CN117448346B - OsABCI8基因或其编码的蛋白在水稻育种中的应用 - Google Patents
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Abstract
OsABCI8基因或其编码的蛋白在水稻育种中的应用。利用OsABCI8基因提高水稻产量和/或增加水稻单穗粒数的方法包括以下步骤：通过基因克隆的方法获得OsABCI8基因的CDS(Coding DNA Sequence)序列；并且构建用于水稻转化的表达载体；将构建好的表达载体转入到根癌农杆菌中，转化水稻，并且获得转基因植株。本申请OsABCI8基因表达水平的增加能够使水稻产量提高和/或水稻单穗粒数增加。
Description
技术领域
本文涉及基因工程技术，尤指OsABCI8基因或其编码的蛋白在水稻育种中的应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一。提高单位面积水稻产量是解决粮食安全问题的关键。有效穗数(分蘖数)、穗粒数、结实率和千粒重是影响水稻产量的重要因素(Wangand Li,2011)。水稻穗粒数是与水稻产量联系最为直接，并且变异度最大的要素，因此历来是育种家们首要关注的育种目标(Yamagishi et al,2002)。研究发现穗粒数由多基因控制且受环境影响较大，已克隆的穗粒数调控基因较少，因而限制了其在农业生产上的应用。
对已经克隆的控制水稻穗粒数的基因进行分析发现：一部分基因，如TAW仅调控水稻穗粒数(Yoshida et al.,2013)。而更多控制水稻穗粒数的基因，表现出了明显的一因多效性-除了调控穗粒数，还影响了其他农艺性状如分蘖数、抽穗期等。同时控制水稻穗粒数和分蘖数的基因可分为2类，一类基因在调控穗粒数(穗枝梗数)和分蘖数上保持着相同的变化趋势如MOC1、LAX1、APO1等,，其突变后导致穗枝梗数减少，分蘖数下降(Komatsu etal.,2003；Ikeda et al.,2007)。另外一部分基因对穗粒数和分蘖数的调控则表现出不一致的变化趋势。如IPA基因，其近等基因系NIL-ipa1表现出穗粒数增加，分蘖减少的表型(Jiao et al.,2010)；从野生稻中分离出的QTL位点gpa7、qssp1和spd6等导致穗粒数减少，分蘖数增加(Xing et al.,2008；Shan et al.,2009)。研究发现一些水稻穗粒数相关基因(如Ghd7、Ghd8、RFL、RCN1/2、COL13等)还参与了水稻抽穗期的调控(Xue et al.,2008；Weiet al.,2010)。上述基因可能通过延长生育期，使水稻产生更多的枝梗原基和籽粒原基，从而增加穗粒数。另外，一些基因通过影响水稻植株整体生长情况或者影响生殖生长来调控穗粒数，其突变后往往导致籽粒数目减少，如JMJ703和DFO等(Cui et al.,2013；Yan etal.,2015)。此外，一些调控水稻穗粒数的基因还控制水稻驯化相关性状，如控制水稻匍匐属性的关键基因PROG1(Tan et al.,2008)，控制水稻芒的基因An-1和GAD1(Luo et al.,2013；Jin et al.,2016)。综上，已知的大多数调控穗粒数的基因，同时还调控其他农艺性状。因此，当其增加籽粒数目的同时，可能伴随着抽穗期延长、分蘖数降低、千粒重减少等表型，进而影响了水稻的增产。
ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter)在生物界广泛存在，其主要功能是参与底物(包括激素、金属离子、糖类、脂质、次生代谢产物和外源物质等)的跨膜转运(Verrier et al.,2008；Do et al.,2018)。植物中的ABC转运蛋白家族成员较多，拟南芥和水稻中分别有130个和132个ABC转运蛋白。根据同源性分析，将与真核生物同源的家族成员划分为ABCA-ABCG七个亚家族；将与原核生物中多亚基转运蛋白类似的成员划分为ABCI亚家族，拟南芥和水稻中分别有21和17个ABCI蛋白(Garcia et al.,2004；Verrier etal.,2008)。拟南芥中的研究发现ABCI蛋白参与了光信号传导(Moller et al.,2001)，铁-硫簇组装(Xu et al.,2004)及金属离子平衡调控(Shimoni et al.,2010)等生命过程。然而，目前对水稻中ABCI基因的功能研究还相对较少。对OsABCI8的研究发现，OsABCI8定位于叶绿体，其突变导致叶片中铁和镍含量增加，叶绿素含量下降，类囊体膜结构减少，叶片在连续阴雨天表现出白化表型(Zeng et al.,2017)。但OsABCI8过量表达后的表型并不清楚。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
本申请提供了OsABCI8基因或其编码的蛋白在水稻育种中的应用。本申请发现在OsABCI8过量表达后，抽穗期基本不变，水稻穗粒数明显增加，株高、分蘖数(即有效穗数)、千粒重、结实率等农艺性状与对照相比无明显差异。因此，OsABCI8基因及其蛋白可用于增加水稻产量。
本申请提供了OsABCI8基因或其编码的蛋白在水稻育种中的应用。
本申请提供了OsABCI8基因或其编码的蛋白在提高水稻产量中的应用。
本申请提供了OsABCI8基因或其编码的蛋白在增加水稻单穗粒数中的应用。
在一些示例性实施方式中，所述应用还包括使用与所述OsABCI8基因序列具有至少70％同一性的序列或其编码的蛋白。
在一些示例性实施方式中，所述序列与SEQ ID NO.1具有至少71％同一性；优选地至少72％同一性；优选地至少73％同一性；优选地至少74％同一性；优选地至少75％同一性；优选地至少76％同一性；优选地至少77％同一性；优选地至少78％同一性；优选地至少79％同一性；优选地至少80％同一性；优选地至少81％同一性；优选地至少82％同一性；优选地至少83％同一性；优选地至少84％同一性；优选地至少85％同一性；优选地至少86％同一性；优选地至少87％同一性；优选地至少88％同一性；优选地至少89％同一性；优选地至少90％同一性；优选地至少91％同一性；优选地至少92％同一性；优选地至少93％同一性；优选地至少94％同一性；优选地至少95％同一性；优选地至少96％同一性；优选地至少97％同一性；优选地至少98％同一性；优选地至少99％同一性；优选地至少99.99％同一性。
“百分比同一性”和“％同一性”是指两个序列(核苷酸或氨基酸)在比对中的相同位置处具有相同残基的程度。例如，“氨基酸序列与SEQ ID NO:Y X％相同”是指氨基酸序列与SEQ ID NO:Y的同一性％并且详细说明为氨基酸序列中X％的残基与SEQ ID NO:Y中公开的序列的残基相同。通常，应用计算机程序进行这样的计算。比较和比对序列对的示例性程序包括ALIGN(Myers和Miller,1988)、FASTA(Pearson和Lipman,1988；Pearson,1990)和带空位的BLAST(Altschul等人，1997)、BLASTP、BLASTN或GCG(Devereux等人，1984)。
在一些示例性实施方式中，所述OsABCI8基因在SEQ ID NO.1中示出；所述OsABCI8基因编码的蛋白序列在SEQ ID NO.2中示出。
在一些示例性实施方式中，利用OsABCI8基因提高水稻产量和/或增加水稻单穗粒数的方法包括以下步骤：通过基因克隆的方法获得OsABCI8基因的CDS序列；并且构建用于水稻转化的表达载体；将构建好的表达载体转入到根癌农杆菌中，转化水稻，并且获得转基因植株。
在一些示例性实施方式中，基因克隆的方法中采用的引物如下：
正向引物8F：5’-CGGGATCCATGCAGGTGGTGGGGACGGC-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物8R：5’-GGGGTACCTCAATTATCTCTCCATTGAA-3’(SEQ ID NO.4)。
上述斜体加下划线的序列分别为BamHI酶切位点与KpnI酶切位点，并且酶切位点上游GG为保护碱基，且酶切位点下游序列为用于扩增目的基因的特异性序列。
在一些示例性实施方式中，所述应用包括产生包含OsABCI8基因过量表达的水稻品系。
本申请提供了OsABCI8基因或其编码的蛋白在农作物育种中、在提高农作物产量中或在增加农作物单穗粒数中的应用，所述农作物为小麦、高粱或小米。
与相关技术相比，本申请具有以下优点：
本申请发现已有的调控穗粒数的基因多是利用正向遗传学克隆获得的。通过构建群体，图位克隆获得目的基因，工作量大，花费的时间长。本项目通过反向遗传学的方法，用水稻基因OsABCI8的过量表达载体转化水稻后，可显著增加穗粒数，工作量少，时间短。
已知OsABCI8具有调控叶绿体发育的功能，其突变后产生叶片黄化的表型，但其过量表达后的表型及用途尚未见报道。
已有的增加穗粒数的材料，可能伴随着结实率降低、分蘖数减少、千粒重降低，植株矮化等表型，并不能达到增产的效果，但本申请中OsABCI8过量表达后，穗粒数增加，其他农艺性状保持不变，因而可以达到增产的效果。
过量表达后，抽穗期基本不变，水稻穗粒数明显增加，株高、有效穗数(分蘖数)、千粒重、结实率等农艺性状与对照相比无明显差异。因此，OsABCI8基因及其蛋白可用于增加水稻产量。
本申请的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
图1示出了OsABCI8过量表达植株与对照植株的OsABCI8相对表达量的检测结果。
图2示出了OsABCI8过量表达植株与对照植株的农艺性状统计结果。
图3示出了OsABCI8过量表达植株与对照植株的穗粒数比较结果。
图4示出了OsABCI8过量表达植株与对照植株的单株产量比较结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述实施例仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂、载体、菌株等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
1.载体构建及遗传转化
使用引物正向引物8F：CGGGATCCATGCAGGTGGTGGGGACGGC和反向引物8R：GGGGTACCTCAATTATCTCTCCATTGAA从水稻(日本晴)叶片cDNA中扩增OsABCI8的CDS序列，用BamHI(宝生物工程有限公司)和KpnI(宝生物工程有限公司)酶切后，连入过量表达载体pUN1301(中国科学院植物研究所)，获得过量表达载体ABCI8OE。将表达载体ABCI8OE转化根癌农杆菌EHA105(来自中国科学院植物研究所)，获得阳性克隆。用阳性克隆转化水稻愈伤组织，获得OsABCI8的过量表达转基因材料30株(水稻的遗传转化方法同常规方法)。
2.转基因材料的鉴定
由于转化载体带有GUS报告基因，因此通过对再生苗进行GUS染色，可以初步判断再生苗是否为转基因阳性苗。剪取3-4片叶子于离心管，加入10μL GUS染液，37℃温育30min，叶片切口呈现蓝色的为阳性苗。
GUS染色液的成分为：200mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，0.1％TritonX-100，10mM EDTA，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，1mg/mL X-Gluc。
进一步提取再生苗的基因组DNA，通过扩增潮霉素抗性基因或OsABCI8的cDNA片段来确定是否为转基因阳性植株，获得阳性植株25株。
3.表达量分析
随机挑取5个单株(OE2、OE4、OE10、OE15、OE22)利用引物qRT-8F(序列为TGCCATTAACTCGGTTGGTC，SEQ ID NO.5)和qRT-8R(序列为AGGTCATGACTTACAGCCAG，SEQ IDNO.6)，检测OsABCI8的表达量，内参基因为肌动蛋白1，引物序列为肌动蛋白-F：TGCTATGTACGTCGCCATCCAG(SEQ ID NO.7)和肌动蛋白-R：AATGAGTAACCACGCTCCGTCA(SEQ IDNO.8)。表达结果表明过量表达转基因植株中OsABCI8的表达水平升高了2-20倍(图1，CK为对照)，挑选表达量中等的2个植株OE4和OE10进行后续实验。
4.农艺性状分析
OsABCI8过量表达植株与对照植株相比，抽穗期基本一致，播种日期为4月30日，抽穗期为8月5日。对过量表达植株的基本农艺性状进行统计(统计数为20个单株)，发现与对照(CK)相比株高略有增加，有效穗数、结实率与千粒重与对照无显著差异(图2)，但单穗粒数显著增加(图3，CK为对照；其中，*表示差异显著，**表示差异极显著)。对OsABCI8的过量表达植株OE4和OE10的单株产量进行测定，发现OE4和OE10的单株产量显著高于对照(CK)(图4，CK为对照；其中，*表示差异显著，**表示差异极显著)。因此，OsABCI8过量表达后，通过增加穗粒数，进而增加单株产量。
种植条件：
将转基因株系(OE4和OE10)及对照(CK)于2023年春季种植于贵阳。每桶土壤量为15kg，种植4棵水稻，于分蘖期施加尿素8g，氯化钾0.8g，常规水肥管理。
以下为OsABCI8的CDS序列及其氨基酸序列：
OsABCI8(Os11g0490800LOC_Os11g29850 LOC9270400)
CDS序列SEQ ID NO.1
ATGCAGGTGGTGGGGACGGCCGCCGCGTTCTCGCCGGCGGTGACGCCGTCTCCGGCGAGGAGGCGGGCCGTGGATTCAGGGAGGAGGTTTTCTCGAAGCTGTCGGTCGGGGAGAGTTTCAGTCTCAGCAGTTGGGTACTCCCAATTGGAGGTCAGAAGAGTTAGCTATCGACCTCCAGGAACCGAACAAAACTTGTTGAATGAAATTAGCCTCAATCTTAAGGAGAAAAGTTTTGGATTACTTTTTGGACGAAGCGGGAGCGGAAAAACTACTCTTTTGCAGCTTTTGGCAGGTCTATCGGAACCTACCCATGGGACAATTTGCATACAGAAGTACAACGATAGTGGAAATCCTATGGGTCCACCAGAATTATTAACTGCTCAAAGAGTTGGTATCGTGTTTCAGTTTCCTGAGAGGTACTTCTTAGCAGATACTGTGCTTGAGGAAATTACTTTTGGATGGCC ACGGCAAAATACAGACTTTCTTTTTAGGGAGAAGCTTGCTTTAAAACTTCAAAATGCCATTAACTCGGTTGGTCTGAATGGCATTTCATTGGAAGAAGATCCACAATCTCTAAGTGGTGGGTTTAAACGGCGACTTGCTTTGGCAATTCAACTGGTCCAAACTCCTGATCTATTATTGCTTGATGAGCCTCTTGCTGGTCTTGATTGGAAAGCTCGTGCTGACGTTGTGAATCTTCTCAAGGACCTAAAGAAGGATCATACTATACTGGCTGTAAGTCATGACCTAAGGGAATTGTACCCACTAGTTGACCGCTCATGGAGAATGGAAATGGGGGGAGTTTTGAAGGAAGAAGCTTTATCTGTGAGCAAGCAAATGCAAGCAGAACTTCAATGGAGAGATAATTGA；
氨基酸序列SEQ ID NO.2
MQVVGTAAAFSPAVTPSPARRRAVDSGRRFSRSCRSGRVSVSAVGYSQLEVRRVSYRPPGTEQNLLNEISLNLKEKSFGLLFGRSGSGKTTLLQLLAGLSEPTHGTICIQKYNDSGNPMGPPELLTAQRVGIVFQFPERYFLADTVLEEITFGWPRQNTDFLFREKLALKLQNAINSVGLNGISLEEDPQSLSGGFKRRLALAIQLVQTPDLLLLDEPLAGLDWKARADVVNLLKDLKKDHTILAVSHDLRELYPLVDRSWRMEMGGVLKEEALSVSKQMQAELQWRDN。
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Claims (5)
1.OsABCI8基因或其编码的蛋白在提高水稻产量中的应用，其中，所述OsABCI8基因在SEQ ID NO.1中示出；所述OsABCI8基因编码的蛋白序列在SEQ ID NO.2中示出。
2.OsABCI8基因或其编码的蛋白在增加水稻单穗粒数中的应用，其中，所述OsABCI8基因在SEQ ID NO.1中示出；所述OsABCI8基因编码的蛋白序列在SEQ ID NO.2中示出。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的应用，其中，利用OsABCI8基因提高水稻产量和/或增加水稻单穗粒数的方法包括以下步骤：通过基因克隆的方法获得OsABCI8基因的CDS序列；并且构建用于水稻转化的表达载体；将构建好的表达载体转入到根癌农杆菌中，转化水稻，并且获得转基因植株。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，基因克隆的方法中采用的引物如下：
正向引物8F：5’-CGGGATCCATGCAGGTGGTGGGGACGGC-3’；
反向引物8R：5’-GGGGTACCTCAATTATCTCTCCATTGAA-3’。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述应用包括产生包含OsABCI8基因过量表达的水稻品系。
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