CN105462983B - 一种抑制水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的amiRNA - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑制水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的amiRNA，公开了一种沉默水稻呼吸爆发氧化酶OsRboh的amiRNA序列，其序列为：TTAAACAACCGAAGGATACGC。本发明通过人工合成OsRboh(LOC_Os01g25820)‑amiRNA序列并连接到表达载体上并转化水稻，获得的转基因水稻植株叶片变为白色，育性降低。利用本发明制备的水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)amiRNA能高效靶向水稻目标基因，在基础研究和生产实践上具有一定的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制OsRboh(LOC_Os01g25820)基因表达的amiRNA及应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一类生物体有氧代谢的副产物，一方面可以作为有毒的次生代谢物对体内正常分子产生破坏作用；另一方面作为重要的信号分子参与生物体的生长和发。研究发现，ROS 的来源包括质膜NADPH 氧化酶、过氧化物酶及胺氧化酶，其中由NADPH 氧化酶介导产生的ROS 最受关注。
植物NADPH 氧化酶又称呼吸爆发氧化酶（Respiratory burst oxidasehomologue，Rboh），是哺乳动物巨噬细胞NADPH 氧化酶催化亚基gp91phox 的同源物。 目前的研究表明，植物Rboh 基因的功能主要集中于两个方面：参与胁迫反应和调控生长发育。本塞姆氏烟草植株（Nicotiana benthamiana）中NbRbohA 或NbRbohB 基因沉默后，转基因植株的ROS 生成量降低，同时，对致病疫霉菌（Phytophthora infestans）的抗性降低，且过敏反应受到抑制。马铃薯中stRbohA 参与受伤后超氧根离子O2-·的产生，其在马铃薯块茎的伤口愈合及抗微生物感染中起作用番茄反义Rboh 植株中ROS 的生成量明显下降，同时植株的侧枝增加，花序和花数量为野生型的2-3 倍，花瓣多于6 瓣，胚珠和花柱的形状变得扁平。大麦HvrRbohA 反义转基因植株表现出分蘖变少，育性降低。西瓜CcRboh 基因的表达水平在种子萌发后的3 d 达到最高，推测其可能在根的发育中起作用。
microRNA (miRNA)是真核生物细胞内还存在一类长19-21个核苷酸的单链小RNA分子。茎环状premiRNA是miRNA的前体，premiRNA进入细胞后被Dicer酶识别，剪切修饰后得到miRNA。miRNA结构有一段错配序列，这使得miRNA不能与目的mRNA完全互补配对，导致目的mRNA无法被降解。miRNA可以与目的mRNA的3’端UTR结合，以阻碍蛋白翻译的方法达到沉默目的基因的目的。amiRNA即人工合成微RNA(artificial microRNA，amiRNA)，是以生物内源性的miRNA前体分子为骨架，依据体内miRNA的形成过程，采用基因合成的方法合成能够沉默目的基因的微RNA。amiRNAi具有特异性高、稳定性强和沉默效果可控等优点，amiRNA可以特异沉默基因家族中的某一个靶基因的表达，而不影响其它成员从而越来越受到人们的关注。
水稻(Oryza sativa L.) 是最主要的粮食作物之一，全世界超过一半的人口都以水稻作为主粮。水稻不仅是一种重要的粮食作物，也是一种重要的模式生物，对相关基因进行功能研究具有重要作用。随着水稻功能基因组研究的不断深入，许多重要农艺性状相关基因相继被分离。Respiratory Burst Oxidase Homolog (Rboh) 基因直接参与ROS的形成，但在水稻中的功能并不清楚。鉴于ROS植物生长中的重要作用，获得相应的功能缺失突变体进行研究具有一定的理论和实践意义。尽管目前普通采用RNAi技术具有高效、直接等优点，但其主要的缺点是可同时沉默目的基因家族的其它同源性较高的基因，出现脱靶效应，很难对目的基因进行特异性沉默。因此，采用amiRNA技术针对特异的靶序列可以解决这一难题。本研究利用获得的OSBROH amiRNA序列构建载体水稻，获得的转基因水稻植株叶片变为白色，育性降低，在基础研究和生产实践上具有一定的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的amiRNA及用于沉默水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体。
本发明的沉默水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的amiRNA，其DNA序列如SEQIDNO.1 所示。
用于沉默水稻呼吸氧爆发氧化酶OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的载体，其特征在于：含有特异性靶向OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的amiRNA序列及amiRNA*序列，双35S启动子，潮霉素筛选标记。
本发明的靶向沉默水稻呼吸氧爆发氧化酶基因OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体构建方法，按以下步骤进行：
(1)根据在线软件httP://wmd3.weigelworld.org搜寻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的合适的amiRNA序列，OsRboh(LOC_Os01g25820)的序列特征见 SEQ NO 4所示，靶标序列见SEQ IDNO.1所示。
（2）将amiRNA序列进行反向互补，然后第6位T变为A，第10位的T变为 A， 获得amiRNA*，其DNA序列如SEQ IDNO.2 所示；
（3）将OsRboh(LOC_Os01g25820)的amiRNA和amiRNA*序列替换OsmiR528前体中的amiRNA和amiRNA*序列，获得OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA序列，其DNA序列如SEQIDNO.3 所示；
（5）将人工合成的OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA序列并将其连接至PHB双35S启动子上游，然后转化大肠杆菌DH5a获得目的载体载体PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA1。
3. 本发明的有益效果是干扰载体PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA1转化水稻后能高效靶向水稻目标基因。转基因水稻植株呈现白化苗，植株育性降低，可直接用此做研究材料来探讨OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的功能和作用机理，为在生产实践上更好利用OsRboh(LOC_Os01g25820)基因进行遗传改良奠定基础。
附图说明
（1）图1为pMD18T-OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA的
BamH I和
Xba I酶切图。
（2）图2为PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA的
BamH I和
Xba I酶切图。
（3）图3转基因水稻植株的鉴定图。
（4）图4为苗期转基因水稻植株，其中A为野生型，B为转基因水稻。
（5）图5为成熟期转基因水稻植株，其中A为野生型，B为转基因水稻。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连) 产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，CRISPR-Cas9载体BGK03购自杭州百格生物技术公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：水稻OSBROH基因amiRNA序列获得
利用tigr在线数据库查找水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因并下载。根据在线软件httP://wmd3.weigelworld.org搜寻可能的amiRNA序列，并根据反应热动力学参数、有效自由杂交能(ΔG)和杂交能(ΔGint)等参数，最后选择“TTAAACAACCGAAGGATACGC”作为目标amiRNA序列。获得候选amiRNA后，将其进行反向互补，第6位T变为A，第10位的T变为A获得amiRNA*。
实施例2：水稻PHB-OSBROH-amiRNA载体的构建
将OsRboh(LOC_Os01g25820)的amiRNA与amiRNA*序列分别替换骨架
OsmiR528中的amiRNA和 amiRNA*序列获OsRboh(LOC_Os01g25820)
-amiR
NA序列。依据目的序列与载体PHB不重复出现酶切位点的原则，在OsRboh(LOC_Os01g25820)
-amiRNA序列片段两端分别添加酶切位点为
BamH I和
Xba I。然后将其交由上海捷瑞生物工程有限公司进行基因合成，将该目的序列连接到克隆载体pMD18T上。
BamH I和
Xba I消化pMD18T-OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA，能明显切出目的条带的大小，见图1。琼脂糖凝胶回收酶切产物，将其与的表达载体PHB酶切产物进行T4 DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，摇菌过夜，菌液中抽提质粒后酶切验证，见图2。得到的表达载体命名为PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA，。
实施例3：PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA转农杆菌EHA105
(1) 农杆菌感受态细胞制备
挑取农杆菌 EHA105 单菌落接种于5ml YEB 培养基中，28℃摇培过夜，按 1:100的比例接种于 50 ml YEB培养基中扩培，28℃继续培养约6-7h至OD600=0.4-0.6。将菌液置于冰上30min；5000 rpm，4℃离心5min，弃上清，将菌体悬于10 ml 0.15 M NaCl 中；5000rpm，4℃离心5min，弃上清，菌体用1 ml 20 mM CaCl2，4℃）轻轻悬浮，每管 200μl分装，或加入终浓度为 20％的无菌甘油，-70℃保存。
(2)农杆菌的转化及鉴定
将 10μl 质粒 DNA 加入200μl农杆菌感受态中，混匀，冰浴30min，液氮冷冻 3-5min，37℃水浴5min，加入1 ml YEB 培养基，28℃摇培3-4h。10000rpm，室温离心 30s，弃上清，加入200μl YEB培养基重悬菌体，涂于YEB 培养基上，28℃培养2天；碱裂解法提取农杆菌质粒DNA，质粒再重新转化大肠杆菌（DH5α），过夜培养后，挑取单菌落液体培养，提取质粒DN并进行PCR鉴定。
实施例4：含PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)的农杆菌EHA105转化水稻
(1) 材料的预处理
首先将干种子去壳, 去壳种子在70%乙醇中浸泡1 分钟,然后在50%漂白剂
(含2%HClO)中灭菌20 分钟,再用无菌水洗4 次, 将整个种子转移至MD2 培养基
平板上，26℃暗培养4 天。当黄色愈伤组织在胚轴出现时（通常需要四天，在这
期间，根通常有2-5cm 长），切除根部和胚乳，将胚轴转移至一个新鲜的NBD2
培养基平板，钝形面向上, 26℃暗培养7-10 天。
(2) 挑取EHA105 农杆菌单菌落，在100ml 含相应抗性的YEB 培养基中震荡培
养约16 小时（200rpm，28℃），至OD600 为0.6-0.8 左右。
(3) 3000rmp 离心10 分钟，在AAM-AS 液体培养基液体培养基中重悬沉淀至浓
度OD600 为0.6-0.8。
(4) 将300 个带有黄色愈伤的胚浸泡在细菌悬液中20 分钟，间或震荡。
(5) 从悬液中收集胚，在两张无菌滤纸间吸干。
(6) 在NBD2-AS 培养基平板表面放上无菌滤纸，把胚放在滤纸表面，26℃暗培
养2 天。
(7) 把胚的根部去掉，把胚放入新NBD2 培养基平板上（含潮霉素和头孢霉素），
切割面向下，26℃暗培养12 天。
(8) 再转入新鲜的NBD2 培养基平板上（含潮霉素和头孢霉素），26℃暗培养12-15
天，在这个时间可以看见新的愈伤长出。
(9) 把抗性愈伤（将抗性愈伤从胚上切下）放在Pre-MS 预分化培养基平板上，
26℃暗培养8 天。
(10) 把愈伤放在生芽培养基MS-H 分化培养基平板上，26℃（12 小时光照，12
小时 黑暗）培养，当绿芽出现（大约15 天），立即将它们转入新鲜的MS-H 培
养平板上不要加潮霉素（如果只看见绿点，立即将它们转入新鲜的MS-H 培养基
平板上加入终浓度为25mg/L 的潮霉素，防止愈伤形成），新的无根苗在10 天内
形成。
(11) 将无根苗移入MSNH 再生培养基上，诱导根的形成。
(12) 当根形成后，将培养瓶打开7天后，把苗移入温室。
实施例5：转基因植株的鉴定和分析
(1)水稻DNA的提取
将适量的经筛选的水稻叶片放入1.5 ml的离心管中，加入400 μl的CTAB抽提缓冲液，用蓝色小棒研磨成浆状，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），猛烈摇匀，12000 rpm，离心10 min。取上清至新的离心 管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M 醋酸钠(PH5.2)，剧烈混匀使DNA成团，放入-20℃沉淀2hr以上。随后12000 rpm，离心10 min。弃上清，沉淀用 70% 乙醇洗涤一次后室温晾干，加适量的TE或超纯水溶解。
（2）转基因水稻植株的鉴定
以抽提的DNA为模板、使用上游引物
：TTGGATCCGCATCAGCAGC和下游引物：ATTAACTTCGGTCATTAGAGGC进行PCR扩增，PCR的25μl体系为：PCR 缓冲液（10*） 2.5μl、Taq0.5μl、cDNA模板2μl、10mM dNTP 0.5μl、10μM
OSBROH-F′引物1μl、10μM
OSBROH-R′引物1μl、使用无菌水补足25μl。反应条件为：94℃5min，35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，72℃反应10min。可以发现大部分转化苗都为阳性植株，能扩增出目的条带，见图3。
(3)转基因水稻植株表型分析和叶片中过氧化氢含量染色
通过尼康D7100数码相机进行拍照，进行表型观察，可以发现在苗期会出现白化苗，同时在成熟时期育性会降低，见图4和图5。
SEQ ID NO：1
〈210〉：1
〈211〉:21
〈212〉：DNA
〈213〉：水稻（Oryza sativa L.）
〈400〉: 1
TTAAACAACCGAAGGATACGC
SEQ ID NO：2
〈210〉：2
〈211〉:21
〈212〉：DNA
〈213〉：水稻（Oryza sativa L.）
〈400〉: 2
GCGTAACCTACGGTTGTTTAA
SEQ ID NO：3
〈210〉：3
〈211〉:245
〈212〉：DNA
〈213〉：水稻（Oryza sativa L.）
〈400〉: 3
GCATCAGCAG CAGCCACAG CAAAATTTGG TTTGGGATAG GTGTTATGTT AGGTCTGGTT 60
TTTTGGCTGT AGCAGCAGT TAAACAACCG AAGGATACGC CAGGAGATTC AGTTTGAAGC 120
TGGACTTCAC TTTTGCCTC TCTGCGTAAC CTACGGTTGT TTAATTCCTG CTAGGCTGTT 180
CTGTGGAAGT TTGCAGAGT TTATATTATG GGTTTAATCG TCCATGGCAT CAGCATCAGC 240
AGCGGTAGG 249
SEQ ID NO：4
〈210〉：4
〈211〉:26
〈212〉：DNA
〈213〉：水稻（Oryza sativa L.）
〈400〉: 4
ATGGCTGACC TGGAAGCAGG CATGGTTGCT GCTGCCACAG ACCAGGGCAA TTCAACAAGG 60
TCACAAGATG ACGCAGCCAC ACTGATCCCG AACAGTGGCA ATCTGGGCTC GAGCAACAGG 120
AGCACCAAGA CGGCCAGGTT CAAGGACGAC GACGAGCTGG TCGAGATCAC CCTCGACGTG 180
CAGCGCGATT CGGTGGCAAT CCAAGAAGTG AGAGGGGTGG ATGAGGGTGG CTCCGGGCAC 240
GGTACCGGGT TCGACGGCCT GCCACTGGTG TCACCCTCGT CGAAGAGCGG AAAGCTGACG 300
TCAAAGCTCA GGCAGGTGAC CAATGGGCTC AAGATGAAGA GCTCCAGCAG GAAGGCGCCA 360
TCCCCGCAGG CGCAGCAGTC TGCGAAGAGG GTGAGGAAGA GGCTGGACAG GACCAAGAGC 420
AGCGCCGCCG TGGCGCTCAA AGGATTGCAG TTTGTGACTG CAAAGGTTGG CAATGACGGC 480
TGGGCCGCGG TGGAGAAGCG GTTCAATCAG CTGCAGGTGG ATGGTGTGCT GCTCCGTTCA 540
AGATTTGGGA AATGCATTGG AATGGATGGG TCCGACGAGT TTGCGGTGCA AATGTTCGAT 600
TCTCTGGCGA GGAAGAGAGG GATAGTGAAG CAGGTGCTCA CTAAGGACGA GCTCAAAGAT 660
TTCTATGAGC AATTGACTGA TCAGGGGTTT GACAATCGTC TTCGGACATT CTTTGACATG 720
GTTGACAAGA ACGCTGATGG AAGGCTCACA GCAGAAGAGG TTAAGGAGAT TATTGCCCTT 780
AGTGCATCAG CAAACAAACT TTCCAAGATC AAGGAGCGAG CTGATGAGTA CACAGCACTC 840
ATTATGGAAG AGCTTGACCC TACAAACTTG GGATACATCG AGATGGAGGA CTTGGAAGCA 900
CTATTGCTTC AGTCACCATC TGAAGCTGCT GCAAGATCAA CAACGACGCA CAGCTCCAAA 960
CTTAGCAAAG CTCTTAGCAT GAAGCTTGCG TCTAACAAAG AAATGAGCCC AGTTCGTCAT 1020
TACTGGCAGC AGTTCATGTA CTTCCTTGAA GAGAATTGGA AGCGCAGTTG GGTTATGACT 1080
CTGTGGATCT CAATCTGCAT TGCCCTTTTC ATTTGGAAGT TCATTCAGTA CCGTAATCGA 1140
GCCGTATTCG GCATCATGGG TTATTGTGTG ACCACTGCAA AGGGTGCTGC AGAGACCCTC 1200
AAATTCAACA TGGCTTTGGT CCTACTTCCT GTCTGCAGAA ATACAATCAC ATGGATTCGG 1260
TCAAAGACAC AGGTTGGAGC TGTTGTACCC TTCAACGACA ATATAAACTT TCATAAGGTC 1320
ATAGCCGCAG GTGTTGCAGT TGGTGTTGCT TTGCATGCAG GTGCTCATCT GACATGTGAT 1380
TTTCCCCGGC TGCTCCATGC GAGTGATGCA CAATATGAAC TAATGAAGCC CTTCTTTGGG 1440
GAGAAGAGGC CACCAAATTA CTGGTGGTTT GTAAAGGGAA CTGAAGGCTG GACAGGTGTG 1500
GTCATGGTGG TGCTCATGGC AATAGCATTT ACATTAGCCC AACCATGGTT CCGACGTAAC 1560
AAGCTCAAGG ACTCCAATCC CCTCAAAAAA ATGACTGGCT TCAATGCCTT CTGGTTTACC 1620
CACCACCTGT TTGTCATTGT GTACACTTTG CTCTTTGTCC ATGGAACGTG CTTGTATCTA 1680
AGCAGGAAAT GGTACAAGAA GACGACATGG ATGTACCTCG CTGTTCCTGT TGTCCTGTAT 1740
GTAAGTGAGC GTATTCTTCG GTTGTTTAGG AGCCATGATG CAGTTGGGAT TCAGAAGGTT 1800
GCAGTGTATC CCGGGAATGT ATTGGCTCTT TATATGTCGA AGCCACCTGG TTTCAGATAC 1860
CGTAGTGGGC AGTACATCTT CATAAAATGC ACTGCTGTGT CTCCATATGA ATGGCATCCA 1920
TTTTCCATAA CATCAGCACC TGGAGATGAT TATCTTAGTG TTCATATTCG CACAAGGGGT 1980
GATTGGACTT CACGGCTTAG AACTGTTTTC TCTGAGGCAT GCCGACCCCC CACTGAGGGA 2040
GAAAGTGGAC TACTTAGAGC TGACCTTTCC AAGGGAATAA CGGACGAAAA AGCAAGATTC 2100
CCAAAACTTT TGGTCGATGG ACCGTATGGT GCACCGGCAC AAGATTACCG TGAATACGAT 2160
GTGCTACTTC TCATCGGGCT GGGCATCGGA GCCACCCCTT TGATTAGCAT TGTGAAGGAC 2220
GTGCTTAACC ACATTCAAGG TGAGGGATCA GTTGGAACCA CGGAGCCGGA GAGCAGCAGC 2280
AAGGCGAAGA AGAAACCTTT CATGACGAAG AGAGCCTACT TCTACTGGGT GACGAGAGAG 2340
GAGGGCTCGT TTGAGTGGTT CAGAGGCGTC ATGAACGAGG TGTCTGAGAA GGACAAGGAT 2400
GGAGTCATTG AGCTCCATAA CCACTGCTCA AGCGTGTACC AGGAAGGCGA TGCTCGTTCT 2460
GCTCTCATTG TCATGCTCCA AGAACTTCAG CATGCGAAGA AGGGCGTCGA TATCTTGTCG 2520
GGAACTAGTG TGAAGACCCA TTTCGCACGA CCTAATTGGC GAAGCGTCTT CAAGAAGGTT 2580
GCGGTCAGCC ATGAGAACCA GCGCGTCGGT GTGTTCTACT GTGGTGAGCC TGTGCTGGTT 2640
CCCCAACTAA GGCAGTTGTC AGCAGATTTC ACCCACAAGA CAAACACAAG ATTTGATTTC 2700
CACAAGGAGA ACTTCTAA 2718
Claims (1)
1.包含沉默水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因amiRNA的载体的应用，其特征在于，用于改变水稻叶色及育性，所述OsRboh(LOC_Os01g25820)基因amiRNA的DNA序列如SEQ IDNO.1所示；
包含沉默水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因amiRNA的载体的构建方法，按以下步骤进行：
(1)搜寻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的合适的amiRNA序列，OsRboh(LOC_Os01g25820)的序列如SEQ ID NO.4所示，靶标序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将amiRNA序列进行反向互补，然后第6位T变为A，第10位的T变为A，获得amiRNA*，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)将OsRboh(LOC_Os01g25820)的amiRNA和amiRNA*序列替换OsmiR528前体中的amiRNA和amiRNA*序列，获得OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA序列，其DNA序列如SEQ IDNO.3所示；
(4)人工合成OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA序列，将其与PHB表达载体酶切连接，然后转化大肠杆菌DH5α获得目的载体PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-amiRNA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201610028696.8A CN105462983B (zh) | 2016-01-18 | 2016-01-18 | 一种抑制水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的amiRNA |
Applications Claiming Priority (1)
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| OsRboh基因家族在水稻免疫应答中的表达及功能分析;李业等;《生物工程学报》;20111125;第27卷(第11期);摘要，第1575页左栏第1段-右栏第1段 * |
| 植物人工微RNA（amiRNA）表达载体构建的方法学研究及其应用;严红;《中国博士学位论文全文数据库 基础科技辑》;20120615(第06期);第27页第2-3段，第28页第3段-第34页第1段 * |
| 水稻OsRbohB基因原位杂交载体的构建及其在花药中的表达分析;胡丽芳等;《广东农业科学》;20141231;第121页左栏第3段 * |
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