CA2296046A1 - Gene chimere codant pour la drosomicine, vecteur le contenant et obtention des plantes transgeniques resistantes aux maladies - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un gène chimère contenant une séquence d'ADN codant pour la drosomicine, un vecteur contenant le gène chimère, un procédé pour la transformation des plantes et les plantes transformées. La drosomicine produite par les plantes tranformées leur confère une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.
Description
GENE CHIMERE CODANT POUR LA DROSOMICINE, VECTEUR LE CONTENANT ET OBTENTION DES
PLANTES TRANSGENIQUES RESISTANTES AUX MALADIES
La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour la drosomicine, un gène chimère la contenant, un vecteur contenant le gène chimère et un procédé pour la transformation des plantes et les plantes transformées résistantes aux maladies.
Il existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter, d'avoir recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à
même d'assurer leur défense contre ces maladies.
1 ~ On connaît différentes substances d'origine naturelle, en particulier des peptides, présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment contre les champignons responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème consiste à
trouver de telles substances qui pourront non seulement être produites par des plantes transformées, mais encore conserver leurs propriétés bactéricides ou fongicides et Ies ?0 conférer aux dites plantes. Au sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés bactériostatiques ou fongistatiques.
Les drosomicines sont des peptides produits par les larves et adultes de drosophiles par induction à la suite d'une blessure septique ou de l'injection d'une
PLANTES TRANSGENIQUES RESISTANTES AUX MALADIES
La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour la drosomicine, un gène chimère la contenant, un vecteur contenant le gène chimère et un procédé pour la transformation des plantes et les plantes transformées résistantes aux maladies.
Il existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter, d'avoir recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à
même d'assurer leur défense contre ces maladies.
1 ~ On connaît différentes substances d'origine naturelle, en particulier des peptides, présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment contre les champignons responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème consiste à
trouver de telles substances qui pourront non seulement être produites par des plantes transformées, mais encore conserver leurs propriétés bactéricides ou fongicides et Ies ?0 conférer aux dites plantes. Au sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés bactériostatiques ou fongistatiques.
Les drosomicines sont des peptides produits par les larves et adultes de drosophiles par induction à la suite d'une blessure septique ou de l'injection d'une
2~ faible dose de bactéries. Un peptide a déjà été décrit comme présentant certaines propriétés antifongiques et antibactériennes in vitro, notamment dans la demande de brevet français 2 725 992, où le peptide est obtenu par induction sur les drosophiles et purification. Le gène codant pour ce mëme peptide a également été décrit par Fehlbaum & coll. ( 1994). La possibilité d'intégrer ce gène à une plante pour lui 30 conférer une résistance aux maladies d'origine fongique ou bactérienne n'a toutefois pas été décrite à ce jour.
On a maintenant trouvé que les gènes des drosomicines pouvaient ëtre insérés dans les plantes pour leur conférer des propriétés de résistance aux maladies fongiquzs et aux maladies d'origine bactérienne. apportant une solution particulièrement avantageuse au problème énoncé ci-dessus.
L'invention a donc d'abord pour objet un gène chimère comprenant un fragment d'acide nucléique codant pour une drosomicine ainsi que des éléments de régulation en position ~' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans les plantes et un vecteur pour la transformation des plantes contenant ce gène chimère. Elle comprend aussi une cellule végétale transformée contenant au moins un fragment d'acide nucléique codant pour la drosomicine et une plante résistante aux maladies contenant la dite cellule. Elle concerne enfin un procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies dans lequel on insère un gène codant pour Ia drosomicine.
Par drosomicine. on entend selon l'invention tout peptide pouvant être isolé
des larves et adultes de drosophiles par induction à la suite d'une blessure septique ou de l'injection d'une faible dose de bactéries, ces peptides comprenant au moins -44 acides 1 ~ aminés et 8 résidus cystéine formant entre eux des ponts disulfure.
De manière avantageuse, la drosomicine comprend essentiellement la séquence peptidique de formule (I) ci-dessous Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cvs-Xad-Cys-Xae-Cvs-Xaf Cys-Xag-Cvs-Xah-Cys ?0 dans laquelle Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins I acide aminé.
Xab représente un reste peptidique de 8 acides aminés.
Xac représente un reste peptidique de 7 acides aminés, Xad représente unreste peptidique de 3 acides aminés, 2~ Xae représente un reste peptidique de 9 acides aminés, Xaf représente un reste peptidique de 5 acides aminés, Xag représente unreste peptidique d'un acide aminé. et Xah représente un reste peptidique de 2 acides aminés.
De manière avantageuse, Xab et/ou Xad et/ou Xac comprenent au moins un ~0 acide aminé basique. Plus avantageusement. Xab comprend au moins 2 acides aminés basiques. de préférence ? et/ou Xad et/ou Xaf comprenent au moins 1 acide aminé
basique, de préférence 1. Par acide aminé basique, on enbtend selon l'invention ies acides aminés choisis parmi la lysine. l'arQinine ou l'homoarginine.
On a maintenant trouvé que les gènes des drosomicines pouvaient ëtre insérés dans les plantes pour leur conférer des propriétés de résistance aux maladies fongiquzs et aux maladies d'origine bactérienne. apportant une solution particulièrement avantageuse au problème énoncé ci-dessus.
L'invention a donc d'abord pour objet un gène chimère comprenant un fragment d'acide nucléique codant pour une drosomicine ainsi que des éléments de régulation en position ~' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans les plantes et un vecteur pour la transformation des plantes contenant ce gène chimère. Elle comprend aussi une cellule végétale transformée contenant au moins un fragment d'acide nucléique codant pour la drosomicine et une plante résistante aux maladies contenant la dite cellule. Elle concerne enfin un procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies dans lequel on insère un gène codant pour Ia drosomicine.
Par drosomicine. on entend selon l'invention tout peptide pouvant être isolé
des larves et adultes de drosophiles par induction à la suite d'une blessure septique ou de l'injection d'une faible dose de bactéries, ces peptides comprenant au moins -44 acides 1 ~ aminés et 8 résidus cystéine formant entre eux des ponts disulfure.
De manière avantageuse, la drosomicine comprend essentiellement la séquence peptidique de formule (I) ci-dessous Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cvs-Xad-Cys-Xae-Cvs-Xaf Cys-Xag-Cvs-Xah-Cys ?0 dans laquelle Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins I acide aminé.
Xab représente un reste peptidique de 8 acides aminés.
Xac représente un reste peptidique de 7 acides aminés, Xad représente unreste peptidique de 3 acides aminés, 2~ Xae représente un reste peptidique de 9 acides aminés, Xaf représente un reste peptidique de 5 acides aminés, Xag représente unreste peptidique d'un acide aminé. et Xah représente un reste peptidique de 2 acides aminés.
De manière avantageuse, Xab et/ou Xad et/ou Xac comprenent au moins un ~0 acide aminé basique. Plus avantageusement. Xab comprend au moins 2 acides aminés basiques. de préférence ? et/ou Xad et/ou Xaf comprenent au moins 1 acide aminé
basique, de préférence 1. Par acide aminé basique, on enbtend selon l'invention ies acides aminés choisis parmi la lysine. l'arQinine ou l'homoarginine.
3 De manière préférentielle.
Xaa représente la séquence peptidique Xaa'-Asp- dans laquelle Xaa' représente NH?
ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé. rt/ou Xab représente Ia séquence peptidique -Leu-Xab'-Pro- dans laquelle Xab' représente un reste peptidique de 6 acides aminés, et/ou Xac représente la séquence peptidique -Ala-Xac'-Thr- dans laquelle Xac' représente un reste peptidique des acides aminés, et/ou Xad représente la séquence peptidique -Arg-Xad'-Val, dans laquelle Xad' représente un reste peptidique d'un acide aminé, et/ou Xae représente la séquence peptidique -Lys-Xae'-His- dans laquelle Xae' représente un reste peptidique de 7 acides aminés, et/ou Xaf représente la séquence peptidique -Ser-Xaf -Lys- dans laquelle Xaf représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou Xag représente Trp, et/ou 1 ~ Xah représente le reste peptidique Glu-Gly.
De manière plus préférentielle, Xab' représente la séquence peptidique Ser-Gly-Arg-Tyr-Lys-Gly, et/ou Xac' représente la séquence peptidique Val-Trp-Asp-Asn-Glu, et/ou Xad' représente Arg, et/ou ?0 Xae' représente la séquence peptidique Glu-Glu-Gly-Arg-Ser-Ser-Gly, et/ou Xat représente la séquence peptidique Pro-Ser-Leu.
Selon un mode plus préférentiel de réalisation de l'invention. la drosomicine est la séquence peptidique représentée par l'identificateur de séquence n° ~4 (SEQ ID
No 4) et les séquences peptidiques homologues.
?5 Par séquence peptidiques homologues, on entend toute séquence équivalente comprenant au moins 65 % d'homologie avec la séquence représentée par l'identificateur de séquence n° 4, étant entendu que les 8 résidus cystéine et le nombre d'acides aminés les séparant restent identiques certains acides aminés étant remplacés par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites ri induisant pas de 30 modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de la dite séquence homologue. De préférence, les séquences homologues comprennent au moins 7~ % d'homologie, plus préférentiellement au moins $~ % d'homologie, encore plus préférentiellement 90 % d'homologie.
WO 99/02717 ~ PCT/FR98/01462 Le résidu NH2 terminal peut présenter une modification post-traductionnelle.
par exemple une acétylation. de même que le résidu C-terminal peut présenter une modification post-traductionnelle, par exemple une amidation.
Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I), on entend non seulement les séquences définies ci-dessus. mais également de telles séquences comprenant à l'une ou l'autre de leurs extrémités. ou les deux, des résidus peptidiques, notamment nécessaires à leur expression et ciblage dans les cellules végétales ou dans les plantes.
I1 s'agit notamment de la drosomicine « full length » (longueur totale) représentée par l'identiticateur de séquence n°2 (SEQ ID No 2).
Il s'agit en particulier d'un peptide de fusion « peptide-drosomicine » ou cc drosomicine-peptide », avantageusement « peptide-drosomicine », dont la coupure par les systèmes enzymatiques des cellules végétales permet la libération de la drosomicine.
définie ci-dessus. Le peptide fusionné à la drosomicine peut être un peptide signal ou un 1 ~ peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de la drosomicine de manière spécifique dans une partie de la cellule végétale ou de la plante.
comme par exemple le cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans un type particulier de compartiments cellulaires ou de tissus ou dans la matrice extracellulaire.
Selon un mode de réalisation. le peptide de transit peut être un signal d'adressa~~e '_'0 chloroplastique ou mitochondrial. lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes ou les mitochondries.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut ëtre un signal N-terminal ou « prépeptide », éventuellement en association avec un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, ou un peptide '_'~ d'adressage vacuolaire ou « propeptide ». Le réticulum endoplasmique est le lieu où sont pris en charge par ia « machinerie cellulaire » des opérations de maturation de la protéine produite, comme par exemple le clivage du peptide signal.
Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant. dans le 30 sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiaIe, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale.
puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour WO 99/02717 ~ PCT/FR98/01462 une enzyme à localisation piastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0 X08 909.
Comme peptide de transit utile selon 1"invention, on peut citer en particulier le peptide si~~nal du gène PR-la du tabac (WO 9/19443), ou encore l'ubiquitine représentée - fusionnée à la drosomicine par l'identiticateur de séquence n° 6.
Le peptide de fusion « ubiquitine-drosomicine » et sa séquence codante sont également partie de la présente invention. en particulier décrits par f'identificateur de séquence n° 5.
La présente invention concerne donc un gène chimère comprenant une séquence codante pour la drosomicine ainsi que des éléments de régulation en position ~' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans les plantes, la séquence codante comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour la drosomicine telle que définie ci-dessus.
La séquence d'ADN peut être obtenue selon les méthodes standards d'isolation et de purification à partir des drosophiles. ou encore par synthèse selon les techniques usuelles 1 ~ d'hybridations successives d'oligonucléotides synthétiques. Ces techniques sont notamment décrites par Ausubel cr al.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN codant pour la drosomicine comprend la séquence d'ADN décrite par les bases ? 1 à 1 ~? de l'identificateur de séquence n° 3 (SEQ ID NO 3), une séquence homologue ou _'0 complémentaire de ladite séquence.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention. la séquence d'ADN codant pour la drosomicine « full length » comprend la séquence d'ADN décrite par les bases 101 à
3I0 de l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID No I ), une séquence homologue ou complémentaire de ladite séquence.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN codant pour le peptide de fusion « peptide-héliomicine » comprend la séquence d'ADN
décrite par les bases I~ à 221 de l'identificateur de séquence n°5 (SEQ ID NO ~), une séquence homologue ou une séquence complémentaire des dites séquences.
Par « homologue ». on entend selon l'invention toute séquence d'ADN présentant 30 une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique décrite par les identificateurs de séquences n° I, 3 ou ~ et codant pour la drosomicine. la drosomicine « full length » ou le peptide de fusion « peptide-drosomicine ».
Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un mème acide aminé. les différences entre la séquence de référence décrite par les identificateurs de séquences n° 1. 3 ou J
et l'homologue correspondant peuvent être importantes, d'autant plus qu'il s'agit de fragments d'ADN de faible taille réalisables par synthèse chimique. De manière avantageuse, le degré
d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de la drosomicine ou du peptide de fusion résultants.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons. des parties de plantes. des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié
1 ~ capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones.
plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs. le blé, le colza. le soja, le riz, la canne à sucre.
la betterave, le tabac, le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence d'AD?~
?0 codant pour la drosomicine sont bien connus de l'homme du métier en fonction de la plante. Ils comprennent notamment des séquences promotrices. des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons stars et stop. LeS IlloyeilS
et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier.Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes. on peut 2~ utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne. virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylaseiowgénase (RuBisCO) ou d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou un promoteur inductible par les pathogènes comme le PR-ia du 30 tabac, tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à
une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène. tel que par exemple. celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 307 698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice. d'autres séquences de ré~~ulation, qui sont situées entre le promoteur - et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription i "enhancer"). comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington &
Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'~grobacterium tumefaciens. ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
La présente invention concerne également un vecteur d'intégration pour la transformation des plantes contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules 1 ~ végétales par intégration d'au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus.
transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les demandes citées dans la présente demande.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes '_'0 avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN.
Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium ra~mefàciens ou Ri d'Agrobacterium rhi~ogenes.
D'autres méthodes peuvent ëtre utilisées telles que la micro-injection ou i'électroporation.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de la plante. notamment de son caractère monocotylédone ou dicotylédone.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US
Xaa représente la séquence peptidique Xaa'-Asp- dans laquelle Xaa' représente NH?
ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé. rt/ou Xab représente Ia séquence peptidique -Leu-Xab'-Pro- dans laquelle Xab' représente un reste peptidique de 6 acides aminés, et/ou Xac représente la séquence peptidique -Ala-Xac'-Thr- dans laquelle Xac' représente un reste peptidique des acides aminés, et/ou Xad représente la séquence peptidique -Arg-Xad'-Val, dans laquelle Xad' représente un reste peptidique d'un acide aminé, et/ou Xae représente la séquence peptidique -Lys-Xae'-His- dans laquelle Xae' représente un reste peptidique de 7 acides aminés, et/ou Xaf représente la séquence peptidique -Ser-Xaf -Lys- dans laquelle Xaf représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou Xag représente Trp, et/ou 1 ~ Xah représente le reste peptidique Glu-Gly.
De manière plus préférentielle, Xab' représente la séquence peptidique Ser-Gly-Arg-Tyr-Lys-Gly, et/ou Xac' représente la séquence peptidique Val-Trp-Asp-Asn-Glu, et/ou Xad' représente Arg, et/ou ?0 Xae' représente la séquence peptidique Glu-Glu-Gly-Arg-Ser-Ser-Gly, et/ou Xat représente la séquence peptidique Pro-Ser-Leu.
Selon un mode plus préférentiel de réalisation de l'invention. la drosomicine est la séquence peptidique représentée par l'identificateur de séquence n° ~4 (SEQ ID
No 4) et les séquences peptidiques homologues.
?5 Par séquence peptidiques homologues, on entend toute séquence équivalente comprenant au moins 65 % d'homologie avec la séquence représentée par l'identificateur de séquence n° 4, étant entendu que les 8 résidus cystéine et le nombre d'acides aminés les séparant restent identiques certains acides aminés étant remplacés par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites ri induisant pas de 30 modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de la dite séquence homologue. De préférence, les séquences homologues comprennent au moins 7~ % d'homologie, plus préférentiellement au moins $~ % d'homologie, encore plus préférentiellement 90 % d'homologie.
WO 99/02717 ~ PCT/FR98/01462 Le résidu NH2 terminal peut présenter une modification post-traductionnelle.
par exemple une acétylation. de même que le résidu C-terminal peut présenter une modification post-traductionnelle, par exemple une amidation.
Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I), on entend non seulement les séquences définies ci-dessus. mais également de telles séquences comprenant à l'une ou l'autre de leurs extrémités. ou les deux, des résidus peptidiques, notamment nécessaires à leur expression et ciblage dans les cellules végétales ou dans les plantes.
I1 s'agit notamment de la drosomicine « full length » (longueur totale) représentée par l'identiticateur de séquence n°2 (SEQ ID No 2).
Il s'agit en particulier d'un peptide de fusion « peptide-drosomicine » ou cc drosomicine-peptide », avantageusement « peptide-drosomicine », dont la coupure par les systèmes enzymatiques des cellules végétales permet la libération de la drosomicine.
définie ci-dessus. Le peptide fusionné à la drosomicine peut être un peptide signal ou un 1 ~ peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de la drosomicine de manière spécifique dans une partie de la cellule végétale ou de la plante.
comme par exemple le cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans un type particulier de compartiments cellulaires ou de tissus ou dans la matrice extracellulaire.
Selon un mode de réalisation. le peptide de transit peut être un signal d'adressa~~e '_'0 chloroplastique ou mitochondrial. lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes ou les mitochondries.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut ëtre un signal N-terminal ou « prépeptide », éventuellement en association avec un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, ou un peptide '_'~ d'adressage vacuolaire ou « propeptide ». Le réticulum endoplasmique est le lieu où sont pris en charge par ia « machinerie cellulaire » des opérations de maturation de la protéine produite, comme par exemple le clivage du peptide signal.
Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant. dans le 30 sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiaIe, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale.
puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour WO 99/02717 ~ PCT/FR98/01462 une enzyme à localisation piastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0 X08 909.
Comme peptide de transit utile selon 1"invention, on peut citer en particulier le peptide si~~nal du gène PR-la du tabac (WO 9/19443), ou encore l'ubiquitine représentée - fusionnée à la drosomicine par l'identiticateur de séquence n° 6.
Le peptide de fusion « ubiquitine-drosomicine » et sa séquence codante sont également partie de la présente invention. en particulier décrits par f'identificateur de séquence n° 5.
La présente invention concerne donc un gène chimère comprenant une séquence codante pour la drosomicine ainsi que des éléments de régulation en position ~' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans les plantes, la séquence codante comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour la drosomicine telle que définie ci-dessus.
La séquence d'ADN peut être obtenue selon les méthodes standards d'isolation et de purification à partir des drosophiles. ou encore par synthèse selon les techniques usuelles 1 ~ d'hybridations successives d'oligonucléotides synthétiques. Ces techniques sont notamment décrites par Ausubel cr al.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN codant pour la drosomicine comprend la séquence d'ADN décrite par les bases ? 1 à 1 ~? de l'identificateur de séquence n° 3 (SEQ ID NO 3), une séquence homologue ou _'0 complémentaire de ladite séquence.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention. la séquence d'ADN codant pour la drosomicine « full length » comprend la séquence d'ADN décrite par les bases 101 à
3I0 de l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID No I ), une séquence homologue ou complémentaire de ladite séquence.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN codant pour le peptide de fusion « peptide-héliomicine » comprend la séquence d'ADN
décrite par les bases I~ à 221 de l'identificateur de séquence n°5 (SEQ ID NO ~), une séquence homologue ou une séquence complémentaire des dites séquences.
Par « homologue ». on entend selon l'invention toute séquence d'ADN présentant 30 une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique décrite par les identificateurs de séquences n° I, 3 ou ~ et codant pour la drosomicine. la drosomicine « full length » ou le peptide de fusion « peptide-drosomicine ».
Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un mème acide aminé. les différences entre la séquence de référence décrite par les identificateurs de séquences n° 1. 3 ou J
et l'homologue correspondant peuvent être importantes, d'autant plus qu'il s'agit de fragments d'ADN de faible taille réalisables par synthèse chimique. De manière avantageuse, le degré
d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de la drosomicine ou du peptide de fusion résultants.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons. des parties de plantes. des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié
1 ~ capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones.
plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs. le blé, le colza. le soja, le riz, la canne à sucre.
la betterave, le tabac, le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence d'AD?~
?0 codant pour la drosomicine sont bien connus de l'homme du métier en fonction de la plante. Ils comprennent notamment des séquences promotrices. des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons stars et stop. LeS IlloyeilS
et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier.Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes. on peut 2~ utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne. virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylaseiowgénase (RuBisCO) ou d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou un promoteur inductible par les pathogènes comme le PR-ia du 30 tabac, tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à
une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène. tel que par exemple. celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 307 698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice. d'autres séquences de ré~~ulation, qui sont situées entre le promoteur - et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription i "enhancer"). comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington &
Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'~grobacterium tumefaciens. ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
La présente invention concerne également un vecteur d'intégration pour la transformation des plantes contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules 1 ~ végétales par intégration d'au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus.
transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les demandes citées dans la présente demande.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes '_'0 avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN.
Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium ra~mefàciens ou Ri d'Agrobacterium rhi~ogenes.
D'autres méthodes peuvent ëtre utilisées telles que la micro-injection ou i'électroporation.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de la plante. notamment de son caractère monocotylédone ou dicotylédone.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US
4,439,333, 30 US 4.336.473, US 5,464,763, US 3.177,010, US 5,187,073, EP 267,139. EP 604 662, EP
672 732, US 4,943,030, US 3.036.006, US 3.100,79?, US x,371,01-1. US 3.478,7:1-t, US
3,179,022, US 5,363,346, US 5,484,956, US 3.308,468, US x,538,877, US
3.334,798, US
672 732, US 4,943,030, US 3.036.006, US 3.100,79?, US x,371,01-1. US 3.478,7:1-t, US
3,179,022, US 5,363,346, US 5,484,956, US 3.308,468, US x,538,877, US
3.334,798, US
5,489,3'_'0. US 3,510,318, US 3.204,253, US 3.-105.763. EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP X39 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 9/06128.
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales. de plantes monocotylédones ou dicotylédones, notamment de cultures, transformées et contenant dans leur génome une quantité efficace d'un gène comprenant une séquence codante pour la drosomicine définie ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce. comme par exemple décrit dans les brevets et demandes ci-dessus.
La présente invention a également pour objet les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les gaines des plantes transformées.
Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en particulier à certaines maladies fongiques. De ce fait. la séquence d'ADN
codant pour 1 ~ la drosomicine peut ëtre intégré avec pour objectif principal la réalisation de plantes résistantes aux dites maladies, la drosomicine étant efficace contre des maladies fongiques telles que celles causées par Botrytis, en particulier Botrytis cinerea (mycélium ou spores), Cercospora, en particulier Cercospora beticolct.
Septoricr, en particulier Septoria tritici, ou Fusariztm, en particulier Fusarium ct~lmorzrm (mvcélium '0 ou spores) ou Fztscrriztm graminearztm.
Le gène chimëre pourra comprendre également et de manière avantageuse au moins un marqueur de sélection, tel qu'un ou plusieurs gènes de tolérance aw herbicides.
La séquence d'ADN codant pour la drosomicine peut également être intégrée comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres séquences 2~ codant pour d'autres peptides ou protéines d'intérêt, comme par exemple des gènes de tolérance aux herbicides.
De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de l'homme du métier et notamment décrits dans les demandes de brevet EP 11~ 673, WO 87,'04181, EP 337 899.
WO 96i38~67 ou WO 97/04103.
30 Bien entendu. les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre outre la séquence codant pour la drosomicine, d'autres séquences hétérologues codant pour des protéines d'intérêt comme d'autres peptides complémentaires susceptibles de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique. etiou d'autres séquences codant pour des protéines de tolérance aux herbicides et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de résistance aux insectes.
comme les protéines lit notamment.
Les autres séquences peuvent être intégrées au moyen du même vecteur comprenant un gène chimère, lequel comprend une première séquence codant pour la drosomicine et au moins une autre séquence codant pour un autre peptide ou protéine d'intérët.
Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant au moins la dite autre séquence, selon les techniques usuelles définies ci-dessus.
Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents. l'un portant le gène selon l'invention codant pour la drosomicine, l'autre portant un gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt.
La présente invention concerne enfin un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention, le procédé consistant à planter les graines des dites plantes 1 ~ transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à
appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
~0 Par composition agrochimique, on entend selon l'invention toute composition agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités suivantes, herbicide. fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide.
Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé de culture selon l'invention, la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une '_' ~ activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant une activité
complémentaire de celle de la drosomicine produite par les plantes transformées selon l' invention.
- Par produit présentant une activité complémentaire de celle de la drosomicine, on entend selon l'invention un produit présentant un spectre d'activité
complémentaire, c'est 30 à dire un produit qui sera actif contre des attaques de contaminants (champi~_nons, bactéries ou virus) insensibles à la drosomicine, ou encore un produit dont le spectre d'activité recouvre celui de la drosomicine, totalement ou en partie, et dont la dose d'application sera diminuée de manière substantielle du fait de la présence de la l0 drosomicine produite par la plante transformée.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention. fa préparation du ~,ène chimère. du vecteur d'intégration, des plantes transformées et leur résistance à
différentes maladies d'origine fongique. Les figures 1 à 7 en annexe décrivent les structures schématiques de certains plasmides préparés pour la construction des cènes chimères. Dans ces figures, les différents sites de restriction sont marqués en italiques.
Exemple 1: Construction des gènes chimères Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits dans Ausubel & colt.
pRPA-RD-180:
On insère un clone entier de l'ADNc codant pour la drosomicine décrit par Fehlbaum & colt (SEQ. ID N° 1) dans le plasmide pCR-1000 (INVITROGEN) comme 1 ~ fragment EcoRl Hindlll.
pRPA-RD-182: Création d'une région codant pour la drosomicine dite "longueur totale" (correspondant au peptide pre-pro) en éliminant la région non transcrite en ~' et en supprimant le premier codon ATG.
Le plasmide pRPA-RD-I80 est digéré avec ies enzymes de restriction Scal et ?0 EcoRl, et le grand fragment d'ADN est purifcé. Un oligonucléotide synthétique double brins de séquence Oligo 1 suivante est ensuite lié à la séquence d'ADN
purifiée dérivée de pRPA-RD-180:
Oligo l: S' AATTCCCGAAGACGACATGCAGATCAAGT 3' GGGCTTCTGCTGTACGTCTAGTTCA
pRPA-RD-183: Création d'une séquence codant pour la drosomicine mature gui ne comprend pas la région non transcrite en 3'.
30 Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oligo 2 et Oligo 3 ci-après sont hybridés à 6~°C pendant ~ minutes puis par diminution lente de la température à 30°C pendant 30'.
WO 99/02717 I.1 PCT/FR98/01462 Oli~;o ~: S ' GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GACTGCCTGT CCGGAAGATA
CAAGGGTCCC TGTGCCGTCT GGGACAACGA GACCTGTCGT
CGTGTGTGCA AGGAGGAGGG 3' 011go3: S' GCGCGCGGAT CCTTAGCATC CTTCGCACCA GCACTTCAGA
CTGGGGCTGC AGTGGCCACT GGAGCGTCCC TCCTCCTTGC
ACACACGACG 3' Après hybridation entre l'Oligo 2 et l'Oligo 3, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin. Cet oligonucléotide double brin est ensuite digéré par les enzymes de restriction Sacll et EcoRl et clonés dans le plasmide pBS II
SK(-) (Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction. On obtient alors un clone I ~ comprenant la région codant pour la drosomicine mature située entre les sites de restriction Sacll et BamHl {SEQ ID 3).
pRPA-RD-186: Élimination de la région 3' non transcrite de la région codant pour la drosomicine longueur totale de pRPA-RD-182.
Le plasmide pRPA-RD-182 est digéré avec les enzymes de restriction BspEl et ?0 h'pnL et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-183 est ensuite digéré avec les enzymes de restriction BspEl et Kpnl, et le petit fragment d'ADN est purifié. Ces deux fragments purifiés sont ensuites liés de manière à obtenir un plasmide contenant la région codant pour le peptide pre-pro de la drosomicine dont le premier codon ATG et les deux régions non codantes en 5' et 3' ont été
supprimées (SEQ ID ~).
pRPA-RD-187: Création d'un vecteur d'erpression dans les plantes comprenant la séquence codant pour la forme mature de la drosomicine.
Le plasmide pUGUS(118), dérivé du pUC-19, a été obtenu auprès du Dr.
Richard Vierstra de l'Université du Wisconsin (plasmide non décrit). Ce plasmide dont 30 la structure schématique est représentée sur la figure 1, contient le promoteur CaMV
3~S qui dirige l'expression d'un ARN contenant la séquence non traduite en ~' du virus de la mosaïque alfalfa {AMV ~' UTR; Brederode & coll., 1980), la région N-terminale du gène de l'ubiquitine ubqll d'Arabidopsis thaliana jusqu'au site de clivage de l'ubiquitine hydrolase (ubql l N-term; Callis & coll., 1993) laquelle est fusionnée dans WO 99/02717 I ' PCT/FR98/01462 le mème cadre de lecture avec le gène de la ~3-glucuronidase de E. coli (GUS;
Jefferson & coll.. 1987). suivi du site de polyadenvlation du gène de la nopaline svnthase d'.J;~rubucterium tunrcfcrciens (NUS polyA; Bevan & coll.. 19831.
Le plasmide pUGUS( 1 I 8) est digéré avec les enzymes de restriction Sacll et BarnHl et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-I83 est digéré
avec les enzymes de restriction Sacll et BamHl et le petit fragment d'ADN
contenant la région codante pour la forme mature de (a drosomicine est ensuite purifié.
Les deux fragments d'ADN purifiés sont liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétisent une protéine de fusion ubiquitine-drosomicine dans le cytoplasme des cellules végétales. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 2. Sous l'action de I'ubiquitine hydrolase sur cette protéine de fusion. la drosomicine mature est libérée dans le cytoplasme des cellules de la plante.
pRP.4-RD-188: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant I ~ la lonâueur totale de la séquence codant pour la drosomicine (pre-pro).
Le plasmide pRTL-? GUS, dérivé du plasmide pUC-I9, a été obtenu auprès du Dr. Jim Carrington (Texas A&M University. non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 3, contient le promoteur CaivIV 35S
dupliqué
isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Promoteur CaMV 2x3~S; Odell 8;
coll..
~'U 1980 qui dirige l'expression d'un ARN contenant séquence non traduite en ~' du virus etch du tabac (TEV ~' UTR; Carrington & Freed, 1990), le gène de la (3-glucuronidase de E. coli (GUS Jefferson & coll.. 1987) suivi du site de polyadenylation de TARN
35S de CaMV (CaMV polyA; Odell & coll.. i98~).
Le plasmide pRTL-2 GUS est digéré avec les enzymes de restriction ~Vcol et BamHl et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-186 est digéré
avec les enzymes de restriction Bbsll et BamHl et le petit fragment d'ADN
contenant la région codant pour la drosomicine pre-pro est purifié. Les deux fragments d'ADN
purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans Ies plantes qui synthétisent une protéine de drosomicine pre-pro. La structure schématique de cette 30 cassette d'expression est représentée sur la figure ~t. « pre-pro-drosomicine »représente la région codante pour la drosomicine de pRPA-RD-186. La drosomicine est transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action d'un peptide signal ( pre-pro ).
pRP.4-RD-19~: Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple modifié.
Le plasmide pRPA-RD-195 est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un site de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 4 et Oligo 5 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-RD-183.
Oligo4: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC
GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG
I 0 CATGC 3 ' OligoS: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT
GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3' 1 ~ L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite lié dans pUC-19 qui a été
préalablement digéré avec les enzymes de restriction EcoRl et HindIll et rendu bouts francs en employant le fragment klenow de l'ADN polymérase 1 de E. coli. On obtient un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction des cassettes d'expression dans un plasmide vecteur d'Agrobacreria~m tumefaciens.
La ~'0 structure schématique de ce site de clonage multiple est représentée sur la figure 5.
pRPA-RD-190: Introduction de la cassette d'expression de la drosomicine de pRP.~-RD-187 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-187 est digéré avec les enzymes de restriction Kpnl et Sall, et le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de la drosomicine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RD-195 qui a été
préalablement digéré avec les même enzymes de restriction.
pRPA-RD-191: Introduction de la cassette d'expression de la drosomicine de ;0 pRPA-RD-188 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-188 est digéré avec l'enzyme de restriction Hindlll et déphosphorylé avec de la phosphatase intestinale de veau. Le fragment d'ADN
contenant la cassette d'expression de la drosomicine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RP-195 qui a été préalablement digéré avec l'enzyme de WO 99/02717 1 ~ PCT/FR98/01462 restriction Hindlll.
I~RPA-RD-17:1: Plasmide dérivé de pRPA-BL-1~OA (EP 0 ~O8 909) contenant le gène dc tolérance au bromoxynil dc pRPA-BL-237 (EP 0 S08 909).
Le gène de toiérance au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est cloné dans le site EcoRl de pRPA-BL-1~OA qui a été rendu bouts francs par l'action de la polymérase klenow dans des conditions standard. On obtient un vecteur d'Agrobacterium tarmefaciens qui contient le gène de tolérance au bromoxynil à
proximité de sa bordure droite. un gène de tolérance à la kanamycine à
proximité de sa bordure gauche et le site de clonage multiple de pUC-19 entre ces deux gènes.
La structure schématique de pRPA-RD-17~ est représentée sur la figure 6. Sur cette figure, "nos" représente le site de polyadenylation de la nopaline synthase d'.~grobacrerium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NOS pro" représente le promoteur de la nopaline synthase d'.4grobacterium tzrmefaciens (Bevan &
coll., I~ 1983). "NPT II" représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du transposon Tn5 de E. coli (Rothstein & coll., 1981 j, "3~S pro" représente le promoteur 3~S isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Odell & coll., 1985), "BRX"
représente le gène de la nitrilase isolé de K. ozaenae (Stalker & coll., 1988). "RB" et "LB" représentent respectivement les bordures droite et gauche de la séquence d'un '_'0 plasmide Ti d'.Agrobacteriunr tumef~ciens.
~RPA-RD-18.x: Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA-RD-17-1.
Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 6 et Oligo 7 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-RD-183.
Oligo6: S' CGGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC
CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG
TACCTGGTTC AGG 3' Oligo7: 5' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA
CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT
30 GTGGCCTGAC TGG 3' L~oligonucléotide double brin hybridé (9~ paires de bases) est purifié après séparation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-17~
est digéré wec l'enzyme de restriction :¿mcrl, et le grand fragment d'ADN est purifié. Les WO 99/02717 1 ~ PCT/FR98/01462 dmx fragments d'ADN obtenus sont ensuite liés.
On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la kanamvcine marqueur de sélection.
s La strucure schématique du plasmide pRPA-RD-184 est représentée sur la figure 7 où les termes "nos", "NPT II", "NOS pro", "3~S pro", "BRX gene". "RB"
et "LB" ont la même signification que pour la figure 6.
pRPA-RD-192: Création d'un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la construction du gène codant pour la drosomicine dirigée vers le cytosol des cellules.
Le plasmide pRPA-RD-190 est digéré avec les enzymes de restriction Apal et .~scl. et le ti-agment d'ADN contenant la cassette d'expression de la drosomicine est purifié. Le fragment d'ADN purifié contenant la cassette d'expression de la drosomicine est lié dans pRPA-RD-184, après digestion préalable avec les même deux 1 ~ enzymes. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacteriz~m tumefaciens contenant la séquence codant pour la protéine de fusion drosomicine-ubiquitine qui conduit à
l'expression de la drosomicine dans ie cytosol des cellules de la plante.
pRPa-RD-193: Création d'un vecteur d'Agrobacterium tttntefaciens contenant la construction du gène codant pour la drosomicine dirigée vers la matrice '_'0 ertracellulaire.
On reprend le mode opératoire décrit ci-dessus avec le plasmide pRPA-RD-191 et les enzymes de restriction Pmel et Ascl, remplaçant le plasmide pRPA-RD-190 et les enzymes de restriction Apal et Ascl. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterium runrefaciens contenant la séquence codant pour ia protéine pre-pro de la drosomicine qui conduit à l'expression de la drosomicine dans la matrice extracellulaire de la plante.
Exemnle 2: Tolérance aux herbicides des tabacs transformés.
- 2.1- Transformation Les vecteurs pRPA-RD-192 and pRPA-RD-193 sont introduit dans la souche 30 d'.~ «robacterizrm tzzmefaciens EHA 1 O l (Hood & coll.. 1987) porteuse du cosmide pTVK?91 (Komari & coli., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh & colt. (1980.
2-2- Régénération La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants foliaires zst réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30 g/1 de saccharose ainsi que ?00 ugiml de kanamycine. Les expiants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et transformées selon la technique des disques foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/1 de saccharose contenant 0.05 mg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 1 ~ jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS
additionné de 30 g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à
teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 1 ~
jours. les pousses enracinées sont passées en terre.
1 ~ 2-3- Tolérance au bromoxvnil Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour chaque construction pRPA-RD-19? et pRPA-RD-193. Ces plantes ont été traitées en serre au stade ~ feuilles avec une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,? kg de matière active bromoxvnil par hectare.
~0 Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont employées dans les expérimentations suivantes pour tester les effets de l'expression de la drosomicine sur la tolérance des plantes transformées aux agressions fongiques.
Exemple 3: Détection de la drosomicine dans les tabacs transformés Une analyse immunoblot (telle que décrites par Coligan & coll.) est employée pour détecter la drosomicine produite par les tabacs transformés. en employant un anticorps de lapin dirigé contre la drosomicine synthétique fixée sur une protéine porteuse KLH, avec la drosomicine synthétique comme antigène.
Les protéines de feuilles sont extraites d'abord par broyage des tissus congelés 30 à -180°C. suivi par l'addition d'un tampon d'extraction (urée 8 M, tris HC1 pH 6,8 ~0 ml~f. SDS ? %, (3-mercaptoéthanol ~ %, saccharose 10 %. EDTA 2 mM et dithiothreitol l0 mM). La quantité totale de protéines extractables est ensuite mesurée.
100 pg de protéines extraites sont ensuite char«ées dans des puits de bel SDS-PAGE
_ _ _ __.__._ . _ _ _ ______ _.
WO 99/02717 1 ~ PCT/FR98/01462 (20 % acrylamide) pour une analyse immunoblot (selon Coligan & colt.).
Pour les plantes transformées avec le plasmide pRPA-RD-193 (drosomicine pre-pro), on a trouvé jusqu'à 160 ng de drosomicine pour 100 u~_ du total de protéines extraites des feuilles.
Pour les plantes transformées avec le plasmide pRPA-RD-192 (drosomicine mature), on a trouvé jusqu'à 50 ng de drosomicine pour 100 pg du total de protéines extraites des feuilles.
La drosomicine synthétisée et isolée dans les plantes transformées avec les plasmides pRPA-RD-192 et pRPA-RD-193 co-migre avec la drosomicine isolée des drosophiles. Ce résultat montrent que chacune des drosomicines dirigée soit vers le cytoplasme (pRPA-RD-192) soit vers la matrice extracellulaire (pRPA-. RD-193) conduisent à une drosomicine mature. En outre, Ie système de gel employé dans cet analyse (20 % acrylamide) aurait permis de détecter aisément de la drosomicine qui n'aurait pas été transformée puisque les deux constructions (ubiquitine-drosomicine et 1 ~ drosomicine pre-pro) font approximativement 10 kD, contre ~ kD pour la drosomicine mature.
Exem~ale -t: Résistance au Botrytis cinerea des tabacs transformés.
l~/?0 plantes issues des plantes obtenues à l'exemple 2.3. sont cultivées en serre dans des pots de repiquage de 7 cm de côté dans les conditions suivantes:
- température: 16° C durant la nuit: 19° C durant le jour:
- photopériode: 14 h de nuit; 10 h de jour, - hygrométrie: 90-1400 Deux feuilles par plantes sont innoculées avec 6 disques de 6 mm de diamètre par feuille. chaque disque étant constitué d'une suspension de Botyvtis cinerea ( 100 000 spores/ml). L'évolution de l'infection est observée 7 jours après l'innoculation en mesurant l'augmentation du diamètre de chaque disque.
Pour l'essentiel des plantes transformées par le plasmide pRPA-RD-192 (protéine mature dans le cytoplasme) ou par le plasmide pRPA-RD-193 (drosomicine extra-cellulaire), on observe une absence d'augmentation des diamètres des disques.
ou une augmentation très minime, ce qui indique une forte résistance aux infections causées par Botritis cinerea.
Exemple ~: Résistance à Chalara elegans des tabacs transformés.
On reprend le mode opératoire précédent avec les conditions opératoires smvantes:
- température: 18° C durant la nuit; 22° C durant le jour:
- photopériode: 14 h de nuit; 10 h de jour.
L'innoculation est effectuée 18 jours après le semis par apport dans chaque pot de 1 ml d'une suspension d'endoconidies à 1 000 000 conidies/ml. La lecture des résultats de l'infection est effectuée 21 jours après l'innoculation en observant les racines des plantules préalablement nettoyées à l'eau. L'évolution de Ia maladie est appréciée par une échelle de notation de 0 à 1 I , 0 correspodant à une absence d'infection. Pour les plantes transformées par le plasmide pRPA-RD-192 (protéine mature dans le cytoplasme) et celles transformées par le plasmide pRPA-RD-193 (drosomicine extra-cellulaire). la notation moyenne est de 4, ce qui correspond à une forte résistance à Chalara elegans.
1~
Les résultats obtenus in vivo dans les exemples 4 et ~ montrent que la transformation par le gène chimère selon l'invention confère à la plante transformée de nouvelles propriétés de résistance aux champignons. activité est liée à la conservation des propriétés antifon5iques de la drosomicine produite par les plantes transformées '_'0 selon l'invention.
REFERENCES
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30 Coligan. J.E. & coil. (ed. V.B. Chanda). Current Protocois in Protein Science. Publ.
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Komari & col!. {1986). J. Bacteriol. 166:88-94.
Rothstein & col!. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. -1~: 99-10~.
Stalker & colt. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.
~ Odell, J.T. & col!. (1985). Nature 313:810-812.
WO 99/02717 1 °~'T/FR98/01462 LISTE DE SÉQUENCES
(1) INFORMATION GÉNÉRALE:
(i) DÉPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC AGROCHIMIE
(B) RUE: 14/20 Rue Pierre BAIZET
(C) VILLE: Lyon (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 69009 (ii) TITRE DE L'INVENTION: Gène chimère codant pour la drosomicine, vecteur le contenant pour la transformation des cellules végétales et plantes transformées obtenues résistantes aux maladies (iii) NOMBRE DE SÉQUENCES: 14 (iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:1:
(i) CARACTERISTTQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 488 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISMEE: Drosophila melanogaster (vii) SOURCE IMMÉDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-180 (ix) CARACTÉRISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 101..310 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:1:
Met Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys ACATTAAAAA AAAAAAAAAA P~~AAAAAAAA AAAAAAAGGG CGGCCGCGAC CTGCAGGCAT 480 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:2:
(i) CHARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 70 acides aminés (B) TYPE: acides aminés (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:2:
Met Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:3:
(i) CHARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 167 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) (vi) SOURCE D~ORIGINE:
(A) ORGANISME: SynThetique (vii) SOURCE IMMÉDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-183 (ix) CARACTÉRISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 21..152 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:3:
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro TGT GCC GTC TGG GAC AAC GAG ACC TGT CGT CGT GTG TGC AAG GAG GAG 9g Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu GGA TGC TAAGGATCCG CGCGC
Gly Cys (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:4:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:4:
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 236 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE HRINS: double FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: Synthetique (vii) SOURCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-186 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 15..221 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: NO:S:
SEQ ID
CGCC ATG CTC
CAG ATC
AAG TAC
TTG TTC
Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Phe Ala Val Leu GAG GCC GCC
Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala Asn Asp Asp Cys Leu Glu Ala Ala GTC TGG AAC
Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Asp Glu Thr Cys Val Trp Asn TCC AGT CAC
Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Gly Cys Ser Pro Ser Ser His TAAGGATCCG CGCGC
Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 69 acides amins (B) TYPE: acide amin (D) CONFIGURATION: linaire () TYPE DE MOLCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SQUENCE: D N0:6:
SEQ I
Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Val Met Leu Val Phe Ala Leu Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys FEUILLE DE R~~p~qGEMENT (RÉGLÉ 26) Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:7:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:8:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 100 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE; SEQ ID N0:9:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 100 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
WO 99/02717 b PCT/FR98/01462 (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 3 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:10:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 85 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADN
(vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: Oligonucléotide Synthétique 4 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:11:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:12:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:12:
TAGAGG
' 66 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:13:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases (81 TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECLJLE: ADN Oligonucléotide Synthétique 6 FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) WO 99/02717 ~ PCT/FR98/01462 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:13:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
fA) LONGUEUR: 93 paires de bases (B) TYPE: acide nuclêique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 7 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:14:
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales. de plantes monocotylédones ou dicotylédones, notamment de cultures, transformées et contenant dans leur génome une quantité efficace d'un gène comprenant une séquence codante pour la drosomicine définie ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce. comme par exemple décrit dans les brevets et demandes ci-dessus.
La présente invention a également pour objet les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les gaines des plantes transformées.
Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en particulier à certaines maladies fongiques. De ce fait. la séquence d'ADN
codant pour 1 ~ la drosomicine peut ëtre intégré avec pour objectif principal la réalisation de plantes résistantes aux dites maladies, la drosomicine étant efficace contre des maladies fongiques telles que celles causées par Botrytis, en particulier Botrytis cinerea (mycélium ou spores), Cercospora, en particulier Cercospora beticolct.
Septoricr, en particulier Septoria tritici, ou Fusariztm, en particulier Fusarium ct~lmorzrm (mvcélium '0 ou spores) ou Fztscrriztm graminearztm.
Le gène chimëre pourra comprendre également et de manière avantageuse au moins un marqueur de sélection, tel qu'un ou plusieurs gènes de tolérance aw herbicides.
La séquence d'ADN codant pour la drosomicine peut également être intégrée comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres séquences 2~ codant pour d'autres peptides ou protéines d'intérêt, comme par exemple des gènes de tolérance aux herbicides.
De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de l'homme du métier et notamment décrits dans les demandes de brevet EP 11~ 673, WO 87,'04181, EP 337 899.
WO 96i38~67 ou WO 97/04103.
30 Bien entendu. les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre outre la séquence codant pour la drosomicine, d'autres séquences hétérologues codant pour des protéines d'intérêt comme d'autres peptides complémentaires susceptibles de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique. etiou d'autres séquences codant pour des protéines de tolérance aux herbicides et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de résistance aux insectes.
comme les protéines lit notamment.
Les autres séquences peuvent être intégrées au moyen du même vecteur comprenant un gène chimère, lequel comprend une première séquence codant pour la drosomicine et au moins une autre séquence codant pour un autre peptide ou protéine d'intérët.
Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant au moins la dite autre séquence, selon les techniques usuelles définies ci-dessus.
Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents. l'un portant le gène selon l'invention codant pour la drosomicine, l'autre portant un gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt.
La présente invention concerne enfin un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention, le procédé consistant à planter les graines des dites plantes 1 ~ transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à
appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
~0 Par composition agrochimique, on entend selon l'invention toute composition agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités suivantes, herbicide. fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide.
Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé de culture selon l'invention, la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une '_' ~ activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant une activité
complémentaire de celle de la drosomicine produite par les plantes transformées selon l' invention.
- Par produit présentant une activité complémentaire de celle de la drosomicine, on entend selon l'invention un produit présentant un spectre d'activité
complémentaire, c'est 30 à dire un produit qui sera actif contre des attaques de contaminants (champi~_nons, bactéries ou virus) insensibles à la drosomicine, ou encore un produit dont le spectre d'activité recouvre celui de la drosomicine, totalement ou en partie, et dont la dose d'application sera diminuée de manière substantielle du fait de la présence de la l0 drosomicine produite par la plante transformée.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention. fa préparation du ~,ène chimère. du vecteur d'intégration, des plantes transformées et leur résistance à
différentes maladies d'origine fongique. Les figures 1 à 7 en annexe décrivent les structures schématiques de certains plasmides préparés pour la construction des cènes chimères. Dans ces figures, les différents sites de restriction sont marqués en italiques.
Exemple 1: Construction des gènes chimères Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits dans Ausubel & colt.
pRPA-RD-180:
On insère un clone entier de l'ADNc codant pour la drosomicine décrit par Fehlbaum & colt (SEQ. ID N° 1) dans le plasmide pCR-1000 (INVITROGEN) comme 1 ~ fragment EcoRl Hindlll.
pRPA-RD-182: Création d'une région codant pour la drosomicine dite "longueur totale" (correspondant au peptide pre-pro) en éliminant la région non transcrite en ~' et en supprimant le premier codon ATG.
Le plasmide pRPA-RD-I80 est digéré avec ies enzymes de restriction Scal et ?0 EcoRl, et le grand fragment d'ADN est purifcé. Un oligonucléotide synthétique double brins de séquence Oligo 1 suivante est ensuite lié à la séquence d'ADN
purifiée dérivée de pRPA-RD-180:
Oligo l: S' AATTCCCGAAGACGACATGCAGATCAAGT 3' GGGCTTCTGCTGTACGTCTAGTTCA
pRPA-RD-183: Création d'une séquence codant pour la drosomicine mature gui ne comprend pas la région non transcrite en 3'.
30 Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oligo 2 et Oligo 3 ci-après sont hybridés à 6~°C pendant ~ minutes puis par diminution lente de la température à 30°C pendant 30'.
WO 99/02717 I.1 PCT/FR98/01462 Oli~;o ~: S ' GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GACTGCCTGT CCGGAAGATA
CAAGGGTCCC TGTGCCGTCT GGGACAACGA GACCTGTCGT
CGTGTGTGCA AGGAGGAGGG 3' 011go3: S' GCGCGCGGAT CCTTAGCATC CTTCGCACCA GCACTTCAGA
CTGGGGCTGC AGTGGCCACT GGAGCGTCCC TCCTCCTTGC
ACACACGACG 3' Après hybridation entre l'Oligo 2 et l'Oligo 3, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin. Cet oligonucléotide double brin est ensuite digéré par les enzymes de restriction Sacll et EcoRl et clonés dans le plasmide pBS II
SK(-) (Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction. On obtient alors un clone I ~ comprenant la région codant pour la drosomicine mature située entre les sites de restriction Sacll et BamHl {SEQ ID 3).
pRPA-RD-186: Élimination de la région 3' non transcrite de la région codant pour la drosomicine longueur totale de pRPA-RD-182.
Le plasmide pRPA-RD-182 est digéré avec les enzymes de restriction BspEl et ?0 h'pnL et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-183 est ensuite digéré avec les enzymes de restriction BspEl et Kpnl, et le petit fragment d'ADN est purifié. Ces deux fragments purifiés sont ensuites liés de manière à obtenir un plasmide contenant la région codant pour le peptide pre-pro de la drosomicine dont le premier codon ATG et les deux régions non codantes en 5' et 3' ont été
supprimées (SEQ ID ~).
pRPA-RD-187: Création d'un vecteur d'erpression dans les plantes comprenant la séquence codant pour la forme mature de la drosomicine.
Le plasmide pUGUS(118), dérivé du pUC-19, a été obtenu auprès du Dr.
Richard Vierstra de l'Université du Wisconsin (plasmide non décrit). Ce plasmide dont 30 la structure schématique est représentée sur la figure 1, contient le promoteur CaMV
3~S qui dirige l'expression d'un ARN contenant la séquence non traduite en ~' du virus de la mosaïque alfalfa {AMV ~' UTR; Brederode & coll., 1980), la région N-terminale du gène de l'ubiquitine ubqll d'Arabidopsis thaliana jusqu'au site de clivage de l'ubiquitine hydrolase (ubql l N-term; Callis & coll., 1993) laquelle est fusionnée dans WO 99/02717 I ' PCT/FR98/01462 le mème cadre de lecture avec le gène de la ~3-glucuronidase de E. coli (GUS;
Jefferson & coll.. 1987). suivi du site de polyadenvlation du gène de la nopaline svnthase d'.J;~rubucterium tunrcfcrciens (NUS polyA; Bevan & coll.. 19831.
Le plasmide pUGUS( 1 I 8) est digéré avec les enzymes de restriction Sacll et BarnHl et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-I83 est digéré
avec les enzymes de restriction Sacll et BamHl et le petit fragment d'ADN
contenant la région codante pour la forme mature de (a drosomicine est ensuite purifié.
Les deux fragments d'ADN purifiés sont liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétisent une protéine de fusion ubiquitine-drosomicine dans le cytoplasme des cellules végétales. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 2. Sous l'action de I'ubiquitine hydrolase sur cette protéine de fusion. la drosomicine mature est libérée dans le cytoplasme des cellules de la plante.
pRP.4-RD-188: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant I ~ la lonâueur totale de la séquence codant pour la drosomicine (pre-pro).
Le plasmide pRTL-? GUS, dérivé du plasmide pUC-I9, a été obtenu auprès du Dr. Jim Carrington (Texas A&M University. non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 3, contient le promoteur CaivIV 35S
dupliqué
isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Promoteur CaMV 2x3~S; Odell 8;
coll..
~'U 1980 qui dirige l'expression d'un ARN contenant séquence non traduite en ~' du virus etch du tabac (TEV ~' UTR; Carrington & Freed, 1990), le gène de la (3-glucuronidase de E. coli (GUS Jefferson & coll.. 1987) suivi du site de polyadenylation de TARN
35S de CaMV (CaMV polyA; Odell & coll.. i98~).
Le plasmide pRTL-2 GUS est digéré avec les enzymes de restriction ~Vcol et BamHl et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-186 est digéré
avec les enzymes de restriction Bbsll et BamHl et le petit fragment d'ADN
contenant la région codant pour la drosomicine pre-pro est purifié. Les deux fragments d'ADN
purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans Ies plantes qui synthétisent une protéine de drosomicine pre-pro. La structure schématique de cette 30 cassette d'expression est représentée sur la figure ~t. « pre-pro-drosomicine »représente la région codante pour la drosomicine de pRPA-RD-186. La drosomicine est transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action d'un peptide signal ( pre-pro ).
pRP.4-RD-19~: Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple modifié.
Le plasmide pRPA-RD-195 est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un site de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 4 et Oligo 5 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-RD-183.
Oligo4: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC
GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG
I 0 CATGC 3 ' OligoS: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT
GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3' 1 ~ L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite lié dans pUC-19 qui a été
préalablement digéré avec les enzymes de restriction EcoRl et HindIll et rendu bouts francs en employant le fragment klenow de l'ADN polymérase 1 de E. coli. On obtient un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction des cassettes d'expression dans un plasmide vecteur d'Agrobacreria~m tumefaciens.
La ~'0 structure schématique de ce site de clonage multiple est représentée sur la figure 5.
pRPA-RD-190: Introduction de la cassette d'expression de la drosomicine de pRP.~-RD-187 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-187 est digéré avec les enzymes de restriction Kpnl et Sall, et le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de la drosomicine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RD-195 qui a été
préalablement digéré avec les même enzymes de restriction.
pRPA-RD-191: Introduction de la cassette d'expression de la drosomicine de ;0 pRPA-RD-188 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-188 est digéré avec l'enzyme de restriction Hindlll et déphosphorylé avec de la phosphatase intestinale de veau. Le fragment d'ADN
contenant la cassette d'expression de la drosomicine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RP-195 qui a été préalablement digéré avec l'enzyme de WO 99/02717 1 ~ PCT/FR98/01462 restriction Hindlll.
I~RPA-RD-17:1: Plasmide dérivé de pRPA-BL-1~OA (EP 0 ~O8 909) contenant le gène dc tolérance au bromoxynil dc pRPA-BL-237 (EP 0 S08 909).
Le gène de toiérance au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est cloné dans le site EcoRl de pRPA-BL-1~OA qui a été rendu bouts francs par l'action de la polymérase klenow dans des conditions standard. On obtient un vecteur d'Agrobacterium tarmefaciens qui contient le gène de tolérance au bromoxynil à
proximité de sa bordure droite. un gène de tolérance à la kanamycine à
proximité de sa bordure gauche et le site de clonage multiple de pUC-19 entre ces deux gènes.
La structure schématique de pRPA-RD-17~ est représentée sur la figure 6. Sur cette figure, "nos" représente le site de polyadenylation de la nopaline synthase d'.~grobacrerium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NOS pro" représente le promoteur de la nopaline synthase d'.4grobacterium tzrmefaciens (Bevan &
coll., I~ 1983). "NPT II" représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du transposon Tn5 de E. coli (Rothstein & coll., 1981 j, "3~S pro" représente le promoteur 3~S isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Odell & coll., 1985), "BRX"
représente le gène de la nitrilase isolé de K. ozaenae (Stalker & coll., 1988). "RB" et "LB" représentent respectivement les bordures droite et gauche de la séquence d'un '_'0 plasmide Ti d'.Agrobacteriunr tumef~ciens.
~RPA-RD-18.x: Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA-RD-17-1.
Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 6 et Oligo 7 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-RD-183.
Oligo6: S' CGGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC
CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG
TACCTGGTTC AGG 3' Oligo7: 5' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA
CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT
30 GTGGCCTGAC TGG 3' L~oligonucléotide double brin hybridé (9~ paires de bases) est purifié après séparation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-17~
est digéré wec l'enzyme de restriction :¿mcrl, et le grand fragment d'ADN est purifié. Les WO 99/02717 1 ~ PCT/FR98/01462 dmx fragments d'ADN obtenus sont ensuite liés.
On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la kanamvcine marqueur de sélection.
s La strucure schématique du plasmide pRPA-RD-184 est représentée sur la figure 7 où les termes "nos", "NPT II", "NOS pro", "3~S pro", "BRX gene". "RB"
et "LB" ont la même signification que pour la figure 6.
pRPA-RD-192: Création d'un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la construction du gène codant pour la drosomicine dirigée vers le cytosol des cellules.
Le plasmide pRPA-RD-190 est digéré avec les enzymes de restriction Apal et .~scl. et le ti-agment d'ADN contenant la cassette d'expression de la drosomicine est purifié. Le fragment d'ADN purifié contenant la cassette d'expression de la drosomicine est lié dans pRPA-RD-184, après digestion préalable avec les même deux 1 ~ enzymes. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacteriz~m tumefaciens contenant la séquence codant pour la protéine de fusion drosomicine-ubiquitine qui conduit à
l'expression de la drosomicine dans ie cytosol des cellules de la plante.
pRPa-RD-193: Création d'un vecteur d'Agrobacterium tttntefaciens contenant la construction du gène codant pour la drosomicine dirigée vers la matrice '_'0 ertracellulaire.
On reprend le mode opératoire décrit ci-dessus avec le plasmide pRPA-RD-191 et les enzymes de restriction Pmel et Ascl, remplaçant le plasmide pRPA-RD-190 et les enzymes de restriction Apal et Ascl. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterium runrefaciens contenant la séquence codant pour ia protéine pre-pro de la drosomicine qui conduit à l'expression de la drosomicine dans la matrice extracellulaire de la plante.
Exemnle 2: Tolérance aux herbicides des tabacs transformés.
- 2.1- Transformation Les vecteurs pRPA-RD-192 and pRPA-RD-193 sont introduit dans la souche 30 d'.~ «robacterizrm tzzmefaciens EHA 1 O l (Hood & coll.. 1987) porteuse du cosmide pTVK?91 (Komari & coli., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh & colt. (1980.
2-2- Régénération La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants foliaires zst réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30 g/1 de saccharose ainsi que ?00 ugiml de kanamycine. Les expiants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et transformées selon la technique des disques foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/1 de saccharose contenant 0.05 mg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 1 ~ jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS
additionné de 30 g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à
teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 1 ~
jours. les pousses enracinées sont passées en terre.
1 ~ 2-3- Tolérance au bromoxvnil Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour chaque construction pRPA-RD-19? et pRPA-RD-193. Ces plantes ont été traitées en serre au stade ~ feuilles avec une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,? kg de matière active bromoxvnil par hectare.
~0 Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont employées dans les expérimentations suivantes pour tester les effets de l'expression de la drosomicine sur la tolérance des plantes transformées aux agressions fongiques.
Exemple 3: Détection de la drosomicine dans les tabacs transformés Une analyse immunoblot (telle que décrites par Coligan & coll.) est employée pour détecter la drosomicine produite par les tabacs transformés. en employant un anticorps de lapin dirigé contre la drosomicine synthétique fixée sur une protéine porteuse KLH, avec la drosomicine synthétique comme antigène.
Les protéines de feuilles sont extraites d'abord par broyage des tissus congelés 30 à -180°C. suivi par l'addition d'un tampon d'extraction (urée 8 M, tris HC1 pH 6,8 ~0 ml~f. SDS ? %, (3-mercaptoéthanol ~ %, saccharose 10 %. EDTA 2 mM et dithiothreitol l0 mM). La quantité totale de protéines extractables est ensuite mesurée.
100 pg de protéines extraites sont ensuite char«ées dans des puits de bel SDS-PAGE
_ _ _ __.__._ . _ _ _ ______ _.
WO 99/02717 1 ~ PCT/FR98/01462 (20 % acrylamide) pour une analyse immunoblot (selon Coligan & colt.).
Pour les plantes transformées avec le plasmide pRPA-RD-193 (drosomicine pre-pro), on a trouvé jusqu'à 160 ng de drosomicine pour 100 u~_ du total de protéines extraites des feuilles.
Pour les plantes transformées avec le plasmide pRPA-RD-192 (drosomicine mature), on a trouvé jusqu'à 50 ng de drosomicine pour 100 pg du total de protéines extraites des feuilles.
La drosomicine synthétisée et isolée dans les plantes transformées avec les plasmides pRPA-RD-192 et pRPA-RD-193 co-migre avec la drosomicine isolée des drosophiles. Ce résultat montrent que chacune des drosomicines dirigée soit vers le cytoplasme (pRPA-RD-192) soit vers la matrice extracellulaire (pRPA-. RD-193) conduisent à une drosomicine mature. En outre, Ie système de gel employé dans cet analyse (20 % acrylamide) aurait permis de détecter aisément de la drosomicine qui n'aurait pas été transformée puisque les deux constructions (ubiquitine-drosomicine et 1 ~ drosomicine pre-pro) font approximativement 10 kD, contre ~ kD pour la drosomicine mature.
Exem~ale -t: Résistance au Botrytis cinerea des tabacs transformés.
l~/?0 plantes issues des plantes obtenues à l'exemple 2.3. sont cultivées en serre dans des pots de repiquage de 7 cm de côté dans les conditions suivantes:
- température: 16° C durant la nuit: 19° C durant le jour:
- photopériode: 14 h de nuit; 10 h de jour, - hygrométrie: 90-1400 Deux feuilles par plantes sont innoculées avec 6 disques de 6 mm de diamètre par feuille. chaque disque étant constitué d'une suspension de Botyvtis cinerea ( 100 000 spores/ml). L'évolution de l'infection est observée 7 jours après l'innoculation en mesurant l'augmentation du diamètre de chaque disque.
Pour l'essentiel des plantes transformées par le plasmide pRPA-RD-192 (protéine mature dans le cytoplasme) ou par le plasmide pRPA-RD-193 (drosomicine extra-cellulaire), on observe une absence d'augmentation des diamètres des disques.
ou une augmentation très minime, ce qui indique une forte résistance aux infections causées par Botritis cinerea.
Exemple ~: Résistance à Chalara elegans des tabacs transformés.
On reprend le mode opératoire précédent avec les conditions opératoires smvantes:
- température: 18° C durant la nuit; 22° C durant le jour:
- photopériode: 14 h de nuit; 10 h de jour.
L'innoculation est effectuée 18 jours après le semis par apport dans chaque pot de 1 ml d'une suspension d'endoconidies à 1 000 000 conidies/ml. La lecture des résultats de l'infection est effectuée 21 jours après l'innoculation en observant les racines des plantules préalablement nettoyées à l'eau. L'évolution de Ia maladie est appréciée par une échelle de notation de 0 à 1 I , 0 correspodant à une absence d'infection. Pour les plantes transformées par le plasmide pRPA-RD-192 (protéine mature dans le cytoplasme) et celles transformées par le plasmide pRPA-RD-193 (drosomicine extra-cellulaire). la notation moyenne est de 4, ce qui correspond à une forte résistance à Chalara elegans.
1~
Les résultats obtenus in vivo dans les exemples 4 et ~ montrent que la transformation par le gène chimère selon l'invention confère à la plante transformée de nouvelles propriétés de résistance aux champignons. activité est liée à la conservation des propriétés antifon5iques de la drosomicine produite par les plantes transformées '_'0 selon l'invention.
REFERENCES
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Publ.
Wilev & Sons.
Bevan. M. & colt. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385.
Brederode. F.T.M. & coll. ( 1980). Nuc. Acids Res. 8:2213-2223.
Callis & roll. (1993). Plant Mol. Biol. 21:895-906.
Carrineton and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597.
30 Coligan. J.E. & coil. (ed. V.B. Chanda). Current Protocois in Protein Science. Publ.
Wilev & Sons.
Fehlbaum & colt. (1994). J. Biol. Chem 269: 331459-33163.
Horsch c~; coll. (1980. Science 227:1229-1231.
WO 99!02717 1.9 PCT/FR98/01462 Jefferson & colt. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.
Komari & col!. {1986). J. Bacteriol. 166:88-94.
Rothstein & col!. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. -1~: 99-10~.
Stalker & colt. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.
~ Odell, J.T. & col!. (1985). Nature 313:810-812.
WO 99/02717 1 °~'T/FR98/01462 LISTE DE SÉQUENCES
(1) INFORMATION GÉNÉRALE:
(i) DÉPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC AGROCHIMIE
(B) RUE: 14/20 Rue Pierre BAIZET
(C) VILLE: Lyon (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 69009 (ii) TITRE DE L'INVENTION: Gène chimère codant pour la drosomicine, vecteur le contenant pour la transformation des cellules végétales et plantes transformées obtenues résistantes aux maladies (iii) NOMBRE DE SÉQUENCES: 14 (iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:1:
(i) CARACTERISTTQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 488 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISMEE: Drosophila melanogaster (vii) SOURCE IMMÉDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-180 (ix) CARACTÉRISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 101..310 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:1:
Met Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys ACATTAAAAA AAAAAAAAAA P~~AAAAAAAA AAAAAAAGGG CGGCCGCGAC CTGCAGGCAT 480 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:2:
(i) CHARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 70 acides aminés (B) TYPE: acides aminés (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:2:
Met Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:3:
(i) CHARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 167 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) (vi) SOURCE D~ORIGINE:
(A) ORGANISME: SynThetique (vii) SOURCE IMMÉDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-183 (ix) CARACTÉRISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 21..152 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:3:
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro TGT GCC GTC TGG GAC AAC GAG ACC TGT CGT CGT GTG TGC AAG GAG GAG 9g Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu GGA TGC TAAGGATCCG CGCGC
Gly Cys (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:4:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:4:
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 236 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE HRINS: double FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: Synthetique (vii) SOURCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-186 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 15..221 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: NO:S:
SEQ ID
CGCC ATG CTC
CAG ATC
AAG TAC
TTG TTC
Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Phe Ala Val Leu GAG GCC GCC
Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala Asn Asp Asp Cys Leu Glu Ala Ala GTC TGG AAC
Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Asp Glu Thr Cys Val Trp Asn TCC AGT CAC
Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Gly Cys Ser Pro Ser Ser His TAAGGATCCG CGCGC
Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 69 acides amins (B) TYPE: acide amin (D) CONFIGURATION: linaire () TYPE DE MOLCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SQUENCE: D N0:6:
SEQ I
Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Val Met Leu Val Phe Ala Leu Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys FEUILLE DE R~~p~qGEMENT (RÉGLÉ 26) Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:7:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:8:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 100 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE; SEQ ID N0:9:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 100 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
WO 99/02717 b PCT/FR98/01462 (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 3 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:10:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 85 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADN
(vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: Oligonucléotide Synthétique 4 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:11:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:12:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:12:
TAGAGG
' 66 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:13:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases (81 TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECLJLE: ADN Oligonucléotide Synthétique 6 FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) WO 99/02717 ~ PCT/FR98/01462 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:13:
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
fA) LONGUEUR: 93 paires de bases (B) TYPE: acide nuclêique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 7 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:14:
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
Claims (33)
1. Gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans une plante, caractérisé en ce que la séquence codante comprend au moins une séquence d'ADN
codant pour la drosomicine.
codant pour la drosomicine.
2. Gène chimère selon la revendication 1, caractérisée en ce que la drosomicine comprend essentiellement la séquence peptidique de formule (I) ci-dessous Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag-Cys-Xah-Cys (I) dans laquelle Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, Xab représente un reste peptidique de 8 acides aminés, Xac représente un reste peptidique de 7 acides aminés, Xad représente unreste peptidique de 3 acides aminés, Xae représente un reste peptidique de 9 acides aminés, Xaf représente un reste peptidique de 5 acides aminés, Xag représente un reste peptidique d'un acide aminé, et Xah représente un reste peptidique de 2 acides aminés.
3. Gène chimère selon la revendication 2, caractérisé en ce que Xab et/ou Xad et/ou Xac comprenent au moins un acide aminé basique.
4. Gène chimère selon la revdication 3, caractérisé en ce que Xab comprend au moins 2 acides aminés basiques. de préférence 2 et/ou Xad et/ou Xaf comprenent au moins 1 acide aminé basique, de préférence 1.
5. Gène chimère selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que Xaa représente la séquence peptidique Xaa'-Asp- dans laquelle Xaa' représente ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé. rt/ou Xab représente la séquence peptidique -Leu-Xab'-Pro- dans laquelle Xab' représente un reste peptidique de 6 acides aminés, et/ou Xac représente la séquence peptidique -Ala-Xac'-Thr- dans laquelle Xac' représente un reste peptidique des acides aminés, et/ou Xad représente la séquence peptidique -Arg-Xad'-Val, dans laquelle Xad' représente un reste peptidique d'un acide aminé, et/ou Xae représente la séquence peptidique -Lys-Xae'-His- dans laquelle Xae' représente un reste peptidique de 7 acides aminés, et/ou Xaf représente la séquence peptidique -Ser-Xaf-Lys- dans laquelle Xaf' représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou Xag représente Trp, et/ou Xah représente le reste peptidique Glu-Gly.
6. Gène chimère selon la revendication 5, caractérisé en ce que Xab' représente la séquence peptidique Ser-Gly-Arg-Tyr-Lys-Gly, et/ou Xac' représente la séquence peptidique Val-Trp-Asp-Asn-Glu, et/ou Xad' représente Arg, et/ou Xae' représente la séquence peptidique Glu-Glu-Gly-Arg-Ser-Ser-Gly, et/ou Xaf' représente la séquence peptidique Pro-Ser-Leu.
7. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la drosomicine est la séquence peptidique représentée par l'identificateur de séquence n° 4 (SEQ ID No 4) et les séquences peptidiques homologues.
8. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la drosomicine est un peptide de fusion « peptide-drosomicine », dont la coupure par les systèmes enzymatiques des cellules végétales permet la libération de la drosomicine, définie dans les revendications 1 à 7.
9. Gène chimère selon la revendication 8, caractérisé en ce que le peptide de fusion « peptide-drosomicine » est représenté par l'identificateur de séquence n° 6 (SEQ
ID No 6).
ID No 6).
10. Peptide de fusion « peptide-drosomicine », caractérisé en ce que la drosomicine est définie selon les revendications 1 à 7.
11. Peptide de fusion selon la revendication 10, caractérisé en ce que le peptide est être un peptide signal ou un peptide de transit.
12. Peptide de fusion selon la revendication 11. caractérisé en ce que le peptide signal est choisi parmi le peptide signal du gène PR-1.alpha. du tabac, ou l'ubiquitine.
13. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un gène de tolérance aux herbicides.
14. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une séquence codante pour un autre peptide susceptible de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique.
15. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que les éléments de régulations comprennent les séquences promotrices, les activateurs de transcription, les peptides de transit et/ou les séquences terminatrices.
16. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice est choisie parmi les séquences promotrices d'origine bactérienne, virale ou végétale.
17. Gène chimère selon la revendication 16, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice est choisie parmi le promoteur du gène de la petite sous-unité de ribulose-bisphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO) ou celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S).
18. Gène chimère selon la revendication 16, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice comprend au moins un promoteur choisi parmi les promoteurs d'histone ou d'actine.
19. Vecteur pour la transformation des plantes caractérisé en ce qu'il contient au moins un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 18.
20. Cellule végétale transformée contenant au moins un ADN tel que défini dans l'une des revendications 1 à 18.
21. Plante résistante aux maladies, caractérisée en ce qu'elle comprend une cellule transformée selon la revendication 20.
22. Plante selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par régénération à partir d'une cellule transformée selon la revendication 20.
23. Plante transformée résistante aux maladies, caractérisée en ce qu'elle est issue de la culture et/ou du croisement des plantes selon l'une des revendications 21 ou 22.
24. Graines de plantes transformées selon l'une des revendications 21 à 23.
25. Procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies, caractérisé en ce qu'on insère un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 18.
26. Procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies fongiques, caractérisé en ce qu'on insère un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 18.
27. Procédé selon l'une des revendications 25 ou 26, caractérisé en ce que le transfert est effectué avec Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes.
28. Procédé selon l'une des revendications 25 ou 26, caractérisé en ce que le transfert est effectué par apport par bombardement à l'aide de particules chargées de l'ADN.
29. Procédé selon l'une des revendications 25 à 28, caractérisé en ce que l'on insère également au moins un gène de tolérance aux herbicides.
30. Procédé selon l'une des revendications 25 à 29, caractérisé en ce que l'on insère également au moins une séquence codante pour un autre peptide susceptible de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique.
31 Procédé de culture des plantes transformées selon l'une des revendications 21 à 24, caractérisé en ce qu'il consiste à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à
appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à
récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à
séparer les graines des plantes récoltées.
appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à
récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à
séparer les graines des plantes récoltées.
32. Procédé de culture selon la revendication 31, caractérisé en ce que la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide.
33. Procédé de culture selon la revendication 24, caractérisé en ce que le produit actif présente une activité complémentaire de celle de la drosomicine.
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