD酶活性在3h到6h就达到了最高值，然后逐渐降低。在整个实验周期中，ST+MT_0.1和ST+MT₁组的SOD酶活性都是极显著的高于ST组。ST+MT₁₀组的SOD酶活性与ST组相比无显著性差异。ST+MT100组的SOD酶活性自24h后一直是显著的低于ST组。综上，0.1μM和1μM的MT可以极显著的刺激细胞产生SOD酶来保护细胞抵抗NaCl带来的的不良影响；100μM的MT可以直接清除活性氧物质来保护细胞减轻氧化应激，因而细胞自己的SOD酶活并没有被显著提高。

图5显示了CAT活性测定的结果。MT和CK处理组CAT活性在整个实验期间呈现逐渐上升趋势，并于48h达到最大值。MT₁₀和MT₁₀₀组细胞内的CAT活性与CK组没有显著性差异甚至有时还会极显著的低于CK组。然而，MT_0.1和MT₁组细胞内的CAT活性自24h后一直是极显著的高于CK组。这表明0.1μM和1μM MT的MT添加都可以极显著的提高衣藻细胞内CAT的活性，并且1μM MT是最佳浓度。同时说明高浓度MT的添加并不会有效提高细胞内CAT的活力。ST、ST+MT处理组中CAT活性的变化趋势与MT、CK处理组是不同的。由于衣藻的培养液中加入了100mM NaCl，所以衣藻细胞内CAT酶活在第3h就达到了最高值，之后逐渐降低，并于48h达到最低值。这可能是由于随着盐胁迫时间的延长衣藻细胞数量减少所造成的。ST+MT₁₀组细胞内的CAT活性从3h到48h一直是极显著的高于ST组。在24h后，MT浓度较低的ST+MT_0.1和ST+MT₁组及MT浓度较高的ST+MT₁₀₀组也显示出显著高于ST组的特征。所以，在盐胁迫组中，10μM的MT是可以极显著提高细胞内CAT活力的最佳浓度。从以上结果我们可以看出褪黑素的添加是可以提高衣藻细胞内的CAT活力的。但是，针对于不同的处理，加入衣藻培养基中的MT的浓度是不同的。例如盐胁迫组添加的最佳褪黑素浓度为10μM MT，这比非盐处理组的1μMMT的浓度要高。

在POD酶活性的测定中，如图6所示，MT、CK、ST、ST+MT组中细胞内POD酶的活性均呈逐渐上升的趋势。在MT、CK处理组中，24h后MT组细胞内的POD酶活性都是极显著的高于CK组，结果显示无论是高浓度的褪黑素还是低浓度的褪黑素都可以极显著的提高细胞内的POD酶活性。在ST、ST+MT处理组中，细胞内POD的活力在36h～48h达到最高值。从图中可以清楚的观察到0.1μM MT极显著增加细胞内POD酶活性并且是效果最佳的浓度。除此之外，0.1μM的MT可以帮助细胞在36h就有最高的POD酶活性，而MT₁、MT₁₀和MT₁₀₀组细胞内的POD酶活性在48h才达到最高值。这说明在莱茵衣藻面对盐胁迫时，低浓度的MT就可以极显著的提高细胞内POD酶活性，从而增强衣藻的抗氧化能力。

4.褪黑素对莱茵衣藻在盐或非盐胁迫下细胞内膜脂质过氧化产物之一——丙二醛(MDA)含量的影响：

在整个实验期间，MT，CK，ST和ST+MT组细胞内的MDA含量均呈现逐渐增高的趋势。然而，当培养基中添加外源MT后，这种MDA随处理时间而增高的趋势被缓解(图7)。在MT、CK处理组中，自12h后，MT₁组细胞内的MDA含量极显著低于CK组，其他MT组细胞内的MDA含量也低于CK组。在ST、ST+MT处理组中，ST组MDA含量增加的很快。0.1μM和1μM MT的添加(ST+MT_0.1、ST+MT₁)可以极显著降低细胞内MDA的形成。经历盐胁迫24h后，较高剂量的10μM和100μM MT的添加在降低细胞内MDA含量上效果较差。

最终得出如下结果：0.1μM和1μM的MT促进莱茵衣藻细胞的生长，10μM和100μM的MT抑制莱茵衣藻细胞的生长；1μM的MT可以帮助衣藻维持其在不利环境条件下盐胁迫下的聚集细胞形态；0.1μM、1μM和10μM的MT可以增加抗氧化系统中的SOD，CAT和POD酶活性，以帮助莱茵衣藻消除有毒物质，同时可通过降低衣藻属细胞的膜过氧化产物MDA的水平来缓解细胞氧化损伤。结果表明，外源MT通过增加与抗氧化系统相关的酶活性来增强莱茵衣藻细胞的耐盐机制。同时，发现一种合适的外源褪黑素浓度可以提高莱茵衣藻抗盐能力的方法。

Claims (7)

1.褪黑素在增加植物细胞中抗氧化酶活性的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，植物细胞所在的为盐胁迫的环境。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为单细胞植物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述褪黑素中有效成分的浓度为0.1～1μM。

5.根据权利要求4述的应用，其特征在于，所述单细胞植物为莱茵衣藻。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在植物细胞的培养过程中添加褪黑素。

7.一种植物细胞中抗氧化酶活性的促进剂，其特征在于，有效成分为褪黑素。