CN107109408A - 生产无核果实的方法和材料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了生产无核果实的材料和方法，或者结无核果实的植物。本发明涉及将具有降低的AGAMOUS(AG)表达与单性结实组合。单性结实可以通过激素处理诱导，或者可以通过降低或消除PISTILATA(PI)或APETALA3(AP3)的表达提供。本发明提供了通过遗传修饰(GM)和非GM方法生产植物和无核果实的方法和材料。本发明还提供了所述植物和无核果实。

Description

生产无核果实的方法和材料
技术领域
本发明涉及生产无核果实的方法和材料。
背景技术
存在于许多果实中的核携带种子，其在合适的条件下可以发芽以最终产生新的带有果实的植物。果实通常对动物具有吸引力，并且种子与果实一起被摄食，其可以通过动物在距离初始的带有果实的植物较远的位置进行沉积，促进果实植物物种的传播。
尽管带有核的种子对于许多植物来说显然具有进化的优势，但是核的存在对于人们可能是不方便的。许多果实的核是纤维质的并且是坚韧的，因此，对于人们食用是不愉快的，并且可能难以消化。由于这些原因，核经常被食用果实的人丢弃，或者在果实被进一步加工和/或掺入其他食品中之前被去除。核的这种处理或去除代表果实的生物质的显著浪费，并且显著增加了果实加工的成本。
因此，本发明的目的是为了提供生产无核果实的新方法和组合物，或至少为公众提供有用的选择。
发明内容
方法
降低或消除AG
一方面，本发明提供了生产无核果实的方法，所述方法包括降低或消除植物中至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达。
另一方面，本发明提供了生产至少产生一个无核果实的植物的方法，所述方法包括降低或消除植物中AGAMOUS(AG)蛋白的表达。
包括诱导单性结实(parthenocarpy)步骤的方法
在一种实施方式中，该方法还包括诱导植物单性结实的额外步骤。
因此，一个方面，本发明提供了一种生产无核果实的方法，所述方法包括以下步骤：
a)降低或消除植物中至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达，和
b)诱导植物单性结实。
另一方面，本发明提供了生产至少产生一个无核果实的植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)降低或消除植物中至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达，和
b)诱导植物单性结实。
降低或消除单性结实的植物中的AG
在一种实施方式中，其中，至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达被降低或消除的植物是单性结实的植物。
诱导单性结实的方法
通过任何方式诱导单性结实。
在一种实施方式中，通过将植物激素施用于植物的花诱导单性结实。
在另一种实施方式中，通过操纵控制坐果(fruit set)的基因的表达诱导单性结实。
在一种实施方式中，通过操纵至少一种PISTILSTA(PI)基因或蛋白的表达诱导单性结实。
在一种实施方式中，通过降低或消除至少一种PISTILSTA(PI)基因或蛋白的表达诱导单性结实。
在一种实施方式中，通过操纵至少一种APETALA3(AP3)基因或蛋白的表达诱导单性结实。
在一种实施方式中，通过降低或消除至少一种APETALA3(AP3)基因或蛋白的表达诱导单性结实。
突变的单性结实的植物
在一种实施方式中，单性结实的植物是具有降低的或消除的至少一种PISTILSTA(PI)基因或蛋白的表达的突变植物。
在另一种实施方式中，单性结实的植物是具有降低的或消除的至少一种APETALA3(AP3)基因或蛋白的表达的突变植物。
突变植物可以是天然存在的突变植物。可选地，突变体可以是诱导的突变体。
降低或消除AG和PI
一方面，本发明提供了生产无核果实的方法，所述方法包括降低或消除植物中至少一种AGAMOUS(AG)蛋白和至少一种PISTILATA(PI)蛋白的表达。
另一方面，本发明提供了生产至少产生一个无核果实的植物的方法，所述方法包括降低或消除植物中AGAMOUS(AG)蛋白和至少一种PISTILATA(PI)蛋白的表达。
在一种实施方式中，降低或消除至少一种PISTILATA(PI)蛋白的表达诱导单性结实。
降低或消除AG和AP3
一方面，本发明提供了生产无核果实的方法，所述方法包括降低或消除植物中至少一种AGAMOUS(AG)蛋白和至少一种APETALA3(AP3)蛋白的表达。
另一方面，本发明提供了生产至少产生一个无核果实的植物的方法，所述方法包括降低或消除植物中AGAMOUS(AG)蛋白和至少一种APETALA3(AP3)蛋白的表达。
在一种实施方式中，降低或消除至少一种APETALA3(AP3)蛋白的表达诱导单性结实。
降低或消除AGAMOUS(AG)的非GM选择方法
另一方面，本发明提供了一种鉴定植物的方法，所述植物具有表现为产生或能用于产生至少一个无核果实的基因型，所述方法包括对植物进行以下中的至少一种测试：
a)降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达，
b)降低的或消除的编码AGAMOUS(AG)蛋白的至少一种多核苷酸的表达，
c)存在与至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达降低相关的标记，和
d)存在与编码AGAMOUS(AG)蛋白的至少一种多核苷酸的表达降低相关的标记。
在一种实施方式中，a)至d)中任意一项的存在表明植物将生产或能用于生产至少一个无核果实。
在另一种实施方式中，被鉴定的植物是具有降低的或消除的AGAMOUS(AG)基因或蛋白的表达的突变植物。
突变植物可以是天然存在的突变植物。可选地，突变体可以是诱导的突变体。
降低或消除PISTILATA(PI)的非GM选择方法
另一方面，本发明提供了一种鉴定植物的方法，所述植物具有表现为产生或能用于产生至少一个无核果实的基因型，所述方法包括对植物进行以下中的至少一种测试：
a)降低的或消除的至少一种PISTILATA(PI)蛋白的表达，
b)降低的或消除的编码PISTILATA(PI)蛋白的至少一种多核苷酸的表达，
c)存在与至少一种PISTILATA(PI)蛋白的表达降低相关的标记，和
d)存在与编码PISTILATA(PI)蛋白的至少一种多核苷酸的表达降低相关的标记。
在一种实施方式中，a)至d)中任意一项的存在表明植物将生产或能用于生产至少一个无核果实。
在另一种实施方式中，被鉴定的植物是具有降低的或消除的PISTILATA(PI)基因或蛋白的表达的突变植物。
突变植物可以是天然存在的突变植物。可选地，突变体可以是诱导的突变体。
降低或消除APETALA3(AP3)的非GM选择方法
另一方面，本发明提供了一种鉴定植物的方法，所述植物具有表现为产生或能用于产生至少一个无核果实的基因型，所述方法包括对植物进行以下中的至少一种测试：
a)降低的或消除的至少一种APETALA3(AP3)蛋白的表达，
b)降低的或消除的编码APETALA3(AP3)蛋白的至少一种多核苷酸的表达，
c)存在与至少一种APETALA3(AP3)蛋白的表达降低相关的标记，和
d)存在与编码APETALA3(AP3)蛋白的至少一种多核苷酸的表达降低相关的标记。
在一种实施方式中，a)至d)中任意一项的存在表明植物将生产或能用于生产至少一个无核果实。
在另一种实施方式中，被鉴定的植物是具有降低的或消除的APETALA3(AP3)基因或蛋白的表达的突变植物。
突变植物可以是天然存在的突变植物。可选地，突变体可以是诱导的突变体。
培育具有无核果实的植物的方法
另一方面，本发明提供了生产至少产生一个无核果实的植物的方法，所述方法包括将以下中的至少一种植物与另外的植物杂交：
a)本发明的植物，
b)由本发明的方法生产的植物，和
c)由本发明的方法选择的植物
d)具有降低的或消除的AGAMOUS(AG)、PISTILATA(PI)和APETALA3(AP3)中的任意一种的表达的突变植物，
与另外的植物进行杂交，其中，通过杂交生产的后代为生产至少一个无核果实的植物。
在一种实施方式中，a)、b)、c)或d)的植物是具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达的植物。优选地，在该实施方式中，另外的植物为以下中的任意一种：
i)单性繁殖的(parthenogenic)植物，
ii)具有降低的或消除的至少一种PISTILATA(PI)蛋白的表达的植物，
iii)具有降低的或消除的至少一种APETALA3(AP3)蛋白的表达的植物
优选地，通过本发明的方法生产的或选择的i)、ii)或iii)中的植物。可选地，i)、ii)或iii)中的植物可以是具有降低的或消除的PISTILATA(PI)和APETALA3(AP3)的表达的天然存在的突变体。
在一种实施方式中，a)、b)或c)的植物是具有降低的或消除的至少一种PISTILATA(PI)蛋白的表达的植物。在另一种实施方式中，a)、b)或c)的植物是具有降低的或消除的至少一种APETALA3(AP3)蛋白的表达的植物。优选地，在该实施方式中，另外的植物是具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达的植物。优选地，另外的植物通过本发明的方法生产或选择。
包括选择单性结实的非GM选择方法
在一种实施方式中，鉴定具有产生至少一个无核果实的基因型的植物的方法包括鉴定植物中单性结实的标记的额外步骤。
使用选择的植物生产无核果实的方法
在另一方面，本发明提供了一种生产无核果实的方法，所述方法包括培养由本发明的方法鉴定的植物。在一种实施方式中，该方法还包括诱导植物单性结实的额外步骤。
在优选的实施方式中，植物生产无核果实是由于被鉴定的植物具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达。
在另一种优选的实施方式中，植物生产无核果实是由于被鉴定的植物具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达并且具有诱导的单性结实。
在另一种实施方式中，植物生产无核果实是由于被鉴定的植物具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达，并且具有降低的或消除的PISTILATA(PI)和APETALA3(AP3)中的一种的表达。
一种生产无核果实的方法，所述方法包括培养具有降低的或消除的以下至少一种蛋白的表达的植物：
a)至少一种AGAMOUS(AG)蛋白，和
b)至少一种以下蛋白：
i)至少一种PISTILATA(PI)蛋白，和
ii)至少一种APETALA3(AP3)蛋白。
优选地，植物具有降低的或消除的以下两种蛋白的表达：
a)至少一种AGAMOUS(AG)蛋白，和
b)至少一种以下蛋白：
i)至少一种PISTILATA(PI)蛋白，和
ii)至少一种APETALA3(AP3)蛋白。
产品
无核果实
另一方面，本发明提供了通过本发明的方法生产的无核果实。
另一方面，本发明提供了具有降低的或消除至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达的无核果实。
在一种实施方式中，果实还具有降低的或消除的至少一种PISTILATA(PI)蛋白的表达。
在另一种实施方式中，果实还具有降低的或消除的至少一种APETALA3(AP3)蛋白的表达。
在另一种实施方式中，本发明提供了具有降低的或消除以下蛋白的表达的无核果实：
a)至少一种AGAMOUS(AG)蛋白，和
b)至少一种以下蛋白：
i)至少一种PISTILATA(PI)蛋白，和
ii)至少一种APETALA3(AP3)蛋白。
结无核果实的植物
另一方面，本发明提供了通过本发明的方法生产的至少产生一个无核果实的植物。
另一方面，本发明提供了产生至少一个无核果实的植物，其中，所述植物具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达。
在一种实施方式中，果实还具有降低的或消除的至少一种PISTILATA(PI)蛋白的表达。
在另一种实施方式中，果实还具有降低或消除的至少一种APETALA3(AP3)蛋白的表达。
在另一种实施方式中，植物包含本发明的构建体。
在一种实施方式中，植物也是单性结实的。
在另一种实施方式中，本发明提供了生产至少一个无核果实的植物，其中，所述植物具有降低的或消除的以下蛋白的表达：
a)至少一种AGAMOUS(AG)蛋白，和
b)至少一种以下蛋白：
i)至少一种PISTILATA(PI)蛋白，和
ii)至少一种APETALA3(AP3)蛋白。
构建体(用于降低或消除植物中AGAMOUS(AG)蛋白的表达)
另一方面，本发明提供了用于降低植物中AGAMOUS(AG)蛋白的表达的构建体。
在一种实施方式中，构建体含有与AGAMOUS(AG)基因的至少部分可操作地连接的启动子序列，其中，该基因的部分相对于启动子序列为反义方向。
优选地，基因的部分的长度为至少21个核苷酸。
在一种实施方式中，构建体为反义构建体。
在另一种实施方式中，构建体为RNA干扰(RNAi)构建体。
构建体(用于降低或消除植物中PISTILATA(PI)蛋白的表达)
另一方面，本发明提供了用于降低植物中PISTILATA(PI)蛋白的表达的构建体。
在一种实施方式中，构建体含有与PISTILATA(PI)蛋白的至少部分可操作地连接的启动子序列，其中，该基因的部分相对于启动子序列为反义方向。
优选地，基因的部分的长度为至少21个核苷酸。
在一种实施方式中，构建体为反义构建体。
在另一种实施方式中，构建体为RNA干扰(RNAi)构建体。
构建体(用于降低或消除植物中APETALA3(AP3)蛋白的表达)
另一方面，本发明提供了用于降低植物中APETALA3(AP3)蛋白的表达的构建体。
在一种实施方式中，构建体含有与APETALA3(AP3)的至少部分可操作地连接的启动子序列，其中，基因的部分相对于启动子序列为反义方向。
优选地，基因的部分的长度为至少21个核苷酸。
在一种实施方式中，构建体为反义构建体。
在另一种实施方式中，构建体为RNA干扰(RNAi)构建体。
植物/果实
植物可以来自任意物种，其在未使用本发明的方法的情况下生产带核果实。
在一种实施方式中，植物来自生产附果(accessory fruit)的物种。
优选的生产附果的植物包括苹果和梨植物。
优选的苹果的属为苹果属(Malus)。
优选的苹果物种包括：窄叶海棠(Malus angustifolia)、花红果(Malusasiatica)、山荆子(Malus baccata)、花冠海棠(Malus coronaria)、台湾林檎(Malusdoumeri)、弗洛伦萨海棠(Malus florentina)、多花海棠(Malus floribunda)、奥涅海棠(Malus fusca)、垂丝海棠(Malus halliana)、河南海棠(Malus honanensis)、湖北海棠(Malus hupehensis)、草原海棠(Malus ioensis)、陇东海棠(Malus kansuensis)、毛山荆子(Malus mandshurica)、西府海棠(Malus micromalus)、红肉苹果(Malusniedzwetzkyana)、沧江海棠(Malus ombrophilia)、东方苹果(Malus orientalis)、西蜀海棠(Malus prattii)、楸子(Malus prunifolia)、西洋苹果(Malus pumila)、撒氏海棠(Malus sargentii)、三叶海棠(Malus sieboldii)、新疆野苹果(Malus sieversii)、欧洲野苹果(Malus sylvestris)、变叶海棠(Malus toringoides)、花叶海棠(Malustransitoria)、三裂叶海棠(Malus trilobata)、乔劳斯基海棠(Malus tschonoskii)、栽培苹果(Malus×domestica)、新疆野苹果的栽培果(Malus×domestica×Malus sieversii)、苹果和梨的栽培果(Malus×domestica×Pyrus communis)、小金海棠(Malusxiaojinensis)和滇池海棠(Malus yunnanensis)。
特别优选的苹果物种为栽培苹果。
优选的梨的属为梨属(Pyrus)。
优选的梨物种包括：豆梨(Pyrus calleryana)、高加索梨(Pyrus caucasica)、西洋梨(Pyrus communis)、日本豆梨(Pyrus elaeagrifolia)、杂交栽培梨(Pyrus hybridcultivar)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、柳叶梨(Pyrus salicifolia)、秋子梨(Pyrusussuriensis)和白梨(Pyrus×bretschneideri)。
特别优选的梨物种为西洋梨和白梨。
其他优选的植物包括木瓜(quince)、枇杷(loquat)和山楂(hawthorn)。
优选的木瓜的属为木瓜属(Chaenomeles)。
优选的木瓜物种包括：毛叶木瓜(Chaenomeles cathayensis)和皱皮木瓜(Chaenomeles speciosa)。
特别优选的木瓜物种为皱皮木瓜。
优选的枇杷的属为枇杷属(Eriobotrya)。
优选的枇杷物种包括：枇杷(Eriobotrya japonica)和枇杷(Eriobotryajaponica)。
特别优选的枇杷物种为枇杷。
优选的山楂的属为山楂属(Crataegus)。
优选的山楂物种包括：阿查拉山楂(Crataegus azarolus)、哥伦比亚纳山楂(Crataegus columbiana)、白玉山楂(Crataegus crus-galli)、锐刺山楂(Crataeguscurvisepala)、平滑山楂(Crataegus laevigata)、柔毛山楂(Crataegus mollis)、单子山楂(Crataegus monogyna)、欧洲黑山楂(Crataegus nigra)、河山楂(Crataegusrivularis)和西奈山楂(Crataegus sinaic)。
植物部分、繁殖体(propagule)和子代(progeny)
在另一种实施方式中，本发明提供了本发明的植物的部分、子代或繁殖体。
优选地，所述部分、子代或繁殖体具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达。
在一种实施方式中，所述部分、子代、繁殖体具有降低的或消除的至少一种PISTILATA(PI)蛋白的表达。
在另一种实施方式中，所述部分、子代、繁殖体具有降低的或消除的至少一种APETALA3(AP3)蛋白的表达。
优选地，所述部分、子代、繁殖体包含本发明的构建体。
术语植物的“部分”是指植物的任意部分。术语“部分”优选包括以下任意一种：组织、器官、果实和种子。
术语植物的“繁殖体”优选包括可以被用于再生新植物的植物的任意部分。优选地，术语“繁殖体”包括种子和插条(cutting)。
术语“子代”包括植物的任意后代。子代可以是由于与另外的植物进行有性杂交而产生的。子代植物也可以是无性产生的。
具体实施方式
本发明提供了生产无核果实的材料和方法，或者结无核果实的植物。本发明涉及将AGAMOUS(AG)的表达降低与单性结实组合。单性结实可以通过激素处理诱导，或者可以通过降低或消除PISTILATA(PI)或APETALA3(AP3)的表达来提供。本发明提供了通过遗传修饰(GM)和非GM方法生产植物和无核果实的方法和材料。本发明还提供了该植物和无核果实。
本领域技术人员将理解的是具有降低的或消除的AGAMOUS(AG)的表达和具有降低的或消除的PISTILATA(PI)或APETALA3(AP3)的表达的植物可以通过多种不同的方式产生。具有一种或多种基因的表达降低的植物可以通过遗传修饰(GM)方法产生，或者可以以天然存在的突变体的形式被选择或被提供。GM或非GM植物的杂交可以被用于产生具有降低的或消除的预期的基因的表达的组合的植物。类似地，GM方法可以被用于降低天然存在的或选择的突变体中的基因中的一种的表达，所述天然存在的或选择的突变体具有降低的其他必需基因的表达。
不管它们是如何被生产的，本发明优选包括任何无核果实或结无核果实的植物，其中，所述植物或无核果实具有降低的或消除的AGAMOUS(AG)表达和降低的或消除的PISTILATA(PI)或APETALA3(AP3)表达。本发明还包括生产如本文所述的植物和无核果实的方法。
定义
核
术语果实的“核”是指含有局部腔体(locular cavities)和种子的位于苹果的中心的纤维组织。
无核
本文所用的术语“无核”是指缺少核。因此，根据本发明，“无核”果实优选还缺少种子。因此，根据本发明，“无核”果实优选还缺少局部腔体。
附果
与来自子房组织的真果不同，附果来自其他花或花托组织。
以仁果(如苹果和梨)为例，果肉来自于托杯(hypanthium)，所述托杯是由围绕心皮的萼片、花瓣和雄蕊组织形成的管状物。
托杯
托杯组织围绕着形成果实的核的心皮。
花器官特征A、B和C功能基因
所有花均具有花器官的轮生体(whorl)，其被定义为萼片(sepal)、花瓣(petal)、雄蕊(stamen)和心皮(carpel)。这些器官类型中的每一种的产生通过一组MADS盒转录因子(通常被描述为A、B和C功能基因)决定。功能基因如APETELA1控制萼片和花瓣的决定。B功能基因如PISTILATA(PI)和APETALA3(AP3)控制花瓣和雄蕊的决定。C功能基因如AGAMOUS(AG)控制雄蕊和心皮的决定。
所有AG、PI和AP3蛋白具有两个保守的基序、用于DNA结合的MADS结构域和用于蛋白-蛋白相互作用的K结构域，如图9所示。
AGAMOUS(AG)蛋白
AGAMOUS(AG)蛋白和编码它们的基因是本领域技术人员公知的。
例如，模型植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的AGAMOUS簇由已知的AG、SEEDSTICK(STK)、SHATTERPROOF(SHP)1和2的4个基因组成。
根据本发明，AGAMOUS(AG)蛋白可以是任何AGAMOUS蛋白。
在一种实施方式中，AGAMOUS蛋白包含如图9所示的MADS结构域和K结构域中的至少一种。优选地，AGAMOUS蛋白包含如图9所示的MADS结构域和K结构域。
在另一种实施方式中，AGAMOUS蛋白与下表1(并且在序列表中呈现)中提及的任意一种AGAMOUS蛋白具有至少70％的序列同一性。
在另一种实施方式中，AGAMOUS蛋白是下表1(并且在序列表中呈现)中提及的AGAMOUS蛋白中的一种。
在优选的实施方式中，AGAMOUS蛋白与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少70％的序列同一性。
在优选的实施方式中，AGAMOUS蛋白具有SEQ ID NO：1所示的序列。
编码AGAMOUS(AG)蛋白的多核苷酸
在一种实施方式中，编码AGAMOUS蛋白的序列与下表1(并且在序列表中呈现)中提及的任意一种AGAMOUS多核苷酸具有至少70％的序列同一性。
在另一种实施方式中，编码AGAMOUS蛋白的序列是下表1(并且在序列表中呈现)中提及的AGAMOUS多核苷酸中的一种。
在优选的实施方式中，编码AGAMOUS蛋白的序列与SEQ ID NO：4所示的序列具有至少70％的序列同一性。
在优选的实施方式中，编码AGAMOUS蛋白的序列具有SEQ ID NO：4所示的序列。
表1：AGAMOUS序列
SEQ ID NO： 序列类型 常用名 物种 参考
1 多肽 苹果 栽培苹果 MdAG
2 多肽 梨 白梨 PbAG,Pbr039503.1
3 多肽 梨 西洋梨 PcAG,PCP031198
4 多核苷酸 苹果 栽培苹果 MdAG
5 多核苷酸 梨 白梨 PbAG,Pbr039503.1
6 多核苷酸 梨 西洋梨 PcAG,PCP031198
30 多肽 苹果 栽培苹果 MADS15
31 多核苷酸 苹果 栽培苹果 MADS15
AGAMOUS(AG)基因
根据本发明，AGAMOUS(AG)基因可以是任何AGAMOUS(AG)基因。
优选地，AGAMOUS(AG)基因编码如本文所定义的AGAMOUS(AG)蛋白。
基因
本文使用的术语“基因”可以是用于降低或消除AGAMOUS(AG)、PISTILATA(PI)或APETALA3(AP3)蛋白或多核苷酸的表达的靶标。
术语基因包括编码蛋白的序列，其可以是单独的外显子，任何调控序列(包括启动子和终止子序列)5'端和3'端非翻译序列和内含子。
本领域技术人员公知的是基因的这些特征中的任意一种均可以在沉默方法(例如反义、正义抑制和RNA干扰(RNAi))中作为靶标。
降低或消除蛋白/基因表达的方法
术语降低的表达、降低表达及其语法上相应的表述是指相对于以下至少一种降低的/降低表达：
-野生型植物
-非转化的植物
–使用对照构建体转化的植物
-非选择的植物
对照构建体例如可以是空载体构建体。
降低或消除蛋白/多核苷酸/基因的表达的方法是本领域公知的，并且如本文所述。
单性结实
单性结实是在没有授粉的情况下生产果实。
诱导单性结实的方法
在本领域中已经报道了诱导植物单性结实的方法。
单性结实可以使用激素处理或基因调节(Sotelo-Silveira等，2014)中详述的某些基因进行诱导。在苹果中，已经进行了广泛的工作以诱导单性结实，仅GA3、SD8339和2-NAA的三重组合而不是单一或配对应用导致考克斯橙苹(Cox's Orange Pippin)(Kotob&Schwabe 1971)单性结实，并且，霜冻损伤的Bramley幼苗的单性结实单独诱导的GA4+7和细胞分裂素SD8339不具有额外的益处；GA3是无效的。也就是说，Bramley幼苗是三倍体且部分自育(self-fertile)，所以这可能是一种不常见的情况(Modlibowska 1972)。
根据本发明，诱导单性结实的方法包括将植物激素应用于所涉及的植物的花。
在一种实施方式中，单性结实通过施用以下中的至少一种诱导：
a)生长素(auxin)
b)细胞分裂素(cytokinin)
c)赤霉素(giberellin)
优选地，施用a)、b)和c)中的至少两种，更优选所有三种。当施用两种时，优选所述两种为a)和c)。
优选的生长素包括：IAA、NAA、2,4-D和IBA。
优选的生长素为IAA
优选的细胞分裂素包括：BAP、CPPU、玉米素(Zeatin)、TDZ和激动素(kinetin)。
优选的细胞分裂素为BAP
优选的赤霉素包括：GA1、GA3、GA4和GA7。
优选的赤霉素为GA4
优选地，生长素浓度在0.01至100ppm的范围内，更优选0.1至10ppm，更优选0.2至5ppm，更优选0.5至2ppm，更优选约为1ppm，更优选为1ppm。
优选地，细胞分裂素浓度在1至10,000ppm的范围内，更优选10至1000ppm，更优选20至500ppm，更优选50至200ppm，更优选约为100ppm，更优选为100ppm。
优选地，赤霉素浓度在3至30,000ppm的范围内，更优选30至3000ppm，更优选60至1500ppm，更优选150至600ppm，更优选200至400ppm，更优选250至350，更优选约为300ppm，更优选为300ppm。
优选地，花在完全盛开之前处理。
优选地，处理开始于或早于：完全盛开后一天(+1DAFB)，更优选在完全盛开的当天，更优选在完全盛开前至少1天(-1DAFB)，更优选完全盛开前至少2天(-2DAFB)，更优选完全盛开前至少3天(-3DAFB)，更优选完全盛开前至少4天(-4DAFB)，更优选完全盛开前至少5天(-5DAFB)，更优选完全盛开前至少6天(-6DAFB)，更优选完全盛开前至少7天(-7DAFB)。
优选地，将花处理至少一次，更优选至少两次，更优选至少三次，更优选至少四次。
优选地，处理间隔至少一天，优选至少2天，优选至少3天，优选至少4天。
在一种实施方式中，处理在-7，-4和+1DAFB进行。
DAFB是指花盛开之后的天数。
在一种实施方式中，具有部分胚珠(ovule)的花仅使用生长素和赤霉素处理。
在另一种实施方式中，不具有胚珠组织的花使用生长素、细胞分裂素和赤霉素处理。
通过操纵基因表达诱导单性结实
用于诱导单性结实的其他方法包括操纵靶基因的表达。
例如，在苹果中这已经通过消除PISTILATA(PI)蛋白的表达实现了(Yao et al.，“Parthenocarpic apple fruit production conferred by transposon insertionmutations in a MADS-box transcription factor.”，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 98.3(2001):1306-1311.)。
在一种实施方式中，诱导单性结实的方法包括降低或消除PISTILATA(PI)蛋白的表达。
PISTILATA(PI)蛋白
PISTILATA(PI)蛋白和编码它们的基因是本领域技术人员公知的。
敲除苹果中的PISTILATA(PI)基因产生具有两个萼片的轮生体和两个心皮的轮生体的花，但是无花瓣或雄蕊。这些花可以发育成单性结实的果实。这可能是由于萼片发育的增强有助于无授粉坐果。
根据本发明，PISTILATA(PI)蛋白可以是任何PISTILATA蛋白。
在一种实施方式中，PISTILATA蛋白含有如图9所示的MADS结构域和K结构域中的至少一种。优选地，PISTILATA蛋白含有如图9所示的MADS结构域和K结构域。
在另一种实施方式中，PISTILATA蛋白与下表2(并且在序列表中呈现)中提及的任意一种PISTILATA蛋白具有至少70％的序列同一性。
在另一种实施方式中，PISTILATA蛋白是下表1(并且在序列表中呈现)中提及的PISTILATA蛋白中的一种。
在优选的实施方式中，PISTILATA蛋白与SEQ ID NO：7所示的序列具有至少70％的序列同一性。
在优选的实施方式中，PISTILATA蛋白具有SEQ ID NO：7所示的序列。
编码PISTILATA(PI)蛋白的多核苷酸
在一种实施方式中，编码PISTILATA蛋白的序列与下表1(并且在序列表中呈现)中提及的任意一种PISTILATA多核苷酸具有至少70％的序列同一性。
在另一种实施方式中，编码PISTILATA蛋白的序列是下表1(并且在序列表中呈现)中提及的PISTILATA多核苷酸中的一种。
在优选的实施方式中，编码PISTILATA蛋白的序列与SEQ ID NO：10所示的序列具有至少70％的序列同一性。
在优选的实施方式中，编码PISTILATA蛋白的序列具有SEQ ID NO：10所示的序列。
表2：PISTILATA序列
PISTILATA(PI)基因
根据本发明，PISTILATA(PI)基因可以是任何PISTILATA(PI)基因。
优选地，PISTILATA(PI)基因编码如本文所定义的PISTILATA(PI)蛋白。
APETALA3(AP3)
已知APETALA3(AP3)与PISTILATA(PI)形成异二聚体。由AP3和PI编码的蛋白在细胞中仅作为异二聚体是稳定的和具有功能的(Winter，K.U.et al.2002,Evolution ofclass B floral homeotic proteins：Obligate heterodimerization originated fromhomodimerization.Molecular Biology and Evolution 19,587-596)。此外，敲除AP3产生与敲除PISTILATA(PI)相同的表型(Weigel,D.&Meyerowitz,E.M.1994，The ABCs offloral homeotic genes.Cell 78,203-209)。因此，单性结实还可以通过降低或消除APETALA3(AP3)蛋白的表达来诱导。
在一种实施方式中，诱导单性结实的方法包括降低或消除APETALA3(AP3)蛋白的表达。
APETALA3(AP3)蛋白
APETALA3(AP3)蛋白和编码它们的基因是本领域技术人员公知的。
根据本发明，APETALA3(AP3)蛋白可以是任何APETALA3(AP3)蛋白。
在一种实施方式中，APETALA3(AP3)蛋白含有如图9所示的MADS结构域和K结构域中的至少一种。优选地，APETALA3(AP3)蛋白含有如图9所示的MADS结构域和K结构域。
在另一种实施方式中，APETALA3(AP3)蛋白与下表3(并且在序列表中呈现)中提及的任意一种APETALA3(AP3)蛋白具有至少70％的序列同一性。
在另一种实施方式中，APETALA3(AP3)蛋白是下表3(并且在序列表中呈现)中提及的APETALA3(AP3)蛋白中的一种。
在优选的实施方式中，APETALA3(AP3)蛋白与SEQ ID NO：13或14所示的序列具有至少70％的序列同一性。
在优选的实施方式中，APETALA3(AP3)蛋白具有SEQ ID NO：13或14所示的序列。
编码APETALA3(AP3)蛋白的多核苷酸
在一种实施方式中，编码APETALA3(AP3)蛋白的序列与下表3(并且在序列表中呈现)中提及的任意一种APETALA3(AP3)多核苷酸具有至少70％的序列同一性。
在另一种实施方式中，编码APETALA3(AP3)蛋白的序列是下表3(并且在序列表中呈现)中提及的APETALA3(AP3)多核苷酸中的一种。
在优选的实施方式中，编码APETALA3(AP3)蛋白的序列与SEQ ID NO：19或20所示的序列具有至少70％的序列同一性。
在优选的实施方式中，编码APETALA3(AP3)蛋白的序列具有SEQ ID NO：19或20所示的序列。
表3：APETALA3(AP3)序列
APETALA3(AP3)基因
根据本发明，APETALA3(AP3)基因可以是任何APETALA3(AP3)基因。
优选地，APETALA3(AP3)基因编码如本文所定义的APETALA3(AP3)蛋白。
标记辅助选择
标记辅助选择(MAS)是通常被用于鉴定具有特定性状的植物，其使用与该性状相关的一种遗传标记或多种标记。MAS可以允许育种者鉴定和选择处于幼苗期的植物，并且对于难测量的性状特别有价值。MAS的最佳标记是因果突变，但是当这些突变不可用时，也可以使用与因果突变处于强连锁不平衡的标记。这样的信息可以被用于提高遗传增益，或降低性状测量成本，从而在商业育种过程中具有实用性。
标记
用于本发明方法的标记可以包括核酸标记，例如，单核苷酸多态性(SNP)，简单序列重复(SSR或微卫星)，插入，取代，插入缺失和缺失。
优选地，标记与性状处于连锁不平衡(LD)。
优选地，所述标记与所述性状处于LD的D'值至少为0.1，更优选至少为0.2，更优选至少为0.3，更优选至少为0.4，更优选至少为0.5。
优选地，所述标记与所述性状处于LD的R2值至少为0.05，更优选至少为0.075，更优选至少为0.1，更优选至少为0.2，更优选至少为0.3，更优选至少为0.4，更优选至少为0.5。
本文所用的术语“连锁不平衡”或LD是指两个独立的遗传标记的结合或共现的强度的衍生统计学量度。可以使用各种统计方法来概括两个标记之间的连锁不平衡(LD)，但是在实践中，被广泛使用的仅有两种，称为D'和R2。
与性状连锁的和/或在LD中的标记可以是任何类型，包括但不限于SNP、取代、插入、缺失，插入缺失(indel)、简单序列重复(SSR)。
用于标记辅助选择的方法是本领域技术人员公知的。
突变的单性结实的植物
突变的单性结实的植物优选具有降低的PISTILATA(PI)和APETALA3(AP3)中至少一种的表达。
在一种实施方式中，单性结实的植物具有降低的PISTILATA(PI)表达。这种单性结实植物的实例是“Rae Ime”苹果突变体，其在PI基因的内含子中具有插入，并且不表达苹果MdPI基因。“Spencer Seedless”和“Wellington Bloomless”苹果突变体也具有相同的表型和相似的插入(Yao et al.2001)。
可以选择具有相似表型的植物用于全基因组测序以鉴定AP3或PI基因中的突变，以及用于q-RT-PCR分析以确认降低的或消除的AP3或PI表达。可选地，可以首先筛选具有降低的或消除的AP3或PI表达的植物。
突变的AGAMOUS植物
突变的AGAMOUS植物优选具有降低的AGAMOUS(AG)表达。
可以鉴定与AG抑制转基因植物表现出相似表型的植物。
可以选择具有这种表型的植物用于全基因组测序以鉴定AG基因中的突变，以及用于q-RT-PCR分析以确认降低的或消除的AG基因表达。可选地，可以首先筛选具有降低的或消除的AG基因表达。
多核苷酸和片段
本文所用的术语“多核苷酸”是指任何长度的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合体，但是优选为至少15个核苷酸，并且包括作为非限制性实例的基因的编码和非编码序列、正义和反义序列互补序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA，前体mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多肽、分离和纯化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。
优选地，术语“多核苷酸”包括指定的序列及其互补序列。
本文提供的多核苷酸序列的“片段”是连续核苷酸的子序列，例如，长度为至少15个核苷酸的序列。本发明的片段含有本发明的多核苷酸的连续核苷酸的15个核苷酸，优选至少20个核苷酸，更优选至少30个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，最优选至少60个核苷酸。用于沉默的多核苷酸的片段，特别是用于RNA干扰(RNAi)方法的多核苷酸片段优选长度至少为21个核苷酸。
术语“引物”是指通常具有游离3'OH基团的短多核苷酸，其与模板杂交并且被用于引发与靶标互补的多核苷酸的聚合。
多肽和片段
本文所用的术语“多肽”包括任何长度的氨基酸链，但优选至少5个氨基酸，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本发明的多肽可以是纯化的天然产物，或者可以使用重组或合成技术部分或全部产生。该术语可以指的是多肽，多肽的聚集体，例如，二聚体或其他多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其衍生物。
多肽的“片段”是多肽的子序列。在一种实施方式中，所述片段可以发挥与其来源的全长多肽相同的功能，或者是其中的一部分。优选地，片段发挥生物活性所需的功能和/或提供多肽的三维结构。
应用于本文公开的多核苷酸或多肽序列的术语“分离的”是指从其天然细胞环境中去除的序列。在一种实施方式中，所述序列从其在自然界中发现的侧翼序列分离。分离的分子可以通过任何方法或方法的组合获得，包括生物化学、重组和合成技术。
术语“重组体”是指在其天然环境中由在其周围的序列合成产生的或从该序列移除的多核苷酸序列。重组序列可以与其天然环境中不存在的序列重组。
“重组体”多肽序列通过从“重组体”多核苷酸序列翻译产生。
与本发明的多核苷酸或多肽来自特定的属或种相关的术语“来自”是指多核苷酸或多肽与在该属或种中天然发现的多核苷酸或多肽具有相同的序列。因此，来自特定的属或种的多核苷酸或多肽可以被合成或重组产生。
变体
如本文所用，术语“变体”是指与特定鉴定的序列不同的多核苷酸或多肽序列，其中，一个或多个核苷酸或氨基酸残基被缺失、取代或添加。变体可以是天然存在的等位变体，或非天然存在的变体。变体可以来自相同或来自其他物种，并且可以包括同源体、旁系同源体和直系同源体。在某些实施方式中，本文公开的多肽和多核苷酸的变体具有与已被公开的多肽或多核苷酸相同的或相似的生物活性。关于多肽和多核苷酸的术语“变体”包括本文所定义的所有多肽和多核苷酸的形式。
多核苷酸变体
变体多核苷酸序列优选显示出与本发明的序列具有至少50％的同一性，更优选至少51％，更优选至少52％，更优选至少53％，更优选至少54％，更优选至少55％，更优选至少56％，更优选至少57％，更优选至少58％，更优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少61％，更优选至少62％，更优选至少63％，更优选至少64％，更优选至少65％，更优选至少66％，更优选至少67％，更优选至少68％，更优选至少69％，更优选至少70％，更优选至少71％，更优选至少72％，更优选至少73％，更优选至少74％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少77％，更优选至少78％，更优选至少79％，更优选至少80％，更优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％。在本发明的多核苷酸的至少20个核苷酸位置，优选至少50个核苷酸位置，更优选至少100个核苷酸位置，最优选全长的比较窗口上发现同一性。
多核苷酸序列同一性可以以下列方式确定。使用bl2seq中的BLASTN(来自BLAST程序套件，版本2.2.5[2002年11月])，将目标多核苷酸序列与候选多核苷酸序列进行比较(Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，“Blast 2 sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences”，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)，其可以从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得。在一种实施方式中，使用bl2seq的默认参数。在另一种实施方式中，除了使用bl2seq的默认参数之外，除了应当关闭低复杂度部分的过滤之外。
也可以使用全局序列比对程序(例如，Needleman，S.B.and Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)在候选和目标多核苷酸序列之间的重叠的全长上计算多核苷酸序列的同一性。Needleman-Wunsch全局比对算法的完全实施在EMBOSS包中的needle程序中找到(Rice,P.Longden,I.and Bleasby,A.EMBOSS：The European Molecular BiologyOpen Software Suite,Trends in Genetics June 2000,vol 16,No 6.pp.276-277)，其可以从http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/获得。欧洲生物信息学研究所服务器还提供了在两个序列之间进行EMBOSS-needle全局比对的操作，在线http：/www.ebi.ac.uk/emboss/align/。
可选地，可以使用GAP程序，其计算两个序列的最佳全局比对而不扣除终端空位。GAP于以下论文中描述：Huang,X.(1994)On Global Sequence Alignment.ComputerApplications in the Biosciences 10,227-235。
用于计算多核苷酸序列同一性％的优选方法是以使用Clustal X进行比较的比对序列为基础(Jeanmougin et al.,1998,Trends Biochem.Sci.23,403-5.)。
本发明的多核苷酸变体还包括与一个或多个特定鉴定的序列具有相似性的那些序列，所述特定鉴定的序列可能保留那些序列的功能等同性，并且不能合理地预期随机发生。可以使用来自NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)的BLAST程序套件(版本2.2.5[2002年11月])的公众可获得的bl2seq程序来确定关于多肽的这种序列相似性。
可选地，本发明的变体多核苷酸在严格条件下与指定的多核苷酸序列或其互补序列杂交。
术语“在严格条件下杂交”及其语法上相应的表述是指在指定的温度和盐浓度的条件下多核苷酸分子与靶多核苷酸分子杂交的能力(例如，固定在DNA或RNA印迹上的靶多核苷酸分子，如Southern印迹或Northern印迹)。在严格杂交条件下杂交的能力可以通过首先在严格度较低的条件下杂交，然后将严格度增加到预期的严格度进行确定。对于长度大于约100个碱基的多核苷酸分子，典型的严格杂交条件为低于天然双链体(duplex)的解链温度(Tm)25至30℃(例如，10℃)(通常参见，Sambrook et al.,Eds,1987,MolecularCloning,A Laboratory Manual,2nd Ed.Cold Spring Harbor Press；Ausubel et al.,1987,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing,)。可以通过下式计算大于约100个碱基的多核苷酸分子的Tm：Tm＝81.5+0.41％(G+C-log(Na+))(Sambrooket al.,Eds,1987,Molecular Cloning，A Laboratory Manual,2nd Ed.Cold SpringHarbor Press；Bolton and McCarthy,1962,PNAS 84:1390)。对于长度大于100个碱基的多核苷酸，典型的严格条件是杂交条件，例如，在6×SSC，0.2％SDS的溶液中预洗；在65℃，6×SSC，0.2％SDS杂交过夜；随后于65℃下在1×SSC，0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟，并且于65℃下在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟。
对于长度小于100个碱基的多核苷酸分子，示例性的严格杂交条件比Tm低5至10℃。平均而言，长度小于100bp的多核苷酸分子的Tm降低约(500/寡核苷酸长度)℃。
关于被称为肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)的DNA模拟物(Nielsen et al.,Science.1991 Dec 6；254(5037)：1497-500)，Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA杂合体，并且可以使用Giesen et al.,Nucleic Acids Res.1998 Nov l；26(21)：5004-6.中描述的公式进行计算。长度小于100个碱基的DNA-PNA杂合体的示例性严格杂交条件比Tm低5至10℃。
本发明的变体多核苷酸还包括与本发明的序列不同的多核苷酸，但由于遗传密码的简并性，其编码与由本发明的多核苷酸编码的多肽具有相似的活性的多肽。不改变多肽的氨基酸序列的序列改变是“沉默变异”。除了ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)以外，可以通过本领域公认的技术改变相同氨基酸的其他密码子，例如，以优化特定宿主生物体中的密码子表达。
导致所编码的多肽序列中一个或几个氨基酸的保守取代而不显著改变其生物活性的多核苷酸序列改变也包括在本发明中。本领域技术人员将知晓用于制备表型沉默的氨基酸取代的方法(参见，例如，Bowie et al.,1990,Science 247,1306)。
由于所编码的多肽序列中的沉默变异和保守取代而引起的变体多核苷酸可以使用来自NCBI(ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/blast/)的BLAST程序套件(版本2.2.5[2002年11月])的公众可获得的bl2seq程序来确定，通过如前所述的tbiastx算法。
多肽变体
关于多肽的术语“变体”包括天然存在的，重组和合成产生的多肽。变体多肽序列优选显示出与本发明的序列具有至少50％，更优选至少51％，更优选至少52％，更优选至少53％，更优选至少54％，更优选至少55％，更优选至少56％，更优选至少57％，更优选至少58％，优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少61％，更优选至少62％，更优选至少63％，更优选至少64％，更优选至少65％，更优选至少66％，更优选至少67％，更优选至少68％，更优选至少69％，更优选至少70％，更优选至少71％，更优选至少72％，更优选至少73％，更优选至少74％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少77％，更优选至少78％，更优选至少79％，更优选至少80％，更优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的同一性。在本发明多肽的至少20个氨基酸位置，优选至少50个氨基酸位置，更优选至少100个氨基酸位置，最优选全长的比较窗口上发现同一性。
多肽序列同一性可以以下列方式确定。使用bl2seq中的BLASTP(来自BLAST程序套件，版本2.2.5[2002年11月])，将目标多肽序列与候选多肽序列进行比较，其可以从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得。在一种实施方式中，使用bl2seq的默认参数。在另一种实施方式中，除了使用bl2seq的默认参数之外，除了应当关闭低复杂度部分的过滤之外。
也可以使用全局序列比对程序在候选和目标多核苷酸序列之间的重叠的全长上计算多肽序列同一性。如上所述的EMBOSS-needle(可以在http：/www.ebi.ac.uk/emboss/align/获得)和GAP(Huang，X.(1994)On Global Sequence Alignment.ComputerApplications in the Biosciences 10,227-235.)也是用于计算多肽序列同一性的合适的全局序列比对程序。
用于计算多肽序列同一性％的优选方法是以使用Clustal X进行比较的比对序列为基础(Jeanmougin et al.,1998,Trends Biochem.Sci.23,403-5.)。
变体多肽包括其中氨基酸序列与本文的多肽不同的多肽，通过一个或多个保守氨基酸的取代、缺失、添加或插入，而不影响肽的生物活性。保守取代通常包括一个氨基酸被具有相似特性的另一氨基酸所取代，例如，在下列组内的取代：缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
非保守取代将需要将这些类别中的一种的成员交换为另一类别的成员。
进化生物学序列的分析已经表明并非所有序列变化同样可能，至少部分反映了保守取代与非保守取代在生物水平上的差异。例如，某些氨基酸取代可以频繁发生，而其他氨基酸取代非常罕见。氨基酸残基中的进化改变或取代可以通过也被称为取代矩阵的评分矩阵来建模。这种矩阵被用于生物信息学分析以鉴定序列之间的关系，一个实例是以下(表4)所示的BLOSUM62矩阵。
表4：含有所有可能的取代评分的BLOSUM62矩阵[Henikoff and Henikoff，1992]。
所示的BLOSUM62矩阵用于产生在对应的列和行的交叉处发现的每个对齐的氨基酸对的评分。例如，从谷氨酸残基(E)到天冬氨酸残基(D)的取代评分为2。对角线显示未改变的氨基酸的评分。大多数取代变化具有负评分。矩阵仅包含整数。
确定适当的评分矩阵以产生指定序列集的最佳比对被认为在本领域的技术范围内。表1中的BLOSUM62矩阵也被用作BLAST搜索中的默认矩阵，但并不限于此。
其他变体包括具有影响肽稳定性的具有修饰的肽。这种类似物可以在肽序列中含有例如一个或多个非肽键(其代替肽键)。还包括的是含有除天然存在的L-氨基酸以外的(例如，D-氨基酸)或非天然存在的合成氨基酸以外的(例如，β或γ氨基酸)残基的类似物以及环状类似物
构建体，载体及其组成
术语“遗传构建体”是指多核苷酸分子，通常是双链DNA，其可以插入至另一多核苷酸分子(插入多核苷酸分子)，例如但不限于cDNA分子。遗传构建体可以含有允许转录插入多核苷酸分子和任选地将转录本翻译成多肽的必需元件。插入多核苷酸分子可以来自宿主细胞，或者可以来自不同的细胞或生物体和/或可以是重组多核苷酸。一旦在宿主细胞内，遗传构建体就可以整合到宿主染色体DNA中。遗传构建体可以连接到载体。
术语“载体”是指用于将遗传构建体转运到宿主细胞中的多核苷酸分子，通常是双链DNA。载体可以能够在至少一种另外的宿主系统(例如大肠杆菌)中复制。
术语“表达构建体”是指包括允许转录插入多核苷酸分子和任选地将转录本翻译成多肽的必需元件的遗传构建体。表达构建体通常在5'至3'方向上含有：
a)在构建体将被转化至其中的宿主细胞中具有功能的启动子，
b)待表达的多核苷酸，和
c)在构建体将被转化至其中的宿主细胞中具有功能的终止子。
在一种实施方式中，启动子和终止子中的至少一个相对于待表达的多核苷酸是异源的。在一种实施方式中，启动子相对于待表达的多核苷酸是异源的。在另一种实施方式中，终止子相对于待表达的多核苷酸是异源的。术语“异源的”是指彼此异源的序列，它们在自然界中并没有一起被发现。优选地，所述序列在自然界中没有被发现可操作地连接。在一种实施方式中，异源序列在不同的物种中被发现。然而，一个或多个异源序列也可以是合成产生的，并且根本不存在于自然界中。
术语“编码区”或“开放阅读框”(ORF)是指能够在合适的调控序列控制下产生转录产物和/或多肽的基因组DNA序列或cDNA序列的正义链。编码序列通过5'翻译起始密码子和3'翻译终止密码子的存在来鉴定。当被插入至遗传构建体中时，“编码序列”能够在其与启动子和终止子序列可操作地连接时被表达。
“可操作地连接”是指将目的序列(例如，待表达的序列)置于包含调控元件的另一序列的控制下，并且通常被连接到另一个序列，所述调控元件可以包括启动子、组织特异性调控元件、时间调控元件、增强子、阻抑物和终止子、5'-UTR序列、含有uORF的5'-UTR序列和uORF。
术语“非编码区”是指位于翻译起始位点上游和翻译终止位点下游的非翻译序列。这些序列也分别被称为5'-UTR和3'-UTR。这些区域包括转录起始和终止以及翻译效率调控所需的元件。
5'-UTR序列是转录起始位点与翻译起始位点之间的序列。
5'-UTR序列是由基因组DNA编码的mRNA序列。然而，如本文所使用的，术语5'-UTR序列包括编码5'-UTR序列的基因组序列，以及该基因组序列的互补序列和5'-UTR mRNA序列。
终止子是终止转录的序列，并且存在于翻译序列下游的基因的3'非翻译末端。终止子是mRNA稳定性的重要决定因素，并且在一些情况下已经发现具有空间调控功能。
术语“启动子”是指调控基因转录的编码区上游的顺式调控元件。启动子包含指定转录起始位点和保守盒(例如，TATA盒)的顺式引发子元件和由转录因子结合的基序。
“转基因”是通过转化被引入生物体的多核苷酸。转基因可以来自与引入转基因的生物体的物种相同的或不同的物种。转基因也可以是合成的，并且在自然界中不存在于任何物种中。
“转基因植物”是指由于遗传操作或转化而产生的含有新遗传物质的植物。新的遗传物质可以来自与所得转基因植物相同物种或来自不同物种的植物，或可以是合成的。
优选地，“转基因的”是由于转基因的存在而不同于在自然界中发现的任何植物。
“反向重复”是重复的序列，其中，重复的后半部分在互补链中，例如，
(5′)GATCTA.......TAGATC(3′)
(3′)CTAGAT.......ATCTAG(5′)
通读转录(read-through transcription)将产生经历互补碱基配对以形成发夹结构的转录本，条件是在重复区之间存在3-5bp间隔。
术语“改变本发明的多核苷酸或多肽的表达”和“改变的表达”旨在包括其中对应于本发明的多核苷酸的基因组DNA被修饰从而导致多核苷酸或多肽的表达改变的情况。基因组DNA的修饰可以通过遗传转化或本领域公知的用于诱导突变的其他方法。“改变的表达”可以与所产生的信使RNA和/或多肽的量的增加或减少相关，并且还可以由于所产生的多核苷酸和多肽的序列的改变而导致多肽的活性改变。
分离或产生多核苷酸的方法
本发明的多核苷酸分子可以通过使用本领域普通技术人员公知的多种技术被分离。举例来说，这样的多肽可以通过使用Mullis et al.(Mullis et al.,Eds.1994 ThePolymerase Chain Reaction，Birkhauser，通过引用并入本文)所述的聚合酶链反应(PCR)被分离。本发明的多肽可以使用本文定义的来源于本发明的多核苷酸序列的引物扩增。
用于分离本发明的多核苷酸的其他方法包括使用具有本文所示序列的多肽的全部或部分作为杂交探针。将标记的多核苷酸探针与固定在固体支持物如硝化纤维素滤膜或尼龙膜上的多核苷酸杂交的技术可以被用于筛选基因组或cDNA文库。示例性杂交和洗涤条件是：于65℃下在5.0×SSC，0.5％十二烷基硫酸钠，1×Denhardt's溶液中杂交20小时；在1.0×SSC，1％(w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤(于55℃下洗涤三次，每次20分钟)，并任选于60℃下在0.5×SSC，1％(w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤一次(20分钟)。任选的进一步洗涤(20分钟)可以在0.1×SSC，1％(w/v)十二烷基硫酸钠的条件下于60℃下进行。
本发明的多核苷酸片段可以通过本领域熟知的技术产生，例如，限制性内切核酸酶消化，寡核苷酸合成和PCR扩增。
在本领域熟知的方法中可以使用部分多核苷酸序列以鉴定相应的全长多核苷酸序列。这样的方法包括基于PCR的方法，5'RACE(Frohman MA，1993，Methods Enzymol.218：340-56)和基于杂交的方法，基于计算机/数据库的方法。此外，作为实例，反向PCR允许从基于已知区域的引物开始获得位于本文公开的多核苷酸序列侧翼的未知序列(Triglia etal.，1998，Nucleic Acids Res 16,8186，通过引用并入本文)。该方法使用几种限制酶在基因的已知区域中产生合适的片段。然后通过分子内连接将片段环化，并用作PCR模板。从已知区域设计不同的引物。为了物理地组装全长克隆，可以使用标准的分子生物学方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold SpringHarbor Press，1987)。
当从特定物种产生转基因植物时，使用来自该物种的一个序列或多个序列转化这样的植物可能是有益的。益处可以是减轻公众对生成转基因生物体中物种间转化的关注。此外，当基因的下调是预期的结果时，可能需要利用与植物中相同(或至少高度相似)的序列，以用于预期降低的表达。由于这些原因，期望能够鉴定和分离几种不同植物物种中特定基因的直系同源体。
变体(包括直系同源体)可以通过所述方法鉴定。
鉴定变体的方法
物理方法
可以使用基于PCR的方法(Mullis et al.，Eds.1994The Polymerase ChainReaction，Birkhauser)来鉴定变体多肽。通常地，能用于通过PCR扩增本发明的多核苷酸分子的变体的引物的多核苷酸序列可以基于编码相应氨基酸序列的保守区的序列。
可选地，可以使用本领域技术人员熟知的文库筛选方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press，1987)。当鉴定探针序列的变体时，相对于寻找精确序列匹配时，杂交和/或洗涤的严格性通常将降低。
多肽变体也可以通过物理方法鉴定，例如，通过使用针对本发明多肽产生的抗体筛选表达文库(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndEd.Cold Spring Harbor Press，1987)或通过鉴定借助于这样的抗体从天然来源获得多肽。
基于计算机的方法
本发明的变体序列，包括多核苷酸和多肽变体，也可以通过本领域技术人员熟知的基于计算机的方法，使用公共结构域序列比对算法和序列相似性搜索工具来搜索序列数据库(公共结构域数据库包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR和其他)。参见，例如，NucleicAcids Res.29：1-10and 11-16，2001的在线资源的实例。相似性搜索检索和比对靶序列以与待分析的序列(即，查询序列)进行比较。序列比较算法使用评分矩阵为每个比对分配总分。
用于鉴定序列数据库中的变体的示例性程序家族是BLAST程序套件(版本2.2.5[2002年11月])，包括BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和tBLASTX，它们可以从(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)被公共获得或来自于国家生物技术信息中心(NCBI)，国家医学图书馆，38A楼，8N805室，贝塞斯达，马里兰州20894美国。NCBI服务器还提供使用这些程序来筛选多个公共可用的序列数据库的设施。BLASTN将核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库进行比较。BLASTP将氨基酸查询序列与蛋白序列数据库进行比较。BLASTX将在所有阅读框中翻译的核苷酸查询序列与蛋白序列数据库进行比较。tBLASTN将蛋白查询序列与在所有阅读框中动态翻译的核苷酸序列数据库进行比较。tBLASTX将核苷酸查询序列的六帧翻译与核苷酸序列数据库的六帧翻译进行比较。BLAST程序可以以默认参数使用，或者可以根据需要改变参数以优化屏幕。
BLAST家族的算法(包括BLASTN、BLASTP和BLASTX)的使用描述于Altschul etal.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402,1997。
通过BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或类似算法产生的查询序列对一个或多个数据库序列的“命中”比对和鉴定序列的相似部分。命中按照相似度和序列重叠的长度的顺序排列。对数据库序列的命中通常表示仅被查询序列的序列长度的一部分的重叠。
BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和tBLASTX算法也产生比对的“期望”值。期望值(E)表示当搜索包含随机连续序列的相同大小的数据库时，可以“期望”偶然看到的命中的数目。期望值用作用于确定对数据库的命中是否表示具有真实相似性的显著性阈值。例如，分配给多核苷酸命中的E值为0.1被解释为意味着在所筛选的数据库的大小的数据库中，可以期望看到与具有相似分数的序列的比对部分的0.1个匹配。对于比对和匹配部分具有0.01或更小的E值的序列，使用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法在该数据库中偶然发现匹配的概率为1％或更小。
一组相关序列的多重序列比对可以使用CLUSTALW进行(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.and Gibson，T.J.(1994)CLUSTALW：improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting,positions-specific gappenalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Research，22:4673-4680，http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或T-COFFEE(CedricNotredame，Desmond G.Hegins，Jaap Heringa，T-Coffee：A novel method for fast andaccurate multiple sequence alignment，J.Mol.Biol.(2000)302：205-217)或PILEUP，其使用渐进式配对比对。(Feng and Doolittle，1987，J.Mol.Evol.25,351)。
模式识别软件应用程序能用于发现基序或标识序列。例如，MEME(Multiple Emfor Motif Elicitation,用于基序启动的多重Em)在一组序列中发现基序和标识序列，并且MAST(Motif Alignment and Search Tool)使用这些基序来鉴定查询序列中的相似或相同基序。MAST结果以一系列比对提供，具有适当的统计数据和所发现的基序的可视概况。MEME和MAST在加州大学圣地亚哥分校开发。
PROSITE(Bairoch and Bucher，1994，Nucleic Acids Res.22,3583；Hofmann etal.，1999，Nucleic Acids Res.27,215)是鉴定从基因组或cDNA序列翻译的未表征的蛋白的功能的方法。PROSITE数据库(www.expasy.org/prosite)包含具有生物学意义的模式和配置文件，并且被设计以使得其可以与合适的计算工具一起使用以将新序列分配给已知的蛋白家族或确定存在于序列中的已知结构域(Falquet et al.，2002，Nucleic AcidsRes.30,235)。Prosearch是一种可以搜索具有给定序列模式或标识的SWISS-PROT和EMBL数据库的工具。
分离多肽的方法
本发明的多肽，包括变体多肽，可以使用本领域熟知的肽合成方法制备，例如，使用固相技术的直接肽合成(例如，Stewart et al.，1969，在固相肽合成中，WH Freeman公司，旧金山，加利福尼亚州，或自动合成，例如。使用Applied Biosystems 431A肽合成仪(福斯特城，加利福尼亚州)。在这样的合成过程中也可以产生多肽的突变形式。
本发明的多肽和变体多肽也可以使用本领域熟知的多种技术(例如，Deutscher，1990，Ed，Methods in Enzymology，Vol.182，Guide to Protein Purification，)从天然来源纯化。
可选地，本发明的多肽和变体多肽可以在合适的宿主细胞中重组表达，并与细胞分离，如下所述。
修饰序列的方法
用于修饰蛋白序列或编码它们的多核苷酸序列的方法是本领域技术人员公知的。可以通过改变/修饰编码蛋白的序列并表达修饰的蛋白来适当地修饰蛋白的序列。可以应用诸如定点诱变的方法来修饰现有的多核苷酸序列。可选地，限制性内切核酸酶可以被用于切除现有序列的部分。改变的多核苷酸序列也可以以修饰形式被适当地合成。
产生构建体和载体的方法
本发明的遗传构建体包含一个或多个本发明的多核苷酸序列和/或编码本发明多肽的多核苷酸，并且能用于转化，例如，细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。本发明的遗传构建体旨在包括如本文所定义的表达构建体。
产生和使用遗传构建体和载体的方法是本领域熟知的，并且通常描述于Sambrooket al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press，1987；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing，1987)。
产生含有多核苷酸、构建体或载体的宿主细胞的方法
本发明提供了含有本发明的遗传构建体或载体的宿主细胞。宿主细胞可以来自于，例如，细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。
含有本发明的遗传构建体(例如表达构建体)的宿主细胞可以在本领域熟知的方法(例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.ColdSpring Harbor Press，1987；Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing，1987)中使用以用于重组生产本发明的多肽。这样的方法可以包括在适合于或有助于表达本发明多肽的条件下在合适的培养基中培养宿主细胞。然后可以任选地分泌到培养物中的表达的重组多肽可以通过本领域熟知的方法从培养基、宿主细胞或培养基中分离(例如，Deutscher,Ed,1990,Methods in Enzymology,Vol 1982,Guide to Protein Purification)。
生产含有构建体和载体的植物细胞和植物的方法
本发明还提供了含有本发明的遗传构建体的植物细胞和被修饰以改变本发明的多核苷酸或多肽的表达的植物细胞。含有这样的细胞的植物也形成本发明的一个方面。
使用多肽转化植物细胞、植物及其部分的方法描述于Draper et al.，1988，PlantGenetic Transformation and Gene Expression.A Laboratory Manual.BlackwellSci.Pub.Oxford，p.365；Potrykus and Spangenburg,1995,Gene Transfer toPlants.Springer-Verlag,Berlin.；and Gelvin et al.,1993,Plant MolecularBiol.Manual.Kluwer Acad.Pub.Dordrecht。转基因植物的综述，包括转化技术，在Galunand Breiman，1997，Transgenic Plants.Imperial College Press,London中提供。
植物遗传操作方法
许多植物转化策略是可用的(例如,Birch，1997，Ann Rev Plant Phys Plant MolBiol，48,297，Hellens RP,et al(2000)Plant Mol Biol 42：819-32，Hellens R et al(2005)Plant Meth 1：13)。例如，可以设计策略以增加多核苷酸/多肽在植物细胞、器官中和/或在其中/其正常表达时的特定发育阶段的表达，，或者在细胞、组织、器官中和/或在其中/其不正常表达时的特定发育阶段异位表达多核苷酸/多肽。表达的多核苷酸/多肽可以来自待转化的植物物种或可以来自不同的植物物种。可以设计转化策略以降低或消除植物细胞、组织、器官中或在其中/其正常表达时的特定发育阶段的多核苷酸/多肽的表达。这样的策略被称为基因沉默策略。
用于在转基因植物中表达基因的遗传构建体通常包括用于驱动一个或多个克隆的多核苷酸、终止子和选择标记序列的表达以排除在转化植物中存在遗传构建体。
适用于本发明的构建体的启动子在单子叶植物或双子叶植物的细胞、组织或器官中具有功能，并且包括细胞、组织和器官特异性启动子、细胞周期特异性启动子、时间启动子(temporal promoters)、诱导型启动子、在大多数植物组织中具有活性的组成型启动子和重组启动子。启动子的选择将取决于所需的克隆的多核苷酸的时间和空间表达。启动子可以是通常与目的转基因相关的启动子，或者来自其他植物、病毒和植物病原性细菌和真菌的基因的启动子。本领域技术人员无需过度实验即可选择适合用于使用含有本发明的多核苷酸序列的遗传构建体修饰和调节植物性状的启动子。组成型植物启动子的实例包括CaMV 35S启动子，胭脂碱合酶(nopaline synthase)启动子和章鱼碱合酶(octopinesynthase)启动子，以及来自玉米的Ubi 1启动子。在特定组织中具有活性，对内部发育信号或外部非生物或生物胁迫有反应的植物启动子在科学文献中已有描述。示例性启动子描述于例如WO 02/00894中，其通过引用并入本文。
通常用于植物转化遗传构建体的示例性终止子包括，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、根癌土壤杆菌胭脂碱合酶或章鱼碱合酶终止子、玉米蛋白基因(Zeamays zein gene)终止子、水稻(Oryza sativa)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子和马铃薯(Solanum tuberosum)PI-II终止子。
通常用于植物转化的选择标记包括赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因(NPT II)，赋予壮观霉素和链霉素抗性的aadA基因，用于Ignite(AgrEvo)和Basta(Hoechst)抗性的膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyl transferase)(bar基因)，和用于潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase)基因(hpt)。
使用含有报告基因(表达与宿主不相关的活性的编码序列，通常是酶活性和/或能用于植物中启动子表达分析的可视化信号(例如，荧光素酶、GUS、GFP))的遗传构建体。报道基因文献在Herrera-Estrella et al.，1993，Nature 303,209,and Schrott，1995，In：Gene Transfer to Plants(Potrykus，T.，Spangenberg.Eds)Springer Verlag.Berline，pp.325-336中进行综述。
基因沉默
如上所述，旨在降低或消除多核苷酸/多肽在植物细胞、组织、器官中或在其中/其正常表达时的特定发育阶段的表达的策略被称为基因沉默策略。
基因沉默策略可以关注于基因本身或影响编码的多肽的表达的调控元件。“调控元件”在此以最广泛的含义使用，并且包括与目的基因相互作用的其他基因。
旨在降低或沉默本发明的多核苷酸/多肽的表达的遗传构建体可以包括本文所述的全部或部分多核苷酸的反义拷贝。在这样的构建体中，多核苷酸相对于启动子和终止子以反义方向放置。“反义”多核苷酸通过反转多核苷酸或多核苷酸的区段来获得，使得产生的转录本将与基因的mRNA转录本互补，
5'GATCTA 3'(编码链) 3'CTAGAT 5'(反义链)
3'CUAGAU 5'mRNA 5'GAUCUCG 3'反义RNA
旨在用于基因沉默的遗传构建体还可以包括反向重复。“反向重复”是重复的序列，其中，重复的后半部分在互补链中，例如，
5′-GATCTA.........TAGATC-3′
3′-CTAGAT.........ATCTAG-5′
形成的转录本可以经历互补碱基配对以形成发夹结构。通常需要在重复区域之间具有至少3-5bp的间隔以允许发夹形成。
这样的构建体用于RNA干扰(RNAi)方法。
另一种沉默方法包括使用靶向作用于相当于miRNA的转录本的小反义RNA(Llaveet al.，2002，Science 297,2053)。明确考虑到对应于本发明的多核苷酸的此类小反义RNA的使用。
使用本文定义的表达构建体的转化还可以通过被称为正义抑制的过程导致基因沉默(例如，Napoli et al.，1990，Plant Cell 2,279；de Carvalho Niebel et al.，1995，Plant Cell，7，347)。在一些情况下，正义抑制可以包括整个或部分编码序列的过表达，但还可以包括基因的非编码区的表达，例如，内含子或5'或3'非翻译区(UTR)。嵌合部分正义构建体可以被用于协调沉默多个基因(Abbott et al.，2002，Plant Physiol.128(3)：844-53；Jones et al.，1998，Planta 204：499-505)。也考虑使用这样的正义抑制策略来沉默靶多核苷酸/基因。
旨在用于基因沉默的遗传构建体中的多核苷酸插入片段可以对应于编码序列和/或非编码序列，例如，启动子和/或内含子和/或5'或3'-UTR序列或相应的基因。
优选地，在用于沉默靶基因的构建体(例如，反义、正义抑制或RNAi构建体)中使用的插入序列包含长度为至少21个核苷酸的插入序列，其长度与靶基因相对应或互补。
其他基因沉默策略包括显性失活方法和核酶构建体的使用(Mclntyre，1996，Transgenic Res，5,257)。
可以通过基因本身或其调控元件的突变引起转录前沉默。这样的突变可以包括点突变、移码，插入、缺失和取代。
本领域公知的其他几种方法可以被用于改变、降低或消除根据本发明的多核苷酸和/或多肽的表达。这样的方法包括但不限于Tilling(Till et al.，2003，Methods MolBiol，2％，205)，所谓的“Deletagene”技术(Li et al.，2001，Plant Journal 27(3)，235)和使用人工转录因子，例如，合成的锌指转录因子(例如，Jouvenot et al.，2003，GeneTherapy 10,513)。另外，靶向作用于特定多肽的抗体或其片段也可以在植物中表达以调节该多肽的活性(Jobling et al.，2003，Nat.Biotechnol.，21(1)，35)。也可以应用转座子标签方法。此外，与本发明的多肽相互作用的肽可以通过如相位显示(Dyax公司)技术进行鉴定。这种相互作用的肽可以在植物中表达或应用于植物以影响本发明多肽的活性。特别考虑使用上述方法中的每一种来改变本发明的核苷酸和/或多肽的表达。
修饰植物中的内源DNA序列的方法
修饰植物中的内源基因组DNA序列的方法是本领域技术人员公知的。这样的方法可以包括使用在目的基因中产生靶向双链DNA断裂的序列特异性核酸酶。用于植物的这些方法的实例包括：锌指核酸酶(Curtin et al.，2011.Plant Physiol.156：466-473.；Sander，et al.，2011.Nat.Methods 8：67-69.)、转录激活子样效应物核酸酶或“TALEN”(Cermak et al.，2011，Nucleic Acids Res.39：e82；Mahfouz et al.，2011Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108：2623-2628；Li et al.，2012Nat.Biotechnol.30：390-392)和LAGLIDADG归巢核酸内切酶，也被称为“大范围核酸酶”(Tzfira et al.，2012.PlantBiotechnol.J.10：373-389)。
在本发明的某些实施方式中，这些技术中的一种(例如，TALEN或锌指核酸酶)可以被用于修饰靶基因中的一个或多个碱基对以使其失活，因此，其不再是可转录的和/或可翻译的。
使用工程核酸酶，例如，聚簇、规则间隔、短回文重复(CRISPR)技术的靶向基因组编辑是用于产生具有可定制特异性的RNA-引导的核酸酶(例如Cas9)的重要新方法。通过这些核酸酶介导的基因组编辑已经被用于快速地、简易地和有效地修饰多种生物医学上重要的细胞类型中的内源基因和在传统上具有挑战性以操纵遗传学的生物体。已经开发了CRISPR-Cas9系统的改进版本以获得能够调控内源基因表达或在活细胞中标记特定基因座的异源结构域(Nature Biotechnology 32,347-355(2014))。该系统适用于植物，并且可以被用于调节靶基因的表达(Bortesi and Fischer，Biotechnology Advances，Volume 33，Issue 1，January-February 2015，Pages 41-52)。
因此，本领域技术人员将理解的是存在多种可以降低或消除靶基因/多核苷酸/多肽的表达的方法。任何这样的方法都包括在本发明的范围内。
转化方案
以下是代表性的出版物，其公开了可以被用于遗传转化下列植物物种的遗传转化方案：水稻(Alam et al.，1999，Plant Cell Rep.18,572)；苹果(Yao et al.，1995，PlantCell Reports 14,407-412)；玉米(美国专利序列号5,177,010和5,981,840)；小麦(Ortizet al.，1996，Plant Cell Rep.15,1996,877)；番茄(美国专利序列号5,159,135)；马铃薯(Kumar et al.，1996Plant J.9：821)；木薯(Li et al.，1996Nat.Biotechnology 14,736)；莴苣(Michelmore et al.，1987，Plant Cell Rep.6,439)；烟草(Horsch et al.，1985，Science 227,1229)；棉花(美国专利序列号5,846,797和5,004,863)；草(美国专利号5,187,073和6,020,539)；薄荷(Niu et al.，1998，Plant Cell Rep.17,165)；柑橘属植物(Pena et al.，1995，Plant Sci.104,183)；香菜(caraway)(Krens et al.，1997，PlantCell Rep，17,39)；香蕉(美国专利序列号5,792,935)；大豆(美国专利号5,416,011；5,569,834；5,824,877；5,563,04455和5,968,830)；菠萝(美国专利序列号5,952,543)；杨树(美国专利号4,795,855)；常规的单子叶植物(美国专利号5,591,616和6,037,522)；芸苔属植物(美国专利号5,188,958；5,463,174和5,750,871)；谷类(美国专利号6,074,877)；梨(Matsuda et al.，2005，Plant Cell Rep.24(1)：45-51)；李属植物(Prunus)(Ramesh etal.，2006Plant Cell Rep.25(8)：821-8；Song and Sink 2005Plant Cell Rep.2006；25(2)：117-23；Gonzalez Padilla et al.，2003Plant Cell Rep.22(1)：38-45)；草莓(Oosumi et al.，2006Planta.223(6)：1219-30；Folta et al.，2006Planta Apr 14；PMID：16614818)，玫瑰(Li et al.，2003)，悬钩子属植物(Rubus)(Graham et al.，1995MethodsMol Biol.1995；44：129-33)，番茄(Dan et al.，2006，Plant Cell Reports V25：432-441)，苹果(Yao et al.，1995，Plant Cell Rep.14,407-412)和猕猴桃(Wang et al.，2006，Plant Cell Rep.25,5：425-31)。其他物种的转化也是本发明所考虑的。合适的其他方法和方案可以在科学文献中获得。
植物
术语“植物”旨在包括完整的植物、植物的任何部分、植物的繁殖体和子代。
术语“繁殖体”是指可以被用于生殖或繁殖的植物的任何部分，无论是有性的还是无性的，包括种子和插枝。
本发明的植物可以生长并且可以自交或与不同的植物品系杂交，并且得到的来自两代或更多代的后代(off-spring)也形成本发明的一个方面。优选地，所述后代保留根据本发明的构建体、转基因或修饰。
概述
在本说明书中，已经参考专利说明书、其他外部文件或其他信息源，这通常是为了提供讨论本发明的特征的背景。除非另有特别说明，否则对这样的外部文件的引用不应被解释为承认在任何管辖区中这种文件或这种信息源是现有技术或形成本领域的公知常识的一部分。
本说明书中使用的术语“含有(comprising)”是指“至少部分地由...组成”。当解释本说明书中包括术语“含有”的每个语句时，还可以存在除该术语之外的特征或那些以该术语为开端的特征。诸如“含有(comprise)”和“含有(comprises)”的相关术语以相同的方式解释。
在某些实施方式中，术语“包括(comprising)”和相关术语如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”可以用“组成(consisting)”和相关术语如“组成(consist)”和“组成(consists)”替代。
本发明还可以被广泛地说成包括单独地或共同地在本申请的说明书中提及或表明的部分、元件和特征，以及任何两个或更多个所述部分、元件或特征的任何或所有组合，并且其中本文中提及的具有本发明所涉及领域中已知的等同物的特定整数，这样的已知等同物被认为并入本文，如同单独阐述一样。
附图说明
参考附图将更好地理解本发明，其中：
图1显示了在拟南芥和苹果中AGAMOUS簇样MADS盒基因。
图2显示了MdAG(SEQ ID NO：1)与AtAG(SEQ ID NO：X)的比对。
图3显示了MdAG(SEQ ID NO：1)与公开的MdMADS15(SEQ ID NO：30)的比对。
图4显示了在未转化的(WT)苹果和表现出ag表型的2个独立的ag RNAi转基因株系(AS2905和AS2921)中的AG-样基因的表达分析。
图5显示了苹果中AG抑制的花表型。ag(AS2921)突变体显示出花瓣和萼片的轮生。
图6显示了通过使用GA/IAA处理ag(AS205)花以生成苹果。这些苹果具有推向calex的减少的核组织。
图7显示了通过使用GA/IAA/细胞分裂素处理ag(AS2921)花产生苹果。该苹果没有明显的核组织。
图8显示了pTKO2S_262928的图谱，MdAG序列显示为绿色箭头(KO seq)。
图9显示了蛋白MdAG(SEQ ID NO：1)、MdPI(SEQ ID NO：7)、MdTM6(SEQ ID NO：13)和MdMADS13(SEQ ID NO：14)的保守MADS结构域和K结构域。
实施例
现在将参考以下非限制性实施例说明本发明。
这并不是希望将本发明的范围仅限于上述实施例。本领域技术人员将理解的，在不脱离本发明的范围的情况下，许多变化是可能的。
实施例1：通过降低Agamous(AG)基因的表达和激素的施用来生产无核果实。
基因鉴定
拟南芥中的AG簇由AG、SEEDSTICK(STK)和SHATTERPROOF(SHP)1和2这4个基因组成。苹果中的古基因组重复意味着对于这些拟南芥基因中的每一个存在两个相似的苹果基因。
使用苹果基因组(Velasco et al.，2010)，苹果MDP0000324166和同源基因MDP0000250080)与拟南芥AG(atAG)最相似，参见图1。
第一个MDP0000324166已被公布为MADS15(SEQ ID NO：30，van der Linden etal.，2002)。编码MADS15的DNA序列如SEQ ID NO：31所示。
申请人鉴定了苹果栽培品种皇家嘎啦(Royal Gala)的等同基因，并将其命名为MdAG。MdAG蛋白和编码该蛋白的多核苷酸的序列分别如SEQ ID NO：1和4所示。
MdAG和AtAG蛋白的比对如图2所示。
表达分析
根据发育的(前花期，balloon stage)花和盛开的花的mRNA序列的基因的表达分析表明与MDP0000250080MADS 115相比，MDP0000324166/MADS15/MdAG在苹果的花中表达更高。
MDP0000324166/MADS15/MdAG的RNAi抑制导致较低的转录本丰度(图3)以及STK样和SHP样基因的下调(可能预期这些基因都是在定义不同心皮结构的拟南芥中AG的下游)。该分支以外的下一个最相似的基因(SOC样)不受影响(图3)。
MdAG被抑制的植物的产生
含有SEQ ID NO：4所示的MdAG基因的头403bp
(ATGGCCTATGAAAGCAAATCCTTGTCCTTGGACTCTCCCCAGAGAAAATTGGGTAGGGGAAAGATCGAGATTAAGCGGATCGAAAACACAACGAATCGTCAAGTGACCTTCTGCAAGAGGCGCAATGGGTTGCTCAAGAAGGCCTATGAACTCTCTGTGCTCTGTGATGCAGAGGTTGCTCTCATAGTCTTCTCTAACCGTGGCCGCCTCTATGAGTATGCCAACAATAGTGTTAAAGGAACAATTGAGAGGTACAAGAAGGCAAGTGCAGATTCTTCAAATACTGGATCAGTTTCTGAAGCTAGTACTCAGTACTACCAGCAAGAAGCTGCGAAATTGCGTGCGCAGATAGTGAAATTGCAGAATGACAACCGGAATATGATGGGTGATGCATTGAGTAGTATGTCTGTCAAGGACCTGAAGAGCCTGG-SEQ ID NO：25)的发夹构建体被克隆至pDONOR(Invitrogen)并且以反向重复的方式被插入至入门(gateway)相容的pTKO2载体(图8)。这些被转化成“皇家嘎拉”苹果，如(Yao et al.，1995)所述。
发夹敲除载体pTKO2S_262928(EST 262928)
采用Gateway技术(Invitrogen)，使用pTKO2(Snowden et al.2005)构建发夹敲除载体pTKO2S_262928(EST 262928)。
使用引物262928_F(Gateway attB1-atggcctatgaaagcaaatcc-SEQ ID NO：26)和262928_R(Gateway attB2-CCAGGCTCTTCAGGTCCTTG-SEQ ID NO：27)在pBluescript(SK-)EST_262928上进行PCR，得到PCR产物430bp。
在Techne Pro基因循环仪中，在10ng模板DNA上使用0.5mM的每种引物，0.8mMdNTP，1×Taq DNA聚合酶缓冲液，0.5U Expand High Fidelity Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)进行扩增：94℃(3min)，接着是94℃(30s)，60℃(45s)，68℃(1min)的30个循环。
按照制造商(Invitrogen)的推荐进行与PCR产物和pDONR的Gateway BP反应。使用Wizard Plus Miniprep DNA纯化系统(Promega)分离所得转化体的质粒DNA，通过对pENTRY_262928(430bp插入片段)的限制性酶分析验证正确的构建体。
根据制造商(Invitrogen)的推荐进行具有所得pENTRY_262928载体和目的载体pTKO2的Gateway LR反应。
通过限制性酶分析验证最终的构建体。
pTKO2S_262928的图谱如图8所示。
RNAi抑制株系的表型
AG被抑制的苹果具有花转化为萼片和花瓣的轮状体，这些可以在图4中看到。这与当在其他物种(例如拟南芥)中敲除AG时的文献(Yanofsky et al.，1990)相一致。
被抑制的株系中的一种(AS2905)的显微镜结果表明在更多的器官的向顶轮生体中存在明显的残留胚珠和可能的花粉样形成物(图5)。
单性结实的诱导
可以使用激素处理或遗传学上使用(Sotelo-Silveira et al.，2014)中详细描述的某些基因的调节来诱导单性结实(未经授粉而产生果实)。
在苹果中，已经进行了广泛的工作以诱导单性结实，仅GA3、SD8339和2-NAA的三重组合而不是单一或配对应用导致考克斯橙苹(Kotob&Schwabe，1971)单性结实，并且，霜冻损伤的Bramley幼苗的单性结实单独诱导的GA4+7和细胞分裂素SD8339不具有额外的益处；GA3是无效的。也就是说，Bramley幼苗是三倍体且部分自育(self-fertile)，所以这可能是一种不常见的情况(Modlibowska 1972)。
为了诱导ag苹果的单性结实，将使用不同浓度的赤霉素(GA)、生长素(IAA)和细胞分裂素(BAP)以及它们的不同组合的处理应用于花。激素浓度：300ppm GA 4和1ppm IAA，和300ppm GA4，100ppm 6-BA和1ppm IAA。
所有处理在约-7DAFB的阶段开始。所有花于-7，-4和+1DAFB进行处理，大多数花共进行三次处理，小部分花进行四次处理。
基因型 处理 信息 花 最终的果实数量
野生类型 GA/IAA 22 110 5 4.5％
GA/IAA/BA 23 115 7 6.1％
AS2905 GA/IAA 22 110 1 0.9％
AS2921 GA/IAA/BA 8 40 1 2.5％
使这些苹果生长至成熟，然后收获它们并评估核的存在。来自含有部分胚珠的转基因株系的苹果能够单独使用GA和IAA诱导。具有更严格表型(无胚珠组织)的转基因株系需要细胞分裂素(图5)。
核减少和无核苹果的性质
核减少的和无核苹果分别如图6和7所示。与未转化的对照相比，核减少的苹果(图6)具有更少的腔组织且肉组织的相对量增加。由于胚珠(核)组织完全不存在(图7)，不存在带有组织的腔体或种子，并且果肉组织分布在整个苹果中。
实施例2：通过降低AG和AP3样基因的表达生产无核果实
本领域技术人员将理解的是不表达AP3样基因的苹果植株是单性结实的(Yao etal.，2001)。因此，根据本发明，抑制AG和AP3样基因(诱导单性结实)导致植物结出无核果实。
用于抑制AP3样基因的发夹构建体
为了抑制两个苹果AP3样基因、MdMADS13和MdTm6，含有MdMADS13(SEQ ID NO：20)的头414bp
(ATATATCAAGTAAAACAAGATCAGAAAATTGCTAGGAAAAGGTAAGAAATTTGAGAGAGAGAGAGAAATTATGGGTCGTGGGAAGATTGAAATCAAGCTGATCGAAAACCAGACCAACAGGCAGGTGACCTACTCCAAGAGAAGAAATGGGATCTTCAAGAAGGCTCAGGAGCTCACCGTTCTCTGTGATGCCAAGGTCTCCCTCATTATGCTCTCCAACACTAATAAAATGCACGAGTATATCAGCCCTACCACTACGACCAAGAGTATGTATGATGACTATCAGAAAACTATGGGGATCGATCTGTGGAGGACACACGAGGAGTCGATGAAAGACACCTTGTGGAAGTTGAAAGAGATCAACAATAAGCTGAGGAGAGAGATCAGGCAGAGGTTGGGCCATGATCTAAATGG-SEQ ID NO：28的发夹结构可以被克隆至pDONOR(Invitrogen)中，并且以反向重复的方式被插入至gateway相容的pTKO2载体(Snowden etal.，2005)。该构建体将抑制MdTM6和MdMADS13，因为该区域中的DNA序列在两个基因之间是高度保守的。
转化
为了抑制AG和AP3样基因，该构建体和MdAG抑制构建体(如实施例1所述)均可以如实施例1和Yao et al.，1995中所述的被转化至“皇家嘎啦”苹果中。
含有两种基因构建体的转基因植物可以使用PCR分析进行鉴定并在温室中生长以用于果实生产和表型分析。
这将导致苹果植株具有降低的或消除的MdAG和AP3样基因的表达，从而结出无核果实。
实施例3：通过降低AG和PI基因的表达生产无核果实
本领域技术人员将理解的是不表达PI基因的苹果植株是单性结实的(Yao etal.，2001)。因此，根据本发明，抑制AG和PI基因导致植物结出无核果实。
用于抑制PI基因的发夹构建体
为了抑制两个苹果MdPI，含有MdPI(SEQ ID NO：20)的头414bp
(ATGGGACGTGGGAAGGTTGAGATCAAGAGGATTGAGAACTCAAGTAACAGGCAGGTGACCTACTCCAAGAGGAGGAATGGGATTATCAAGAAGGCAAAGGAGATCACTGTTCTATGTGATGCTAAAGTATCTCTTATCATTTATTCTAGCTCTGGGAAGATGGTTGAATACTGCAGCCCTTCAACTACGCTGACAGAAATCTTGGACAAATACCATGGACAATCTGGGAAGAAGTTGTGGGATGCtAAGCATGAGAACCTCAGCAATGAAGTGGATAGAGTCAAGAAAGACAATGACAGCATGCAAGTAGAGCtCAGGCATCTGAAGGGAGAGGATATCACATCATTGAACCATGTAGAGCTGATGGCCTTAGAGGAAGCACTTGAAAATGGCCTTACAAGTATCCGGGACAAG-SEQ ID NO：29的发夹结构可以被克隆至pDONOR(Invitrogen)中，并且以反向重复的方式被插入至gateway相容的pTKO2载体(Snowden etal.，2005)。
转化
为了抑制MdAG和MDPI基因，该构建体和MdAG抑制构建体(如实施例1所述)均可以如实施例1和Yao et al.，1995中所述的被转化至“皇家嘎啦”苹果中。
含有两种基因构建体的转基因植物可以使用PCR分析进行鉴定并在温室中生长以用于果实生产和表型分析。
这将导致苹果植株具有降低的或消除的MdAG和MdPI基因的表达，从而结出无核果实。
实施例4：通过降低Pistilata(PI)突变体中AG的表达以生产无核果实
本领域技术人员将理解的是不表达MdPI基因的苹果植株是单性结实的(Yao etal.2001)。因此，根据本发明，在不表达PI基因的植物中抑制AG导致结无核果实的植物产生。
旨在抑制MdAG(如实施例1所述，并且如图8所示)的发夹构建体可以被转移至不表达苹果MdPI基因(Yao et al.2001)的'Rae Ime'苹果突变体中，使用如实施例1中所述的方法。
这将导致苹果植株具有降低的或消除的MdAG和MdPI的表达，从而结出无核果实。
实施例5：通过非转基因手段结出无核果实的结果植物
根据本发明，具有抑制的或消除的AG和PI，或AG和AP3样基因表达的苹果植株将结出无核果实。
可以通过使用有性杂交与天然苹果突变体相结合产生具有降低的或消除的AG和PI表达的苹果植株。首先，鉴定苹果AG基因的天然突变体。AG被抑制的苹果具有增加的花瓣轮生体，并且因此可以在现有栽培品种中选择。
申请人在其种质收集物中鉴定了具有苹果变体的AG的天然突变体，例如，草原海棠'Plena'，其显示出与实施例1中所述的AG抑制转基因植物具有相似的表型。
可以任选地选择具有这种表型的植物用于全基因组测序以鉴定AG基因中的突变，以及用于q-RT-PCR分析以证实降低的或消除的AG基因的表达。可选地，可以筛选AG基因的表达首先降低的植物。
AG突变植物可以通过本领域技术人员熟知的方法与单性结实的植物，例如，本文所述的PI突变体杂交。
例如，AG和PI突变体可以例如通过使用快速开花的“皇家嘎拉”苹果品系的快速渐渗育种与高果实质量相组合。已经通过开花促进基因的过表达建立了“皇家嘎拉”苹果转基因株系。该株系从组织培养被移植到温室中几个星期后开花。该株系的幼苗预期在一年内开花，即每代一年，而正常苹果植株的每代为6-8年。
所得植物具有降低的或消除的MdAG和MdPI的表达，其将结出无核果实。
如果含有AG和PI突变的变体的果实品质差，则可以通过本领域技术人员公知的方法进行优质苹果品种的多次回交，以保持将来的无核苹果的栽培品种具有高果实品质。
参考文献
Kotob M，Schwabe W.1971.Induction of parthenocarpic fruit in Cox′sOrange Pippin apples.J Hort Sci.
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<150> NZ 628200
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<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 243
<212> PRT
<213> Malus domestica
<400> 1
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Thr Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Ser Ala Asp Ser Ser Asn Thr Gly
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<212> DNA
<213> Malus domestica
<400> 4
atggcctatg aaagcaaatc cttgtccttg gactctcccc agagaaaatt gggtagggga 60
aagatcgaga ttaagcggat cgaaaacaca acgaatcgtc aagtgacctt ctgcaagagg 120
cgcaatgggt tgctcaagaa ggcctatgaa ctctctgtgc tctgtgatgc agaggttgct 180
ctcatagtct tctctaaccg tggccgcctc tatgagtatg ccaacaatag tgttaaagga 240
acaattgaga ggtacaagaa ggcaagtgca gattcttcaa atactggatc agtttctgaa 300
gctagtactc agtactacca gcaagaagct gcgaaattgc gtgcgcagat agtgaaattg 360
cagaatgaca accggaatat gatgggtgat gcattgagta gtatgtctgt caaggacctg 420
aagagcctgg agaataaact ggagaaagca attagcagaa tccgatccaa aaagaatgag 480
ctcttgtttg ccgaaattga gtacatgcag aaaagggaac tggacttgca caacaataac 540
cagctcctac gagcaaagat agctgagaat gagaggggcc agcagaacat aaatgtgatg 600
gctggaggag gaagttatga gatcctgcag tctcagccat acgactctcg ggactatttc 660
caagtgaacg tgttacaacc caatcatcac tacaatcccc gccacgatca gatttccctt 720
caattagtat gaatgatcaa gattgctttg ggaatgaaga ccgttggtac caagtacgta 780
ggcatacgta cgtattttag tatatgaaag cggatttctc gtctgtattt ttatatttat 840
gcctgcagca atgtgtacta ctaagatttc tgtgagaaat taccctaaca agttcctcca 900
acttacatgt gaaaaaaaaa aaa 923
<210> 5
<211> 729
<212> DNA
<213> Pyrus bretschneideri
<400> 5
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aagatcgaga ttaagcggat cgaaaacacg acaaatcgtc aagtgacctt ctgcaagagg 120
cgcaatgggt tgctcaagaa ggcctatgaa ctctctgtgc tctgtgatgc cgaggttgct 180
ctcgtagtct tctctaaccg tggccgcctc tatgagtatg ccaacaatag tgttaaagga 240
acaattgaga ggtacaagaa ggcatgtgca gattcttcaa atactggatc agtttctgaa 300
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caattagta 729
<210> 6
<211> 729
<212> DNA
<213> Pyrus communis
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cgcaatgggt tgcttaagaa ggcctatgaa ctctctgtgc tctgtgatgc tgaggttgct 180
ctcatagtct tctctaaccg tggccgcctc tatgagtatg ccaacaatag tgttaaagga 240
acaattgaga ggtacaagaa ggcatgtgca gattcttcaa atactggatc agtttctgaa 300
gctagtactc agtactacca gcaagaagct gcgaaattgc gtgcgcagat agtgaaattg 360
cagaatgaca accggaatat gatgggtgat gcattgagta gtatgtctgt caaggacctg 420
aagagcctgg agaataaact ggagaaagga attagcagaa tccgatccaa aaagaatgag 480
ctcttgtttg ccgaaattga gtacatgcag aaaagggaac tggacttgca caacaataac 540
cagctcctac gagcaaagat agctgagaat gagaggggcc agcagaacat aaatgtaatg 600
gctggaggag gaagctatga gatcctgcag tctcagccat acgactctcg ggactatttc 660
caagtgaacg tgttacaacc caataatcac tacaatcccc gccacgatca gatttcccta 720
caattagta 729
<210> 7
<211> 215
<212> PRT
<213> Malus domestica
<400> 7
Met Gly Arg Gly Lys Val Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Ser Ser Asn
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Ile Lys Lys Ala
20 25 30
Lys Glu Ile Thr Val Leu Cys Asp Ala Lys Val Ser Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Ser Ser Ser Gly Lys Met Val Glu Tyr Cys Ser Pro Ser Thr Thr Leu
50 55 60
Thr Glu Ile Leu Asp Lys Tyr His Gly Gln Ser Gly Lys Lys Leu Trp
65 70 75 80
Asp Ala Lys His Glu Asn Leu Ser Asn Glu Val Asp Arg Val Lys Lys
85 90 95
Asp Asn Asp Ser Met Gln Val Glu Leu Arg His Leu Lys Gly Glu Asp
100 105 110
Ile Thr Ser Leu Asn His Val Glu Leu Met Ala Leu Glu Glu Ala Leu
115 120 125
Glu Asn Gly Leu Thr Ser Ile Arg Asp Lys Gln Ser Lys Phe Val Asp
130 135 140
Met Met Arg Asp Asn Gly Lys Ala Leu Glu Asp Glu Asn Lys Arg Leu
145 150 155 160
Thr Tyr Glu Leu Gln Lys Gln Gln Glu Met Lys Ile Lys Glu Asn Val
165 170 175
Arg Asn Met Glu Asn Gly Tyr His Gln Arg Gln Leu Gly Asn Tyr Asn
180 185 190
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195 200 205
Pro Asn Leu Gln Glu Arg Ile
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<210> 8
<211> 217
<212> PRT
<213> Pyrus communis
<400> 8
Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Ser Ser Asn
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Ile Lys Lys Ala
20 25 30
Lys Glu Ile Thr Val Leu Cys Asp Ala Lys Val Ser Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Ser Ser Ser Gly Lys Met Val Glu Tyr Cys Ser Pro Ser Thr Thr Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Ala Lys His Glu Asn Leu Ser Asn Glu Val Asp Arg Val Lys Lys
85 90 95
Asp Asn Asp Ser Met Gln Val Glu Leu Arg His Leu Lys Gly Glu Asp
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Ile Thr Ser Leu Asn His Leu Glu Leu Met Ala Leu Glu Glu Ala Leu
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Glu Asn Gly Leu Thr Ser Ile Arg Asp Lys Gln Ala Ser Phe Phe His
130 135 140
Tyr Ser Tyr Phe Lys Gln Ser Gly Lys Ala Leu Glu Asp Glu Asn Lys
145 150 155 160
Arg Leu Thr Tyr Glu Leu Gln Lys Gln Gln Glu Met Lys Ile Asp Glu
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Asn Val Arg Asn Met Glu Asn Gly Tyr His Gln Arg Gln Leu Gly Asn
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Tyr Asn Asn Thr Gln Gln Gln Ile Pro Phe Ala Phe Arg Val Gln Pro
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Ile Gln Pro Asn Leu Gln Glu Arg Ile
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<211> 215
<212> PRT
<213> Pyrus bretschneideri
<400> 9
Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Ser Ser Asn
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Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Ile Lys Lys Ala
20 25 30
Lys Glu Ile Thr Val Leu Cys Asp Ala Lys Val Ser Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Ser Ser Ser Gly Lys Met Val Glu Tyr Cys Ser Pro Ser Thr Thr Leu
50 55 60
Thr Glu Ile Leu Asp Lys Tyr His Gly Gln Ser Gly Lys Lys Leu Trp
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Asp Ala Lys His Glu Asn Leu Ser Asn Glu Val Asp Arg Val Lys Lys
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Asp Asn Asp Ser Met Gln Val Glu Leu Arg His Leu Lys Gly Glu Asp
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Ile Thr Ser Leu Asn His Val Glu Leu Met Ala Leu Glu Glu Ala Leu
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Glu Asn Gly Leu Thr Ser Ile Arg Asp Lys Gln Ser Lys Phe Val Asp
130 135 140
Met Met Arg Asp Asn Gly Lys Ala Leu Glu Asp Glu Asn Lys Arg Leu
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Thr Tyr Glu Leu Gln Lys Gln Gln Glu Met Lys Ile Gly Glu Asn Val
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Pro Asn Leu Gln Glu Arg Ile
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<213> Malus domestica
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gg 842
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<210> 12
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<212> DNA
<213> Pyrus bretschneideri
<400> 12
atggggaggg gtaagattga gatcaagagg attgagaact caagtaacag gcaggtgacc 60
tactccaaga ggaggaatgg gattatcaag aaggcaaagg agatcactgt tttatgtgat 120
gctaaagtat ctcttatcat ttattctagc tctgggaaga tggttgaata ctgcagccct 180
tcaactacgc tgacagaaat cttggataaa taccatggcc aatctgggaa gaagttgtgg 240
gatgctaagc atgagaacct cagcaatgaa gtggatagag tcaagaaaga caatgacagc 300
atgcaagtag agctcaggca tctgaaggga gaggatatca catcattgaa ccatgtagag 360
ctgatggcct tagaggaagc acttgaaaat ggccttacaa gtatccggga caagcagtcc 420
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<211> 242
<212> PRT
<213> Malus domestica
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Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Leu Ile Glu Asn Gln Thr Asn
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Phe Lys Lys Ala
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Gln Glu Leu Thr Val Leu Cys Asp Ala Lys Val Ser Leu Ile Met Leu
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Ser Asn Thr Ser Lys Met His Glu Tyr Ile Ser Pro Thr Thr Thr Thr
50 55 60
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Ile Asn Asn Lys Leu Arg Arg Glu Ile Arg Gln Arg Leu Gly His Asp
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Leu Asn Gly Leu Ser Tyr Asp Asp Leu Arg Ser Leu Glu Asp Lys Met
115 120 125
Gln Ser Ser Leu Asp Ala Ile Arg Glu Arg Lys Tyr His Val Ile Lys
130 135 140
Thr Gln Thr Glu Thr Thr Lys Lys Lys Val Lys Asn Leu Glu Glu Arg
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Arg Gly Asn Met Leu His Gly Tyr Glu Ala Ala Ser Glu Asn Pro Gln
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Tyr Cys Tyr Val Asp Asn Glu Gly Asp Tyr Glu Ser Ala Leu Val Leu
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Ala Asn Gly Ala Asn Asn Leu Tyr Thr Phe Gln Leu His Arg Asn Ser
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Asp Gln Leu His His Pro Asn Leu His His His Arg Gly Ser Ser Leu
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Gly Ser Ser Ile Thr His Leu His Asp Leu Arg Leu Ala Arg Ile Gly
225 230 235 240
Ile Asn
<210> 14
<211> 232
<212> PRT
<213> Malus domestica
<400> 14
Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Leu Ile Glu Asn Gln Thr Asn
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Phe Lys Lys Ala
20 25 30
Gln Glu Leu Thr Val Leu Cys Asp Ala Lys Val Ser Leu Ile Met Leu
35 40 45
Ser Asn Thr Asn Lys Met His Glu Tyr Ile Ser Pro Thr Thr Thr Thr
50 55 60
Lys Ser Met Tyr Asp Asp Tyr Gln Lys Thr Met Gly Ile Asp Leu Trp
65 70 75 80
Arg Thr His Glu Glu Ser Met Lys Asp Thr Leu Trp Lys Leu Lys Glu
85 90 95
Ile Asn Asn Lys Leu Arg Arg Glu Ile Arg Gln Arg Leu Gly His Asp
100 105 110
Leu Asn Gly Leu Ser Phe Asp Glu Leu Ala Ser Leu Asp Asp Glu Met
115 120 125
Gln Ser Ser Leu Asp Ala Ile Arg Gln Arg Lys Tyr His Val Ile Lys
130 135 140
Thr Gln Thr Glu Thr Thr Lys Lys Lys Val Lys Asn Leu Glu Gln Arg
145 150 155 160
Arg Gly Asn Met Leu His Gly Tyr Phe Asp Gln Glu Ala Ala Gly Glu
165 170 175
Asp Pro Gln Tyr Gly Tyr Glu Asp Asn Glu Gly Asp Tyr Glu Ser Ala
180 185 190
Leu Ala Leu Ser Asn Gly Ala Asn Asn Leu Tyr Thr Phe His Leu His
195 200 205
His Arg Asn Leu His His Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser Ile Thr
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His Leu His Asp Leu Arg Leu Ala
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<211> 240
<212> PRT
<213> Pyrus bretschneideri
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Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Leu Ile Glu Asn Gln Thr Asn
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Phe Lys Lys Ala
20 25 30
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50 55 60
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Leu Asn Gly Leu Ser Tyr Asp Asp Leu Arg Ser Leu Glu Asp Lys Met
115 120 125
Gln Ser Ser Leu Asp Ala Ile Arg Glu Arg Lys Tyr His Val Ile Lys
130 135 140
Thr Gln Thr Glu Thr Thr Lys Lys Lys Val Lys Asn Leu Glu Glu Arg
145 150 155 160
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Asn Pro Gln Tyr Cys Tyr Val Asp Asn Glu Glu Asp Tyr Glu Ser Ala
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Leu Ala Leu Ala Asn Gly Ala Asn Asn Leu Tyr Thr Phe Gln Leu His
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Arg Asn Ser Asp Gln Leu His His Pro Asn Leu His His His Arg Gly
210 215 220
Ser Ser Leu Gly Ser Ser Ile Thr His Leu His Asp Leu Arg Leu Ala
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<210> 16
<211> 234
<212> PRT
<213> Pyrus bretschneideri
<400> 16
Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Leu Ile Glu Asn Gln Thr Asn
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Phe Lys Lys Ala
20 25 30
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50 55 60
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Ile Asn Asn Lys Leu Arg Arg Glu Ile Arg Gln Arg Leu Gly His Asp
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Leu Asn Gly Leu Arg Phe Asp Glu Leu Ala Ser Leu Asp Asp Glu Met
115 120 125
Gln Ser Ser Leu Asp Ala Ile Arg Gln Arg Lys Tyr His Val Ile Lys
130 135 140
Thr Gln Thr Glu Thr Thr Lys Lys Lys Val Lys Asn Leu Glu Gln Arg
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Arg Gly Asn Met Leu His Gly Tyr Phe Asp Gln Glu Ala Ala Ser Glu
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Asp Pro Gln Tyr Gly Tyr Glu Asp Asn Glu Gly Asp Tyr Glu Ser Ala
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Leu Ala Leu Ala Asn Gly Ala Asn Asn Leu Tyr Thr Phe His Leu His
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Ile Thr His Leu His Asp Leu Arg Leu Ala
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<212> PRT
<213> Pyrus communis
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Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Leu Ile Glu Asn Gln Thr Asn
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Phe Lys Lys Ala
20 25 30
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65 70 75 80
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Leu Asn Gly Leu Ser Tyr Asp Asp Leu Arg Ser Leu Glu Asp Lys Met
115 120 125
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<212> PRT
<213> Pyrus communis
<400> 18
Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Leu Ile Glu Asn Gln Thr Asn
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Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Phe Lys Lys Ala
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Thr Gln Thr Glu Thr Thr Lys Lys Lys Val Lys Asn Leu Glu Gln Arg
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Asp Pro Gln Tyr Gly Tyr Glu Asp Asn Glu Gly Asp Tyr Glu Ser Ala
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Leu Ala Leu Ala Asn Gly Ala Asn Asn Leu Tyr Thr Phe His Leu His
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Arg Asn Ser Asp His Leu His His Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser
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<210> 19
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<212> DNA
<213> Malus domestica
<400> 19
atatcaacta aaacaagatc tgaaaattac tagaaaaaag taagaaaatt gagagagaga 60
ttatgggtcg tggaaagatt gagatcaagc tgatcgaaaa ccagaccaac aggcaggtga 120
cctactccaa gagaagaaat gggatcttca agaaggctca ggagctcacc gttctctgtg 180
atgccaaggt ctccctcatc atgctctcca acactagtaa aatgcacgag tatatcagcc 240
ctaccactac gaccaagagt atgtatgatg actatcagaa aactatgggg atcgatctat 300
ggaggacaca ctacgagtct atgaaagaca ccttgtggaa gttgaaagag atcaacaata 360
agctgaggag agagatcagg cagaggttgg gccatgatct aaatggtctg agctatgacg 420
atctccgttc tcttgaggat aagatgcaat cttccttaga tgccatacgt gaaagaaagt 480
accatgtgat caaaactcaa acggagacca ccaagaagaa ggttaagaac ttggaggaaa 540
gaagaggaaa catgctgcat ggctatgaag ctgccagtga gaatccacaa tattgttatg 600
tggacaatga gggagactat gaatctgcac ttgtgttggc aaatggggca aataacttgt 660
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gaggaagttc gctcggctcc tccatcactc atctacatga tctccgcctt gcttgatcgt 780
gatccgagag atgattaatc gccactaagt tttatattaa ggtcacttat aattttatat 840
atattcctca gagacttaac tgcttatgtt ctaaagtgtt tttttagtga tgatctttag 900
gcacttggat tacctctaaa aacatatgca taaatatatc tgggatgttt tatttaatga 960
taacactaac acaagaatct atggcctgaa agtaataata ttatgaacac ttccgtgccc 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1043
<210> 20
<211> 1102
<212> DNA
<213> Malus domestica
<400> 20
atatatcaag taaaacaaga tcagaaaatt gctaggaaaa ggtaagaaat ttgagagaga 60
gagagaaatt atgggtcgtg ggaagattga aatcaagctg atcgaaaacc agaccaacag 120
gcaggtgacc tactccaaga gaagaaatgg gatcttcaag aaggctcagg agctcaccgt 180
tctctgtgat gccaaggtct ccctcattat gctctccaac actaataaaa tgcacgagta 240
tatcagccct accactacga ccaagagtat gtatgatgac tatcagaaaa ctatggggat 300
cgatctgtgg aggacacacg aggagtcgat gaaagacacc ttgtggaagt tgaaagagat 360
caacaataag ctgaggagag agatcaggca gaggttgggc catgatctaa atggcctgag 420
ctttgacgag ctggcttctc ttgacgatga gatgcagtct tccttggatg ccatacgtca 480
aaggaagtac catgtgatca aaactcagac ggagaccacc aagaagaagg ttaagaactt 540
ggagcaaaga agaggaaaca tgctgcatgg ctattttgac caggaagcag ccggcgagga 600
tccacagtat ggttatgagg acaatgaggg agactacgaa tctgcacttg cattgtcaaa 660
tggggcgaat aacttgtaca ctttccacct ccaccaccgt aacctccacc acggaggaag 720
ttcgctcggc tcctccatta ctcatctgca cgatctccgc cttgcttgat cgtgatctga 780
gatatgatta atcatcacta agttatatat taaggtcact tataactgct tttgttctaa 840
agtgtttgct tggtgactat ctttaggcaa ggagttagac ttggactacc tctgaaaaca 900
gatgcataaa tatgtgtgtg gtgttttaat caatgatagc actaaaaaaa tccgcgccct 960
tgttgcttgt gggtttgttt gtataattaa tacttctatt ctatatatat catggcagac 1020
attgcttttg atattttggt ttgtttgtct tggatgtctt gtattggctt tagggacttg 1080
tttggaaaag acaataactg cc 1102
<210> 21
<211> 723
<212> DNA
<213> Pyrus bretschneideri
<400> 21
atgggtcgtg gaaagattga gatcaagctg atcgaaaacc agaccaacag gcaggtgacc 60
tactccaaga gaagaaatgg gatcttcaag aaggctcagg agctcaccgt tctctgtgat 120
gccaaggtct ccctcatcat gctctccaac actagtaaaa tgcacgagta tatcagccct 180
accactacga ccaagaggat gtacgacgac tatcagaaaa ctatgggggt cgatctatgg 240
aggacacact acgagtcgat gaaagacacc ttgtggaagt tgaaagagat caacaataag 300
ctgaggagag agatcaggca gaggttgggc catgatctaa atggtctgag ctatgacgat 360
ctccgttctc ttgaggataa gatgcaatct tccttagatg ccatacgtga aagaaagtac 420
catgtgatca aaactcagac ggagaccacc aagaagaagg ttaagaactt ggaggaaaga 480
agaggaaaca tgctgcatgg ctattttgac caggaagctg ccagtgagaa tccacaatat 540
tgttatgtgg acaatgagga agactatgaa tctgcacttg cgttggcaaa tggggcaaat 600
aacttgtaca ctttccagct ccaccgcaac tccgaccagc tccaccaccc taacctccac 660
caccacagag gaagttcgct cggctcctcc atcactcatc tacatgatct ccgccttgct 720
tga 723
<210> 22
<211> 705
<212> DNA
<213> Pyrus bretschneideri
<400> 22
atgggtcgtg ggaagattga aatcaagctg atcgaaaacc agaccaacag gcaggtgacc 60
tactccaaga gaagaaatgg gatcttcaag aaggctcagg agctcaccgt tctctgtgat 120
gcgaaggtct ccctcattat gctctccaac actaataaaa tgcacgagta tatcagccct 180
accactacga ccaagagtat gtatgatgac tatcagaaaa ctatggggat cgatctgtgg 240
aggacacacg acgagtcgat gaaagacacc ttgtggaagt tgaaagagat caacaataag 300
ctgaggagag agatcaggca gaggttgggc catgatctaa atggcctgcg ctttgacgag 360
ctggcttctc ttgacgatga gatgcagtct tccttggatg ccatacgtca aaggaagtac 420
catgtgatca aaactcagac ggagaccacc aagaagaagg ttaagaactt ggagcaaaga 480
agaggaaaca tgctgcatgg ctattttgac caggaagcag ccagtgagga tccacagtat 540
ggttatgagg acaatgaggg agactacgaa tctgcacttg cattggcaaa tggggcaaat 600
aacttgtaca ctttccacct ccaccgcaac tccgaccacc tccaccacgg aggaagttcg 660
ctcggctcct ccattactca tctgcacgat ctacgccttg cttga 705
<210> 23
<211> 714
<212> DNA
<213> Pyrus communis
<400> 23
atgggtcgtg gaaagattga gatcaagctg atcgaaaacc agaccaacag gcaggtgacc 60
tactccaaga gaagaaatgg gatcttcaag aaggctcagg agctcaccgt tctctgtgat 120
gccaaggtct ccctcatcat gctctccaac actagtaaaa tgcacgagta tatcagccct 180
accactacga ccaagaggat gtacgacgac tatcagaaaa ctatgggggt cgatctatgg 240
aggacacact acgagtcgat gaaagatacc ttgtggaagt tgaaagagat caacaataag 300
ctgaggagag agatcaggca gaggttgggc catgatctaa atggtctgag ctatgacgat 360
ctccgttctc ttgaggataa gatgcaatct tccttagatg ccatacgtga aagaaagtac 420
catgtgatca aaactcagac ggagaccacc aagaagaagg ttaagaactt ggaggaaaga 480
agaggaaaca tgctgcatgg ctatgaagct gccagtgaga atccacaata ttgttatgtg 540
gacaatgagg aagactatga atctgcactt gcgttggcaa atggggcaaa taacttgtac 600
actttccagc tccaccgcaa ctccgaccag ctccaccacc ctaacctcca ccaccacaga 660
ggaagttcgc tcggctcctc catcactcat ctacatgatc tccgccttgc ttga 714
<210> 24
<211> 705
<212> DNA
<213> Pyrus communis
<400> 24
atgggtcgtg ggaagattga aatcaagcta atcgaaaacc agaccaacag gcaggtgacc 60
tactccaaga gaagaaatgg gatcttcaag aaggctcagg agctcaccgt tctctgtgat 120
gccaaggtct ccctcattat gctctccaac actaataaaa tgcacgagta tatcagccct 180
accactacga ccaagagtat gtatgatgac tatcagaaaa ctatggggat cgatctgtgg 240
aggacacacc acgagtcgat gaaagacacc ttgtggaagt tgaaagagat caacaataag 300
ctgaggagag agatcaggca gaggttgggc catgatctaa acggcctgcg ctttgacgag 360
ctggcttctc ttgacgatga gatgcagtct tccttggatg ccatacgtca aaggaagtac 420
catgtgatca aaactcagac ggagaccacc aagaagaagg ttaagaactt ggagcaaaga 480
agaggaaaca tgctgcatgg ctattttgac caggaagcag ccagtgagga tccacagtat 540
ggttatgagg acaatgaggg agactacgaa tctgcacttg cattggcaaa tggggcaaat 600
aacttgtaca ctttccacct ccaccgcaac tccgaccacc tccaccacgg aggaagttcg 660
ctcggctcct ccattactca tctgcacgat ctacgccttg cttga 705
<210> 25
<211> 430
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Construct
<400> 25
atggcctatg aaagcaaatc cttgtccttg gactctcccc agagaaaatt gggtagggga 60
aagatcgaga ttaagcggat cgaaaacaca acgaatcgtc aagtgacctt ctgcaagagg 120
cgcaatgggt tgctcaagaa ggcctatgaa ctctctgtgc tctgtgatgc agaggttgct 180
ctcatagtct tctctaaccg tggccgcctc tatgagtatg ccaacaatag tgttaaagga 240
acaattgaga ggtacaagaa ggcaagtgca gattcttcaa atactggatc agtttctgaa 300
gctagtactc agtactacca gcaagaagct gcgaaattgc gtgcgcagat agtgaaattg 360
cagaatgaca accggaatat gatgggtgat gcattgagta gtatgtctgt caaggacctg 420
aagagcctgg 430
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 26
atggcctatg aaagcaaatc c 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 27
ccaggctctt caggtccttg 20
<210> 28
<211> 414
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Construct
<400> 28
atatatcaag taaaacaaga tcagaaaatt gctaggaaaa ggtaagaaat ttgagagaga 60
gagagaaatt atgggtcgtg ggaagattga aatcaagctg atcgaaaacc agaccaacag 120
gcaggtgacc tactccaaga gaagaaatgg gatcttcaag aaggctcagg agctcaccgt 180
tctctgtgat gccaaggtct ccctcattat gctctccaac actaataaaa tgcacgagta 240
tatcagccct accactacga ccaagagtat gtatgatgac tatcagaaaa ctatggggat 300
cgatctgtgg aggacacacg aggagtcgat gaaagacacc ttgtggaagt tgaaagagat 360
caacaataag ctgaggagag agatcaggca gaggttgggc catgatctaa atgg 414
<210> 29
<211> 414
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Construct
<400> 29
atgggacgtg ggaaggttga gatcaagagg attgagaact caagtaacag gcaggtgacc 60
tactccaaga ggaggaatgg gattatcaag aaggcaaagg agatcactgt tctatgtgat 120
gctaaagtat ctcttatcat ttattctagc tctgggaaga tggttgaata ctgcagccct 180
tcaactacgc tgacagaaat cttggacaaa taccatggac aatctgggaa gaagttgtgg 240
gatgctaagc atgagaacct cagcaatgaa gtggatagag tcaagaaaga caatgacagc 300
atgcaagtag agctcaggca tctgaaggga gaggatatca catcattgaa ccatgtagag 360
ctgatggcct tagaggaagc acttgaaaat ggccttacaa gtatccggga caag 414
<210> 30
<211> 245
<212> PRT
<213> Malus domestica
<400> 30
Met Ala Tyr Glu Ser Lys Ser Leu Ser Leu Asp Ser Pro Gln Arg Lys
1 5 10 15
Leu Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr Asn
20 25 30
Arg Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala
35 40 45
Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe
50 55 60
Ser Asn Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ala Asn Asn Ser Val Lys Gly
65 70 75 80
Thr Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Ser Ala Asp Ser Ser Asn Thr Gly
85 90 95
Ser Val Ser Glu Ala Ser Thr Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu Ala Ala Lys
100 105 110
Leu Arg Ala Arg Ile Val Lys Leu Gln Asn Asp Asn Arg Asn Met Met
115 120 125
Gly Asp Ala Leu Asn Ser Met Ser Val Lys Asp Leu Lys Ser Leu Glu
130 135 140
Asn Lys Leu Glu Lys Ala Ile Ser Arg Ile Arg Ser Lys Lys Asn Glu
145 150 155 160
Leu Leu Phe Ala Glu Ile Glu Tyr Met Gln Lys Arg Glu Leu Asp Leu
165 170 175
His Asn Asn Asn Gln Leu Leu Arg Ala Lys Ile Ala Glu Asn Glu Arg
180 185 190
Ala Ser Arg Thr Leu Asn Val Met Ala Gly Gly Gly Thr Ser Ser Tyr
195 200 205
Asp Ile Leu Gln Ser Gln Pro Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Phe Gln Val
210 215 220
Asn Ala Leu Gln Pro Asn His Gln Tyr Asn Pro Arg His Asp Gln Ile
225 230 235 240
Ser Leu Gln Leu Val
245
<210> 31
<211> 1037
<212> DNA
<213> Malus domestica
<400> 31
ttctttattt tctgcatatc tccttgttta gatttgtgga gctgtgaaaa aatcccaaaa 60
gcttccaact atggcctatg aaagcaaatc cttgtccttg gactctcccc agagaaaatt 120
gggtagggga aagatcgaga ttaagcggat cgaaaacaca acgaatcgtc aagtgacctt 180
ctgcaagagg cgcaatgggt tgctcaagaa ggcctatgaa ctctctgtgc tctgtgatgc 240
agaggttgct ctcatagtct tctctaaccg tggccgcctc tatgagtatg ccaacaatag 300
tgttaaagga acaattgaga ggtacaagaa ggcaagtgca gattcttcaa atactggatc 360
agtttctgaa gctagtactc agtactacca gcaagaagct gcgaaattgc gtgcgcggat 420
agtgaaattg cagaatgaca accggaatat gatgggtgat gcattgaata gtatgtctgt 480
caaggacctg aagagcctgg agaataaact ggagaaagca attagcagaa tccgatccaa 540
aaagaatgag ctcttgtttg ccgaaattga gtacatgcag aaaagggaac tggacttgca 600
caacaataac cagctcctac gagcaaagat agctgagaat gagagggcca gcagaacatt 660
aaatgtgatg gccggaggag gaacttcaag ctatgacatc ctgcagtctc agccatacga 720
ctctcggaac tatttccaag tgaacgcgtt acaacccaat catcagtaca atccccgcca 780
cgatcagatt tctcttcaat tagtatgaat gatccagatt gcttggggaa tgaagaccgt 840
taccaagtac gtaggtatac gtacgtatat tagttgatgg aaggggattt cttgtctgta 900
tttttatatt tatgcctcct gcaacgtgta ctactaagac ttctgtgaga cattacccta 960
acaagttctt ccaactttga tgtgattgaa tcttcataat gttggtttga atatctatta 1020
tatatgtgtc tgataaa 1037
<210> 32
<211> 252
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 32
Thr Ala Tyr Gln Ser Glu Leu Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Arg Lys
1 5 10 15
Ser Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr Asn
20 25 30
Arg Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala
35 40 45
Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe
50 55 60
Ser Ser Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ser Asn Asn Ser Val Lys Gly
65 70 75 80
Thr Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Ile Ser Asp Asn Ser Asn Thr Gly
85 90 95
Ser Val Ala Glu Ile Asn Ala Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu Ser Ala Lys
100 105 110
Leu Arg Gln Gln Ile Ile Ser Ile Gln Asn Ser Asn Arg Gln Leu Met
115 120 125
Gly Glu Thr Ile Gly Ser Met Ser Pro Lys Glu Leu Arg Asn Leu Glu
130 135 140
Gly Arg Leu Glu Arg Ser Ile Thr Arg Ile Arg Ser Lys Lys Asn Glu
145 150 155 160
Leu Leu Phe Ser Glu Ile Asp Tyr Met Gln Lys Arg Glu Val Asp Leu
165 170 175
His Asn Asp Asn Gln Ile Leu Arg Ala Lys Ile Ala Glu Asn Glu Arg
180 185 190
Asn Asn Pro Ser Ile Ser Leu Met Pro Gly Gly Ser Asn Tyr Glu Gln
195 200 205
Leu Met Pro Pro Pro Gln Thr Gln Ser Gln Pro Phe Asp Ser Arg Asn
210 215 220
Tyr Phe Gln Val Ala Ala Leu Gln Pro Asn Asn His His Tyr Ser Ser
225 230 235 240
Ala Gly Arg Gln Asp Gln Thr Ala Leu Gln Leu Val
245 250
<210> 33
<211> 1614
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 33
ctaaatgtac tgaaaagaaa caccagttta attaattata cttccctcat atataactat 60
caaccaagta caaaactttt gtcaattctc aaaatcaact ttcaccacat aattatctaa 120
catgtgtatg ttccaaaacc agtttaaata gaattacttt tcagaaaata catgtatatt 180
aactctatct aataaagaag aaacacatac ttatctcata gattccattc ataaaactat 240
gctttagtga gtaagaaaac cagtaatcaa acacaaattg acaagacact atatggatgt 300
aaaaagtggg gaaaaatggt gataaatagt agagaaaatt aaaaagaaaa aaaatattcc 360
tttataaatg tatataccca tctcttcacc agcacaacct taccttccat tttctgcaac 420
ttctccaaat ctcatacttt ccagaaaatc attttcccaa gaaaaataaa actttcccct 480
ttgttcttct ccccccaaca gcaatcacgg cgtaccaatc ggagctagga ggagattcct 540
ctcccttgag gaaatctggg agaggaaaga tcgaaatcaa acggatcgag aacacaacga 600
atcgtcaagt cactttttgc aaacgtagaa atggtttgct caagaaagct tacgagctct 660
ctgttctttg tgatgctgaa gtcgcactca tcgtcttctc tagccgtggt cgtctctatg 720
agtactctaa caacaggttt cgtattagaa tcacttaact gtgcaagtgg tcgatttgac 780
cctatcaatt ttatttttta ttacttatca aaatgcagat ttaagcggac tattgagagg 840
tacaagaagg caatatcgga caattctaac accggatcgg tggcagaaat taatgcacag 900
tattatcaac aagaatcagc caaattgcgt caacaaataa tcagcataca aaactccaac 960
aggcaattga tgggtgagac gatagggtca atgtctccca aagagctcag gaacttggaa 1020
ggcagattag agagaagtat tacccgaatc cgatccaaga agaatgagct cttattttct 1080
gaaatcgact acatgcagaa aagagaagtt gatttgcata acgataacca gattcttcgt 1140
gcaaagatag ctgaaaatga gaggaacaat ccgagtataa gtctaatgcc aggaggatct 1200
aactacgagc agcttatgcc accacctcaa acgcaatctc aaccgtttga ttcacggaat 1260
tatttccaag tcgcggcatt gcaacctaac aatcaccatt actcatccgc gggtcgccaa 1320
gaccaaaccg ctctccagtt agtgtaatat aggctgaagg aaatggccgg gagtgaataa 1380
aaaccagaat tgggttgagc aagcaatata aagctaatgc atgttatata tatatttatc 1440
ccatgaatgt tgtatcagtg aattttatgc ttatgttgat gtgaaattaa tatcttaaag 1500
acatgtcatt aatgtgctta atttgcttca aaacatctat gtgtataagt gtactattag 1560
ttcaattgtt gtatttaatt accaattcct gctctattaa tgattttatt atag 1614

Claims (42)

1.一种生产无核果实的方法，其特征在于，所述方法包括降低或消除植物中至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括诱导植物单性结实的额外步骤。
3.一种生产至少产生一个无核果实的植物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)降低或消除植物中至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达，和
b)诱导植物单性结实。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，单性结实的植物中至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达降低或消除。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其中，通过将植物激素施用于植物的花诱导单性结实。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其中，通过操纵控制坐果的基因的表达诱导单性结实。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，通过降低或消除至少一种PISTILSTA(PI)基因或蛋白的表达诱导单性结实。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，通过降低或消除至少一种APETALA3(AP3)基因或蛋白的表达诱导单性结实。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，所述单性结实的植物是具有降低的或消除的至少一种PISTILSTA(PI)基因或蛋白的表达的突变植物。
10.根据权利要求4所述的方法，其中，所述单性结实的植物是具有降低的或消除的至少一种APETALA3(AP3)基因或蛋白的表达的突变植物。
11.一种生产无核果实或至少产生一个无核果实的植物的方法，其特征在于，所述方法包括降低或消除植物中以下蛋白中的至少一种的表达：
a)至少一种AGAMOUS(AG)蛋白和
b)至少一种以下蛋白：
i)至少一种PISTILATA(PI)蛋白，和
ii)至少一种APETALA3(AP3)蛋白。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，降低或消除PISTILATA(PI)或蛋白APETALA3(AP3)的表达诱导单性结实。
13.一种鉴定植物的方法，所述植物具有表现为产生或能用于产生至少一个无核果实的基因型，其特征在于，所述方法包括对植物进行以下中的至少一种测试：
a)降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达，
b)降低的或消除的编码AGAMOUS(AG)蛋白的至少一种多核苷酸的表达，
c)存在与至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达降低相关的标记，和
d)存在与编码AGAMOUS(AG)蛋白的至少一种多核苷酸的表达降低相关的标记。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，a)至d)中任意一项表明所述植物将生产或能用于生产至少一个无核果实。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，被鉴定的植物是具有降低的或消除的AGAMOUS(AG)基因或蛋白的表达的突变植物。
16.一种鉴定植物的方法，所述植物具有表现为产生或能用于产生至少一个无核果实的基因型，其特征在于，所述方法包括对植物进行以下中的至少一种测试：
a)降低的或消除的至少一种PISTILATA(PI)或APETALA3(AP3)蛋白的表达，
b)降低的或消除的编码PISTILATA(PI)或APETALA3(AP3)蛋白的至少一种多核苷酸的表达，
c)存在与至少一种PISTILATA(PI)或APETALA3(AP3)蛋白表达降低相关的标记，和
d)存在与编码PISTILATA(PI)或APETALA3(AP3)蛋白的至少一种多核苷酸的表达降低相关的标记。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，a)至d)中任意一项的存在表明所述植物将生产或能用于生产至少一个无核果实。
18.根据权利要求14所述的方法，其中，被鉴定的植物是具有降低的或消除的PISTILATA(PI)或APETALA3(AP3)基因或蛋白的表达的突变植物。
19.一种生产至少产生一个无核果实的植物的方法，其特征在于，所述方法包括将以下中的至少一种与另外的植物杂交：
a)具有降低的或消除的AGAMOUS(AG)、PISTILATA(PI)和APETALA3(AP3)中的一种的表达的植物，
b)由权利要求3和5-8中任意一项所述的方法生产的植物，和
c)由权利要求13-18中任意一项所述的方法选出的植物，和
d)具有降低的或消除的AGAMOUS(AG)、PISTILATA(PI)和APETALA3(AP3)中至少一种的表达的突变植物，
其中，通过杂交产生的后代是生产至少一个无核果实的植物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，a)、b)、c)或d)的植物是具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达的植物，且另外的植物是以下中的一种：
i)单性繁殖的植物，
ii)具有降低的或消除的至少一种PISTILATA(PI)蛋白的表达的植物，
iii)具有降低的或消除的至少一种APETALA3(AP3)蛋白的表达的植物。
21.根据权利要求19所述的方法，其中，a)、b)或c)或d)的植物是具有降低的或消除的至少一种PISTILATA(PI)或APETALA3(AP3)蛋白的表达的植物，且另外的植物是具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达的植物。
22.一种生产无核果实的方法，其特征在于，所述方法包括培养由权利要求13-18中任意一项所述的方法鉴定的植物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述方法还包括诱导植物单性结实的额外步骤。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述植物生产无核果实是由于被鉴定的植物具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达，且具有降低的或消除的PISTILATA(PI)和APETALA3(AP3)中的一种的表达。
25.一种生产无核果实的方法，其特征在于，所述方法包括培养具有降低的或消除的以下至少一种蛋白的表达的植物：
a)至少一种AGAMOUS(AG)蛋白，和
b)至少一种以下蛋白：
i)至少一种PISTILATA(PI)蛋白，和
ii)至少一种APETALA3(AP3)蛋白。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述植物具有降低的或消除的以下两种蛋白的表达：
a)至少一种AGAMOUS(AG)蛋白，和
b)至少一种以下蛋白：
i)至少一种PISTILATA(PI)蛋白，和
ii)至少一种APETALA3(AP3)蛋白。
27.由权利要求22-26中任意一项所述的方法生产的无核果实。
28.一种具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达的无核果实。
29.根据权利要求28所述的无核果实，其中，所述无核果实还具有降低的或消除的以下至少一种蛋白的表达：
i)至少一种PISTILATA(PI)蛋白，和
ii)至少一种APETALA3(AP3)蛋白。
30.一种具有降低的或消除的以下蛋白的表达的无核果实：
a)至少一种AGAMOUS(AG)蛋白，和
b)至少一种以下蛋白：
i)至少一种PISTILATA(PI)蛋白，和
ii)至少一种APETALA3(AP3)蛋白。
结无核果实的植物
31.一种至少产生一个无核果实的植物，其中，所述植物由权利要求3和5-8中任意一项所述的方法生产。
32.一种至少产生一个无核果实的植物，其中，所述植物具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达。
33.根据权利要求32所述的植物，其中，所述植物还具有降低的或消除的以下蛋白中的至少一种的表达：
i)至少一种PISTILATA(PI)蛋白，和
ii)至少一种APETALA3(AP3)蛋白。
34.一种至少产生一个无核果实的植物，其特征在于，所述植物具有降低的或消除的以下蛋白的表达：
a)至少一种AGAMOUS(AG)蛋白，和
b)至少一种以下蛋白：
i)至少一种PISTILATA(PI)蛋白，和
ii)至少一种APETALA3(AP3)蛋白。
构建体(用于降低或消除植物中AGAMOUS(AG)蛋白的表达)
35.一种用于降低或消除植物中以下蛋白中的至少一种的表达的构建体：
a)AGAMOUS(AG)蛋白，
b)PISTILATA(PI)蛋白，和
c)APETALA3(AP3)蛋白。
36.根据权利要求35所述的构建体，其中，所述构建体含有编码所述蛋白的基因或多核苷酸的部分。
37.根据权利要求36所述的构建体，其中，所述构建体含有与基因或多核苷酸可操作地连接的启动子序列。
38.根据权利要求35所述的构建体，其中，所述构建体旨在降低或消除以下蛋白中的至少一种的表达：
a)AGAMOUS(AG)蛋白和PISTILATA(PI)蛋白，和
b)AGAMOUS(AG)蛋白和APETALA3(AP3)蛋白。
植物部分、繁殖体和子代
39.权利要求33-34中任意一项所述的植物的植物部分、子代或繁殖体。
40.根据权利要求39所述的植物部分、子代或繁殖体，其中，所述植物部分、子代或繁殖体具有降低的或消除的至少一种AGAMOUS(AG)蛋白的表达。
41.根据权利要求40所述的植物部分、子代或繁殖体，其中，所述植物部分、子代或繁殖体还具有降低的或消除的以下蛋白中的至少一种的表达：
a)PISTILATA(PI)蛋白，和
b)APETALA3(AP3)蛋白。
42.含有权利要求35-38中任意一项所述的构建体的植物、植物部分、子代或繁殖体。
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