JP3512409B2 - 植物内での増強発現 - Google Patents

植物内での増強発現

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換え体発現系に関し、詳しくは植物中で
より大量の蛋白質を発現する植物発現系に関する。
発明の背景 植物中で蛋白質を生産するための組換え遺伝子は、植
物中で機能するプロモーター、標的蛋白質をコードする
構造遺伝子、及び植物中でポリアデニル化ヌクレオチド
をRNA配列に付加させるべく機能する非翻訳領域をこの
順序で含む。多くの科学研究が、より大量の標的蛋白質
を発現させるためにこれらの組換え体植物遺伝子の改良
に向けられてきた。
より高いレベルの発現の一つの利点は、耕種学的に重
要である充分な量の標的蛋白質を生産する植物を回収す
るために、より少数のトランスジェニック植物が生産及
びスクリーニングされる必要が有るということである。
高レベルの発現は、商業的に重要な表現型特性を示す植
物をもたらす。
改良された組換え体植物遺伝子が、植物ウィルス由来
のプロモーターの如きより強力なプロモーターの使用に
より見い出されている。プロモーターの５′側にエンハ
ンサー配列を配置することにより、発現の改良が遺伝子
構築物で得られている。また更なる改良が、特に単子葉
植物に於いて、構造遺伝子をコードする配列とプロモー
ターとの間に位置する非翻訳リーダー内にイントロンを
有する遺伝子構築物によって達成されている。例えば、
Callisら（1987年）Genes and Development,1巻、1183
−1200ページは、アルコール脱水素酵素−１（Adh−
１）イントロン又はBronze−１イントロンの存在が高レ
ベルの発現に導くことを報告している。Dietrichら（19
87年）J.Cell Biol.,105,67ページは、５′非翻訳リー
ダー鎖長がプロトプラスト中での遺伝子発現に重要であ
ると報告している。Mascarenhasら（1990年）Plant Mo
l.Biol.,15巻、913−920ページは、Adh−１イントロン
の使用によりCAT発現の12倍及び20倍の増強を報告して
いる。Vasilら（1989年）Plant Physiol.,91,1575−157
9ページは、Shrunken−１（sh−１）イントロンが、Adh
−１イントロン含有構築物に比べて約10倍の高い発現を
生じさせることを報告している。Silvaら（1987年）J.C
ell Biol.,105,245ページは、CATの発現に対する18Kd熱
ショック蛋白質（HSP18）遺伝子の非翻訳領域の作用に
ついての研究を報告している。Semrauら（1989年）J.Ce
ll Biol.,109,39Aページ及び、MettlerらN.A.T.O.Advan
ced Studies Institute on Molecular Biology,Elmer,B
avaria（1990年５月）は、82Kd熱ショック蛋白質（HSP8
2）の140bpイントロンが、トウモロコシプロトプラスト
中で発現を増強することを報告している。
より改良された組換え体植物遺伝子の研究が、上記の
理由により続けられている。
発明の概要 本発明は、植物中でのキメラ植物遺伝子の発現のため
の、詳しくは単子葉植物中でのより高い発現を達成する
ための改良された方法に関する。本発明の改良点は、遺
伝子プロモーターから３′で且つ蛋白質をコードする構
造DNA配列から５′に位置する非翻訳リーダー内に、本
質的に配列番号:1、配列番号:2及び配列番号:3から成る
群から選ばれる70Kdトウモロコシ熱ショック蛋白質（HS
P70）から誘導されるイントロンを有するキメラ植物遺
伝子を発現することを含む。
本発明の一の実施態様は、 （ａ）植物中でRNA配列を産生させるべく機能するプロ
モーター、 （ｂ）本質的に配列番号:1、配列番号:2及び配列番号:3
から成る群から選ばれるイントロンを含む非翻訳リーダ
ーDNA配列、 （ｃ）蛋白質をコードするRNA配列の産生を引き起こす
構造DNA配列、及び （ｄ）植物細胞内でRNA配列の３′末端にポリアデニル
化ヌクレオチドを付加させるべく機能する３′非翻訳配
列（ここで、イントロンはプロモーターに関して異種で
ある）をこの順序で含む組換え二重鎖DNA分子である。
本発明の他の実施態様は、本質的に配列番号:1に示さ
れるヌクレオチドから成る単離したDNA配列である。
本発明の他の実施態様は、本質的に配列番号:2に示さ
れるヌクレオチド及び配列番号:3に示されるヌクレオチ
ドから成る群から選ばれる合成DNA配列である。
本発明の他の実施態様は、上記キメラ植物遺伝子を含
むトランスジェニック植物、特にトランスジェニック単
子葉植物である。その結果得られたトランスジェニック
植物は、植物細胞の染色体中に挿入された外来遺伝子を
発現することが出来る。
本発明は、トランスジェニック植物中で発現した場
合、本発明のキメラ遺伝子内の構造コード配列によりコ
ードされるより大量の目的蛋白質を与えるキメラ植物遺
伝子を提供する。高蛋白質レベルは、存在する蛋白質に
依存して植物に重要な耕種学的性質を賦与する。例え
ば、Bacillus thuringiensis結晶トキシン蛋白質の発現
は、トランスジェニック植物を昆虫の攻撃から防御す
る。植物ウィルスコート蛋白質の発現は、植物ウィルス
感染からトランスジェニック植物を防御する。グリホセ
ート（glyphosate）耐性遺伝子の発現は、グリホセート
除草剤の除草作用からトランスジェニック植物を防御す
る。
図面の簡単な説明 図１は、70kdトウモロコシ熱ショック蛋白質由来のイ
ントロンのDNA配列（配列番号:1）を示す。
図２は、70kdトウモロコシ熱ショック蛋白質由来のイ
ントロンの内部欠失を有する切頭DNA配列（配列番号:
2）を示す。
図３は、70kdトウモロコシ熱ショック蛋白質由来のイ
ントロンの内部欠失を有する別の切頭DNA配列（配列番
号:3）を示す。
図４は、プラスミドpMON8677の物理的地図を示す。
図５は、プラスミドpMON8678の物理的地図を示す。
図６は、プラスミドpMON19425の物理的地図を示す。
図７は、pMON19433、pMON19457及びpMON19470を調製
するために用いた工程を示す。
図８は、HSP70イントロン及び、植物中で発現させよ
うとする蛋白質をコードする構造遺伝子挿入のための多
数の制限部位を含むプラスミドpMON19470の物理的地図
を示す。
図９は、HSP70イントロン及びGUSコード配列を含むプ
ラスミドpMON19433の物理的地図を示す。
図10は、HSP70イントロン及びLUXコード配列を含むプ
ラスミドpMON19437の物理的地図を示す。
図11は、HSP70イントロン及びBt.k.−HD73コード配列
を含むプラスミドpMON10921の物理的地図を示す。
図12は、HSP70イントロン及びEPSPS:215コード配列を
含むプラスミドpMON19640の物理的地図を示す。
図13は、HSP70イントロン及びB.t.t.コード配列を含
むプラスミドpMON19484の物理的地図を示す。
図14は、HSP70イントロン及びB.t.k.−P2Cry IIコー
ド配列を含むプラスミドpMON19486の物理的地図を示
す。
図15は、HSP70イントロン及びACC−デアミナーゼコー
ド配列を含むプラスミドpMON18131の物理的地図を示
す。
図16は、切頭HSP70イントロン及びglgC16コード配列
を含むプラスミドpMON18103の物理的地図を示す。
図17は、HSP70イントロン及びGOXコード配列を含むプ
ラスミドpMON19643の物理的地図を示す。
図18は、ADH1イントロン及びLUXコード配列を含むプ
ラスミドpMON19400の物理的地図を示す。
図19は、ADH1イントロンを含むプラスミドEC9の物理
的地図を示す。
図20は、B.t.k.コード配列−HD73全長を含むプラスミ
ドpMON10920の物理的地図を示す。
図21は、ADH1イントロン及びGOXコード配列を含むプ
ラスミドpMON19632の物理的地図を示す。
図22は、トウモロコシEPSPSコード配列を含むプラス
ミドpMON8631の物理的地図を示す。
図23は、HSP70イントロンを含むカセットプラスミドp
MON19467の物理的地図を示す。
図24は、BARコード配列を含むプラスミドpMON19477の
物理的地図を示す。
図25は、B.t.k.コード配列−HD1/HD73ハイブリッドを
含むプラスミドpMON19493の物理的地図を示す。
図26は、GUSコード配列を含むプラスミドpMON19468の
物理的地図を示す。
図27は、CP4コード配列を含むプラスミドpMON19653の
物理的地図を示す。
本発明のキメラ遺伝子のイントロンを、Rochesterら
（1986年）Embo.J.,5:451−458によって記載されたpMON
9502中の70Kdトウモロコシ熱ショック蛋白質（HSP70）
からポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）を用いて誘導し
た。本明細書中に記載したイントロン配列（配列番号:
1）は、773塩基対のHSP70イントロン、10塩基対のフラ
ンキング５′エクソン配列及び、11塩基対のフランキン
グ３′エクソン配列を含む。イントロンを単離するため
に用いたプライマーは、PCR産物が、５′末端に６塩基
対のBgl II部位及び３′末端に６塩基対のNco I部位を
含むように設計する。
キメラ遺伝子は、植物プロモーター、評価可能な（sc
arable）マーカーコード配列及び、ポリアデニル化コー
ド配列を含む発現ベクターの５′非翻訳リーダー内のBg
l II及びNco I部位中に前記イントロンを挿入すること
によって構築される。所望の蛋白質をコードする構造DN
A配列の挿入を可能にする適切な制限部位を有する発現
ベクターを構築する。特に断らない限り、通常のクロー
ニング手法及びスクリーニング手法を用いる。
HSP70イントロンを含む本発明の遺伝子は、所望の植
物種の形質転換に適する植物形質転換ベクター中に挿入
することが出来る。適切な植物形質転換ベクターとして
は、Agrobacterium tumefaciensのTiプラスミドから誘
導されるものが挙げられる。植物形質転換ベクターは、
好ましくは、植物又は植物細胞の形質転換に必要とされ
る全ての必要な構成要素を含む。典型的植物形質転換ベ
クターは、選択可能マーカー遺伝子、１個又は両方のＴ
−DNAボーダー、クローニング部位、トランスコンジュ
ゲート（transconjugates）の同定を容易にする適当な
細菌遺伝子、広範な宿主域での複製及び転移機能及び、
他の所望の構成要素を含む。
植物細胞の形質転換は、ベクター又はDNAでコートし
た微粒子発射体を植物組織中へ高速で打ち込むことから
成る粒子銃（particle gun）の使用による形質転換ベク
ター又は遊離のDNAの送達により実現させることが出来
る。形質転換した植物細胞の選択及び全植物体への再生
は、通常の手法を用いて行うことが出来る。遊離のDNA
取り込みを高めるエレクトロポレーション又は化学薬品
の如き、植物細胞中へのDNAの挿入が可能な他の形質転
換技法を用いることが出来る。
植物中で発現させることの出来る遺伝子として、HSP7
0イントロンcDNA配列を植物形質転換ベクター中に挿入
する。本発明の目的により、“遺伝子”とは、単独で又
は他の構成要素との組み合わせのいずれかで植物中で発
現させることが可能である構成要素又は構成要素の組み
合わせと定義する。かかる遺伝子は、一般に、以下の順
序で、植物細胞中で機能するプロモーター、５′非翻訳
リーダー配列、所望の蛋白質をコードするDNA配列、及
び植物中でmRNA転写体の３′末端にポリアデニル化リボ
ヌクレオチドを付加させるべく機能する３′非翻訳領域
を含む。この定義に於いて、上記の各構成要素を操作可
能なように隣接の構成要素と結合させる。上記構成要素
を含む植物遺伝子は、植物形質転換ベクター中に公知の
標準組換えDNA法により挿入することが出来、必要に応
じて他の構成要素をベクターに付加することが出来る。
植物形質転換ベクターは、公知の方法によりDNAコード
領域をベクターに容易に付加することが出来る、蛋白質
又はその一部をコードする所望のDNA領域を除く、植物
発現のために必要な全ての構成要素を有するように調製
することが出来る。一般に、本発明のイントロンは、
５′非翻訳リーダー配列中に挿入される。
植物細胞中でDNAの転写を引き起こすことが知られて
いる又は見い出されているいずれのプロモーターも本発
明に用いることが出来る。本発明のイントロンの利用に
よる発現の増強量は、他のイントロンの利用により観察
されているように、用いるプロモーターの種類によって
変化する。Callisら（上掲）及びMascanenhasら（上
掲）の文献参照。適当なプロモーターは、植物又は植物
DNAウィルスの如き種々の起源から得ることが出来、そ
れとしては、必ずしもこれに限定されるものではない
が、カリフラワーモザイクウィルス19S及び35S（CaMV19
S及びCaMV35S）転写プロモーター又はゴマノハグサモザ
イクウィルス（figwort mosaic virus）全長転写プロモ
ーター（FMV35S）の如きカリモウィルス（caulimoviru
s）群から単離したプロモーターが含まれる。FMV35Sプ
ロモーターは、たいていの植物組織中でそれに結合した
蛋白質コード領域の高レベルの一定の発現を引き起こ
す。他の有用なプロモーターとしては、Katら（1987
年）Science 236:1299−1302によって述べられた如き増
強CaMV35Sプロモーター（eCaMV35S）及び、リブロース
1,5−ビスホスフェートカルボキシラーゼオキシゲナー
ゼ（RUBISCO）の小サブユニットプロモーターが挙げら
れる。
他の適当なプロモーターの例としては、イネアクチン
プロモーター、シクロフィリンプロモーター、ユビキチ
ンプロモーター、上記CallisらのADH1プロモーター、Be
vanら（1986年）Nucleic Acids Res.14（11）,4675−46
38のクラスＩパタチンプロモーター、ADPグルコースピ
ロホスホリラーゼプロモーター、Tierneyら（1987年）P
lanta 172:356−363のβ−コングリシニンプロモータ
ー、Deikmanら（1988年）Embo J.7（11）3315−3320のE
8プロモーター、Pearら（1989年）Plant Mol.Biol.13:6
39−651の2AIIプロモーター、Samacら（1990年）Plant
Physiol.93:907−914の酸性キチナーゼプロモーターが
ある。
選ばれたプロモーターは、所望の蛋白質のみの充分な
発現を引き起こすことが出来るはずであるが、特にHSP7
0イントロンと共に用いる場合、発現蛋白質によって表
現型でもたらされる性質を示す植物細胞及びそれから再
生される植物をもたらす有効量の所望蛋白質の産生に導
く。特に、増強したCaMV35Sプロモーター又はFMV35Sプ
ロモーターは、本発明に有用である。増強したCaMV35S
プロモーターは、植物細胞中で産生しようとする充分な
レベルの蛋白質mRNA配列をもたらす。
プロモーターにより産生されるmRNAは、５′非翻訳リ
ーダー配列を含有する。この非翻訳リーダー配列は、適
当な起源から誘導することが出来、mRNAの翻訳を増加さ
せるために特に改変することが出来る。５′非翻訳領域
は、遺伝子を発現させるために選ばれたプロモーター、
発現させようとする遺伝子又はコード領域の本来の５′
リーダー配列、ウィルスRNA、適当な真核細胞遺伝子配
列、又は合成遺伝子配列から誘導することが出来る。本
発明は、非翻訳領域がeCaMV35Sプロモーター由来の45個
のヌクレオチドから誘導される、後述の実施例で示され
る構築物に限定されるものではない。又、非翻訳リーダ
ー配列は、上記の如き無関係のプロモーター又はウィル
ス性コード領域から誘導することが出来る。
キメラ植物遺伝子の３′非翻訳領域は、植物中でポリ
アデニル化リボヌクレオチドをmRNA3′末端に付加させ
るべく機能するポリアデニル化シグナルを含有する。適
当な３′領域の具体例としては、NOS遺伝子の如きAgrob
acterium腫瘍誘導（Ti）プラスミド遺伝子のポリアデニ
ル化シグナルを含有する３′転写非翻訳領域及び、大豆
貯蔵蛋白質遺伝子の如き植物遺伝子及びRUBISCO遺伝子
の小サブユニットプロモーターが有る。好ましい３′領
域の具体例としては、下記実施例で述べた如きノパリン
シンターゼ（nopaline synthase）遺伝子由来のものが
有る。
単離したHSP70イントロン配列が所望のイントロン領
域を含むかどうかを決定するために、又単離したHSP70
イントロンの有効性及び効用を示すために、リポーター
遺伝子を植物カセットベクター中に挿入した。選択した
リポーター遺伝子は、E.coli β−グルクロニダーゼ（G
US）コード配列及びルシフェラーゼ（LUX）コード配列
である。
本発明のキメラ遺伝子は、植物中で発現させようとす
る蛋白質をコードするいかなる構造遺伝子をも含有する
ことが出来る。本発明の使用に適する蛋白質の具体例と
しては、植物のシキミ酸経路に関連する酵素であるEPSP
シンターゼ（５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ
酸シンターゼ;EC:25.1.19）がある。シキミ酸経路は、
植物に必須の芳香族アミノ酸の合成に前駆物質を提供す
る。特に、EPSPシンターゼは、ホスホエノールピルビル
酸及び３−ホスホシキミ酸の５−エノールピルビル−３
−ホスホシキミ酸への変換を触媒する。Ｎ−ホスホノメ
チルグリシンを含有する除草剤は、EPSPシンターゼ酵素
を阻害し、そのことにより、植物のシキミ酸経路を阻害
する。“グリホセート（glyphosate）”とは、通常、酸
性又は陰イオン形態のＮ−ホスホノメチルグリシン除草
剤を指すのに用いられる。新規なEPSPシンターゼ酵素
が、グリホセート含有除草剤に対し増加した耐性を表す
ことが発見されている。特に、成熟野性型EPSPシンター
ゼアミノ酸配列内の80番目と120番目の間に位置する配
列：−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−を有する高度に保
存された領域中のグリシンからアラニンへの単一置換を
有するEPSPシンターゼ酵素は、グリホセートに対する増
加した耐性を表すことが示されており、“グリホセート
耐性５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸シンタ
ーゼ”を発明の名称とする普通に譲渡された米国特許第
4,971,908号明細書に記載されている。その教示は、参
考として本明細書に含めるものとする。グリホセート耐
性を表すように植物を形質転換する方法は、“グリホセ
ート耐性植物”を発明の名称とする普通に譲渡された米
国特許第4,940,835号明細書中で考察されており、その
開示を、特に参考として本明細書に含めるものとする。
グリホセート耐性EPSPシンターゼ植物遺伝子は、EPSPシ
ンターゼポリペプチド（又はその活性部分）が植物細胞
内の葉緑体中へ運搬されるのを可能にする葉緑体転移ペ
プチド（CTP）を含有するポリペプチドをコードする。E
PSPシンターゼ遺伝子は、核中のmRNAに転写され、mRNA
は、細胞質中で前駆物質ポリペプチド（CTP/成熟EPSPシ
ンターゼ）に翻訳される。前駆物質ポリペプチドは、葉
緑体内に輸送される。
本発明の使用に適した蛋白質の別の具体例は、グリホ
セートをアミノメチル燐酸及びグリオキシル酸に変換す
る酵素であるグリホセート酸化還元酵素（GOX）であ
る。植物内でGOX酵素を発現することにより、グリホセ
ート除草剤に対する植物耐性が生じる。GOX酵素のアミ
ノ酸配列及び、植物中で増強した発現を表すように改変
したGOX酵素をコードする改変遺伝子については、“グ
リホセート耐性植物”を発明の名称とする1991年６月24
日出願の米国特許出願第07/717,370号の普通に譲渡され
た特許出願に記載があり、その教示を参考として本明細
書に含めるものとする。
本発明の使用に適した蛋白質の他の具体例は、Bacill
us thuringiensis（B.t.）結晶トキシン蛋白質であり、
これは、植物中で発現した場合、昆虫がB.t.トキシン蛋
白質を含有する植物を食べて死ぬか食べるのを止めるか
のいずれかであることから、昆虫来襲から植物を防御す
る。燐翅目昆虫又は甲虫類のいずれかに有毒なB.t.トキ
シン蛋白質を用いることが出来る。B.t.トキシン蛋白質
をコードする特に好適なDNA配列の具体例については、1
990年９月５日公開されたヨーロッパ特許出願第385,962
号明細書の“合成植物遺伝子及びその製造法”と題する
普通に譲渡された特許出願に記載があり、参考としてそ
の教示を本明細書に含めるものとする。
本発明の使用に適した酵素の他の具体例は、植物中で
発現した場合、植物組織内のエチレンレベルを減少させ
ることにより果物が熟すのを遅らせるアミノシクロプロ
パン−１−カルボン酸（ACC）オキシダーゼである。ACC
オキシダーゼをコードする好適なDNA配列の具体例につ
いては、1990年12月26日出願された米国特許出願第07/6
32,440号の“植物に於ける果物の成熟及び老化の制御”
と題する普通に譲渡された特許出願に記載があり、参考
としてその教示を本明細書に含めるものとする。
本発明の使用に好適な他の酵素の具体例は、アセト乳
酸シンターゼ、雄性不稔を起こすRNアーゼ（Marianiら
（1990年）Nature 347:737−741）及び、小麦アグルテ
ニンである。
本発明の使用に適した酵素の他の具体例は、植物中で
発現した場合澱粉含量を増加させるADPグルコースピロ
ホスホリラーゼである。かかる澱粉増強酵素の具体例に
ついては、1991年６月７日出願された米国特許出願第07
/709,663号の“植物内で増加した澱粉含量”と題する普
通に譲渡された特許出願に記載があり、参考としてその
教示を本明細書に含めるものとする。
Adamsら（1983年）J.Amer.Chem.Soc.105,661の方法に
より全オリゴヌクレオチドを合成した。ヌクレオチド塩
基アデニン、チミン、ウラシル、シトシン及びグアニン
は、それぞれ文字Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ及びＧにより表され
る。
本発明は、これらに限定されるものではないが、トウ
モロコシ、イネ、大麦、カラス麦、小麦、モロコシ、ラ
イ麦、サトウキビ、パイナップル、ヤマノイモ、タマネ
ギ、バナナ、ココナッツ、ナツメヤシ及びホップを含む
単子葉（monocot）植物科のいずれにも好適である。本
発明は、トウモロコシのトランスジェニック植物の生産
にとりわけ有用性を有する。
植物細胞の形質転換及びトランスジェニック植物の再
生に適したいずれの方法も、本発明の実施に用いること
が出来る。トランスジェニック植物の再生に適した方法
の具体例は、コーン（Frommら,1990年,Bio/Technology
8:833−839;及びGordon−Kammら,1990年,The Plant Cel
l 2:603−618）；イネ（Wangら,1988年,Plant Mol.Bio
l.11:433−439）及び小麦（Vasilら,1991年,Bio/Techno
logy 9:743−747）である。
生殖能力のあるトランスジェニック単子葉植物の生産
は、その生産法を共に形成するいくつかの工程を含む。
一般に、これらの工程は、１）形質転換しようとする所
望の単子葉植物組織を培養して適切な出発材料を得るこ
と;2）好適なDNAベクター及び、単子葉植物組織に移入
させる遺伝子を開発すること;3）適当な方法により目的
のDNAを標的組織内に挿入すること;4）植物細胞;5）ト
ランスジェニック細胞を生殖能力のあるトランスジェニ
ック植物に再生し子孫を生産すること；及び６）挿入し
た異種のDNA又は外来遺伝子の存在を確認するためにト
ランスジェニック植物及びその子孫を分析することを含
む。
本発明の好ましい方法は、出発植物材料として形質転
換及び再生に好適である胚形成カルス（embryogenic ca
llus）を用いる。胚形成カルスとは、形質転換されるこ
とができ、その後、生殖能力のある成熟トランスジェニ
ック植物に再生することの出来るカルスと定義する。胚
形成カルスは、好ましくは、組織培養に於いて良好なパ
フォーマンスを示すもろい（すなわち、砕け易い）Type
IIカルス表現型を有する。胚形成カルスは、当業者に
公知の標準手法（Armstrong,1991,Maize Genetic Newsl
etter 65:92−93）を用いて得ることが出来る。好適な
トウモロコシ胚形成カルス材料は、授粉後10日から12日
のトウモロコシ植物から未成熟胚を分離することにより
得ることが出来る。しかる後、カルス生育を開始させる
ため未成熟胚を固体培養培地上に移す。未成熟胚は、約
１週間後Type IIカルスとして増殖し始め、以後、これ
は、本発明の方法に用いるのに好適である。本発明の方
法に用いるのに好適な胚形成カルスは、未成熟胚の初期
カルス形成物から得ても良いし、或は２年齢までの古い
樹立カルス培養物から得てもよい。しかしながら、生殖
能力のあるトランスジェニック植物の回収を増強するた
めに、より若いカルス培養物を用いるのが好ましい。１
週齢から６カ月齢である胚形成カルスが好ましく、１週
から４週齢の胚形成カルスが最も好ましい。本発明の胚
形成カルスは、一度も懸濁培養を介して処理されたり、
懸濁培養物として維持されたことのない“一次”カルス
とみなされる。懸濁培養物とは、生育懸濁培養を樹立す
るために粉砕され１カ月から９カ月間液体溶液中に置か
れたカルスと定義する。本発明の使用に適した胚形成カ
ルスは、一度も懸濁培養を介して処理されたり、懸濁培
養物として維持されたことがないものである。
本発明の好ましい方法は、生殖能力のある成熟トラン
スジェニック植物に再生することのできる全ての単子葉
植物胚形成カルスへの適用が可能であり、特定の遺伝子
型、近交系、ハイブリッド又は形質転換される所望の単
子葉植物の種に依存しない。しかしながら、この方法の
効率が、おそらく用いられる特定の植物系の培養能及び
形質転換能に依存して変わるであろうことは、当然のこ
とである。本発明に於いて、好ましいトウモロコシ胚形
成カルスは、A188×B73F1遺伝子型ハイブリッド系、又
はこの系の誘導体、又は“Hi−II"遺伝子型から得るこ
とが出来る。もろいType IIカルス材料を生じさせ得る
いずれの遺伝子型も、本発明の方法に好適であり有用で
ある。胚形成カルスは、所望の表現型のカルスの生育を
促進する好適な組織培養培地中で培養を開始し維持する
ことが出来る。好適な組織培養培地は、植物遺伝子工学
の当業者等に公知である。表１に記載の組織培養培地中
で、A188×B73F1ハイブリッド系及びHi−II系を首尾良
く培養開始し維持し再生させた。
一旦、所望の胚形成カルス培養物を手に入れたなら
ば、組織の形質転換は可能である。外来遺伝子又は目的
とする遺伝子を胚形成カルスに移入することができる。
一般的に、胚形成カルス中に挿入されたDNAを異種DNAと
称する。異種DNAは、形質転換される特定の単子葉植物
中に普通に存在してもよいし存在しなくてもよい一つ以
上の外来遺伝子を含有することが出来る。外来遺伝子
は、典型的には、形質転換される特定の単子葉植物のゲ
ノム中に普通に存在してもよいし存在しなくてもよいDN
A配列を含む、キメラ又は組換え遺伝子構築物である。
異種DNAは、通常、特定の植物内での所望のポリペプチ
ドの発現に必要な構成要素を含む外来遺伝子を含有す
る。単子葉植物への形質転換に好適な異種DNAは、典型
的には、形質転換される植物に所望の形質又は特性を賦
与するポリペプチドをコードする外来遺伝子及び、植物
材料が形質転換されたかどうか決定するための、スクリ
ーニング及び選択が可能なマーカーを含有する。単子葉
植物内で発現することのできる典型的外来遺伝子は、単
子葉植物中で機能することの出来るプロモーター、イン
トロン、所望のポリペプチドをコードする構造DNAコー
ド配列及び、単子葉植物内で認識されるポリアデニル化
部位領域を含有する。トランスジーン（transgene）
は、植物又は植物細胞中に移入された遺伝子又はDNA配
列である。単子葉植物中での発現に好適な異種DNAベク
ター及び／又は外来遺伝子の構築の詳細は、植物遺伝子
工学の当業者等に公知である。単子葉胚形成カルスに移
入させようとする異種DNAは、単一のプラスミドベクタ
ー上に含まれてもよいし又は異なるプラスミド上にあっ
てもよい。
本発明の方法で胚形成カルスを形質転換するのに用い
る異種DNAは、好ましくは、非形質転換細胞の生育を遅
らせる代謝阻害物質の存在下で形質転換細胞を生育させ
る選択可能マーカー遺伝子を含む。トランスジェニック
細胞のこの生育の有利性は、培養時間により、この細胞
と遅い生育又は非生育細胞との識別を可能にする。ある
いは、選択可能マーカーと共に、E.coli β−グルクロ
ニダーゼ遺伝子又は蛍ルシフェラーゼ遺伝子（deWetら,
1987年,Mol.Cell Biol.7:725−737）の如き視覚化可能
な選択可能マーカーも、トランスジェニック細胞の回収
を容易にする。
本発明の方法に用いる好ましい選択可能マーカー遺伝
子としては、クロルスルフロン（chlorsulfuron）の如
きスルホニルウレア除草剤に対する耐性を賦与する突然
変異体アセト乳酸シンターゼ遺伝子又はcDNA、抗生物質
カナマイシンもしくはG418に耐性のNPT II遺伝子、又は
ホスフィノトリシンもしくはビアラホス（bialaphos）
に耐性のbar遺伝子が挙げられる。
単子葉胚形成カルス中への挿入のために選ばれる外来
遺伝子は、単子葉植物中で発現した場合有用であるだろ
ういかなる外来遺伝子であってもよい。単子葉植物中で
発現する特に有用な外来遺伝子としては、除草剤に対す
る耐性、昆虫に対する耐性、ウィルスに対する耐性を賦
与する遺伝子及び、栄養価又は植物の加工特性もしくは
品質に影響を及ぼす改良された又は新しい特性を提供す
る遺伝子が挙げられる。耕種学的に有用な適当な遺伝子
の具体例としては、昆虫抵抗性を賦与するためのBacill
us thuringiensis由来の殺虫遺伝子及び、グリホセート
除草剤に対する耐性を賦与するための５′−エノールピ
ルビル−３′−ホスホシキミ酸シンターゼ（EPSPS）遺
伝子及びその変異体が挙げられる。当業者等に容易に理
解してもらえることではあるが、所望の形質を賦与する
多数の他の耕種学的に重要な遺伝子を、本発明の方法と
組合わせて胚形式カルス中に導入することが出来る。本
発明の技術の実際の利益の一つは、耕種学的形質を改良
したトランスジェニック単子葉植物の生産である。
所望の異種DNAを含有する形質転換ベクターを調製し
たならば、このDNAは、粒子銃技術又はBiolistics法と
も呼ばれる微粒子発射体突射（microprojectile bombar
dment）法を用いることにより単子葉胚形成カルスに移
入させることが出来る。移入させようとする異種DNA
は、まず、植物遺伝子工学分野の当業者等に公知のいく
つかの方法のいずれかにより適当な微粒子発射体上にコ
ートする。この微粒子発射体を微粒子発射銃装置により
標的胚形成カルス中に撃ち込む。加速機能を果たす限
り、加速装置又は加速銃の設計は重要ではない。加速さ
れた微粒子発射体は、調製された胚形成カルスに強い衝
撃を与え、遺伝子移入を実現させる。微粒子発射体突射
法を用いる場合、胚形成カルスに所望の遺伝子を移入さ
せるために用いるDNAベクタはー、典型的には、プラス
ミドベクターとして調製し、タングステン又は金の微粒
子発射体上にコートする。
いずれの粒子銃装置も用いることが出来るが、本発明
に於いては、Biolistics PDS 1000微粒子発射銃装置を
用いた。この装置は、レキサンディスク（lexan disk）
が3/8″厚さでディスクの中央に3/32″直径の穴を有す
ることを除いては、市販のストッピングプレート（stop
ping plates）と同様のストッピングプレート構造を有
する。この穴は、上部表面で7/16″に広がっており、穴
の口を広げた配置で深さ1/4″まで先細りにし、この位
置で穴の直径が3/32″に狭まり、この穴は残り1/18″厚
さでは先細りを持たない。胚形成標的組織は、底部から
１レベルであるこの装置のレベル４にセットする。カル
ス組織サンプルを１〜３回の突射に供した。100μ開口
部を有するシールドメタルスクリーンは、典型的には、
ストッピングプレートのすぐ下の棚の位置で用いられ
る。この装作は、適当な真空下で行なわれる。
胚形成カルスを所望の異種DNAベクターで突射した
後、突射された細胞を、非選択培養培地中で数日間生育
させ、非形質転換細胞の生育は阻害するがトランスジェ
ニック細胞の生育は継続させる選択培地上に移す。約８
週間で継続生育トランスジェニックカルス細胞が大きい
生育カルスとして明白になり、回収することが出来、個
別に増殖させることが出来る。しかる後、トランスジェ
ニック胚形成カルスを、非形質転換胚形成カルスを再生
させるプロトコールに準じて全成熟トランスジェニック
植物に再生させることが出来る。通常、再生植物が、三
葉段階に達し、良好に発達した根系を有する時点で、温
室に移す前の２週間、土壌に移して生育室で鍛えること
が出来る。本発明の形質転換胚形成カルスは、非トラン
スジェニックカルスのために機能する再生手法に良好に
応答する。
その後、再生植物を温室に移動させることが出来、授
粉及び採種用の普通の植物として扱うことが出来る。ト
ランスジェニックカルスの性質及び再生植物の確認は、
形質転換を実証する、PCR分析、抗生物質又は除草剤耐
性、酵素分析及び／又はサザンブロット法により行うこ
とが出来る。再生植物の子孫を得、これを又分析してト
ランスジーンの遺伝性（hereditability）を実証するこ
とが出来る。これは、安定した形質転換及び、R1植物に
於けるトランスジーンの遺伝を示す。
以下の実施例は、本発明の方法を具体的に説明するた
めに提供するものであり、本発明の範囲は、これにより
制限されるものではない。本発明の思想及び範囲から逸
脱しない限り、本明細書に記載した方法に合わせて種々
の変形をすることが出来ることを、当業者は認識するで
あろう。
好ましい態様の説明 実施例１ ポリメラーゼ連鎖反応法によるHSP70イントロンの合成 ポリメラーゼ連鎖反応法を用い、トウモロコシHSP70
遺伝子（pMON9502:Rochester等,1986年,Embo J.,5:451
−458）を含有するゲノミッククローンからHSP70イント
ロンを合成した。
二つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーをPCR反
応法に用いた。最初のプライマーは、ヌクレオチド１〜
26の配列番号:1から成り、クローニングのためのBg1 II
部位、10個のヌクレオチドのフランキングHSP70エクソ
ン１配列及び、10個の塩基のイントロン配列を含有す
る。二番目のプライマーは、配列番号:1の791番目から8
16番目までの塩基の逆相補配列であり、10bpのイントロ
ン配列、11ヌクレオチドのフランキング３′HSP70エク
ソン配列及び、クローニングのためのNco I部位を含有
する。
“HSP70イントロン”塩基７〜812は、トウモロコシHS
P70遺伝子（塩基17〜799）由来の全イントロン及びHSP7
0エクソン１（塩基７〜16）由来の10個のヌクレオチド
及びHSP70エクソン２（塩基800〜812）由来の11個の塩
基を含有する。塩基１〜６及び813〜816は、クローニン
グに用いる制限部位を含む。塩基802は、天然のHSP70エ
クソン内のＧであるが、遺伝子発現を最大に増強するた
めＡで置換した。
10ngのpMON9502 DNA、それぞれ40ピコモルのSEQ7及
びSEQ20、10mMのトリス−HCL（pH8.3）、50mMのKCl、1.
5mMのMgCl2、0.01％（w/v）のゼラチン、各20ナノモル
のdNTP及び2.5単位のAmplitaq DNAポリメラーゼ（Perki
n Elmer Cetus）を含有する100ulの反応液でPCR法を行
った。28サイクル行った（１サイクル当り、94℃での変
性１分、50℃でのアニーリング２分、72℃での伸長３
分）。
PCR反応生成物をフェノール：クロロホルム（1:1）抽
出により精製し、続いてBg1 II及びNco Iを用いて消化
した。0.8kbのHSP70イントロン断片をゲル電気泳動によ
り単離し、続いてElutip−Ｄカラム（Schleicher ＆ Sc
huell）で精製した。HSP70イントロン配列をサンガーの
ジデオキシDNA配列決定法により確認した。HSP70イント
ロン配列を配列番号:1と命名し、図１に示す。しかる
後、0.8kbのHSP70イントロン断片をpMON8677の５′非翻
訳リーダー領域内のBg1 II及びNco I部位にクローン
し、下記の如きpMON19433を形成させた。
実施例２ トランジエントアッセイに於けるコーン遺伝子発現に対
するHSP70イントロンの効果 A.pMON8677、pMON8678、 pMON19433、pMON19425、 pMON19400及びpMON19437の調製 充分に特徴付けられている遺伝的構成要素を用いpMON
8677（図４）を構築した。−90から−300領域の重複を
含有する0.65kbカリフラワーモザイクウィルス（CaMV）
35S RNAプロモーター（e35S）（Kay等,1987年,Science
236:1299−1302）、E.coliβ−グルクロニダーゼ（GU
S）遺伝子由来の1.9kbコード配列（Jefferson等,1986
年,PNAS 83:8447−8451）及び、ノパリンシンターゼ（N
OS）遺伝子由来の３′ポリアデニル化配列を含有する0.
25kb断片（Fraley等,1983年,Proc.Natl.Acad.Sci.80:48
03−4807）を、pUC119（Yanisch−Perron等,1985年,Gen
e 33:103−119）中に挿入し、植物遺伝子発現ベクターp
MON8677を形成させた。
Vasil等（1991年）Bio/Technology 9:743−747に記載
の如きpMON8677中に、トウモロコシのADH1遺伝子（Call
is等,1987年,Genes and Dev.1:1183−1200）由来の第一
イントロンを含有する0.6kb断片を挿入することによりp
MON8678（図５）を形成させた。pMON8678に於ける単子
葉植物発現領域は、５′非翻訳リーダー中にADH1イント
ロン断片を含有することを除いてはpMON8677と同じであ
る。
５′非翻訳リーダー内にトウモロコシHSP70イントロ
ン断片を含有することを除いてはpMON8677と同じである
単子葉植物発現ベクターを生成させるために、pMON8677
内のNco I−Bg1 II部位に、トウモロコシHSP70イントロ
ン配列を含有するBg1 II−Nco I消化PCR断片をクローニ
ングすることによりpMON19433（図９）を構築した。
−90から−300領域の重複を含有する0.65kbカリフラ
ワーモザイクウィルス（CaMV）35S RNAプロモーター
（e35S）、蛍ルシフェラーゼ（LUX）遺伝子（0w等,1986
年,Science 234:856−859;DeWet等,1987年,Mol.Cell Bi
ol.7:725−737）の1.8kb断片及び、NOSポリアデニル化
配列を含有する0.25kb断片を、pUC119（上記Yanisch−P
erron等,1985年）中に挿入することにより、pMON19425
（図６）を構築した。
pMON8678中のGUSコード配列をLUX遺伝子の1.8kb断片
で置き換えることによりpMON19400（図18）を形成させ
た。pMON19400内の単子葉植物発現領域は、５′非翻訳
リーダー内にADH1イントロン断片を含有することを除い
てはpMON19425と同じである。
５′非翻訳リーダー内にトウモロコシHSP70イントロ
ン断片を含有することを除いてはpMON19425と同じであ
る単子葉植物発現ベクターを生成させるために、pMON19
425内のNco I−Bg1 II部位に、pMON19433由来のHSP70イ
ントロン配列を0.8bp Nco I−Bg1 II断片としてクロー
ニングすることによりpMON19437（図10）を構築した。
B.トランジエントアッセイを用いた遺伝子発現分析 コーン細胞中でのHSP70イントロンベクター及びADH1
イントロンベクターからの発現を評価するために、二つ
のトランジエント遺伝子発現系を用いた。上記のプラス
ミドDNAでコートした高速発射体をコーン細胞又は組織
に撃ち込むことにより、二つのコーン細胞系を形質転換
した。一方の細胞系は、ブラックメキシカンスィート
（BMS）コーンの再生不能コーンカルス浮遊細胞であ
る。他方の細胞系は、雄穂原基周辺の節の最も内側の葉
由来の４週齢植物体から得たコーンの葉由来の組織とし
て用いたBC17コーンである。
標準アルカリ細胞溶解、続いてCsCl勾配精製（Maniat
is等,1982年,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,
CSH Labs）を用いることによりプラスミドDNAを調製し
た。25ulの微粒子（50％グリセロール中に25mg/ml）、3
ulの実験用プラスミドDNA（1ug/ul）、2uLの内部対照用
プラスミドDNA（1ug/ul）、25uLの1M塩化カルシウム及
び、10uLの0.1Mスペルミジンを加え短時間撹拌すること
により、プラスミドDNAをタングステンM10微粒子上に沈
着させた。この微粒子を20分間沈降させた後、25ulの上
澄を除去した。各々の評価したベクターのために二つの
独立した微粒子調製物を作成した。
しかる後、微粒子調製物を以下の如く組織／細胞中に
爆撃した。DNA−タングステンの各サンプルを簡単に超
音波で処理し、その2.5ulを、PDS−1000（デュポン社）
バイオティックスパーティクルガンを用いて一つのプレ
ートに入れられた組織／細胞内に撃ち込んだ。それぞれ
の微粒子調製物で組織／細胞が入った三つのプレートを
爆撃した。
24〜48時間のインキュベーション（25℃、暗所）後、
組織／細胞を回収した。各微粒子調製物で爆撃された三
つのプレートに入っていた細胞／組織を合わせ、液体窒
素で冷凍し、乳鉢と乳棒で細かい白色粉末に粉砕した。
各サンプルを氷上で1mlのGUS抽出緩衝液（GEB:0.1MのKP
O4 pH7.8、1mMのEDTA、10mMのDTT、0.8mMのPMSF及び５
％グリセロール）中で解凍した。しかる後、サンプルを
撹拌し、５℃で15分間8Kで遠心し、上澄を新しい試験管
に移した。直ちに酵素のアッセイを行わない場合、サン
プルは、ドライアイスで冷凍し−80℃で貯蔵した。
トランジエントβ−グルクロニダーゼ遺伝子発現を蛍
光分析（Jefferson等,1987年,Embo.J.6:6901−3907）を
用いて定量した。2mMの４−メチルウンベリフェリルグ
ルクロニドを含有する1mlのGEB中に含まれる50ulの粗抽
出物をアッセイした。０、10、20及び30分の時点で100u
lを採取し、2mlの0.2M Na2CO3に加えることにより反応
を停止させた。しかる後、各サンプルの蛍光を、Hoesch
t DNAフルオロメーター（モデルTKO100）を用いて測定
した。GUS活性は、反応時間に対する蛍光の傾きとして
表される。
ルシフェラーゼの定量分析を次の通りに行った。0.2m
lの25mMトリシンpH7.8、15mMのMgCl2、5mMのATP及び0.5
mg/mlのBSAが入ったキュベットに50ulの抽出物を加え
た。0.5mMのルシフェリン基質を、ルミノメーター（Ber
thold Bioluminat LB9500C）により自動的に分注させ、
25℃で10秒カウント間でピークのルミネセンスを測定し
た。LUX活性は、抽出物ul当りの平均光単位として表さ
れる。
試験した全てのベクターは、その酵素活性が、評価さ
れるベクターのそれと区別できる蛋白をコードする内部
対照用ベクターと共に撃ち込まれた。例えば、LUSベク
ターを評価する試験では、pMON8678（GUS）を内部対照
用ベクターとして用い、GUSベクターを試験する場合に
は、pMON19400（LUX）を内部対照用ベクターとして用い
た。しかる後、手法に於ける変動を修正するために、結
果を、内部対照用リポーター遺伝子発現に対する実験リ
ポーター遺伝子発現の比として表した。結果を表２に示
す。
表２に示すように、HSP70イントロンベクターは、BMS
浮遊細胞に於いて、イントロンを含まない（40倍の増
加）ベクター又は、ADH1イントロン（10倍の増加）ベク
ターと比較した場合、有意に増加した遺伝子発現を示し
た。この効果は、リポーター遺伝子としてGUS又はLUXの
いずれかを用いて観察した。表2Bは、この効果がBMS細
胞系に限定されないことを示す。葉トランジエント遺伝
子発現分析に於いて、HSP70イントロンベクターは、イ
ントロンを含まない対照に対し8.7倍のGUS発現レベルを
示し、一方、ADH1イントロンは、イントロンを含まない
対照に対し僅か1.6倍のGUS発現レベルを示した。
実施例３ 安定に形質転換された再生不能コーン培養物に於ける遺
伝子発現に対するHSP70イントロンの効果 A. 安定に形質転換されたBMS細胞系の産生 実質的に上記の通りのパーティクルガン爆撃によりブ
ラックメキシカンスィートコーン浮遊細胞を形質転換し
た。爆撃用プラスミドDNAを調製し、12.5ulの微粒子（5
0％グリセロール中に25mg/ml）、2.5ulのプラスミドDNA
（1ug/ul）、12.5uLの1M塩化カルシウム及び、5uLの0.1
Mスペルミジンを加え短時間撹拌することにより、これ
ををタングステンM10微粒子上に沈着させた。この微粒
子を20分間沈降させた後、12.5ulの上澄を除去した。DN
A−タングステンの各サンプルを短時間超音波で処理
し、その2.5ulを、PDS−1000バイオリシティックスパー
ティクルガン（デュポン社）を用いて胚子培養物中に撃
ち込んだ。アセト乳酸シンターゼ遺伝子を含有するプラ
スミドであるEC9（図19）を、形質転換した対照細胞の
クロルスルフロン選択に用いるのに含めた。試験構築物
を含有する二番目のプラスミドをを、EC9と共に沈着さ
せた。BMS細胞をフィルター上にプレーティングし、PDS
−1000（デュポン社）パーティクルガンを用いて爆撃し
た。爆撃後、細胞をMS液体培地に移して１日置いた後、
20ppbのクロルスルフロンを含有する固形培地上にプレ
ーティングした。約４週間後、クロルスルフロン耐性カ
ルスを選択し、遺伝子発現分析のため生育させた。
B. GUS発現に対するHSP70イントロンの効果 GUS遺伝子及び、イントロン非含有（pMON8677）、ADH
1イントロン（pMON8678）又は、HSP70イントロン（pMON
19433）を含有するプラスミドを、BMS細胞中に撃ち込
み、安定に形質転換した系を上記の如く作製した。クロ
ルスルフロン耐性系を選択して、組織化学染色（Jeffer
son等,1987年,Embo.J.6:3901−3907）によりGUS発現を
評価した。表3Aに示す如く、HSP70イントロンベクター
を用いた形質転換は、ADH1イントロン含有又はイントロ
ン非含有ベクターのいずれかを用いた形質転換に比し、
有意に高い割合の非選択GUSマーカーの共発現を示し
た。より多数のクロルスルフロン耐性カルスが、組織化
学GUS染色検出の閾値より上にあることから、HSP70イン
トロンベクターは、ADH1ベクター又はイントロン非含有
ベクターより高いレベルで発現すると考えられる。これ
を確認するために、各ベクターから得た10個の独立した
GUS陽性形質転換体由来の抽出物に於けるGUS活性を測定
した（pMON8677は１個のGUS陽性カルスをアッセイし、
他の９個は任意に選んだ）。これらのアッセイのデータ
を、表3Bに示す。これらの結果は、HSP70イントロン
が、安定に形質転換された細胞系に於けるGUS発現を、
トランジエント遺伝子発現分析で観察されたものよりよ
り大きい程度に増強することを示している。HSP70イン
トロンベクターを含有する系で観察されたGUS発現の平
均レベルは、ADH1イントロンベクターを含有する系で観
察されたそれの約80倍以上であった。10個のHSP70系の
最高は、ADH1系の最高の100倍以上、イントロンを含ま
ない系の最高の約800倍以上のGUSを発現した。
実施例４ 安定に形質転換したBMS細胞系に於けるB.t.k.発現に対
するHSP70イントロンの効果 本発明者等は、商業上重要なB.t.k.遺伝子の発現に対
するHSP70イントロンの効果を同様に調査した。含有す
るイントロンのみが異なる二つのプラスミド、即ち、pM
ON10920（e35S/ADH1/B.t.k./NOS）及びpMON10921（e35S
/HSP70/B.t.k./NOS）を構築した。それぞれは、Adang等
（1985年）Gene 36:289−300により記載されたBacillus
thuringiensis kurstaki（B.t.k.）昆虫防除蛋白をコ
ードする3.6kb全合成遺伝子を含有する。この遺伝子の
植物中での発現は、昆虫耐性に帰する。1.9kbのGUS断片
の代りに、pMON8678（図５）中にB.t.k.を含有する3.6k
bのNcol/EcoR I断片を挿入することによりpMON10920
（図20）を構築した。pMON19433（図９）中にB.t.k.コ
ード配列を含有する3.6kbのNcol/EcoR I断片を挿入した
ことを除いては同様にしてpMON10921（図11）を構築し
た。
これらの各プラスミド及び、実施例3Aに記載の如きEC
9（ALS）でBMS系を共同形質転換した。各形質転換に於
いて、約30個の独立したクロルスルフロン耐性系が生じ
た。これらのカルスについてタバコホーンウォーム（Ta
bacco Hornworm,THW）毒性を試験し、昆虫耐性系を更に
アッセイした。各THW耐性カルス由来の可溶性抽出物中
のB.t.k.蛋白の量を、ELISAにより測定し、全蛋白に対
するパーセンテージとして表した。ADH1イントロンベク
ター（pMON10920）を含有する昆虫陽性系11個の内、１
個の系のみが、ELISAアッセイに於いて検出されるべき
充分なB.t.k.蛋白を含有した。その量は、0.4×10-5％
であった。HSP70イントロンベクター（pMON10921）を含
有する29個のTHW耐性系の内の20個がELISAによる検出に
とって充分な蛋白を生成した。その量の平均は、5.1×1
0-5％であり、範囲は＜.01−10.5×10-5％であった。平
均B.t.k.蛋白レベルを比較した場合、HSP70イントロン
ベクターは、ADH1イントロンベクターに対し12倍発現を
増加させる。
実施例５ BMS形質転換体に於けるGOX発現に対するHSP70イントロ
ンの効果 GOX発現に対するイントロンの効果を試験するためにp
MON19632及びpMON19643を構築した。両方のベクター
は、Arabidopsis thaliana SSU 1a遺伝子（SSUCTP）（T
imko等,1988年,The Impact of Chemistry on Biotechno
logy,ACS Books,279−295）から誘導されるＮ−末端0.2
6kbの葉緑体トランジットペプチド配列及び、Ｃ−末端
1.3kbの合成GOX遺伝子配列から成る遺伝子融合体を含有
する。GOX遺伝子は、グリホゼートから除草剤として不
活性な生成物であるアミノメチル燐酸及びグリオキシル
酸への変換を触媒する酵素グリホゼート酸化還元酵素を
コードする。遺伝子融合体の植物中での発現は、CTPが
切断及び分解され成熟GOX蛋白（della−Cioppa等,1986
年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:6873−6877）を放出す
る葉緑体内に迅速に運ばれるプレ−蛋白を生成する。
pMON8678と同じ方法で、ADH1イントロン及びNOSポリ
アデニル化配列間の1.6kb Bg1 II−EcoR I断片としてS
SU・CTP−−GOX融合体を挿入することにより、pMON1963
2（図21）を構築した。従って、pMON19632は、５′から
３′までに、増強されたCaMV35Sプロモーター、ADH1イ
ントロン、SSU・CTP−−GOXコード配列及び、細菌に於
けるアンピリシン選択のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有するpUC骨格内のノパリンシンターゼポリアデニ
ル化領域を含む。
HSP70イントロン（図７）に隣接するGOXの如きクロー
ニングコード配列用カセットベクターpMON19470を構築
した。Kpn I及びSac Iで消化したpBSKS＋（Stratagene
社）中に、Kpn I/Not I/Hinc II/Hind III/Bg1 II/Dra
I/Xba I/Nco I/BamH I/EcoR I/EcoR V/Xma I/Not I/Sac
I部位を含有するアニーリングした合成オリゴヌクレオ
チドを挿入することにより、受容体プラスミドpMON1945
3を作成した。pMON8678（図５）をBamH Iで消化し、末
端円滑を創出するためにクレノウポリメラーゼを添加
し、EcoR Iで消化することにより、ノパリンシンターゼ
（NOS）ポリアデニル化領域（Fraley等,1983年,Proc.Na
tl.Acad.Sci.80:4803−4807）を挿入した。pMON19453の
ポリリンカーのEcoR V/EcoR I部位に0.25kb NOS断片を
挿入しpMON19459を形成させた。CaMVE35Sプロモーター
（Kay等,1987年,Science 236:1299−1302）を含有する
0.65kb断片を、pMON19459内のHind III/Bg1 II部位に挿
入することにより、pMON19457を構築した。pMON19433を
Nco Iで直鎖にし、リョクトウヌクレアーゼで末端円滑
し、Xbaリンカーを加えた。しかる後、HSP70イントロン
断片を、Bg1 IIで消化することによって取りだし、pMON
19457内のXba I/Bg1 II部位中に挿入してpMON19458を形
成させた。しかる後、制限部位の順序を変化させる合成
リンカーを、pMON19458注に挿入してpMON19467を形成さ
せた。pMON19467からNot I発現カセットを取りだし、pK
C7（Rao and Rogers,1978年,Gene 3:247）由来のNPT II
配列を含有するpUC様ベクターpMON10081中に挿入してpM
ON19470（図８）を形成させた。従って、pMON19470は、
５′から３′までに、増強されたCaMV35Sプロモータ
ー、HSP70イントロン、コード配列クローニング用ポリ
リンカー及び、細菌に於けるカナマイシン選択のための
NPT II遺伝子を含有するpUC様骨格内のNOSポリアデニル
化領域を含む。
BamH I−EcoR Iで消化したpMON19470（図８）中に1.6
kb Bg1 II−EcoR I断片としてSSU・CTP−−GOX融合体
コード配列を挿入することにより、pMON19643（図17）
を構築した。従って、pMON19643は、５′から３′まで
に、増強されたCaMV35Sプロモーター、HSP70イントロ
ン、SSU・CTP−−GOXコード配列及び、細菌に於けるカ
ナマイシン選択のためのNPT II遺伝子を含有するpUC様
骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含
む。
実施例3Aに記載の如くpMON19632又はpMON19643でBMS
浮遊細胞を爆撃した。形質転換BMS細胞をクロルスルフ
ロンで選択できるようにするために、各々の爆撃にプラ
スミドEC9を含有させた。クロルスルフロン耐性カルス
を、5mMグリホゼート培地に移し、２週間後、新鮮な5mM
グリホゼート培地に移した。２週間後、グリホゼート培
地上で生存するカルスのパーセンテージを調べた。
結果を表４に示す。ADH1イントロンベクター（pMON19
632）は、グリホゼート耐性カルスをほとんど又は全く
生じさせなかった。HSP70イントロンベクター（pMON196
43）は、クロルスルフロン耐性カルスの40％以上が、グ
リホゼートに対しても耐性があることを示した。クロル
スルフロン耐性系に於けるGOX蛋白の蓄積レベルをウェ
スタンブロット分析法により測定した。表４に示すよう
に、HSP70イントロンベクターは、ADH1イントロンベク
ターに比し、有意に高いレベルのGOX発現を示す。
実施例６ EPSPシンターゼ及びグリホゼート選択に対するHSP70イ
ントロンの効果 ５−エノールピルビルシキメート−３−燐酸シンターゼ
（EPSPS）遺伝子の発現に対するADH1及びHSP70イントロ
ンの効果を比較するために、二つのベクター、pMON8631
及びpMON19640を構築した。除草剤グリホゼートに対す
る耐性を賦与する二つの突然変異（成熟ペプチドのGoy1
01＞Ala及びGly163＞Asp）を有するトウモロコシEPSPS
コード配列を含有する1.75kb断片を、ADH1イントロンと
NOSポリアデニル化配列の間に挿入したことを除いて
は、pMON8678（図５）と同様にしてpMON8631（図22）を
構築した。従って、pMON8631は、５′から３′までに、
増強されたCaMV35Sプロモーター、ADH1イントロン、EPS
PSコード配列及び、細菌に於けるアンピシリン選択のた
めのβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有するpUC骨格内のノ
パリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
pMON19640（図12）を形成させるために、pMON8631由
来の1.75kb Xba I−EcoR I断片をpMON19470（図８）内
の対応する制限部位中に挿入した。従って、pMON19640
は、５′から３′までに、増強されたCaMV35Sプロモー
ター、HSP70イントロン、EPSPSコード配列及び、細菌に
於けるカナマイシン選択のためのNPT II遺伝子を含有す
るpUC様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領
域を含む。
グリホゼート含有培地に対する直接選択により、安定
に形質転換したBMS系を作出した。実施例3Aに記載の如
くpMON8631又はpMON19640のいずれかで細胞を爆撃し
た。爆撃後、細胞を選択することなくMS培地中に１日間
再浮遊させた。しかる後、グリホゼートを最終濃度5mM
になるように液体培地に加え、培養物を４日間インキュ
ベートした。爆撃から５日後、細胞を5mMグリホゼート
を含むアガロース中に埋没した。約６週間培養後、グリ
ホゼート耐性カルスの数を調べた。pMON8631（ADH1イン
トロン）は、59個のグリホゼート耐性カルスを産生し、
一方、pMON19640（HSP70イントロン）は、２倍の増加で
ある117個のグリホゼート耐性カルスを産生した。これ
らのカルスに於けるEPSPS発現のレベルは測定しなかっ
たが、HSP70イントロンベクターはより多くのEPSPSを発
現し、それは培地中のグリホゼートの毒性を克服するに
充分なEPSPSを産出する、より多くの形質転換事象に帰
し、従って、グリホゼート耐性カルスの回収頻度が高い
と、考えられる。
実施例７ 殺虫蛋白をコードするHSP70イントロンベクターを用い
た他のコード配列の発現 Bacillus thuringensis var.tenebrionis（B.t.t.）
殺虫蛋白（McPherson等,1988年,Bio/Technology 6:61−
66）をコードする合成遺伝子を含有するpMON19484（図1
3）を、pMON19470（図８）中のBamH I部位にBg1 II断片
上の1.8kb B.t.t.遺伝子を挿入することにより構築し
た。従って、pMON19484は、５′から３′までに、増強
されたCaMV35Sプロモーター、HSP70イントロン、B.t.t.
コード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のため
のNPT II遺伝子を含有するpUC様骨格内のノパリンシン
ターゼポリアデニル化領域を含む。
実施例3Aに記載の如くpMON19484を誘導するためにパ
ーティクルガン爆撃を用いて安定に形質転換したBMSカ
ルスを作出した。EC9（図19）との組み合わせでpMON194
84をBMS細胞中に爆撃した。耐性カルスを20ppbクロルス
ルフロン上で選択した。しかる後、耐性カルスについて
B.t.t.遺伝子の発現を調べた。
コロラドポテトビートル（Colorado Potato Beetle,C
PB）フィーディングアッセイを用いて、B.t.t.蛋白の発
現についてpMON19484で爆撃したクロルスルフロン耐性
カルスをスクリーニングした。CPBの幼虫を、余分な水
分を除くために僅かに吸水処理BMSカルスに供した。５
匹の幼虫に、各クロルスルフロン耐性系を表すカルスを
エサとして与えた。昆虫死亡率及び／又は発育阻止のレ
ベルを、５日後に評価した。40個のカルスを調べた。８
個のカルス（20％）は殺虫活性を示し、11個のカルス
（28％）は発育阻止を起こし、６個のカルス（15％）は
わずかな発育阻止を起こし、15個のカルス（38％）はCP
B昆虫に対して何等影響を及ぼさなかった。
最も大きい殺虫／発育阻止効果を示すカルスを、ウェ
スタンブロット法により更に分析した。BMSカルスをワ
ットマンフィルター上で乾燥させた後、SDS−PAGE緩衝
液中に直接抽出した（Laemmli,1970年,Nature 227:680
−685）。全蛋白レベルを測定（Biorad）し、40〜50ug
の蛋白を12％SDS−PAGEゲルに供した。又、E.coli産生
B.t.t.蛋白も定量標準として供した。ゲル電気泳動後、
蛋白をゲルから膜へ電気泳動により移動させた（Towbin
等,1979年,PNAS 76:4350−4354）。しかる後、この膜
を、抗−B.t.t.抗体と共にインキュベートし、続いて化
学発光（アマシャム社）検出システムを用いて検出し
た。
七つの系について調査した。一つの系は、高レベルの
蛋白発現（全蛋白の0.02％）を示し、四つの系は、中間
のB.t.t.蛋白レベル（0.001％）を示し、二つの系は、
ウェスタンブロット法による検出をするのに充分なB.t.
t.蛋白を産生しなかった。
pMON19486（図14）は、Bacillus thuringensis kurst
aki Cry II A遺伝子をコードする合成遺伝子を含有す
る。この遺伝子（1.9kb）のアミノ酸配列は、Widner等
（1989年）J.Bacteriol.171:965−974に於いてCryB1と
呼ばれる遺伝子と同一である。これは、鱗翅類及び双翅
類昆虫の両者に対する殺虫活性を有する。1.9kb Cry I
I Aコード配列を有するBg1 II断片をpMON19470（図８）
内のBamH I部位中に挿入することによりpMON19486を構
築した。従って、pMON19486は、５′から３′までに、
増強されたCaMV35Sプロモーター、HSP70イントロン、Cr
y II Aコード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択
のためのNPT II遺伝子を含有するpUC様骨格内のノパリ
ンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
実施例3Aに記載の如くpMON19486を誘導するためにパ
ーティクルガン爆撃を用いて安定に形質転換したBMSカ
ルスを作出した。EC9（図19）との組み合わせでpMON194
84をBMS細胞中に爆撃した。耐性カルスを20ppbクロルス
ルフロン上で選択した。しかる後、耐性カルスについて
Cry II A遺伝子の発現を調べた。
pMON19486で爆撃したクロルスルフロン耐性カルスに
於けるB.t.k. Cry II A蛋白の発現は、初めに感受性タ
バコホーウォーム（Tobacco Hornworm,THW）を用いたフ
ィーディングアッセイに於ける殺虫活性により検出し
た。THW昆虫を殺すに充分な高Cry II A発現カルスを生
育させ、ヨーロッパコーンボーダー（European Corn Bo
rder,ECB）及びフォールアーミーウォーム（Fall Army
Worm,FAW）昆虫フィーディングアッセイに供した。16匹
のECB又は12匹のFW昆虫の体重を予め測定した後、７日
間BMSカルスで飼育した。生存数を数えて死亡率を決定
した。発育阻止の程度は、対照に対する生存昆虫の平均
増体重を測定することにより決定した。データを表５に
示す。
又、殺虫活性を有するカルスについて、上記の如きウ
ェスタンブロット法によりCry II A蛋白の蓄積を調べ
た。Cry II A蛋白の量は、同一のブロット上のE.coli産
生標準に対して定量した。表５に示すように、七つの殺
虫系の内六つは、低感受性ウェスタンブロットによる検
出に充分なCry II A蛋白の発現を示した。Cry II Aの発
現は、全細胞内蛋白の0.004％から0.15％の範囲であ
り、平均0.007％であった。
実施例８ pMON18013（図16）は、Arabidopsis thaliana SSU 1a
遺伝子（SSU・CTP）（Timko等,1988年,The Impact of C
hemistry on Biotechnology,ACS Books,279−295）及
び、E.coli ADPグルコースピロホスホリラーゼ突然変異
体遺伝子glgC16（Leung等,1986年,J.Bacteriol.167:82
−88）から誘導されるＮ−末端0.26kb葉緑体トランジッ
トペプチド配列を含む遺伝子融合体を含有する。SSU・C
TP/glgC16融合体の発現は、植物細胞内の澱粉蓄積増加
に帰する。SSU・CTP/glgC16コード配列を有する1.6kb
Xba I断片をpMON18103（図23参照）内のXba I部位中に
挿入することによりpMON18103を構築した。従って、pMO
N19486は、５′から３′までに、増強されたCaMV35Sプ
ロモーター、HSP70イントロン、SSU・CTP/glgC16コード
配列及び、細菌に於けるアンピシリン選択のためのβ−
ラクタマーゼ遺伝子を含有するpUC骨格内のノパリンシ
ンターゼポリアデニル化領域を含む。
実施例3Aに記載の如くpMON18103を誘導するためにパ
ーティクルガン爆撃を用いて安定に形質転換したBMSカ
ルスを作出した。EC9（図19）との組み合わせでpMON191
03をBMS細胞中に爆撃した。耐性カルスを20ppbクロルス
ルフロン上で選択した。しかる後、耐性カルスについて
glgC16遺伝子の発現を調べた。
pMON18103で爆撃したクロルスルフロン耐性BMS系につ
いて、I2/IKI染色（Coe等,1988年,Corn and Corn Impro
vement,GF Sprague及びJW Dudley.編AGS INC.,Madison,
WI 81−258ページ）を用いて澱粉蓄積を調べた。67個の
系の内８個が、対照カルスに対し澱粉染色の増加を示し
た。これらの系について上記の如きウェスタンブロット
法を行った。全ての系は、E.coli−産生ADP−GPP蛋白を
用いた定量標準に対し全蛋白の0.02−0.1％のレベルでA
DP−GPP発現を示した。
実施例９ pMON18131（図15）は、Pseudomonas由来のACCデアミ
ナーゼ遺伝子を含有する。ACCデアミナーゼ酵素は、１
−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ACC）をα
−ケト酪酸とアンモニアに変換する（Honma and shimom
ura,1978年,Agric,Biol.Chem.42巻10号:1825−1813）。
ACCデアミナーゼ酵素の発現は、成熟に影響を及ぼすエ
チレン生合成（Klee等,1991年,Plant Cell 3巻,1187−1
193）の阻害に帰する。glgC16コード配列の代りに、1.1
kb ACCデアミナーゼ遺伝子をXba I−BamH I断片としてp
MON18103（図16）中に挿入することによりpMON18131を
構築した。従って、pMON18131は、５′から３′まで
に、増強されたCaMV35Sプロモーター、HSP70イントロ
ン、ACCデアミナーゼコード配列及び、細菌に於けるア
ンピシリン選択のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有
するpUC骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領
域を含む。
実施例3Aに記載の如くpMON18131を誘導するためにパ
ーティクルガン爆撃を用いて安定に形質転換したBMSカ
ルスを作出した。EC9（図19）との組み合わせでpMON181
31をBMS細胞中に爆撃した。耐性カルスを20ppbクロルス
ルフロン上で選択した。しかる後、耐性カルスについて
ACCデアミナーゼ遺伝子の発現を調べた。
pMON18131で爆撃したクロルスルフロン耐性カルスを
ウェスタンブロット法により分析した。試験した24個の
系の内17個が、高レベルのACCデアミナーゼ蛋白蓄積
（全蛋白の〜0.1％）を示した。
実施例10 HSP70イントロン及びビアラホス選択を有するベクター
を用いた植物の生産 pMON19477（図24）は、S.hygroscopicus由来のBAR遺
伝子を含有する。BAR遺伝子は、除草剤BASTAに於ける有
効成分ホスフィノトリシン又はビアラホスに対する耐性
を賦与することにより選択マーカーとして用いることの
できるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ
酵素をコードする（Fromm等,1990年,Bio/Technology 8:
833−839;De Block等,1987年,Embo.J.6:2513−2518;Tho
mpson等,1987年,Embo.J.6:2519−2523）。BAR遺伝子を
0.6kb BamH I−BC1 I断片としてpMON19470（図８）内
のBamH I部位中に挿入することによりpMON19477を構築
した。従って、pMON19477は、５′から３′までに、増
強されたCaMV35Sプロモーター、HSP70イントロン、BAR
コード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のため
のNPT II遺伝子を含有するpUC様骨格内のノパリンシン
ターゼポリアデニル化領域を含む。
pMON19493（図25）は、616−1177番目のアミノ酸（Ad
ang等,1985年,Gene 36:289−300）をコードするCry I A
（ｃ）遺伝子の1.8kb3′ハーフと翻訳融合した、Fischh
off等，（1987年）Bio/Technology 5:807−813によって
記載されたBacillus thuringensus kurstaki Cry I A
（ｂ）昆虫防除蛋白の１番目から615番目のアミノ酸を
コードする1.8kb切断遺伝子から成る“合成"B.t.k.遺伝
子を含有する。この遺伝子の植物に於ける発現は、昆虫
耐性に帰する。3.6kb“合成"B.t.k.遺伝子コード配列を
Bg1 II断片としてpMON19470（図８）内のBamH I部位中
に挿入することによりpMON19493を構築した。従って、p
MON19493は、５′から３′までに、増強されたCaMV35S
プロモーター、HSP70イントロン、“合成"B.t.k.コード
配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのNPT
II遺伝子を含有するpUC様骨格内のノパリンシンターゼ
ポリアデニル化領域を含む。
pMON19468（図26）は、E.coli GUS遺伝子を含有し、
組織化学染色を用いた形質転換の肉眼的に計数可能マー
カーとして用いることが出来る。pMON8678由来のGUS遺
伝子を含有する1.8kb Bg1 II−EcoR I断片をpMON19470
骨格内のBamH I−EcoR I部位中に挿入することによりpM
ON19468を構築した。従って、pMON19468は、５′から
３′までに、増強されたCaMV35Sプロモーター、HSP70イ
ントロン、GUSコード配列及び、細菌に於けるカナマイ
シン選択のためのNPT II遺伝子を含有するpUC様骨格内
のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
0.2％PhytagelTM（シグマ社）で固形化した、2mg/Lの
2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、180mg/Lのカゼイン加水
分解物、25mMのＬ−プロリン、10uMの硝酸銀、pH5.8を
含むように改変したN62−100−25−Ag培地（Chu等,1975
年,Sci.Sin.Peking 18:659−688）上で18−33日培養し
た“Hi−II"ゲノタイプ（Armstrong等,1991年,Maize Ge
netic Newsletter 65:92−93）の未成熟トウモロコシ胚
子から胚子培養を開始した。これらの胚子培養物を、パ
ーティクルガン爆撃による形質転換のための標的組織と
して用いた。
pMON19477、pMON19493及びpMON19468プラスミドDNAの
2:1:1の混合物に12.5ulの微粒子（50％グリセロール中
に25mg/ml）、2.5ulの実験用プラスミドDNA（1ug/u
l）、12.5uLの1M塩化カルシウム及び、5uLの0.1Mスペル
ミジンを加え短時間撹拌することにより、これををタン
グステンM10微粒子上に沈着させた。この微粒子を20分
間沈降させた後、12.5ulの上澄を除去した。DNA−タン
グステンの各サンプルを短時間超音波で処理し、その2.
5ulを、PDS−1000バイオリシティックスパーティクルガ
ン（デュポン社）を用いて胚子培養物中に撃ち込んだ。
爆撃の翌日にこの組織を新鮮な非選択培地に移した。
爆撃後６日目に、この材料を、2mg/Lの2,4−ジクロロフ
ェノキシ酢酸、10uMの硝酸銀、0.3mg/Lのビアラホスを
含有しカザミノ酸もプロリンも非含有の選択培地に移し
た。２−３週後、この培養物を1.0mg/Lビアラホスを含
有する新鮮な培地に移した。ビアラホス耐性カルスを識
別することが出来るまで、この培養物を２−３週間隔で
移しながら1.0mg/Lビアラホス培地上に維持した。８個
の胚子材料プレートから７個のビアラホス耐性カルスを
回収した。
ビアラホス耐性系を生育させ、B.t.k.又はGUS発現を
調べた。B.t.k.発現を調べるために、全ての系について
タバコホーンウォーム（Tobacco Hornworm,THW）フィー
ディングアッセイに於ける殺虫活性を試験した。約0.5g
の胚子カルスを10−12匹のTHWの幼虫に餌として与え
た。二つの系、284−５−31及び284−６−41は、陽性で
あり、pMON19493由来のB.t.k.遺伝子がゲノム内に導入
され発現したことを示す、THW昆虫に対する有意な致死
を示した。又、全ての系について、組織化学アッセイ
（Jefferson,R.A.,Kavanagh,T.A.,and Bevan,M.W.,1987
年,Embo.J.6:3901−3907）を用いたGUS発現も調べた。
試験した七つの系の内ただ一つの系、284−８−31のみ
が、pMON19468由来のGUS発現を示す検出可能な青色染色
を示した。
三段階再生プロトコールを用いて全ビアラホス耐性カ
ルスから植物体を再生した。全再生は、1mg/LのBASTA上
で行った。胚子組織を約２週間各培地上でインキュベー
トした後、次の段階の培地（表６の再生培地成分参照）
に移した。初めの二段階は、28℃の暗所で行い、最終段
階は、〜25℃で白色蛍光灯により提供された〜70uE、ｍ
−２、sec−１、照射間隔16時間:8時間の条件下で行っ
た。100×25mmのペトリ皿内の再生培地３上に形成され
た小さい緑の苗条を200×25mmのパイレックスTM又はフ
ィタトレイTM内の再生培地３に移し、更なる小植物体へ
の生育及び根形成をなさしめた。充分な根系形成後、植
物体を培地から慎重に取りだし、根系を流水で洗浄し、
Metromix 350生育培地が入った2.5″ポット内にこの植
物体を置いた。この植物を多湿環境で７日間維持した
後、湿度を徐々に減らして植物を鍛えた。この植物は、
生育中2.5″のポットから６″のポットに移植し、最終
的に10″のポットに移植した。
全成分は、シグマケミカル社、P.O.Box 14508,セントル
イス,MO 63178から入手することが出来る。
ビアラホス耐性胚子カルスから再生した全コーン植物
体は、爆撃された遺伝子、即ちBAR、B.t.k.又はGUSの内
少なくとも一つを発現することを示した。ビアラホス耐
性、THW陰性カルス系から再生した植物体は、トランス
ジェニックであり、BAR遺伝子を発現することをBASTAリ
ーフペインティングアッセイによって確認した。輪生体
から４−５枚の葉が充分に出た時点で苗木をアッセイし
た。１％BASTA、0.1％Tween20の溶液を、初めに充分出
た葉の上部及び下部表面に供した。塗布後３日目に植物
体を評価した。対照となる植物体は、葉の黄変及び壊死
を示したが、一方、耐性系由来の葉は、緑色で健康的で
あった。これは、pMON19477内のBAR遺伝子がこれらの植
物体に於いて発現したというだけでなく、発現レベルが
植物体レベルに於ける除草剤BASTAに対する耐性を賦与
するに充分高いことを示している。
THW活性を示す二つの系、284−５−31及び284−６−4
1から再生した植物体について、全植物体フィーディン
グアッセイによりB.t.k.発現をアッセイした。高さ約3
0″の植物体に100個のヨーロッパコーンボアラー（Euro
pean Corn Borer,ECB）の卵を接種した。接種して２週
間経過後、フィーディングダメージを０（ダメージ無
し）から９（高レベルのリーフフィーディングダメー
ジ）までの尺度で評価した。対照植物体は、昆虫フィー
ディング格付け９の評価であった。pMON19493を含有す
るいずれかの系由来の全植物体は、ECBダメージがない
ゼロの格付けを受けた。
ECB飼育調査結果は、B.t.k.遺伝子が、再生した植物
体に於いて昆虫耐性を実現する充分高いレベルで発現し
たことを示す。発現のレベルを定量するために、再生し
た系由来のサンプルをELISAによりアッセイした。各々
のカルス系から再生した８つの植物体を分析した。系28
4−５−31由来の植物体は、B.t.k.の発現が全細胞内蛋
白の0.006％から0.034％の範囲であり、平均値は0.02％
であった。系284−６−41由来の植物体は、B.t.k.の発
現が全蛋白の0.005％から0.05％の範囲であり、平均値
は同じく0.02％であった。
実施例11 HSP70イントロンを含有するグリホゼート選択ベクター
を用いた植物体の生産 pMON19640（図12）は、５−エノールピルビルシキミ
酸−３−燐酸シンターゼ（EPSPS）遺伝子を含有する。p
MON19640（図12）を形成するために、グリホゼート除草
剤に対する耐性を賦与する、成熟ペプチドの二つの突然
変異（Gly144＞Ala及びGly206＞Asp）を有するトウモロ
コシEPSPSコード配列を含有する1.75kb Xba I−EcoR I
断片を、pMON19470（図８）内の対応する制限部位中に
挿入した。従って、pMON19640は、５′から３′まで
に、増強されたCaMV35Sプロモーター、HSP70イントロ
ン、EPSPSコード配列及び、細菌に於けるカナマイシン
選択のためのNPT II遺伝子を含有するpUC様骨格内のノ
パリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
pMON19643（図17）は、Arabidopsis thaliana SSU 1a
遺伝子（SSU CTP）から誘導されるＮ−末端0.26kb葉緑
体トランジットペプチド配列（Timko等,1988年,The Imp
act of Chemistry on Biotechnology,ACS Books,279−2
95）及び、Ｃ−末端1.3kb合成GOX遺伝子配列を含む遺伝
子融合体を含有する。GOX遺伝子は、グリホゼートの、
除草剤として不活性な生成物、アミノメチル燐酸及びグ
リオキシル酸への変換を触媒する酵素グリホゼート酸化
還元酵素をコードする。遺伝子融合体の植物中での発現
は、CTPが切断及び分解され成熟GOX蛋白（della−Ciopp
a等,1986年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:6873−6877）
を放出する葉緑体内に迅速に運ばれるプレ−蛋白を生成
する。pMON19470（図８）を消化したBamH I−EcoR I部
位中に1.6kb Bg1 II−EcoR I断片としてSSU・CTP−−G
OX融合体コード配列を挿入することにより、pMON19643
（図17）を構築した。従って、pMON19643は、５′から
３′までに、増強されたCaMV35Sプロモーター、HSP70イ
ントロン、SSU・CTP−−GOXコード配列及び、細菌に於
けるカナマイシン選択のためのNPT II遺伝子を含有する
pUC様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域
を含む。
0.2％Phytagel TM（シグマ社）で固形化した、1mg/L
の2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、180mg/Lのカゼイン加
水分解物、25mMのＬ−プロリンを含むように改変したN6
1−100−25培地（Chu等,1975年,Sci.Sin.Peking 18:659
−688）上で18−33日培養した“Hi−II"ゲノタイプ（Ar
mstrong等,1991年,Maize Genetic Newsletter 65:92−9
3）の未成熟トウモロコシ胚子から胚子培養を開始し
た。これらの胚子培養物を、パーティクルガン爆撃によ
る形質転換のための標的組織として用いた。
pMON19640及びpMON19493プラスミドDNAの1:1の混合物
に12.5ulの微粒子（50％グリセロール中に25mg/ml）、
2.5ulの実験用プラスミドDNA（1ug/ul）、12.5uLの1M塩
化カルシウム及び、5uLの0.1Mスペルミジンを加え短時
間撹拌することにより、これをタングステンM10微粒子
上に沈着させた。この微粒子を20分間沈降させた後、1
2.5ulの上澄を除去した。DNA−タングステンの各サンプ
ルを短時間超音波で処理し、その2.5ulを、PDS−1000バ
イオリシティックスパーティクルガン（デュポン社）を
用いて胚子培養物中に撃ち込んだ。
爆撃の１週間後、培養物を新鮮なN6 １−０−25培地
（カゼイン加水分解物を省き1mMのグリホゼートを加え
たことを除いては開始用培地と同じ）に移した。1mMの
グリホゼート培地上で２週間成育後、培養物を、3mMの
グリホゼートを含有することを除いては同じ基本培地に
移した。約２週間間隔で3mMのグリホゼート培地上への
更なる移動を行った。爆撃の約８−10週後、爆撃プレー
ト当り約0.2−1.0のグリホゼート耐性カルスの頻度で耐
性カルスを同定した。
1mg/L Bastaの代りに培養培地に0.01mMのグリホゼー
トを加えるか又は選択試薬を何も加えないかのいずれか
であることを除いては、実施例10に於いてビアラホス耐
性カルスのために記載した通りに、グリホゼート耐性カ
ルスから植物体を再生させた。植物体に於けるpMON1964
3の発現を、ウェスタンブロット法により分析した。三
つの独立したグリホゼート耐性カルスから再生したいく
つかの個別の植物体から葉のパンチを採取した。三つの
系全てが、検出可能なレベルのGOX遺伝子発現を示し
た。系264−２−１由来のアッセイした四つの植物体
は、低いが検出可能なレベルのGOXの発現（全蛋白の約
0.002％）を有した。系269−１−１由来の五つの植物体
は、全蛋白の0.04−0.06％の範囲の高いGOX蛋白レベル
を示した。最後に、系292−５−１由来の23の植物体を
アッセイした。GOX蛋白レベルは、全蛋白の0.05％から
0.1％の範囲であった。29オンス／エーカーでグリホゼ
ートを噴霧されたこれらの植物体は、充分に多産の植物
体を生産した。これらの植物体のR1子孫は、29オンス／
エーカー、58オンス／エーカー及び115オンス／エーカ
ーでグリホゼートを噴霧した。植物体の一つの系は、完
全な雑草抑制を達成するレベルでグリホゼート耐性を示
す最も高い使用割合で植物としてのダメージをなんら示
さなかった。
実施例12 HSP70イントロン改変の影響 A. HSP70イントロン内の欠失 pMON19433をBsm I及びNsi Iで消化し、続いて円滑末
端を創るためにT4ポリメラーゼで処理し、再ライゲーシ
ョンすることにより、欠失１（図２）（配列番号:2）を
創出した。消化にBsm I及びSnaB Iを用いたことを除い
ては同様にして欠失２（図３）（配列番号:3）を作成し
た。実施例２に於いて記載したようなBMSパーティクル
ガントランジエントアッセイにより、全長鎖HSP70イン
トロンの遺伝子発現に対する影響と欠失１又は欠失２の
影響とを比較した。下記に示す如く、pMON19433に於い
て、内部欠失を有するイントロンは、イントロンを含ま
ない対照に対し全長鎖イントロンと同じ程度にGUS遺伝
子発現を増加させる。イントロン 相対的GUS発現 非含有 1X HSP70全長鎖 32−51X HSP70欠失１ 14−38X HSP70欠失２ 14−30X B. ５′及び３′スプライス部位共通配列に於ける改変 又、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR法）によるHSP70イ
ントロンの初めのポリメラーゼ連鎖反応法合成に於い
て、変異体イントロンも合成した。この変異体イントロ
ンは、β−グルクロニダーゼ又はルシフェラーゼに隣接
してクローンされる場合、イントロンを含まない対照に
対し発現を４倍増加させるが、野生型HSP70イントロン
より10倍少ない。配列番号:1に示したヌクレオチド配列
からの唯一の有意な相違は、19番目のヌクレオチドに於
けるアデニンの欠失のみである。
HSP70イントロンは、発表された（Brown,J.W.S.,1986
年,Nuc.Acid Res.14:9949−9959）５′スプライス部位
共通配列と二つの位置で異なり、３′スプライス部位共
通配列とは一つの位置で異なる。19番目のヌクレオチド
の欠失は、四つの位置で５′スプライス部位共通配列か
らそれる変異体HSP70イントロンを生じさせる。それ
で、この変異体イントロンは、野性型イントロンほど効
率的にスプライスしないと考えられ、これで、遺伝子発
現に対する影響の相違を説明することが出来る。
この問題を処理するために、５′スプライス部位、
３′スプライス部位、又はその両方の位置に完全な共通
配列を含有するHSPイントロンの変異体を構築した。HSP
70イントロンスプライス部位を５′及び／又は３′スプ
ライス部位共通配列へ突然変異させる所望の変形体を含
有するプライマーを用いてPCR法によりHSP70イントロン
の変異体を合成した。詳しくは、５′スプライス部位共
通プライマーは、配列番号:1の15番目のヌクレオチド及
び20番目のヌクレオチドが各々アデニンに変化したこと
を除いては１番目から26番目のヌクレオチドを含有して
いた。３′スプライス部位共通プライマーは、800番目
のヌクレオチドがグアニン（プライマーではシトシン）
に変化したことを除いては791番目から816番目までのヌ
クレオチドに相補的であるヌクレオチドを含有してい
た。
HSP70イントロン変異体を含有するPCR法生成物をBg1
II及びNco Iで消化し、pMON19433の構築と同様にpMON86
77中にクローンした。従って、各々のベクターは、５′
から３′までに、増強されたCaMV35Sプロモーター、HSP
70イントロン（オリジナル又は変異体）、β−グルクロ
ニダーゼ（GUS）コード配列及び、ノパリンシンターゼ
ポリアデニル化領域を含む。これらは、イントロンを除
いては全て同じである。pMON19433は、オリジナルのHSP
70イントロンを含有し、pMON19460は、５′スプライス
部位共通変異体イントロンを含有し、pMON19463は、
３′スプライス部位共通変異体イントロンを含有し、pM
ON19464は、５′及び３′の両方のスプライス部位共通
配列を含有する変異体イントロンを含有する。
pMON19460、pMON19463、pMON19464及びpMON19433につ
いて、実施例２に記載した如く、BMS細胞に於けるトラ
ンジエント遺伝子発現アッセイの結果を比較した。下記
に示す如く、HSP70イントロンの変形例のいずれも、GUS
遺伝子発現を有意に変えなかった。ベクター スプライス部位 相対的GUS発現 ５′ ３′ pMON19433 HSP70wt HSP70wt 1X pMON19460 共通 HSP70wt 1.1−1.4X pMON19463 HSP70wt 共通 1.1−1.4X pMON19464 共通 共通 1.6−1.7X C. エクソン配列数の増加はHSP70イントロンに影響し
ない オリジナルのHSP70″イントロン″は、完全な介在配
列を含み、又10個の塩基のエクソン１及び11個の塩基の
エクソン２を含有する。このイントロンは、増強された
CaMV35Sプロモーターとコード配列間の５′非翻訳リー
ダー領域内に位置することから、この21個の塩基のエク
ソン配列はリーダー内に残されたままになる。過剰のHS
P70エクソン配列がスプライシング効率及び、遺伝子発
現を増加させる能力に影響するかどうかを調査するため
に、HSP70エクソン１の３′末端の50個のヌクレオチド
及び／又はHSP70エクソン２の５′末端の28個のヌクレ
オチドを生じさせるPCR法用プライマー（Shah等,1985
年,Cell and Mol.Biol.of Plant Stress.Alan R.Liss,I
nc.181−200）を用いて、異なる量のエクソン配列を含
有するイントロンを合成した。
異なるエクソン鎖長を有する種々のHSP70イントロン
を含有するPCR法生成物を、pMON19433の構築と同様に、
Bg1 II及びNco Iで消化し、pMON8677中にクローンし
た。従って、各々のベクターは、５′から３′までに、
増強されたCaMV35Sプロモーター、HSP70イントロン及び
それを取り囲むエクソン配列、β−グルクロニダーゼ
（GUS）コード配列及び、ノパリンシンターゼポリアデ
ニル化領域を含む。これらは、イントロンを囲むHSP70
エクソンの鎖長を除いては全て同じである。
しかる後、これらのベクターについて、実施例２に記
載した如く、BMS細胞に於けるトランジエント遺伝子発
現アッセイの結果を比較した。下記に示す如く、HSP70
イントロンの変形例のいずれも、GUS遺伝子発現を有意
に変えなかった。ベクター エクソン１ エクソン２ 相対的GUS発現 19433 10nt 11nt 1X 19462 10nt 28nt 0.6−0.9X 19465 50nt 11nt 1.2−1.5X 19466 50nt 28nt 0.8−1.5X 実施例13 HSP70イントロンは、小麦細胞に於ける遺伝子発現を増
加させる 小麦細胞に於ける遺伝子発現に対するイントロンの効
果を調べるために、トランジエント遺伝子発現アッセイ
を行った。実施例２に於いてコーン浮遊細胞について記
載したように、C983小麦浮遊細胞（フロリダ大学、I.Va
sil博士より入手）をプレーティングし、イントロン非
含有（pMON8677）、ADH1イントロン（pMON8678）及びHS
P70イントロン（pMON19433）含有β−グルクロニダーゼ
ベクターで爆撃した。下記に示す如く、小麦細胞に於け
るGUS発現に対するADH1イントロン及びHSP70イントロン
の効果は、コーン細胞に於けるものに匹敵する。ADH1イ
ントロンベクターは、イントロンを含まないベクターに
比し高いレベルのGUS発現を示すが、HSP70イントロンベ
クターは、ADH1イントロンベクターに比し有意に高いレ
ベルの発現を示す。ベクター イントロン 平均相対的GUS pMON8677 無し 1X pMON8678 ADH1 2X pMON19433 HSP70 ６−9X 実施例14 HSP70イントロンは、イネに於ける遺伝子発現を増加さ
せる イネ株8706、即ちインディカ／ジャポニカ雑種、由来
のイネ組織培養系812MをMS培地で生育させた。継代培養
の翌日、パーティクルガン爆撃のため、細胞をワットマ
ンフィルターに移した。BMS細胞のために述べた（実施
例３）ように、PDS−1000を用いて、CaCl2/スペルミジ
ンで沈澱させたプラスミドDNAで爆撃を行った。この細
胞に２日間導入した遺伝子を発現させた後、回収した。
β−グルクロニダーゼ（GUS）及びルシフェラーゼ（LU
X）を、前述のごとくアッセイした。表７に示すよう
に、重複実験に於ける５′非翻訳領域内のHSP70イント
ロンの存在は、イントロン非含有ベクターで観察される
発現の、LUX発現に対するGUS発現の平均値を約10倍増加
させる。
実施例15 HSP70イントロンベクターを用いたCP4 EPSPSの発現 HSP70イントロンベクター中のCP4 EPSPS遺伝子（199
1年８月28日出願された米国特許出願S.N.07/749,611、
参照により本明細書に含めるものとする）の発現を調べ
るために、pMON19653（図27）を構築した。1.4kb細菌CP
4 EPSPS蛋白コード領域にフレーム内に融合させた、Ar
abidopsis EPSPS遺伝子（AEPSPS CTP）由来の300bp葉緑
体トランジットペプチドを含有する1.7kb Bg1 II−Eco
R I断片を、BamH I−EcoR I消化したpMON19470中にクロ
ーンして、pMON19653を形成させた。従って、pMON19653
は、５′から３′までに、増強されたCaMV35Sプロモー
ター、HSP70イントロン、AEPSPS CTP/CP4コード配列及
び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのNPT II遺伝
子を含有するpUC様骨格内のノパリンシンターゼポリア
デニル化領域を含む。
pMON19653をpMON19643と組み合わせて胚子細胞内に導
入し、実施例11に於いて記載した如きグリホゼート培地
上で、形質転換されたカルスを選択した。グリホゼート
耐性胚子カルスをウェスタンブロット法によりアッセイ
した。発現したCP4蛋白の量をE.coli生産蛋白の標準と
比較することにより決定した。九つの系が生じた。CP4
発現レベルは、胚子カルスから調製した粗抽出物に於い
て、検出不可能なものから全蛋白の0.3％までの範囲で
あり、平均値は0.17％であった。
上記の実施例は、HSP70イントロンを含有するベクタ
ーの使用が蛋白をコードする他のDNA配列の単子葉植物
に於ける発現を増強することが予期されることを示す。
配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人:Brown,Sherri M. Santino,Colleen G. （ii）発明の名称：植物内での増強発現 （iii）配列の数:3 （iv）連絡先： （Ａ）宛先:Dennis R.Hoerner,Jr.,Monsanto Co.BB
4F （Ｂ）街区:700 Chesterfield Village Parkway （Ｃ）市：セントルイス （Ｄ）州：ミズーリィー （Ｅ）国：アメリカ合州国 （Ｆ）ZIP:63198 （ｖ）コンピューター読取り式： （Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル （Ｃ）操作系:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフト:Patent In Release ＃1.0,Version
＃1.25 （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）弁護士／代理人情報： （Ａ）氏名:Hoerner Jr.,Dennis R. （Ｂ）登録番号:30,914 （Ｃ）参照／事件整理番号:38−21（10528）Ａ （ix）通信情報： （Ａ）電話：（314）537−6099 （Ｂ）ファックス：（314）537−6047 （２）配列番号:1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:816塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号:2の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:283塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:2: （２）配列番号:3の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:162塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:3:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ. ３（1986）ｐ．451−458 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 109，Ｎｏ．４，Ｐｔ．２（1989）ｐ. 39ａ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａ ｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ，Ｖｏｌ．42（1992）ｐ．229−257 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (27)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の順序で、 植物細胞内でRNA配列を産生させるべく機能するプロモ
    ーター、 配列番号:1、配列番号:2及び配列番号:3から成る群から
    選ばれるイントロン配列を含む非翻訳リーダー、 蛋白質をコードするRNA配列の産生を引き起こす構造DNA
    配列、及び 植物細胞内でRNA配列の３′末端にポリアデニル化ヌク
    レオチドを付加させるべく機能する３′非翻訳配列を含
    み、ここでイントロンはプロモーターに関して異種であ
    ることを特徴とする組換え二重鎖DNA構築物。
  2. 【請求項２】イントロンが配列番号:1である、請求項１
    に記載のDNA構築物。
  3. 【請求項３】イントロンが配列番号:2である、請求項１
    に記載のDNA構築物。
  4. 【請求項４】イントロンが配列番号:3である、請求項１
    に記載のDNA構築物。
  5. 【請求項５】プロモーターが植物DNAウィルスプロモー
    ターである、請求項２に記載のDNA構築物。
  6. 【請求項６】プロモーターがCaMV35Sプロモーター及びF
    MVプロモーターから成る群から選ばれる、請求項５に記
    載のDNA構築物。
  7. 【請求項７】構造DNA配列がEPSPシンターゼをコードす
    る、請求項６に記載のDNA構築物。
  8. 【請求項８】構造DNA配列がCP4蛋白質をコードする、請
    求項６に記載のDNA構築物。
  9. 【請求項９】構造DNA配列がACC−デアミナーゼをコード
    する、請求項６に記載のDNA構築物。
  10. 【請求項１０】構造DNA配列がB.t.結晶トキシン蛋白質
    をコードする、請求項６に記載のDNA構築物。
  11. 【請求項１１】構造DNA配列がglgC16蛋白質をコードす
    る、請求項６に記載のDNA構築物。
  12. 【請求項１２】配列番号:2のヌクレオチドを含む切頭DN
    A。
  13. 【請求項１３】配列番号:3のヌクレオチドを含む切頭DN
    A。
  14. 【請求項１４】請求項１記載のDNA構築物を含むトラン
    スジェニックトウモロコシ、イネまたはライ麦植物。
  15. 【請求項１５】イントロンが配列番号:1の配列である、
    請求項14に記載の植物。
  16. 【請求項１６】イントロンが配列番号:2の配列である、
    請求項14に記載の植物。
  17. 【請求項１７】イントロンが配列番号:3の配列である、
    請求項14に記載の植物。
  18. 【請求項１８】植物がトウモロコシである、請求項15に
    記載の植物。
  19. 【請求項１９】請求項１に記載のDNA構築物を含むトラ
    ンスジェニック小麦細胞。
  20. 【請求項２０】植物がイネである、請求項15に記載の植
    物。
  21. 【請求項２１】プロモーターがCaMV35Sプロモーター及
    びFMVプロモーターから成る群から選ばれる、請求項15
    に記載の植物。
  22. 【請求項２２】構造DNA配列がEPSPシンターゼをコード
    する、請求項21に記載の植物。
  23. 【請求項２３】構造DNA配列がCP4蛋白質をコードする、
    請求項21に記載の植物。
  24. 【請求項２４】構造DNA配列がACC−デアミナーゼをコー
    ドする、請求項21に記載の植物。
  25. 【請求項２５】構造DNA配列がB.t.結晶トキシン蛋白質
    をコードする、請求項21に記載の植物。
  26. 【請求項２６】構造DNA配列がglgC16蛋白質をコードす
    る、請求項21に記載の植物。
  27. 【請求項２７】構造DNA配列が植物ウィルスコート蛋白
    質をコードする、請求項21に記載の植物。
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