CN117683775B - 一种山药DpPDS基因的VIGS沉默体系及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种山药DpPDS基因的VIGS沉默体系及其应用。本发明基于山药内源DpPDS基因选择基因片段，可以干扰山药内源的DpPDS基因表达，使植株内源DpPDS基因发生沉默，相比空白对照，山药内源的DpPDS基因的相对表达量降低66.7%~88.23%，能够用于鉴定该内源目的基因的功能。

Description

一种山药DpPDS基因的VIGS沉默体系及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种山药DpPDS基因的VIGS沉默体系及其应用。
背景技术
山药（Dioscorea spp.）是薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea）中能形成地下肉质块茎的草质藤本植物。山药遗传变异广泛，种质资源丰富，我国是山药的重要起源和驯化中心之一，以薯蓣种山药（D. polystachya Turczaninow）普遍栽培。山药具有独特的营养价值和多重保健功效，由传统的旱粮转变为粮、菜、食品加工原料广泛用途的高效作物，具良好市场前景和产业开发潜能。因此，研究山药代谢调控、抗病、抗逆等相关基因功能对山药遗传改良具有重要作用。
八羟番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase, PDS）是植物类胡萝卜素合成途径的限速酶基因，沉默该基因可导致植株白化表型。目前，有关山药八羟番茄红素脱氢酶基因的研究较少，选择山药八羟番茄红素脱氢酶的基因片段，沉默山药DpPDS基因，研究山药DpPDS基因的相关功能尤为重要。
病毒介导的基因沉默技术（virus-induced gene silencing, VIGS），是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源基因沉默，出现相应的表型变化。VIGS技术在当代植物上直接产生RNAi效果，大幅度节约时间和成本，可同时实现多个基因的沉默，避免传统转基因体系的弊端，尤其适合转化体系不成熟的植物和受基因型限制的品种，因而在植物基因功能的研究中应用越来越广泛。然而，在对基因进行沉默时，基因片段的选择尤为重要，片段过短会导致不能满足特异性匹配的要求而导致沉默掉非靶标基因，过长有可能造成插入片段的丢失，或者失去侵染能力，无法得到理想的沉默效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种沉默山药DpPDS基因的基因片段，构建山药DpPDS基因的VIGS沉默体系，提高山药DpPDS基因的沉默效果，进而研究山药基因的相关功能。
本发明提供了一种沉默山药DpPDS基因的基因片段，所述基因片段包括如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的反向互补序列。
本发明还提供了一种沉默山药DpPDS基因的重组表达载体，所述重组表达载体包括VIGS病毒载体和插入所述VIGS病毒载体的基因片段；
所述基因片段为上述技术方案所述的基因片段。
优选的，所述VIGS病毒载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。
本发明还提供了上述技术方案所述的基因片段或重组表达载体在制备山药DpPDS基因VIGS沉默体系中的应用。
本发明还提供了一种山药DpPDS基因的VIGS沉默体系，所述VIGS沉默体系包括含有辅助载体的农杆菌菌液和含有上述技术方案所述重组表达载体的农杆菌菌液。
优选的，农杆菌为农杆菌GV3101或农杆菌LBA4404；
所述辅助载体为烟草脆裂病毒TRV1载体。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的VIGS沉默体系的构建方法，包括如下步骤：
提取山药RNA，反转录获得山药cDNA；
利用上游引物DpPDS-Xba I-F和下游引物DpPDS-Bam HI-R对所述山药cDNA进行PCR扩增，获得山药DpPDS基因的干扰片段；
将所述干扰片段插入VIGS病毒载体，得到含有山药DpPDS基因的重组质粒，转化农杆菌，得到含有重组表达载体的农杆菌菌液；
所述上游引物DpPDS-Xba I-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述下游引物DpPDS-Bam HI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
将辅助载体转化农杆菌，得到含有辅助载体的农杆菌菌液；
将所述含有重组表达载体的农杆菌菌液和含有辅助载体的农杆菌菌液混合，黑暗静置4~6h，得到所述VIGS沉默体系。
本发明还提供了上述技术方案所述的基因片段或重组表达载体或VIGS沉默体系在鉴定山药基因功能中的应用。
本发明还提供了一种沉默山药DpPDS基因的方法，包括如下步骤：
利用上述技术方案所述的VIGS沉默体系对山药珠芽进行真空渗透侵染。
优选的，所述真空渗透侵染还包括：播种真空渗透侵染后的山药珠芽，培养成苗。
有益效果：
本发明提供了一种沉默山药DpPDS基因的基因片段，所述基因片段包括如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的反向互补序列。本发明提供的基因片段可以干扰山药内源的DpPDS基因表达，使植株内源DpPDS基因发生沉默，相比空白对照，山药内源的DpPDS基因的相对表达量降低66.7%~88.23%，能够用于鉴定该内源目的基因的功能。
山药存在遗传转化难度大、生长周期长的问题，严重阻碍山药基因的深入研究，在以上述基因片段作为干扰片段的基础上构建VIGS沉默体系，借助真空渗透法瞬时转化山药珠芽，TRV1可以激活TRV2在植株内的扩散，在使山药内源目的基因发生沉默的同时，克服了山药遗传转化周期长、难度大等困难。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中PCR扩增结果；其中M代表DNA ladder DL2000；
图2为实施例1中菌落PCR验证结果；其中M代表DNA ladder DL2000；
图3为实施例3步骤（1）采用实时荧光定量PCR检测山药珠芽中DpPDS基因的相对表达量结果；
图4为实施例3步骤（2）山药珠芽播种成苗后的表型；其中pTRV-DpPDS-1、pTRV-DpPDS-2为实验组出现白化表型的两个山药单株；其中，箭头位置表示山药叶片的白化表型；标尺代表2cm；
图5为实施例3步骤（2）山药珠芽播种成苗后的实时荧光定量PCR检测山药叶片DpPDS基因的相对表达量结果；其中pTRV-DpPDS-1 pTRV-DpPDS-2为实验组出现白化表型的两个山药单株；
图6为对比例1中侵染山药叶片后DpPDS基因的相对表达量结果；其中pTRV-DpPDS为实验组山药叶片。
具体实施方式
本发明提供了一种沉默山药DpPDS基因的基因片段，所述基因片段包括所述基因片段包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的反向互补序列。
本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具体为：5'-GCTCAGGATGGCTTGACAGTTTCAGAGTGGATGAAGAGGCAGGGTGTGCCAAAACGAGTCAGTGATGAAGTTTTTATTGCCATGTCTAAAGCTCTTAACTTCATAAATCCAGATGAGCTTTCAATGCAGTGCATTCTAATCGCTCTGAATCGTTTCCTTCAGGAGAAGCATGGATCTAAGATGGCCTTCTTGGATGGTAATCCTCCAGAGAGATTATGCATGCCAATTGTCGACCACATCGAATCATTAGGTGGTGAGGTCCGGCTTAATTCACGCCTTAAGACGATTGAGCTCAACTCTGATGGGACGGTGAAACACCTTGTCCTTGGAGATGGAAATATAATCACTGGAGATGTTTATGTAGTTGCTACTCCGGTTGACATCTTGAAGCTTCTTTTACCTCAAGAATGGAAAGAAATTTCTTACTTCGACAAATTGGAAAAACTTGTTGGAGTCCCCGTGATTAATGTTCATATATGGTTTGA-3'，全长485bp。本发明所述山药DpPDS基因全长序列优选如SEQ ID NO.8所示，全长1752bp，具体为：5’- ATGAATGTTATTGGTTCCTTTTCCTGTGTGAGTTTGAATGGAGCTATCCAGAGAAGATATGCTTGGGACGTGAGCACCAGCCAGAGGGCCAATCCCAATATAGATTCTGCACATGACAATCTGCAATCTTTCAGAAGCAGTGACTTCACTGGTTGCCGCCTGAGAGTTCAATCATCATGGCTAAGAAGATCGAGAGGAGGCCGGAATGTTTTTCCACTGCAGGTAGTTTGCATGGACTACCCAAGGCCTGAATTGGAGAACACGATCAATTTTTTAGAGGCTGCTCAACTATCTGCATCCTTCCGTAGCTGTCCACGCCCAAATAAACCATTGCAAATTGTGATTGCTGGTGCAGGTTTGGCTGGCCTATCTACAGCAAAATATCTTGCAGATGCTGGTCATAAGCCTATACTTTTGGAGGCAAGAGATGTTCTTGGTGGCAAGGTTGCTGCTTGGAAAGACCAAGATGGAGATTGGTATGAAACTGGCCTCCATATATTCTTTGGAGCTTATCCCAACATGCAGAACTTGTTTGGTGAACTTGGTATTAATGATCGTTTGCAATGGAAGGAGCACTCAATGATCTTTGCGATGCCAAATAAACCAGGGGAGTTTAGCCGCTTTGATTTTCCAGAGGTTCTTCCTGCACCTTTGAATGGCATCTGGGCTATCTTAAAGAACAATGAAATGCTGACTTGGCCTGAGAAAGTGCAATTTGCCATTGGACTTTTGCCAGCCATGGTTGGGGGTCAAGCTTATGTTGAAGCTCAGGATGGCTTGACAGTTTCAGAGTGGATGAAGAGGCAGGGTGTGCCAAAACGAGTCAGTGATGAAGTTTTTATTGCCATGTCTAAAGCTCTTAACTTCATAAATCCAGATGAGCTTTCAATGCAGTGCATTCTAATCGCTCTGAATCGTTTCCTTCAGGAGAAGCATGGATCTAAGATGGCCTTCTTGGATGGTAATCCTCCAGAGAGATTATGCATGCCAATTGTCGACCACATCGAATCATTAGGTGGTGAGGTCCGGCTTAATTCACGCCTTAAGACGATTGAGCTCAACTCTGATGGGACGGTGAAACACCTTGTCCTTGGAGATGGAAATATAATCACTGGAGATGTTTATGTAGTTGCTACTCCGGTTGACATCTTGAAGCTTCTTTTACCTCAAGAATGGAAAGAAATTTCTTACTTCGACAAATTGGAAAAACTTGTTGGAGTCCCCGTGATTAATGTTCATATATGGTTTGATAGAAAACTGAAGAATACATATGATCATCTTCTCTTTAGCAGGAGTTCATTATTGAGTGTGTATGCAGACATGTCCGTTACATGCAAGGAGTATTATGATCCTAACCGCTCTATGTTAGAGCTAGTTTTTGCACCCGCAGCAGAATGGATCTCACGCAGTGACTCGGAAATTATTGATGCTACTATGCAAGAACTAGCAAAACTATTCCCTGATGAAATCGCTGCAGATCAGAGCAAAGCCAAAATTCTGAAATATCATATCGTCAAAACACCAAGATCTGTTTATAAAACTGTGCCTAACTGCGAACCATGCCGCCCCTCACAAAGATCTCCGATTGAAGGATTCTATCTAGCCGGTGATTACACGAAACAGAAATACTTAGCTTCGATGGAGGGTGCTGTTTTATCAGGAAAACTATGTGCTCAAGCTATTGTACAGGATAATGACTTGCTGGCTTCGCGAGCTCAAAAAAGGGTGGAACCTGAGATGAGTATTGTTTGA-3'。
本发明还提供了一种沉默山药DpPDS基因的重组表达载体，所述重组表达载体包括VIGS病毒载体和插入所述VIGS病毒载体的基因片段；
所述基因片段为上述技术方案所述的基因片段。
在本发明中，所述VIGS病毒载体优选为烟草脆裂病毒TRV2载体。
本发明还提供了上述技术方案所述的基因片段或重组表达载体在制备山药DpPDS基因VIGS沉默体系中的应用。
本发明还提供了一种山药DpPDS基因的VIGS沉默体系，所述VIGS沉默体系包括含有辅助载体的农杆菌菌液和含有上述技术方案所述重组表达载体的农杆菌菌液。在本发明中，所述农杆菌为优选农杆菌GV3101或农杆菌LBA4404，进一步优选为农杆菌GV3101。本发明所述辅助载体优选为烟草脆裂病毒TRV1载体。
在本发明中，所述的VIGS沉默体系的构建方法优选包括如下步骤：
提取山药RNA，反转录获得山药cDNA；
利用上游引物DpPDS-Xba I-F和下游引物DpPDS-Bam HI-R对所述山药cDNA进行PCR扩增，获得山药DpPDS基因的干扰片段；
将所述干扰片段插入VIGS病毒载体，得到含有山药DpPDS基因的重组质粒，转化农杆菌，得到含有重组表达载体的农杆菌菌液；
所述上游引物DpPDS-Xba I-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述下游引物DpPDS-Bam HI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
将辅助载体转化农杆菌，得到含有辅助载体的农杆菌菌液；
将所述含有重组表达载体的农杆菌菌液和含有辅助载体的农杆菌菌液混合，黑暗静置4~6h，得到所述VIGS沉默体系。
本发明提取山药RNA，反转录获得山药cDNA。本发明对所述提取和反转录的步骤没有严格要求，采用本领域的常规方法就进行提取、反转录即可，例如使用植物RNA提取试剂盒提取山药RNA，使用反转录试剂盒将其反转录为山药cDNA。
得到山药cDNA后，本发明利用上游引物DpPDS-Xba I-F和下游引物DpPDS-Bam HI-R对所述山药cDNA进行PCR扩增，获得山药DpPDS基因的干扰片段。在本发明中，所述上游引物DpPDS-Xba I-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5'-AAGGTTACCGAATTCTCTAGAGCTCAGGATGGCTTGACAGTTTCAG-3'，其中，下划线代表限制性内切酶Xba I识别序列；所述下游引物DpPDS-Bam HI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5'-CGTGAGCTCGGTACCG GATCCTCAAACCATATATGAACATTAATCA-3'，其中，下划线代表限制性内切酶Bam HI识别序列。利用所述DpPDS-Xba I-F和下游引物DpPDS-Bam HI-R能够扩增出SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述PCR扩增的程序优选为：94 ℃温育2 min；58 ℃温育30 s，72 ℃温育0.5 min，38个循环；72 ℃延伸5 min；所述PCR扩增的程序优选以50 μl计，包括：5μl10×PCR缓冲液，4μl dNTP Mixture（25mM），1μl Taq高保真酶（5U/μl），2μl 正向引物（10μM），2μl反向引物（10μM），2μl cDNA模板，ddH2O 补齐至50 μl。
得到干扰片段后，本发明将所述干扰片段插入VIGS病毒载体，得到含有山药DpPDS基因的重组质粒，转化农杆菌，得到含有重组表达载体的农杆菌菌液。本发明所述农杆菌优选为农杆菌GV3101或农杆菌LBA4404，进一步优选为农杆菌GV3101。本发明所述辅助载体优选为烟草脆裂病毒TRV1载体。
在本发明中，将所述干扰片段插入VIGS病毒载体的方式优选包括酶切和酶连。本发明所述VIGS病毒载体优选为烟草脆裂病毒TRV2载体。
本发明将辅助载体转化农杆菌，得到含有辅助载体的农杆菌菌液。在本发明中，所述辅助载体优选为烟草脆裂病毒TRV1载体。
得到含有重组表达载体的农杆菌菌液和含有辅助载体的农杆菌菌液后，本发明将所述含有重组表达载体的农杆菌菌液和含有辅助载体的农杆菌菌液混合，黑暗静置4~6h，得到所述VIGS沉默体系。
在本发明中，所述含有重组表达载体的农杆菌菌液和含有辅助载体的农杆菌菌液的体积比优选为1：1。本发明所述含有重组表达载体的农杆菌菌液的OD600值优选为0.8~1.2，进一步优选为1.0。本发明所述含有辅助载体的农杆菌菌液的OD600值优选为0.8~1.2，进一步优选为1.0。
本发明还提供了上述技术方案所述的基因片段或重组表达载体或VIGS沉默体系在鉴定山药基因功能中的应用。在本发明中，所述山药优选为‘瑞昌山药’。利用本发明提供的VIGS沉默体系可快速、简便、低成本鉴定山药基因功能，具有成本低、高通量、易于操作与实现等优势，为大规模开展山药基因功能研究提供依据。
本发明还提供了一种沉默山药DpPDS基因的方法，包括如下步骤：
利用上述技术方案所述的VIGS沉默体系对山药珠芽进行真空渗透侵染。
在本发明中，所述真空渗透侵染的时间优选为15 min。本发明优选每真空渗透侵染5 min充分晃动一次。本发明在所述山药珠芽上扎孔后进行所述真空渗透侵染；所述孔的直径优选为1~1.5mm。
真空渗透侵染结束后，本发明优选播种真空渗透侵染后的山药珠芽，培养成苗。在本发明中，所述培养优选包括生根培养和幼苗培养；所述生根培养的条件优选包括：25 ℃，光照10000 Lux，每天光照16 h、黑暗8 h；所述生根培养的时间优选为4周；所述生根培养的培养基质优选包括蛭石和珍珠岩；所述蛭石和珍珠岩的体积比优选为5：1。本发明所述幼苗培养的培养基质优选包括蛭石、草炭和珍珠岩；所述蛭石、草炭和珍珠岩的体积比优选为9：3：0.5；所述幼苗培养的条件优选与生根培养的条件一致，在此不做赘述。本发明借助真空渗透法瞬时转化山药珠芽，TRV1可以激活VIGS沉默体系中重组表达载体的扩散，诱导山药内源目的基因DpPDS发生沉默，侵染后的山药珠芽播种成株后可直接鉴定表型，繁殖周期短、基因转化率高、基因沉默时间长，无需进行植物遗传转化，克服了山药遗传转化周期长、难度大等困难，对山药DpPDS基因的功能验证具有重要科学意义。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种山药DpPDS基因的VIGS沉默体系及其构建方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
在以下实施例中，除非特殊说明，所涉及的载体和实验材料均为本领域技术人员所公知的。
实施例1
VIGS沉默表达载体pTRV2-DpPDS的构建
（1）采用植物RNA提取试剂盒（MiniBEST Plant RNA Extraction Kit, TaKaRa）提取山药品种‘瑞昌山药’的总RNA，并用反转录试剂盒（PrimeScript™ RT Kit, TaKaRa）将其反转录为cDNA。利用在线工具，设计DpPDS基因保守序列片段的扩增引物DpPDS-Xba I-F（SEQ ID NO.2所示，预先添加Xba I酶切接头）和DpPDS-Bam H-R（SEQ ID NO.3所示，预先添加Bam HI酶切接头）；
以山药cDNA为模板，利用扩增引物进行PCR扩增，其中，
PCR扩增的体系为50 μl，由10×PCR缓冲液、dNTP Mixture、Taq高保真酶、正向引物、反向引物、cDNA模板组成，PCR扩增反应体系见表1。
表1 PCR扩增反应体系
PCR扩增的程序为：94 ℃温育2 min，58 ℃温育30 s，72 ℃温育0.5 min，38个循环，72 ℃延伸5 min；
PCR扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。根据图1可以看出，PCR扩增产物的条带大小为485 bp，测序结果表示核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）用限制性内切酶Xba I和限制性内切酶Bam HI双酶切质粒pTRV2，双酶切体系40μl：2μg质粒DNA，10×NEB酶切缓冲液4μl，Xba I和Bam HI酶各2μl，然后加双蒸水使总体积达到40μl，37 ℃酶切30min，得到线性化的pTRV2；
（3）采用同源重组克隆试剂盒（Hieff Clone® Plus Multi One Step CloningKit, 上海翌圣）将步骤（1）扩增产物连接到步骤（2）酶切后的pTRV2载体上，连接体系见表2，置于PCR仪内50 ℃孵育20min。
表2 同源重组克隆反应体系
（4）连接完成后转化大肠杆菌DH5α，于37 ℃在LB液体培养基中摇菌活化1 h，再在含有50 mg/L卡那霉素的LB固体培养基上筛选阳性单克隆，用上述扩增引物（SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3）进行菌落PCR，结果如图2所示；挑选阳性克隆并测序，测序正确后的质粒备用，记为重组表达载体pTRV2-DpPDS。
实施例2
侵染液的制备
（1）采用冻融法将pTRV2-DpPDS质粒转化农杆菌GV3101，具体步骤如下：
用移液枪取3μl的实施例1得到的pTRV2-DpPDS质粒（浓度200 ng/μl）轻轻加入冰上预先融化的含有50μl农杆菌GV3101的EP管中，然后迅速投入液氮中冷冻5min，然后取出EP管转入37 ℃的水浴锅中融化5min，再加入500μl的LB液体培养基后在28 ℃振荡培养器中以200rpm摇菌2h后涂板，在含有50 mg/L卡那霉素和30 mg/L利福平的LB固体培养基上筛选阳性单克隆，用上述扩增引物（SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3）做菌落PCR鉴定阳性克隆，得到含有植物表达载体pTRV2-DpPDS的农杆菌GV3101；
（2）采用冻融法分别将pTRV1、pTRV2质粒转化农杆菌GV3101，具体步骤同步骤（1），得到含有植物表达载体pTRV1的农杆菌GV3101，和含有植物表达载体pTRV2的农杆菌GV3101；
（3）将步骤（1）得到的含有植物表达载体pTRV2-DpPDS的农杆菌GV3101，步骤（2）得到的含有植物表达载体pTRV1的农杆菌GV3101、含有植物表达载体pTRV2的农杆菌GV3101，分别接种至含有50mg/L卡那霉素和30mg/L利福平的LB液体培养基中，在28 ℃振荡培养器中以200 rpm的转速摇菌过夜至OD600为1.0；
（4）分别收集步骤（3）的菌液，转移到离心管中，5000rpm离心10min，弃上清，菌体分别用MS侵染液（含10mM MgCl2，10mM MES，0.2mM AS）重悬，调整OD600为1.0，得到pTRV1侵染液、pTRV2侵染液和pTRV2-DpPDS侵染液；
（5）将步骤（4）得到的pTRV1侵染液和pTRV2侵染液以体积比1:1混合，黑暗静置4~6小时，得到TRV1/TRV2侵染液，备用；
将步骤（4）得到的pTRV1侵染液和pTRV2-DpPDS侵染液以体积比1:1混合，黑暗静置4~6小时，得到TRV1/pTRV2-DpPDS侵染液，备用。
实施例3
山药珠芽的侵染与VIGS沉默后山药表型的鉴定
（1）将采集的‘瑞昌山药’珠芽用灭菌的牙签扎小孔后，随机分为实验组（pTRV-DpPDS）和对照组（Control），实验组浸泡在实施例2得到的pTRV1/pTRV2-DpPDS侵染液中；对照组浸泡在实施例2得到的pTRV1/pTRV2侵染液中，实验组和对照组抽真空15min，每隔5min充分晃动；
抽真空结束后，实验组侵染pTRV1/pTRV2-DpPDS侵染液的山药珠芽，一部分于28℃培养箱中暗培养3 d，进行RNA的提取，反转录成cDNA，以ACTIN未内参基因，采用实时荧光定量PCR技术检测DpPDS基因的相对表达量，检测结果如表3和图3；其中，所用引物如下：
DpPDS-qRT-F：5'-GCTCAGGATGGCTTGACAGTTTC-3'（SEQ ID NO.4）；
DpPDS-qRT-R：5'-GGAAACGATTCAGAGCGATTAG-3'（SEQ ID NO.5）；
ACTIN-qRT-F：5'-GAGCAAGGAAATCACAGCAC-3'（SEQ ID NO.6）；
ACTIN-qRT-R：5'-TCAGGGAAGCCAAGATAGAG-3'（SEQ ID NO.7），
表3 VIGS沉默后DpPDS基因的相对表达量
注：**代表差异显著，P＜0.01。
根据表3和图3可以看出，相比对照组，实验组DpPDS基因的相对表达量显著降低，说明本发明pTRV2-DpPDS侵染液能够高效沉默山药DpPDS基因。
（2）取步骤（1）实验组另一部分侵染pTRV1/pTRV2-DpPDS侵染液的山药珠芽用无菌水快速漂洗3次，埋入预先准备好的蛭石：珍珠岩体积比5：1的基质中生根催芽，基质穴盘上口封闭塑料盖保湿。在25 ℃，光照10000 Lux，每天光照16 h、黑暗8 h的培养条件下培养4周，将生根的珠芽转移到蛭石：草炭：珍珠岩体积比为9：3：0.5的生长基质中，继续培养至出苗成株，观察并统计幼苗表型，待实验组的植株叶片有白化或白斑的表型时（图4），取新鲜叶片，用RNA试剂盒提取叶片总RNA，按照步骤（1），以ACTIN为内参基因，通过荧光定量PCR检测被沉默后DpPDS基因的表达量，结果如表4和图5所示。
表4 VIGS沉默植株DpPDS基因的相对表达量
注：不同字母代表差异显著，P＜0.05。
根据表4和图2~图5可以看出，与对照组相比，经过VIGS沉默后的山药叶片中DpPDS基因表达量显著降低。
对比例1
山药叶片的侵染与VIGS沉默后叶片表型的鉴定
（1）将‘瑞昌山药’幼苗随机分为实验组（pTRV-DpPDS）和对照组（Control），实验组用注射器吸取实施例2得到的pTRV1/pTRV2-DpPDS侵染液，将其注射至山药叶片中，保证菌液蔓延至整个叶片；对照组用注射器吸取实施例2得到的pTRV1/pTRV2侵染液，将其注射至山药叶片中，保证菌液蔓延至整个叶片；
实验组和对照组注射侵染工作完成后，将山药幼苗放在室温黑暗条件下生长24h，随后使其在弱光下缓冲12h，最后放于26℃恒温培养室中正常培养。
（2）山药VIGS系统沉默效率检测
参照实施例1和实施例3中的方法，采用实时荧光定量PCR技术检测实验组和对照组山药叶片中DpPDS基因的相对表达量；
扩增程序为：95℃温育3min，95℃温育5s，60℃温育30s，共40个循环。基因相对表达量数据处理采用2-ΔΔCt法，每个样品三个生物学重复。结果如表5和图6所示。
表5 VIGS沉默山药叶片DpPDS基因的相对表达量
根据表5和图6可以看出，实验组与对照组基因表达量差异不大，说明该沉默方法未发挥作用。
根据上述内容可以看出，本发明提供的技术方案可以提高山药DpPDS基因的沉默效果，侵染后的山药珠芽播种成株后可直接鉴定表型，繁殖周期短、基因转化率高、基因沉默时间长，无需进行植物遗传转化，克服了山药遗传转化周期长、难度大等困难。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.一种沉默山药DpPDS基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括VIGS病毒载体和插入所述VIGS病毒载体的基因片段；
所述基因片段为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的反向互补序列；
所述VIGS病毒载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。
2.权利要求1所述的重组表达载体在制备山药DpPDS基因VIGS沉默体系中的应用。
3.一种山药DpPDS基因的VIGS沉默体系，其特征在于，所述VIGS沉默体系包括含有辅助载体的农杆菌菌液和含有权利要求1所述的重组表达载体的农杆菌菌液。
4.根据权利要求3所述的VIGS沉默体系，其特征在于，农杆菌为农杆菌GV3101或农杆菌LBA4404；
所述辅助载体为烟草脆裂病毒TRV1载体。
5.一种权利要求3或4所述的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取山药RNA，反转录获得山药cDNA；
利用上游引物DpPDS-Xba I-F和下游引物DpPDS-Bam HI-R对所述山药cDNA进行PCR扩增，获得山药DpPDS基因的干扰片段；
将所述干扰片段插入VIGS病毒载体，得到含有山药DpPDS基因的重组质粒，转化农杆菌，得到含有重组表达载体的农杆菌菌液；
所述上游引物DpPDS-Xba I-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述下游引物DpPDS-Bam HI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
将辅助载体转化农杆菌，得到含有辅助载体的农杆菌菌液；
将所述含有重组表达载体的农杆菌菌液和含有辅助载体的农杆菌菌液混合，黑暗静置4~6h，得到所述VIGS沉默体系。
6.权利要求1所述的重组表达载体或权利要求3或4所述的VIGS沉默体系或权利要求5所述的构建方法得到的VIGS沉默体系在鉴定山药基因功能中的应用。
7.一种沉默山药DpPDS基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用权利要求3或4所述的VIGS沉默体系对山药珠芽进行真空渗透侵染。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述真空渗透侵染还包括：播种真空渗透侵染后的山药珠芽，培养成苗。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1757735A (zh) * 2005-06-27 2006-04-12 福建农林大学 编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列
CN107338266A (zh) * 2017-06-22 2017-11-10 江苏科技大学 一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系及其构建方法和应用
CN108165579A (zh) * 2017-12-26 2018-06-15 北京农学院 一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法
CN115927403A (zh) * 2022-09-08 2023-04-07 山西师范大学 一种霸王ZxPDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7229829B2 (en) * 2002-03-14 2007-06-12 Yale University Tobacco rattle virus vectors and related compositions and methods
WO2005103267A2 (en) * 2004-04-16 2005-11-03 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Agroinoculation method for virus induced gene silencing

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1757735A (zh) * 2005-06-27 2006-04-12 福建农林大学 编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列
CN107338266A (zh) * 2017-06-22 2017-11-10 江苏科技大学 一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系及其构建方法和应用
CN108165579A (zh) * 2017-12-26 2018-06-15 北京农学院 一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法
CN115927403A (zh) * 2022-09-08 2023-04-07 山西师范大学 一种霸王ZxPDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Easter D. Syombua et al..A CRISPR/Cas9-based genome-editing system for yam (Dioscorea spp.).《Plant Biotechnology Journal》.2021,第19卷645-647. *
Hua Xu et al..Virus-induced Phytoene Desaturase (PDS) Gene Silencing Using Tobacco Rattle Virus in Lilium × formolongi.《Horticultural Plant Journal》.2018,第5卷(第1期),引言、第2.2-2.4节、3.2节、第4节. *
none.PREDICTED: Dioscorea cayenensis subsp. rotundata 15-cis-phytoene desaturase, chloroplastic/chromoplastic (LOC120281737)，mRNA，XM_039288437.1.《GenBank》.2021,全文. *
王葡萄等.瑞昌山药遗传多样性及块茎品质变异分析.《中国蔬菜》.2020,(第8期),57-63. *
龙雨青等.CRISPR/Cas9 基因组编辑技术在药用植物中的研究进展.《中草药》.2023,第54卷(第9期),2940-2952. *

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