ES2267175T3 - Procedcimiento y medios para bloqueo genetico en las plantas transgenicas. - Google Patents

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Abstract

Se describen construcciones de ADN ("amplicones" TM) que comprenden un promotor ligado operativamente a ADN que puede transcribirse en una célula de planta a un transcripto de ARN, incluyendo dicho transcripto de ARN una secuencia de virus de planta (por ejemplo derivada del virus X de la patata) que confiere al ARN la capacidad de replicarse en el citoplasma de la célula de planta. La construcción puede carecer de porciones del genoma viral no necesarias para dicha replicación (por ejemplo, proteínas de cubierta), pero incluye preferiblemente una secuencia diana que es capaz de regular negativamente (por ejemplo por silenciamiento génico) la expresión de uno o más genes diana, que pueden ser genes endógenos de plantas, transgenes o genes patogénicos. Se describen también los correspondientes vectores, células huésped, plantas (particularmente con genes modificados y/o silenciados o resistentes a patógenos), y productos de plantas, más también procedimientos de producción y uso de estos materiales.

Description

Procedimiento y medios para bloqueo genético en las plantas transgénicas.
La presente invención se refiere al "silenciamiento génico" ("sg") en plantas transgénicas. Emplea "constructos de amplicón", proporcionando en diversos aspectos moléculas de ácido nucleico y vectores, células y las plantas que las contienen, así como procedimientos y sus usos.
El "silenciamiento génico" es un término que se usa generalmente para referirse a la supresión de la expresión de un gen. El grado de reducción puede ser tal que suprima totalmente la producción del producto génico codificado, pero es más habitual que la supresión de la expresión sea parcial, quedando algún grado de expresión. No debería considerarse, por tanto, que el término requiera un "silenciamiento" completo de la expresión. Se usa en la presente memoria, según procede, porque los expertos en la técnica lo comprenden bien.
Se pueden usar transgenes para suprimir los genes endógenos de plantas. Esto fue originariamente descubierto cuando los transgenes de la chalcona sintasa en la petunia produjeron la supresión de los genes endógenos de la chalcona sintasa (29, 35). Posteriormente, se ha descrito cuántos, si no todos los genes vegetales que pueden ser "silenciados" por transgenes (11, 12, 16, 17, 19, 23). El silenciamiento génico requiere una similitud secuencial entre el transgén y el gen que es silenciado (Matzke, M. A. y Matzke, A. J. M. (1995), Trends in Genetics, 11: 1-3). Esta homología secuencial puede incluir regiones promotoras o regiones codificantes del gen silenciado (Matzke, M. A. y Matzke, A. J. M. (1993) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 44: 53-76, Vaucheret, H. (1993), C. R. Acad. Sci. Paris, 316: 1471-1483, Vaucheret, H. (1994), C. R. Acad. Sci. Paris, 317: 310-323, Baulcombe, D. C. y English, J. J. (1996), Current Opinion In Biotechnology, 7: 173-180, Park, Y-D., et al (1996), Plant J., 9: 183-194). Cuando participan regiones codificantes, el transgén capaz de causar el silenciamiento génico puede haber sido construido con un promotor que transcribiría bien la orientación sentido o la orientación antisentido del ARN de la secuencia codificante. En al menos un ejemplo, el transgén de la secuencia codificante fue construido sin un promotor (Van Blokland, R., et al (1994), Plant J., 6: 861-877). Es probable que los diversos ejemplos de silenciamiento génico incluyan diferentes mecanismos que no son del todo conocidos. En diferentes ejemplos, puede haber sg transcripcional o post-transcripcional (3, 4, 10, 24).
También se ha aclarado que el silenciamiento génico puede ser responsable de algunas características de plantas transgénicas que no son fácilmente conciliadas con el conocimiento convencional de la Genética. Por ejemplo, la amplia variación en la expresión transgénica entre líneas hermanas con un constructo transgénico se debe en parte al silenciamiento génico: los bajos expresores son aquéllos con un nivel elevado de silenciamiento génico, mientras que los altos expresores son aquéllos en los que el silenciamiento génico está ausente o es inducido en una etapa tardía del desarrollo de la planta (10, 13, 14). De manera similar, el silenciamiento génico puede explicar a menudo la resistencia a virus en líneas transgénicas en las que un transgén de ADNc vírico es expresado a un nivel bajo: la actuación del mecanismo de silenciamiento génico sobre ARN inhibe la acumulación de tanto el ARN transgénico como del ARN vírico (5, 10, 22).
En principio, existe un enorme potencial práctico en el sg para la mejora de cultivos. Es posible silenciar genes que confieren caracteres no deseados en plantas mediante la transformación con constructos transgénicos que contienen elementos de estos genes. Los ejemplos de este tipo de aplicación incluyen el sg de genes específicos de la maduración en el tomate para mejorar las características de procesamiento y manipulación del fruto cosechado; el sg de genes que participan en la formación del polen de manera que los cultivadores puedan generar mediante reproducción plantas macho estériles para la producción de híbridos F1; el sg de genes que participan en la biosíntesis de la lignina para facilitar la fabricación del papel a partir de tejidos vegetales de la planta; el sg de genes que participan en la producción de los pigmentos florales para producir nuevos colores para las flores; el sg de genes que participan en las rutas reguladoras que controlan el desarrollo y las respuestas medioambientales para producir plantas con un nuevo hábito de crecimiento o (por ejemplo) con resistencia a enfermedades; la eliminación de metabolitos secundarios tóxicos mediante el sg de genes necesarios para la producción de toxinas. Además, el sg puede ser útil como un medio de desarrollo de plantas resistentes a virus cuando el transgén es similar a un genoma vírico.
Una importante complicación en la explotación práctica de este fenómeno hasta la fecha es la ocurrencia impredecible y reducida del sg. Lo común es que haya un fuerte sg en tan sólo del 5-20% de las líneas generadas con una cualquiera de los constructos (por ejemplo, véase (28, 34)). Por lo tanto, no ha sido realista intentar el sg en plantas que son difíciles de transformar y para las que resulta difícil producir muchos transformantes. De manera similar, sería complicado activar el sg contra varios caracteres diferentes o contra varios virus de la misma planta. Incluso con plantas que son fáciles de transformar, la necesidad de generar múltiples líneas limita la facilidad de explotación
del sg.
La primera indicación de que un virus inoculado pudo provocar el silenciamiento génico se dio con plantas transgénicas en las que el transgén incluía ADNc del polivirus del grabado del tabaco (22). Las líneas que mostró este silenciamiento génico inducido por el virus fueron inicialmente expresores de alto nivel del transgén. Tras la inoculación con una cepa del polivirus del grabado del tabaco que era idéntica o muy similar al transgén, se produjo una reducción en la cantidad del ARN del transgén y la supresión del virus originariamente inoculado en las hojas superiores de la planta. Estas hojas superiores fueron descritas como que se habían recuperado, porque estaban libres de virus y de síntomas. También presentaron resistencia a una inoculación de desafío secundaria con un virus que era muy similar al transgén a nivel de nucleótidos. Todos estos efectos se deben probablemente al sg a nivel post-transcripcional.
Sin embargo, no hay nada en este informe que indique que el silenciamiento génico inducido por virus sea intrínsecamente más reproducible que cualquier otro tipo de silenciamiento génico. De hecho, hubo algunas líneas que mostraron el silenciamiento génico inducido por el virus y otras líneas que no lo mostraron (22). Además, existen muchos informes que se refieren a la inoculación con un virus de plantas transgénicas que portan transgenes que son similares o idénticos al virus inoculado. De estos informes, sólo una minoría describe el silenciamiento génico inducido por virus. De este modo, con transgenes víricos, el silenciamiento génico inducido por virus es la excepción que confirma la regla. Es decir, como se indica anteriormente, de este trabajo no se derivó ninguna indicación sobre que el silenciamiento génico inducido por virus inoculados sea intrínsecamente reproducible.
Biosource Technologies, Inc. (20, 21) ha sugerido el uso de construcciones genéticas basadas en virus de ARN que se replican en el citoplasma de las células para proporcionar ARN inhibidor, bien ARN antisentido o co-supresor. Las células son transfectadas con las construcciones genéticas de replicación citoplasmática en las que la región codificante de ARN es específica para el gen de interés. La prueba experimental que ilustra las desventajas y las limitaciones del enfoque de Biosource se incluye más adelante.
La presente invención pretende superar uno o más de los numerosos problemas en la técnica. Por ejemplo, la prueba experimental que se incluye más adelante demuestra con realizaciones de la presente invención que el sg se puede conseguir más reproduciblemente que con la tecnología convencional.
Brevemente, la presente invención, en diversos aspectos, hace uso de un constructo de amplicón que mostrará sg dirigido frente a una secuencia con homología a una secuencia del amplicón. Un amplicón es un constructo de ADN transgénico que incluye un promotor y ADNc de al menos parte de un genoma vírico y, opcionalmente, un terminador transcripcional. Preferiblemente, el constructo incluye una "secuencia de acceso", que puede ser una secuencia foránea al virus, para dirigir específicamente la regulación reductora de un gen de interés ("gen diana"). Más adelante, se trata esto con mayor detalle.
La incorporación de un constructo en el genoma de plantas transgénicas conforme a la presente invención puede ser usada para garantizar que el ADNc vírico sea transcrito desde el promotor en muchas o la mayoría de las células de la planta, aunque es posible el uso de un promotor inducible y/o regulado por los tejidos o el desarrollo. Si los elementos víricos que actúan en cis y los factores que actúan en trans necesarios para la replicación permanecen intactos, habrá replicación del ARN vírico en la planta transgénica. Como consecuencia, habrá una activación, bien directa o indirecta, del sg dirigido frente a secuencias con suficiente homología con una secuencia incluida con el ARN vírico de replicación, la "secuencia de acceso".
Un constructo de amplicón puede tener un ADNc vírico no modificado. En tal caso, la planta puede ser resistente al virus como resultado del sg. Otros constructos de amplicón pueden tener una secuencia de acceso foránea insertada en el ADNc vírico, y el sg será dirigido contra la secuencia correspondiente así como contra el virus. La secuencia de acceso puede formar parte de un genoma vírico diferente, en cuyo caso la planta también puede ser resistente a este segundo virus. La secuencia de acceso puede derivar de un gen o transgén nuclear, o de un gen de un elemento extracromosómico tal como un plásmido, estando el sg dirigido contra el gen o los homólogos.
Ahora se tratará la presente invención con mayor detalle.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona, preferiblemente en un vector adecuado para la transformación estable de una célula vegetal, un constructo de ADN en el que un promotor está ligado operativamente a ADN para la transcripción en una célula vegetal de una molécula de ARN que incluye la secuencia vírica de la planta que comprende elementos vitales que actúan en cis y una secuencia que codifica factores de transacción que confieren a la molécula de ARN la capacidad de replicarse en el citoplasma de una célula vegetal tras la transcripción. El transcripto de ARN carece de todo o parte del genoma vírico no requerido para la transcripción en el citoplasma. El ARN transcrito a partir del ADN que está bajo el control transcripcional del promotor es capaz de una replicación en el citoplasma de una célula vegetal en virtud de incluir secuencias víricas vegetales apropiadas. Los transcriptos, que posiblemente incluyen una secuencia foránea al virus, se replican como si fueran ARN víricos, activando
el sg.
El ARN transcrito incluye una secuencia ("secuencia de acceso") que es complementaria a una secuencia de un gen diana, bien en la orientación sentido o la orientación antisentido, o una secuencia que tiene una homología suficiente a una secuencia diana (de más del 80%) para que ocurra la regulación reductora de la expresión del gen diana. Aunque no se desee quedar vinculados a la teoría, se cree que la regulación sentido y antisentido supone la hibridación entre las secuencias que son suficientemente complementarias como para hibridarse en las condiciones del interior de una célula.
La secuencia de acceso del constructo puede ser foránea al virus de la planta, es decir, de o derivada de un gen o una secuencia de la que el virus carece. Los expertos en la técnica entenderán que términos tales como "exógeno" o "heterólogo" pueden ser usados igualmente en este contexto.
Se puede usar un vector que contenga el constructo en la transformación de una o más células vegetales para introducir el constructo establemente en el genoma, de manera que se herede establemente de una generación a la siguiente. Esto es preferiblemente seguido por la regeneración de una planta a partir de tales células para producir una planta transgénica.
De este modo, en otros aspectos, la presente invención también proporciona el uso del constructo o el vector en la producción de una planta transgénica, procedimientos de transformación de células y plantas, células microbianas (particularmente, del género Agrobacterium) y vegetales, y diversos productos vegetales.
La función del promotor en el constructo de amplicón consiste en garantizar que el ADN sea transcrito en el ARN que contiene las secuencias víricas. El término "promotor" pretende significar una secuencia de nucleótidos a partir de la cual se puede iniciar la transcripción de ADN ligado operativamente secuencia abajo (es decir, en la dirección de 3' de la cadena sentido del ADN bicatenario). Los promotores "conducen" la transcripción de una secuencia operativamente ligada.
"Operativamente ligada" significa unida como parte de la misma molécula de ácido nucleico, colocada y orientada adecuadamente para que la transcripción sea iniciada desde el promotor. El ADN ligado operativamente a un promotor está "bajo la regulación de iniciación transcripcional" del promotor o "en combinación funcional" con el mismo.
Los promotores preferidos pueden incluir el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor o el promotor de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Sanders, P. R., et al (1987), Nucleic Acids Res., 15: 1543:1558). Estos promotores son expresados en muchos, si no en todos, los tipos de células de numerosas plantas. Es posible usar eficazmente otros promotores expresados constitutivamente como componentes del constructo de amplicón que produce el sg. En función del gen diana del sg inducido por amplicones, se pueden usar otros promotores, incluyendo aquéllos cuyo desarrollo está regulado o son inducibles. Por ejemplo, si es necesario silenciar el gen diana específicamente en un determinado tipo de célula, se puede ensamblar el constructo de amplicón con un promotor que conduzca la transcripción sólo en ese tipo de célula. De manera similar, si el gen diana va a ser silenciado tras un estímulo externo definido, el constructo de amplicón puede incorporar un promotor que vaya a ser activado específicamente por ese estímulo. Se pueden usar los promotores tanto con especificidad tisular como inducibles por estímulos específicos.
Los promotores inducibles pueden ser ventajosos en ciertas circunstancias, porque sitúan el ritmo de reducción de la expresión del gen diana de interés bajo el control del usuario.
El término "inducible" aplicado a un promotor es muy conocido por los expertos en la técnica. En esencia, la expresión bajo el control de un promotor inducible es "activada" o aumentada en respuesta a un estímulo aplicado. La naturaleza del estímulo varía entre los promotores. Algunos promotores inducibles producen niveles bajos o indetectables de expresión (o ninguna expresión) en ausencia del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles producen una expresión constitutiva detectable en ausencia del estímulo. Sea cual sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo, la expresión desde cualquier promotor inducible es aumentada en presencia del estímulo correcto. La situación preferible es cuando el nivel de expresión aumenta ante la aplicación del estímulo relevante en una cantidad eficaz para modificar una característica fenotípica. De este modo, se puede usar un promotor inducible (o "activable") que cause un nivel básico de expresión en ausencia del estímulo, cuyo nivel sea demasiado bajo para provocar un fenotipo deseado (y puede ser, de hecho, cero). Ante la aplicación del estímulo, se aumenta la expresión (o se activa) hasta un nivel que provoca el fenotipo deseado.
Los promotores adecuados incluyen el promotor del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S) que es expresado a un nivel elevado en casi todos los tejidos vegetales (Benfey et al, 1990a y 1990b) y el promotor del gen de la isoforma II de la glutationa-S-transferasa del maíz (GST-II-27), que es activado en respuesta a la aplicación de safener exógeno (WO93/01294, ICI Ltd). Se ha observado que el promotor del gen GST-II-27 es inducido por ciertos compuestos químicos que pueden ser aplicados a plantas en crecimiento. El promotor es funcional tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Por lo tanto, puede ser usado para controlar la expresión génica en una variedad de plantas modificadas genéticamente, incluyendo cultivos de campo tales como los de canola, girasol, tabaco, remolacha, algodón; cereales tales como trigo, cebada, arroz, maíz, sorgo; frutas tales como tomates, mangos, melocotones, manzanas, peras, fresas, plátanos y melones; y verduras tales como zanahoria, lechuga, calabaza y cebolla. El promotor GST-II-27 también es adecuado para su uso en una variedad de tejidos, incluyendo raíces, hojas, tallos y tejidos reproductores.
Un constructo para ser usado conforme a la presente invención incluye secuencias que son copias de ADN de elementos que actúan en cis del genoma vírico y de marcos de lectura abiertos del genoma vírico que son requeridos para la replicación del ARN vírico. Deberían estar dispuestos en el constructo de amplicón de manera que los transcriptos del constructo de amplicón se replicasen en las células vegetales independientemente de otros transgenes o de virus inoculados en las plantas. Las copias de ADNc de cualquier otra parte del genoma vírico no necesitan estar incluidas en el constructo de amplicón con la condición de que su ausencia no interfiera con la replicación de los transcriptos de amplicón. Una característica opcional, pero importante, de algunos constructos de amplicón conforme a la presente invención es la inserción de secuencias foráneas en el ADNc vírico. El sitio de inserción de estas secuencias foráneas es tal que la secuencia foránea sea replicada, como ARN, como parte del ARN vírico producido mediante la transcripción del amplicón en una célula vegetal. La diana del silenciamiento génico está determinada por el ADNc vírico y por cualquier secuencia de acceso foránea del constructo de amplicón.
Los constructos de amplicón usados en la ejemplificación experimental descrita en esta solicitud con el objeto de ilustrar los aspectos de la presente invención sin limitarla están basados en ADNc del genoma del virus X de la patata (PVX, Potato Virus X) (Kavanagh, T. A., et al (1992), Virology, 189: 609-617). Muchos otros, si no la totalidad de virus de ARN o ADN de plantas pueden ser usados en la generación de constructos de amplicón de una manera que sea similar a la descrita aquí para el PVX. Las alternativas particularmente adecuadas al PVX son aquellos virus de los que se sabe que la secuencia foránea es tolerada como parte del genoma vírico de replicación. En este ejemplo, se incluyen el virus del mosaico del tabaco (Dawson, W. O., et al (1989), Virology, 172: 285-292), el virus de grabado del tabaco (Dolja, V. V., et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89: 10208-10212), el virus del cascabel del tabaco (Ziegler-Graff, V., et al (1991), Virology, 182: 145-155), virus del enanismo arbustivo del tomate (Scholthof, H. B., et al (1993), Mol. Plant-Microbe Interact., 6: 309-322), virus del mosaico del bromo (Mori, M., et al (1993), J. Gen. Virol., 74: 1255-1260), virus del mosaico de la coliflor (Futterer, J. y Hohn, T. (1991), EMBO J., 10: 3887-3896), virus del mosaico de la yuca africana (Ward, A., et al (1988), EMBO J., 7: 1583-1587), virus del mosaico dorado del tomate. Los virus preferidos para su uso en la presente invención pueden ser virus de ARN.
Se puede incluir una secuencia de acceso foránea en el constructo como una sustitución de un gen vírico o una secuencia vírica que no sea necesario o necesaria para la replicación o como una secuencia adicional añadida al genoma vírico. Se puede incluir una secuencia foránea en el amplicón como un marco de lectura abierto intacto y así ser transcrito como un ARN subgenómico. Sin embargo, se puede incluir una secuencia foránea en cualquier lugar del ADNc vírico independientemente de la localización del promotor subgenómico.
Es posible incluir una secuencia foránea al ácido nucleico vírico y homóloga o similar al gen diana de interés en una orientación sentido o antisentido en el amplicón.
Al usar genes antisentido o secuencias génicas parciales para una regulación reductora de la expresión génica, se sitúa una secuencia de nucleótidos bajo el control de un promotor en una "orientación inversa" tal que la transcripción produce ARN que es complementario al ARNm normal transcrito desde la cadena "sentido" del gen diana. Véase, por ejemplo, Rothstein et al., 1987; Smith et al, (1988) Nature 334, 724-726; Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, English et al., (1996) The Plant Cell 8, 179-188. La tecnología antisentido también es revisada en Bourque, (1995), Plant Science 105, 125-149, y Flavell, (1994) PNAS EE.UU. 91, 3490-3496.
Una alternativa consiste en usar una copia de todo o parte del gen diana insertado en orientación sentido (que es la misma) como el gen diana para conseguir una reducción en la expresión del gen diana mediante co-supresión. Véase, por ejemplo, Van der Krol et al., (1990) The Plant Cell 2,291-299; Napoli et al., (1990) The Plant Cell 2, 279-289; Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, y US-A-5.231.020.
Es necesario usar la secuencia completa correspondiente a la secuencia codificante (en orientación inversa para el antisentido). Por ejemplo, se pueden usar fragmentos de una longitud suficiente. Es algo rutinario para el experto en la técnica rastrear fragmentos de diversos tamaños y de diversas partes de la secuencia codificante con el fin de optimizar el nivel de inhibición antisentido. Puede resultar ventajoso incluir el codón de iniciación ATG de la metionina y quizás uno o más nucleótidos secuencia arriba del codón de iniciación. Otra posibilidad es dirigir una secuencia conservada de un gen, p.ej., una secuencia que sea característica de uno o más genes en uno o más patógenos contra los cuales se desee la resistencia, tal como una secuencia reguladora.
Una secuencia foránea puede ser de 500 o menos nucleótidos, posiblemente, de aproximadamente 400 nucleótidos, aproximadamente de 300 nucleótidos, aproximadamente de 200 nucleótidos o aproximadamente de 100 nucleótidos. Puede ser posible usar oligonucleótidos de longitudes mucho menores, de 14-23 nucleótidos, aunque se prefieren los fragmentos más largos, y generalmente, incluso mayores de 500 nucleótidos cuando sea posible.
Puede ser preferible que exista una identidad secuencial completa en la secuencia de acceso (p.ej. la foránea) del amplicón y la secuencia diana de la planta, aunque la complementariedad o la similitud secuencial total no es esencial. Pueden diferir uno o más nucleótidos de la secuencia de acceso con respecto al gen diana. De este modo, una secuencia de acceso empleada en un constructo según la presente invención puede ser una secuencia (p.ej., un gen) de tipo salvaje seleccionada entre aquéllas disponibles, o un mutante, derivado, variante o alelo, por medio de una inserción, adición, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos, de tal secuencia. Una secuencia foránea no necesita incluir un marco de lectura abierto ni especificar un ARN que sea traducible. Como se indica, una secuencia foránea puede ser insertada en el constructo de amplicón en cualquier orientación, para una regulación sentido o antisentido. Puede ser preferible que exista suficiente homología para que se hibriden las respectivas moléculas de ARN sentido o antisentido. Puede haber sg incluso cuando haya aproximadamente un 5%, 10%, 15% o 20% o más de apareamientos erróneos entre la secuencia de acceso, p.ej., foránea, del amplicón y el gen
diana.
En realizaciones de la presente invención que han sido ejemplificadas experimentalmente como se describe a continuación con objetos únicamente ilustrativos y no restrictivos, la secuencia foránea del amplicón que determinaba la diana del silenciamiento génico fue el gen indicador uidA (Jefferson, R. A., et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 83: 8447-8451) o el gen codificante de la proteína verde fluorescente de la medusa (Chalfie et al. (1994) Science 263: 802-805). Otros genes revelados en los ejemplos incluyen el DWARF del tomate y el fitoeno desaturasa de Arabidopsis. Sin embargo, cualquier otro gen de origen vegetal, animal, micótico, bacteriano o vírico puede ser una diana del sg inducido por amplicones con la condición de que la secuencia foránea correspondiente esté incorporada en el constructo de amplicón. Los genes particularmente adecuados como dianas son aquéllos que ya han mostrado ser supresibles por el sg en el material publicado. Éstos pueden incluir, por ejemplo, la chalcona sintasa de la petunia o la poligalacturonasa del tomate (Jorgensen, R. A. (1995), Science, 268: 686-691, Hamilton, A.J., et al (1995), Current Topics in Microbiology and Immunology, 197: 77-89).
Se pueden incluir una o más secuencias de acceso en el constructo para proporcionar la supresión de uno o más genes, p.ej., cuando se necesite la regulación reductora de más de un gen al mismo tiempo o para conferir resistencia a más de un patógeno. Se puede usar una secuencia de acceso con una homología suficiente a más de una secuencia diana en la supresión de más de un gen.
Una característica opcional adicional de un constructo usado conforme a la presente invención es un terminador transcripcional. Se puede usar el terminador transcripcional del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Depicker, A., et al (1982), J. Mol. Appl. Genet., 1:561-573), y se encuentra ejemplificado experimentalmente a continuación. Otros terminadores transcripcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquéllos procedentes de la actina de la semilla de soja, la ribulosa bisfosfato carboxilasa de Nicotiana plumbaginifolia (Poulson, C., et al (1986), Mol. Gen. Gent., 205: 193-200) y la alfa amilasa del trigo (Baulcombe, D.C., et al., (1987), Mol. Gen. Genet., 209: 33-40). Puede que no haya incluida una secuencia de terminación transcripcional foránea al virus en un constructo de la invención, en concreto, cuando las secuencias víricas incluidas en el constructo incluyan una o más secuencias de terminación transcripcional.
Los expertos en la técnica son perfectamente capaces de construir vectores y protocolos de diseño para la expresión de genes recombinantes. Para más detalles, véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual". 2ª edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
En "Protocols in Molecular Biology", Segunda edición, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992, se describen numerosos protocolos y técnicas conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructos de ácido nucleico, la mutagénesis, la secuenciación, la introducción de ADN en células y la expresión génica, así como para el análisis de proteínas.
En Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8721) y Guerineau y Mullineaux (1993), Plant transformation and expression vectors, in: "Plant Molecular Biology Labfax" (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp. 121-148, se describen procedimientos y vectores específicos anteriormente usados con gran éxito en plantas.
Para la introducción en una célula vegetal, el constructo de ácido nucleico puede estar en forma de un vector recombinante, por ejemplo, un vector binario de Agrobacterium. La presente invención también proporciona células hospedadoras microbianas, particularmente, bacterianas y, especialmente, de Agrobacterium que contienen un constructo según la invención o un vector que incluye tal constructo, particularmente, un vector binario adecuado para una transformación estable de una célula vegetal.
Los vectores, los constructos y las moléculas de ácido nucleico según la presente invención pueden ser proporcionados aislados y/o purificados (es decir, de su medio natural), en una forma sustancialmente pura u homogénea, o libres o sustancialmente libres de otro ácido nucleico. El ácido nucleico según la presente invención puede ser completa o parcialmente sintético. El término "aislado" engloba todas estas posibilidades.
Un aspecto de la presente invención es el uso de un constructo o un vector según la invención en la producción de una planta transgénica.
Otro aspecto proporciona un procedimiento que incluye introducir el constructo o el vector en una célula vegetal tal que el constructo sea incorporado establemente al genoma de la célula.
Se puede usar cualquier procedimiento apropiado de transformación de plantas para generar células vegetales que contengan un constructo dentro del genoma según la presente invención. Tras la transformación, las plantas pueden ser regeneradas a partir de células y tejido vegetal transformados.
Se pueden seleccionar células y/o plantas transformadas con éxito, es decir, con el constructo incorporado en su genoma, tras la introducción del ácido nucleico en las células vegetales, opcionalmente, seguida por la regeneración en una planta, p.ej., usando uno o más genes marcadores tales como la resistencia a antibióticos. Se pueden usar marcadores genéticos seleccionables que estén constituidos por genes quiméricos que confieran fenotipos seleccionables tales como la resistencia a antibióticos tales como la kanamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfuron, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas y glifosato.
Cuando se introduce un ácido nucleico en una célula, se deben tener en cuenta ciertas consideraciones conocidas por los expertos en la técnica. El ácido nucleico que se va a insertar debería ser ensamblado en un constructo que contenga elementos reguladores eficaces que conduzcan la transcripción. Debe haber disponible un procedimiento para transportar el constructo en la célula. Una vez que el constructo se encuentra dentro de la membrana celular, se debería producir la integración en el material cromosómico endógeno. Finalmente, en cuanto a plantas se refiere, el tipo de célula diana debe ser tal que las células puedan ser regeneradas en plantas enteras.
Las plantas transformadas con el segmento de ADN que contiene la secuencia pueden ser producidas mediante técnicas estándar que ya son conocidas para la manipulación genética de plantas. El ADN puede ser transformado en células vegetales usando cualquier tecnología adecuada, tal como un vector de plásmido Ti desarmado portado por Agrobacterium que explote su capacidad natural de transferencia de genes (EP-A-270355; EP-A-0116718; NAR 12(22) 8711-87215 (1984); el bombardeo de partículas o microproyectiles (US 5100792; EP-A-444882; EP-A-434616); la microinyección (WO 92/09696; WO 94/00583; EP 331083; EP 175966, Green et al., (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press); la electroporación (EP 290395; WO 8706614, Gelvin Debeyser, véase anexo); otras formas de reabsorción directa de ADN (DE 4005152; WO 9012096; US 4684611); la reabsorción de ADN mediada por liposomas (p.ej., Freeman et al., Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)); o el procedimiento de vórtices (p.ej., Kindle, PNAS EE.UU. 87: 1228 (1990d). Los procedimientos físicos para la transformación de células vegetales son revisados en Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11.
La transformación mediada por Agrobacterium es ampliamente usada por los expertos en la técnica para transformar especies de dicotiledóneas. Recientemente, se ha producido un progreso sustancial en la producción rutinaria de plantas transgénicas fértiles estables en casi todas las plantas monocotiledóneas de importancia económica (Toriyama, et al. (1988) Biol Technology 6, 1072-1074; Zhang, et al. (1988), Plant Cell Rep. 7, 379-384; Zhang et al., (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840; Shimamoto, et al. (1989) Nature 338, 274-276; Datta, et al., (1990) Biol Technology 8, 736-740; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, 957-962; Peng, et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Filipinas 563-574; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, 603-618; D'Halluin, et al.(1992) Plant Cell 4, 1495-1505; Walters, et al. (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, 194-200; Vasil, I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594; WO92/14828). En concreto, la transformación mediada por Agrobacterium está surgiendo actualmente como un procedimiento de transformación muy eficaz en monocotiledóneas (Hiei et al.(1994) The Plant Journal 6, 271-282).
Se ha conseguido la generación de plantas transgénicas fértiles en los cereales del arroz, maíz, trigo, avena y cebada (revisado en Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162.; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 página 702).
Cuando Agrobacterium no es eficaz, se prefieren el bombardeo de microproyectiles, la electroporación y la reabsorción directa de ADN. Alternativamente, se puede emplear una combinación de diferentes técnicas para aumentar la eficacia del procedimiento de transformación, p.ej., el bombardeo con micropartículas revestidas de Agrobacterium (EP-A-486234) o el bombardeo de microproyectiles para producir heridas seguido por el co-cultivo con Agrobacterium (EP-A-486233).
Tras la transformación, es posible regenerar una planta, p.ej., a partir de células individuales, tejido calloso o discos foliares, como es común en la técnica. Es posible regenerar completamente casi cualquier planta a partir de células, tejidos u órganos de la planta. Las técnicas disponibles son revisadas en Vasil et al., "Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants", Vol I, II y III, "Laboratory Procedures and Their Applications", Academic Press, 1984, y weissbach y Weissbach, "Methods for Plant Molecular Biology", Academic Press, 1989.
La elección de una determinada tecnología de transformación estará determinada por su eficacia para transformar ciertas especies vegetales, así como por la experiencia y la preferencia de la persona que esté poniendo en práctica la invención con una determinada metodología. Será evidente para el experto en la técnica que la elección concreta de un sistema de transformación para introducir ácido nucleico en células vegetales no es esencial ni supone una limitación para la invención, como tampoco lo es la elección de la técnica de regeneración de la planta.
También según la invención, se proporciona una célula vegetal que tiene incorporada en su genoma un constructo de ADN como el revelado. Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para fabricar tal célula vegetal que supone la introducción de un vector que incluya el constructo en la célula vegetal. Tal introducción debería estar seguida por la recombinación entre el vector y el genoma de la célula vegetal para introducir la secuencia de nucleótidos en el genoma. El ARN codificado por el constructo de ácido nucleico introducido puede ser entonces transcrito en la célula y en los descendientes de la misma, incluyendo las células de las plantas regeneradas a partir del material transformado. Un gen incorporado establemente en el genoma de una planta es pasado de una generación a otra en los descendientes de la planta, de manera que tales descendientes deberían mostrar el fenotipo deseado.
La presente invención también proporciona una planta que comprende una célula vegetal según lo revelado.
Una planta según la presente invención puede ser una que no se ajuste a una o más propiedades. Se pueden excluir variedades de plantas, particularmente, variedades de plantas registrables según los derechos de obtención. Se indica que una planta no necesita ser considerada una "variedad de planta" simplemente porque contenga establemente en su genoma un transgén introducido en una célula de la planta o un antepasado de la misma.
Además de una planta, la presente invención proporciona cualquier clon de tal planta, semilla, progenie y descendientes de sí misma o híbrida, y cualquier parte de cualquiera de éstos, tal como cortes, semilla. La invención proporciona cualquier propágulo de planta, es decir cualquier parte que pueda ser usada en la reproducción o la propagación, sexual o asexual, incluyendo cortes, semillas, etcétera. También se encuentra englobada en la invención una planta que es una progenie propagada sexual o asexualmente, un clon o un descendiente de tal planta o cualquier parte o propágulo de dicha planta, progenie, clon o descendiente. También se proporcionan extractos de plantas y derivados. En cada caso, la planta o el producto contiene una célula vegetal que tiene incorporado en su genoma un constructo de ADN según lo revelado.
La presente invención puede ser particularmente aplicada en plantas tales como hospedadores naturales de un virus vegetal, incluyendo cualquiera mencionado en la presente memoria, aunque es una ventaja de las realizaciones de la presente invención que se puedan utilizar virus para el silenciamiento génico en plantas que no sean sus hospedadores naturales, como se ha demostrado experimentalmente y está descrito más adelante. De hecho, los presentes inventores han demostrado que el PVX, usado en muchos de los siguientes ejemplos, puede replicarse en monocotiledóneas además de en sus hospedadores naturales.
La presente invención puede ser usada en plantas tales como plantas de cultivos, incluyendo cereales y legumbres, maíz, trigo, patatas, tapioca, arroz, sorgo, mijo, mandioca, cebada, guisante y otros cultivos de raíces, tubérculos o semillas. Los cultivos de semillas importantes son los de colza de semilla oleaginosa, remolacha, maíz, girasol, semilla de soja y sorgo. Las plantas hortícolas a las que se pueden aplicar la presente invención pueden incluir lechuga, endibia y coles que incluyen la calabaza, el brócoli y la coliflor, así como claveles y geranios. La presente invención puede ser aplicada al tabaco, cucurbitáceas, zanahoria, fresa, girasol, tomate, pimiento, crisantemo, álamo, eucalipto y pino.
Como se indica, la trascripción a partir del constructo en el genoma de una célula vegetal produce un ARN de replicación citoplasmática capaz de realizar una regulación reductora de la expresión de un gen diana en la célula, cuyo gen diana puede ser de la planta, endógeno al genoma de la planta o un transgén, o de un patógeno tal como un virus.
De este modo, otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento que incluye causar o permitir la transcripción desde un constructo como el revelado en el genoma de una célula vegetal.
Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para reducir, suprimir o descender el nivel de expresión de un gen de interés (o "un gen diana") en una célula vegetal, incluyendo el procedimiento causar o permitir la transcripción desde un constructo como el revelado. La transcripción produce ARN y es generalmente seguida por la replicación del ARN transcrito en virtud de la inclusión de la secuencia vírica. El constructo puede incluir la secuencia del gen diana o un fragmento de la misma en una orientación sentido o antisentido, o una secuencia con una homología suficiente a la secuencia del gen diana o a un fragmento de la misma para reducir el nivel de expresión del gen diana con respecto a la producción de ARN.
Como se demuestra en los ejemplos presentados en lo sucesivo, en ciertas realizaciones, el gen diana puede estar alejado del sitio de replicación del amplicón, que puede estar sólo activado en ciertas células (por ejemplo, porque el amplicón es activado por un promotor inducible). En tales casos, se puede conseguir el sg a través del efecto sistémico o remoto demostrado. A la luz del presente trabajo, parece que este efecto puede ser análogo al revelado en Voinnet y Baulcombe (1997) Nature 389: página 553, (aunque en ese caso, el iniciador de la señal sistémica del sg no era un constructo de replicación citoplasmática). De este modo, el efecto distal puede ser particularmente eficaz cuando el amplicón es activado en un tejido de "fuente" fotosintética, estando presente el tejido diana (bien local o sistemáticamente) en el tejido o los tejidos "sumidero".
Con respecto al nivel de expresión de un gen de interés en una célula, el procedimiento resultará generalmente en una disminución del nivel de expresión en comparación con el nivel en ausencia de la intervención, es decir, en comparación con las células de tipo salvaje equivalentes, p.ej., de plantas de la misma especie. (las células que son de tipo salvaje respecto al nivel de expresión del gen de interés pueden, por supuesto, no ser de tipo salvaje en todos los aspectos).
Cuando la diana es un gen de un patógeno tal como un virus, la regulación reductora de la expresión puede producir un aumento en la resistencia al patógeno, particularmente, cuando el gen es necesario para, o al menos participa en, la replicación y/o la infecciosidad (p.ej., en una ARN polimerasa dependiente de ARN de un virus tal como el virus del mosaico del fríjol (Sijen, T., et al (1996), Plant Cell, 8: 2277-2294)).
La presente invención será ahora ilustrada y ejemplificada con referencia a los resultados experimentales y a las figuras anexas. Otros aspectos y realizaciones de la presente invención, así como las modificaciones de aquéllos revelados en la presente memoria, serán evidentes para los expertos en la técnica. Todos los documentos mencionados en cualquier parte de la presente memoria están incorporados por referencia.
Figuras
La figura 1 ilustra los constructos de amplicón expresados desde 35S que fueron transferidos a plantas de N. tabacum cv Petit havana mediante una transformación mediada por Agrobacterium. Cada constructo fue insertado entre el promotor CaMV 35S y la secuencia de terminación de la nos (Jones, J. D. G., et al (1992), Transgenic Res., 1: 285-297). Los diversos marcos de lectura abiertos (ORF, Open Reading Frame) del PVX están marcados como RdRp: ARN polimerasa dependiente de ARN; 25, 12, 8: los genes del "bloque de genes triple" (que codifican proteínas de 25, 12 y 8 kDa, respectivamente); y CP: gen de la cubierta proteínica. La secuencia de GUS, que se muestra en los cuadros de rayas oblicuas, fue insertada como un ORF adicional en PVX/GUS/CP y fue expresada desde un promotor subgenómico duplicado de la CP, o como un reemplazo directo para la CP en PVX/GUS (denominado pGC3S en Chapman, S. N., et al (1992), Plant J., 2: 549-557). PVX/\DeltaREP/CP era esencialmente PVX/GUS, pero con una deleción de 1,7 kb en el ORF de la RdRp para evitar la iniciación de la replicación vírica. Se observó un sg mediado por amplicones en todas las plantas que expresaban los constructos de PVX, PVX/GUS o PVX/GUS/CP.
La figura 2 muestra el transcurso en el tiempo de la expresión de los síntomas en un amplicón inoculado manualmente y en plantas no transformadas. Se inocularon manualmente veinte plantas de cada línea de amplicón con 0,5 \mug de ARN del virión. Para cada experimento, también se inocularon veinte plantas no transformadas. Se representa el porcentaje medio (+/- SE) de las plantas que mostraron los síntomas a los 5 a 14 días de haberse realizado la inoculación. No fue visible ningún síntoma en ninguna planta hasta el sexto día posterior a la inoculación.
La figura 2(a): las plantas fueron inoculadas con TXS (cepa UK3 del VPX). La línea continua: plantas no transformadas y plantas de PVX/\DeltaREP/GUS (datos combinados); la línea discontinua: progenie de plantas de amplicón (PVX, PVX/GUS y PVX/GUS/CP (datos combinados)).
La figura 2(b): las plantas fueron inoculadas con cepas NL1, NL2, CP2 y CP4 del PVX (datos combinados). Línea continua: plantas no trasformadas y plantas de PVX/\DeltaREP/CP; la línea discontinua: plantas de amplicón que expresan la CP (PVX y PVX/GUS/CP (datos combinados)); la línea punteada (que es parcialmente ocultada por la línea continua): plantas de amplicón que expresan PVX/GUS, es decir, sin CP presente. Todas las plantas mostraron síntomas de infección a los 10 días de la inoculación. Se observó un retraso en la aparición de los síntomas con las plantas que expresaban un virus con CP.
La figura 3 muestra los constructos de plásmido usados en el ensayo de expresión transitoria de GUS (bombardeo de partículas).
La figura 3(a): representación esquemática del plásmido pSLJ4D4 basado en pUC (no dibujado a escala). La secuencia de GUS fue insertada entre el promotor 35S y la secuencia del terminador ocs. El único sitio de BamHI del extremo 3' del ORF de GUS fue usado para insertar cada uno de los ocho fragmentos del genoma del PVX mostrado en la figura 3(b).
La figura 3(b): representación esquemática del genoma del PVX. RdRp: ARN polimerasa dependiente de ARN; 25, 12, 8: el "bloque de genes triple"; CP: gen de la cubierta proteínica. Las barras de debajo del diagrama denotan las regiones del genoma clonado por separado en el sitio BamHI del pSLJ4D4. La dirección de la punta de las flechas indica la orientación sentido o antisentido de los fragmentos en el sitio BamHI. Los números adyacentes a cada barra denotan el clon de plásmido resultante. El tamaño de los fragmentos de PVX clonados fueron los siguientes: 436, 1,7 kb; 437, 2,0 kb; 438, 1,0 kb; 439, 0,7 kb; 441, 0,5 kb. Los fragmentos de PVX usados para producir los constructos 437, 438, 439 y 441 tenían el mismo terminal 3', mapeando la posición del nucleótido 6391 en el genoma del PVX.
La figura 4 muestra la actividad de la GUS en los discos foliares de los amplicones PVX y PVX/\DeltaREP/CP tras un bombardeo de partículas con los constructos ilustrados en la figura 3. Los discos foliares fueron teñidos para la actividad de la GUS 1 día después del bombardeo y aclarados en etanol al 70%, realizándose el recuento de las manchas azules. Los histogramas son de los números medios (+/- SE) de las manchas positivas de GUS sobre los discos foliares de PVX/\DeltaREP/CP (\DeltaREP) (barras blancas (constructos sentido)) y PVX (barras sombreadas (constructos sentido) y barras ralladas (constructos antisentido)). Cada experimento contenía de 6 a 8 discos foliares control extirpados de plantas no transformadas (barra negra). Los datos experimentales fueron estandarizados tal que la media para los discos control en cada experimento era de 100. Cada constructo fue bombardeado en 9 plantas de PVX y 6 plantas de PVX/\DeltaREP/CP (dos discos foliares de cada planta). Para cada constructo, se han combinado los datos. Los test de t de Student mostraron que no existía una diferencia significativa en el número de manchas con pSLJ4D4 en ninguna planta (PVX, PVX/\DeltaREP/GUS o no transformadas), ni con ningún constructo en las plantas control no transformadas en comparación con las plantas de PVX/\DeltaREP/GUS. La diferencia en el número de manchas en las plantas de PVX con los plásmidos de GUS/PVX fue significativamente diferente (P>0,95) del número en las plantas no transformadas con estos plásmidos.
La figura 5 muestra un análisis de transferencia sobre gel del ARN extraído de plantas del amplicón X 35S/GUS. El ARN fue extraído de plantas que expresaban un amplicón de PVX/GUS/CP (Amp X NT) o que expresaban un transgén de 35S/GUS (GUS X NT), o que expresaban ambos, el amplicón de PVX/GUS/CP y el transgén de 35S/GUS (GUS X Amp). La presencia de los transgenes fue confirmada mediante un análisis PCR y una hibridación Southern. Se sometieron a electroforesis 5 microgramos de ARN total sobre un gel al 1%. Se usó la secuencia de GUS completa como una sonda. Las flechas indican el ARNm de GUS (GUS) y el ARN de amplicón (PVX) que estaba encapsulado.
La figura 6 muestra un análisis de transferencia sobre gel del ARN extraído de las plantas del amplicón X TGB. El ARN fue extraído de las plantas que expresaban un amplicón, un amplicón más el transgén 35S/TGB, o sólo el transgén TGB. La huella 1 muestra el ARN extraído de una planta de PVX/GUS (AMP). Las huellas 2 a 5 muestran el ARN extraído de plantas transgénicas de 35S/TGB12+8 (TGB). Las huellas 6 y 7 muestran el ARN extraído de plantas que expresaban tanto el un amplicón de PVX/GUS como el transgén 35S/TGB12+8 (AMP X TGB). Las huellas 8 y 9 muestran el ARN extraído de plantas que expresaban tanto el transgén 35S/TGB12+8 como el amplicón de PVX (AMP X TGB). La sonda usada fue la secuencia codificante completa de TGB 12+8. Las flechas indican el ARN vírico encapsulado (PVX) o el ARNm de TGB (TGB).
La figura 7 muestra un análisis de transferencia sobre gel del ARN extraído de injertos de 35S/GUS. El ARN fue extraído 5 semanas después de realizar el injerto de injertos de 35S/GUS. Las plantas patrón fueron un amplicón de PVX/GUS (AMP) o un amplicón de PVX/DREP/GUS (DREP) o plantas control no transformadas (NT). Se sometieron a electroforesis sobre un gel al 1% 5 microgramos de ARN total. Se usó la secuencia de GUS completa como sonda. La flecha de GUS indica el ARNm de GUS. El asterisco señala hacia un segundo transcripto mayor de GUS que es producido en la línea de 35S/GUS (SA94084). Se observó una reducción similar en el ARNm de GUS en otras dos líneas de 35S/GUS analizadas, que no producen este segundo transcripto de GUS, cuando fueron inoculadas a las plantas del amplicón de GUS.
La figura 8 muestra un análisis de transferencia sobre gel del ARN extraído de plantas de Arabidopsis que expresaban un amplicón de PVX/GUS/AtrbohD (plantas de amplicón) o plantas control no transformadas (C). La sonda usada fue el extremo 5' de AtrbhD.
Ejemplos
Ejemplo 1
La demostración de que un transgén de amplicón activa el sg supuso la utilización de una serie de constructos en los que se introdujeron ADNc del virus X de la patata (PVX) como constructos transgénicos en el genoma del tabaco.
La figura 1 ilustra los constructos de amplicón de ADNc del PVX que fueron ensamblados e introducidos en Nicotiana tabacum cv Petite Habana mediante una transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Un constructo tenía el genoma de PVX_{UK3} intacto ("PVX"; Figura 1). El resto de los constructos también estaban basados en el genoma de PVX_{UK3}, pero fueron modificados para que incluyeran el gen de la \beta-glucuronidasa (GUS) insertado bien como un marco de lectura abierto (ORF) adicional en el genoma vírico ("PVX/GUS/CP"; Figura 1) o como un reemplazo de la cubierta proteínica ("PVX/GUS"; Figura 1).
Tanto el constructo de PVX/GUS/CP como el constructo de PVX/GUS especificaban genomas víricos que no causarían una infección sistémica si su ARN era inoculado en plantas no transformadas. En el constructo de PVX/GUS/CP se produjo una mutación en el ORF 2 del PVX que codifica una proteína necesaria para el movimiento del PVX fuera de la célula inoculada. El virus especificado por el constructo de PVX/GUS también permanecería confinado en la célula inoculada, porque las células infectadas no producirían cubierta proteínica.
Otro constructo de amplicón pA209 que fue analizado en alguno de nuestros experimentos especificaba un ORF3 defectuoso del PVX. Como resultado de esta mutación, el genoma vírico producido a partir del ADN de amplicón, como aquél con mutaciones en el ORF 2 y la CP, era defectuoso en el movimiento. Las plantas también fueron transformadas con un constructo de PVX/GUS defectuoso que codificaba una ARN polimerasa dependiente de ARN no funcional ("PVX/\DeltaREP/GUS"; Figura 1). El ARN derivado del transgén procedente de este constructo no iniciaría el ciclo de replicación vírica. Otras plantas control expresaron la GUS directamente a partir del promotor 35S ("35S/GUS").
Las líneas de amplicón seleccionadas para un análisis en mayor detalle fueron aquéllas en las que había un único inserto transgénico. Estas líneas de planta (5 a 7 líneas independientes por cada constructo) fueron identificadas mediante análisis de transferencia sobre gel de ADN de los transformantes primarios (a plantas) y mediante relaciones de segregación para GUS y/o el gen nptII en la auto progenie de T (plantas T1). Sin embargo, la naturaleza de locus único de los insertos no es crucial: las líneas con múltiples insertos se comportaron del mismo modo que aquéllas con insertos únicos.
Se concluyó que el ARN transcrito desde los constructos de amplicón fue replicado en las células de las diversas líneas transgénicas porque había actividad de la GUS en las líneas que portaban los constructos de PVX/GUS pA209 y PVX/GUS/CP (tabla I), y partículas de PVX en las líneas en las que el ORF de la CP estaba intacto (PVX y PVX/GUS/CP). La producción de GUS o de CP no fue debida a la traducción directa de estas proteínas a partir de ARN derivado de transgenes, porque no había GUS en las plantas que portaban el constructo de PVX/\DeltaREP/GUS.
La prueba de que la replicación del ARN de amplicón en plantas transgénicas había activado el sg se obtuvo del análisis de la expresión génica mediada por amplicones y porque había resistencia frente al PVX y supresión de ADN expresado transitoriamente en las líneas de amplicón. Los siguientes párrafos tratan estos puntos con mayor detalle.
La primera indicación de que la expresión del ARN de tipo salvaje y el ARN de PVX derivado fue suprimida en las plantas de amplicón fue la observación inesperada de que estas plantas carecían completamente de síntomas víricos. La indicación inicial de que el sg estaba activo en las líneas de amplicón se obtuvo a partir del análisis de los niveles de actividad de la GUS en las plantas. Los niveles de actividad de la GUS en las plantas de amplicón no fueron mayores y eran tan variables como los niveles de las líneas de 35S/GUS (tabla I). En ausencia del sg, sería de esperar que los niveles de actividad de la GUS fueran mayores que en las líneas 35S/GUS, debido a la amplificación del transcripto de amplicón mediante el procedimiento de replicación. La participación del sg en el fenotipo de las líneas de amplicón también fue apoyada por la tinción histoquímica, que reveló que la actividad de la GUS no fue detectada en muchas de las células de estas plantas. La ausencia de la GUS fue atribuida al sg.
Las células productoras de GUS fueron evidentes como manchas de la tinción histoquímica de cada planta que expresaba el transgén PVX/GUS/CP o PVX/GUS, y en todos los órganos de estas plantas incluyendo las hojas verdaderas, los tallos, los cotiledones y las raíces. El patrón teñido de la actividad de la GUS no fue observado en las plantas que expresaban el transgén 35S/GUS. Existe un número de posibles explicaciones para el aspecto teñido de las hojas de amplicón tras la tinción histoquímica para la GUS. En principio, las manchas podrían desarrollarse porque el sg mediado por amplicones es somáticamente inestable. Sin embargo, consideramos que la inestabilidad somática no es probable por varias razones: las regiones de producción de GUS no se correspondían con los sectores del desarrollo de la planta; los niveles de ARN de amplicón no eran tan altos como sería de esperar si el sg no estuviera activo en todas las hojas de la planta y hubiera resistencia frente al PVX, incluso en las regiones de las hojas de amplicón que se tiñeron de azul para la GUS. Una explicación alternativa es que el sg y la resistencia asociada dependiente de la homología son somáticamente estables en las plantas de amplicón, pero que el ARN de amplicón replicable ocasionalmente supera los efectos de este sg. La ruptura de la resistencia, que se manifiesta como manchas de la actividad de la GUS, sería más evidente en las líneas de amplicón de GUS que en las líneas de PVX inoculadas manualmente con PVX.GUS, porque la transcripción in planta del amplicón generaría una presión de inoculación más elevada que con un virus inoculado manualmente.
Los atributos característicos de la resistencia a virus mediante el sg en plantas transgénicas consisten en que ésta es específica de virus que son muy similares al transgén a nivel nucleotídico y que habitualmente está asociada con niveles bajos de ARN transgénico. La resistencia a virus con estas características es denominada resistencia dependiente de la homología.
Para determinar si las líneas de amplicón (figura 1) mostraban una resistencia dependiente de la homología, las plantas de amplicón de la generación T1 fueron inoculadas con PVX_{UK3}, que es la cepa del PVX usada como la fuente original de ADNc de los constructos de amplicón.
Los síntomas de la infección por el PVX se desarrollaron en el 25% de las plantas al mismo tiempo que en las plantas que expresaban el transgén PVX/\DeltaREP/GUS o en las plantas no transformadas. El 75% restante de las plantas de amplicón no desarrolló síntomas a los 14 días de realizarse la inoculación (todas las plantas control mostraron síntomas a los 9 días de realizarse la inoculación) (figura 2).
Esta relación de segregación de 3:1 del carácter de resistencia indicó que la resistencia al PVX fue expresada en la mayoría, si no en la totalidad, de la progenie transformada de las líneas de amplicón. Los datos mostrados en la figura 2 están combinados de varios experimentos independientes y son destacan particularmente por la falta de variación entre las plantas y entre las líneas generadas con cada constructo.
Por el contrario, hubo poca o ninguna resistencia frente a las cepas de PVX_{CP} y de PVX_{NL}. Como la secuencia de nucleótidos de PVX_{CP} es 78% similar a la secuencia de PVX_{UK3} (30), se concluye que la resistencia en las líneas de amplicón es muy específica de la cepa.
Para analizar en mayor profundidad la resistencia específica de las cepas, se inoculó un constructo de PVX.GFP en plantas no transformadas, en dos líneas de PVX/GUS, dos de PVX/GUS/CP y dos de PVX/\DeltaREP/GUS. El PVX.GFP es un constructo del vector PVX_{UK3} que porta el gen indicador de la proteína verde fluorescente (GFP, Green Fluorescent protein).
En las hojas inoculadas de las plantas no transformadas y de las plantas de PVX/\DeltaREP/GUS había muchas manchas grandes de verde fluorescente a los 7 días de realizarse la inoculación, lo que ilustraba la infección de PVX.GFP en estas plantas. Por el contrario, no había regiones verde fluorescente en las hojas de las plantas de amplicón.
De manera similar, el PVX.GUS (el vector PVX_{UK3} que expresaba el gen indicador de la GUS) produjo grandes focos positivos de infección de GUS en las plantas de PVX/\DeltaREP/GUS y en las no transformadas, pero no en las plantas de PVX. Rara vez, y tras una tinción histoquímica prolongada, se observaron de 3 a 6 manchas pequeñas de actividad de la GUS en las hojas de las plantas de PVX inoculadas con PVX.GUS.
En base a estos datos de gen indicador, se concluyó que la ausencia de los síntomas tras la inoculación de las plantas de amplicón con PVX_{UK3} era debida a la resistencia a la infección inicial en lugar de a la tolerancia del PVX.
La conclusión de que había resistencia al PVX en la célula inicialmente inoculada fue confirmada por la inoculación del PVX en protoplastos preparados a partir de plantas transgénicas. Los inóculos para estos ensayos con protoplastos eran transcriptos sintetizados in vitro de bien pTXS o pCP2, que son clones de ADNc de longitud completa de PVX_{UK3} y PVX_{CP2}, respectivamente.
Los protoplastos fueron preparados a partir de plantas que expresaban cada uno de los constructos de amplicón o a partir de plantas control no transformadas. Los protoplastos fueron inoculados con transcriptos sintetizados in vitro de pTXS, el clon de ADNc de PVX_{UK3} (T) o pCP2, el clon del ADNc de PVX_{CP2} (C). Se extrajo ARN de 50.000 protoplastos a las 24 horas de realizar la inoculación y se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa-formaldehído al 1% (p/v), se transfirió sobre una membrana de nailon y se hibridó a una sonda de ARN específica del extremo 3' de PVX_{UK3} (T) o PVX_{UK3} (C). Los autorradiogramas fueron expuestos durante 1 hora.
El análisis de transferencia sobre gel del ARN de los extractos de protoplasto reveló que los ARN genómicos y subgenómicos de ambas cepas se acumulaban a niveles elevados en los protoplastos de las líneas no transformadas y de PVX/\DeltaREP/GUS. El ARN de PVX_{CP2} se acumuló hasta el mismo grado en los protoplastos de las líneas de amplicón y las no transformadas. Por el contrario, los protoplastos de las líneas de amplicón mostraron una resistencia extrema al PVX_{UK3}.
Una importante observación que hicimos es que hay un nivel bajo de ARN de amplicón en las células inoculadas de prueba de las líneas de PVX o de las líneas de PVX/GUS/CP. En las células de PVX/GUS, los transcriptos de amplicón apenas fueron detectables incluso tras una larga exposición del autorradiograma. Estas observaciones confirman que la resistencia al PVX en la línea de amplicón era similar a la resistencia dependiente de la homología en que ésta estaba asociada con un nivel bajo de acumulación del transcripto transgénico.
Ejemplo 2
La resistencia a virus, como se muestra en el ejemplo 1 anterior, podría ser considerada como un sg que actúa en trans de genes víricos. Para demostrar que los amplicones también podían mediar el sg que actúa en trans de genes nucleares, se realizó un ensayo transitorio.
Los constructos usados en el ensayo transitorio estaban basados en un plásmido que expresaba GUS directamente desde el promotor 35S (pSLJ4D4; Figura 3). Se insertaron regiones del clon de ADNc del PVX_{UK3} en el lado 3' del ORF de la GUS. Se insertaron secuencias procedentes bien de la región 5' o de la región 3' del genoma vírico en pSLJ4D4 tanto en la orientación sentido como en la antisentido (figura 3). Cada constructo de plásmido fue revestido con partículas de oro y bombardeado electrostáticamente en las hojas de las plantas que expresaban el transgén PVX o PVX/\DeltaREP/GUS o de plantas no transformadas.
La tinción histoquímica para la actividad de la GUS de las hojas bombardeadas reveló que había una supresión sustancial y estadísticamente significativa de la expresión de la GUS en las plantas de PVX, pero sólo cuando los constructos plasmídicos contenían una región del genoma de PVX (figura 4). La supresión se manifestó como un número reducido de manchas azules en las hojas de PVX en comparación con el número de manchas de las plantas control no transformadas (figura 4). En base al número de manchas azules de este ensayo transitorio, la expresión de la GUS en las plantas de PVX fue del 50 al 90% menor que la observada en las plantas no transformadas.
La expresión de la GUS desde los plásmidos con las secuencias de PVX transcritas en la orientación antisentido fue suprimida al menos al igual que desde aquéllos en los que la secuencia de PVX fue transcrita como ARN sentido.
No se observó ninguna supresión de la expresión de la GUS en el ensayo transitorio en las plantas con el transgén PVX/\DeltaREP/GUS (figura 4).
No hubo supresión de la expresión de la GUS desde pSLJ4D4, que tiene una homología de promotor con el transgén de amplicón (figura 4). Por lo tanto, es probable que la supresión de la expresión de la GUS desde los constructos quiméricos de GUS/PVX supusiera un mecanismo post-transcripcional en las plantas de amplicón. Este mecanismo se asemeja al sg post-transcripcional en que está dirigido hacia ARN víricos y ARN transcritos desde genes nucleares expresados transitoriamente. Presumiblemente, la secuencia de PVX del extremo 3' del transcripto de GUS/PVX desde el plásmido expresado transitoriamente era la diana de un mecanismo de sg post-transcripcional en las plantas de amplicón que expresaban el transgén PVX.
Ejemplo 3
No fue posible usar el ensayo biolístico transitorio del silenciamiento génico en las líneas con los amplicones de PVX/GUS y PVX/GUS/CP, porque el procedimiento de bombardeo condujo a niveles elevados de fondo de GUS. Para analizar el silenciamiento génico en estas líneas, se realizó un ensayo transitorio alternativo del sg.
La secuencia de 35S/GUS desde el pSLJ4d4 fue transferida a un vector binario. Se infiltraron cultivos de Agrobacterium tumefaciens que llevaban este constructo en las hojas de las plantas de amplicón, y se determinó la expresión de la GUS mediante una tinción histoquímica. Los datos preliminares sugirieron que el amplicón de PVX/GUS es un mejor silenciador de la GUS que el constructo de PVX/GUS/CP.
En experimentos similares, la secuencia de 35S/GUS/PVX del plásmido 437 fue transferida a un vector binario e introducida en las plantas de amplicón mediante una infiltración en Agrobacterium. El análisis histoquímico reveló que la expresión de la GUS desde el constructo de 437 fue suprimida en las plantas de PVX en y las plantas de PVX/GUS.
La reproducibilidad del sg mediado por amplicones está indicada por los ensayos anteriores, en los que todas las líneas de amplicón analizadas mostraron un fenotipo similar. Se representa una tabla (tabla I) para mostrar el número de líneas usado para cada ensayo.
TABLA I
Análisis Nº de líneas analizadas
Resistencia a virus 24
Bombardeo 5
Infiltración en Agrobacterium 8
Ejemplo 4
En un tercer ensayo de sg mediado por amplicones, las líneas de amplicón (PVX/GUS, PVX/GUS/CP y PVX/
\DeltaREP/GUS) fueron cruzadas con líneas que llevaban un transgén 35S/GUS. El análisis de transferencia sobre gel de ARN mostró una supresión del ARNm de la GUS en plantas que portaban tanto el amplicón como transgenes 35S/GUS en comparación con plantas que sólo portaban el transgén 35S/GUS (figura 5).
Estos datos indican que el amplicón puede mediar el sg de un gen nuclear con homología al constructo de ampli-
cón.
Se realizaron cruces recíprocos entre plantas de amplicón de Nicotiana tabacum cv. Petite (PVX o PVX/GUS o PVX/\DeltaREP/GUS) o plantas control no transformadas) y plantas transgénicas de 35S/TGB12+8. Las plantas de 35S/TGB12+8 expresan las proteínas de triple bloque génico de 12 kDa y 8kDa de PVX. Estas plantas muestran un fenotipo de enanismo extremo y tienen hojas cloróticas y necróticas.
Todas las plantas que expresaban tanto el amplicón de PVX como el transgén 35S/TGB12+8 tenían un aspecto de tipo salvaje; es decir, perdieron la clorosis y la necrosis, y eran de un tamaño normal. Todas las plantas que expresaban tanto el amplicón de PVX/\DeltaREP/GUS como el transgén 35S/TGB12+8 mostraron un fenotipo de TGB, que concordaba con la hipótesis de que la replicación del amplicón es necesaria para activar el mecanismo de silenciamiento génico. El análisis de trasferencia sobre gel de ARN confirmó que el ARNm de TGB se redujo en las plantas silenciadas por el amplicón (figura 6).
Ejemplo 5
En un cuarto ensayo de silenciamiento medido por amplicón, las plantas transgénicas de 35S/GUS fueron injertadas en plantas de amplicón (PVX/GUS/CP, PVX/GUS, PVX o PVX/\DeltaREP/GUS)o plantas control no transformadas (NT). El análisis de transferencia sobre gel en el ARN extraído de los injertos de 35S/GUS mostró que el ARNm de la GUS fue reducido cuando la planta patrón expresaba un amplicón de PVX/GUS o PVX/GUS/CP de replicación (figura 7). Estos datos indican que el amplicón produce una señal sistémica del sg que puede suprimir la expresión de un transgén con homología con el constructo de amplicón.
Esto indica que el sg inducido por un amplicón sistémico o remoto puede ser observado en aquellas realizaciones en las que no todas las células de una planta están transcribiendo el amplicón que codifica el ácido nucleico, por ejemplo, porque no ha sido introducido a través de la planta o porque la transcripción está bajo el control de un promotor inducible o regulado por los tejidos o por el desarrollo.
Ejemplo 6
En otro ensayo del sg mediado por amplicones, se insertó parte de un gen de enanismo del tomate en un amplicón de PVX/GUS. El constructo resultante, PVX/GUS/DWARF, fue introducido en plantas de tomate usando una transformación mediada por A. tumefaciens. La tinción histoquímica reveló manchas de actividad de la GUS en las plantas transformadas, similar al patrón de tinción de GUS observado en plantas de tabaco que expresaban un amplicón de PVX/GUS o PVX/GUS/CP. Esta observación sugirió que el amplicón de PVX/GUS/DWARF era expresado, y la replicación vírica había inducido el sg en las plantas de tomate. Todas las plantas que expresaron el amplicón de PVX/GUS/DWARF mostraron una altura reducida con respecto a las plantas control no transformadas tomadas a través del procedimiento de cultivo de tejidos al mismo tiempo (las plantas fueron evaluadas 3-4 semanas después de haber sido transferidas a medios de enraizamiento y fueron cultivadas a 24ºC con 16 horas de iluminación). Estos datos indican que el amplicón puede activar el sg reproducible en el tomate y puede suprimir la expresión de un gen endógeno.
Ejemplo 7
El sg mediado por amplicones no se basa en el uso del promotor 35S del CaMV. Hemos repetido las transformaciones descritas anteriormente con constructos que son similares a los constructos de promotor 35S mostrados en la figura 1, a excepción de que tienen el promotor nos de Agrobacterium tumefaciens.
Los análisis realizados en los transformantes primarios revelaron que las plantas mostraban poca o ninguna actividad de la GUS (plantas de nos/PVX/GUS y nos/PVX/GUS/CP), pero que contenían viriones (plantas nos/PVX y nos/PVX/GUS/CP), similares a las observaciones realizadas con los amplicones expresados por 35S.
Las plantas de amplicón de nos fueron infiltradas con cultivos de Agrobacterium que portaban un plásmido 35S/GUS y hojas infiltradas teñidas para la actividad de la GUS 2 días después de la infiltración. Los paneles de la actividad de la GUS fueron observados en hojas de plantas control no transformadas y hojas que expresaban un amplicón de nos/PVX y nos/PVX/\DeltaREP/GUS.
No se observó actividad de la GUS desde el plásmido expresado transitoriamente en las hojas que expresaban un amplicón de nos/PVX/GUS o nos/PVX/GUS/CP.
Estos datos indican que los amplicones de nos actúan del mismo modo que los amplicones de 35S, en que éstos pueden mediar el sg reproducible.
Ejemplo 8
Los amplicones de PVX pueden ser usados en un abanico de plantas que incluye aquéllas que no son hospedadores naturales del PVX.
Para demostrar este aspecto del espectro de hospedador del fenotipo de amplicón, se ensambló una serie de constructos de amplicón similares a los mostrados en la figura 1, con la excepción de que la secuencia de GUS fue reemplazada por ADNc que codifica la proteína verde fluorescente (GTP) de la medusa. Estos constructos de amplicón de GTP eran esencialmente idénticos a los constructos del vector PVX.GFP que han sido descritos anteriormente (en Baulcombe et al. (1995), Plant 7: 1045-1053). Estos constructos fueron transformados en Arabidopsis thaliana, que no es un hospedador del PVX.
Las plantas transgénicas contenían partículas (viriones) de PVX.GFP, lo que indicaba que el transcripto de ARN del amplicón había sufrido una replicación en Arabidopsis. Los plantones transformados con un amplicón de PVX/GFP/CP mostraron una fluorescencia verde procedente del gen indicado por la GFP en las puntas de sólo las primeras hojas verdaderas. No se detectó la GFP en las plantas más viejas.
Adicionalmente, se inoculó una planta con savia extraída de una planta de Arabidopsis transformada con un amplicón de PVX/GFP/CP. Se iluminó una hoja bajo luz UV, mostrándose manchas de actividad de la GFP que indicaban la presencia de viriones de PVX/GFP/CP en el extracto de sabia de Arabidopsis.
La progenie de estas Arabidopsis transformadas también contenía partículas de PVX.GFP, lo que indicaba que el amplicón estaba integrado en el genoma nuclear y era heredado. Sin embargo, a pesar de la presencia de partículas de PVX.GFP, no había GFP detectable en estas líneas.
Por lo tanto, el fenotipo de estas líneas de Arabidopsis es análogo al fenotipo de las plantas de tabaco transgénicas anteriormente descritas: hay replicación vírica, pero hay supresión del gen indicador (GFP en este caso) que es parte del constructo de amplicón. Estas características son potentes indicadores de que hay sg debido a la presencia del amplicón en el genoma de Arabidopsis.
En otro experimento, se transformaron plantas de Arabidopsis con un transgén 35S/GFP. Estas plantas fueron polinizadas de forma cruzada con plantas que expresaban un amplicón de PVX/GFP/CP o con plantas control no transformadas (NT). Tanto las plantas transgénicas de 35S/GFP parentales como la progenie procedente del cruce de 35S/GFP x NT mostraron una expresión uniforme de GFP. Sin embargo, todas las plantas que expresaron tanto el amplicón de PVX/GFP/CP como el transgén 35S/GFP no mostraron actividad de la GFP. Las plantas transgénicas de 35S/GFP también fueron transformadas de nuevo con un amplicón de PVX/GFP. Las plantas transgénicas resultantes no mostraron actividad de la GFP a pesar de portar el transgén 35S/GFP. Estas observaciones indican que el amplicón puede mediar el sg reproducible en Arabidopsis.
Ejemplo 9
Para demostrar que los amplicones pueden mediar el sg reproducible de endogenes de Arabidopsis, parte de los endogenes de fitoeno desaturasa (PDS), de ALBINO3 y del homólogo D de la oxidasa de estallido respiratorio de A. thaliana (AtrbohD) fueron clonados por separado en un amplicón de PVX y fueron transformados en Arabidopsis. Cada transformante que expresaba un amplicón de PVX/PDS o PVX/ALBINO mostró manchas blancas en las hojas, y los niveles de ARNm del AtrbhoD fueron suprimidos en cada transformante que expresaba el amplicón de PVX/AtrbhoD (figura 8). Estos datos demuestran que el amplicón puede mediar el sg reproducible de endogenes de plantas, incluso aquéllos que no son hospedadores naturales del PVX. De este modo, el sg mediado por amplicones puede ser usado con genes endógenos, incluyendo aquéllos responsables o asociados con caracteres tales como la maduración, la formación de polen, la biosíntesis de la lignina, la producción de pigmentos florales, las rutas reguladoras que controlan el desarrollo, las respuestas medioambientales (p.ej., hábito de crecimiento o resistencia a enfermedades), la producción de toxinas, etc.
Conclusiones de los ejemplos anteriores
La prueba experimental descrita anteriormente proporciona indicaciones de que los constructos de amplicón pueden causar el sg de múltiples dianas. En las líneas de 35S/PVX/GUS, hay una resistencia dependiente de la homología frente tanto al PVX como a la supresión de la GUS en el ensayo transitorio.
Los constructos de amplicón pueden ser útiles activadores del sg, incluso con más elementos eliminados de los constructos mostrados en la figura 1. De este modo, los constructos se basan en los revelados anteriormente, pero sólo comprenden un amplicón mínimo, en el que toda la secuencia procedente del constructo vírico que no codifica proteínas necesarias para la replicación o que no incluye elementos que actúan en cis necesarios para la replicación ha sido eliminada. También debería tenerse en cuenta que el sg aparentemente no requiere que la secuencia diana esté unida a un promotor vírico, porque la región 5' del genoma vírico que no está en un ARN subgenómico vírico es una diana del silenciamiento génico.
Ejemplo 10
Comparación con el enfoque sugerido por biosource technologies en el documento WO95/34668
El trabajo de Biosource Technologies Inc (20, 21) puede ser considerado como un estudio posterior al trabajo de lo transgenes polivíricos (22) anteriormente mencionado, aunque la similitud de secuencias entre el virus y el genoma nuclear supone un gen nuclear endógeno en lugar de un transgén, y no hay caracterización del sg inducido por el virus en la acumulación de virus.
El artículo (21- Kumagai et al.) y la solicitud de patente asociada (20) describen dos tipos de ejemplos que implican vectores TMV.
En uno de ellos, la secuencia de ADNc insertada en el vector era de ARNm de fitoeno desaturasa, y hay un silenciamiento inducido por virus del gen endógeno de fitoeno desaturasa. Un segundo ejemplo supone la adición de ADNc de fitoeno sintasa a los vectores TMV. En este ejemplo, no hay silenciamiento del gen endógeno. De hecho, hubo una sobre-expresión de la fitoeno sintasa. Las diferencias entre estos dos ejemplos proporcionan más pruebas de que el silenciamiento génico inducido por virus no es necesariamente un fenómeno reproducible.
Se ha demostrado otro punto importante sobre la variación en el silenciamiento génico inducido por virus mediante nuestro análisis experimental adicional de los documentos de Biosource.
Estos análisis han revelado que el silenciamiento génico inducido por virus varía entre las especies vegetales. Hemos producido un constructo de vector vírico similar a su constructo de TMV/fitoeno desaturasa. La única diferencia principal entre nuestro constructo y los experimentos específicos de Biosource es que el vector vírico es el virus X de la patata en lugar del TMV. Sin embargo, no es probable que esta diferencia influya en el resultado de los experimentos, porque un constructo de PVX, como el constructo de TMV, es capaz de iniciar el silenciamiento del gen de PDS endógeno cuando es inoculado en Nicotina benthamiana. Este vector también es capaz de silenciar la PDS de Nicotiana clevelandii.
Sin embargo, no hay silenciamiento del gen de PDS de Lycopersicon esculentum, incluso aunque esta planta sea un hospedador reconocido del PVX.
Introdujimos un fragmento del ADNc de la fitoeno desaturasa (PDS) del tomate en el vector PVX y lo inoculamos a Nicotiana benthamiana, Nicotiana clevelandii y Lycopersicon esculentum (tomate). El fragmento de la secuencia de PDS del tomate insertada en el vector PVX era exactamente igual que el fragmento añadido al vector TMV en los experimentos de Kumagai et al. (21). Cuando se inocularon los constructos del vector PVX/PDS en las especies de Nicotiana, como describen Kumagai et al, con los constructos de TMV, se produjo un fotoblanqueamiento de las partes superiores de la planta, lo que indicó que había habido sg de los genes endógenos de la PDS. Sin embargo, cuando se inocularon los mismos constructos de PVX/PDS en el tomate, a pesar de ser el tomate un buen hospedador del PVX y a pesar de la identidad de la secuencia de PDS vírica y de la secuencia endógena, no se produjo fotoblanqueamiento y, por lo tanto, no se produjo un sg de la PDS del tomate.
La carencia del fotoblanqueamiento no pudo ser atribuida a la falta de infección: había síntomas de PVX en las plantas infectadas y se había acumulado ARN de PVX/PDS hasta un nivel elevado.
En un experimento similar, se insertó el ADNc (entre el codón de iniciación de la posición 105 hasta el codón de terminación del marco de lectura abierto de la posición 1.542) de glutamato semialdehído aminotransferasa (GSA-AT2) de Nicotiana tabacum en el vector PVX (Hofgen et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91: 1726-1730). En este experimento, se produjo un fuerte sg de la secuencia endógena de GSA-AT2 tras la inoculación en N. benthamiana, y las plantas infectadas desarrollaron una clorosis amarilla. Sin embargo, tras la inoculación en N. tabacum, se produjo un sg mucho más débil, desarrollándose sólo una clorosis muy suave.
Estos resultados ilustran las diferencias entre el sg inducido por amplicones y el sg inducido por virus de los documentos de Biosource. El sg inducido por amplicones no depende de la capacidad del virus para moverse en la planta infectada y puede ser usado incluso con plantas que no sean hospedadores reconocidos del virus usado como un componente del constructo de amplicón. El sg inducido por amplicones es útil incluso cuando el amplicón especifica un constructo defectuoso que no se mueve de célula a célula en la planta infectada. En las especies vegetales en las que se replican transcriptos de amplicón, nuestros experimentos muestran que el sg es constante de planta a planta.
Por otro lado, nuestros experimentos muestran que el sg inducido por un virus inoculado está sujeto a la variación de planta a planta asociada con los efectos mediambientales sobre la propagación del virus. Es un efecto que no funciona igualmente bien incluso en diferentes hospedadores del vector vírico, y nuestros experimentos muestran que no tiene la coherencia alcanzada mediante el uso de la presente invención.
Esta influencia de la planta hospedadora no se aplica al silenciamiento génico mediado por amplicones conforme a la presente invención, que, como se indica anteriormente, es eficaz en plantas que pueden o no pueden ser hospedadores naturales para el componente vírico del constructo de amplicón.
Materiales y procedimientos Constructos y transformación de plantas
Todos los constructos de ADNc vírico fueron insertados entre el promotor CaMV 35S y el terminador transcripcional del gen de la nopalina sintasa (nos), y transferidos al vector binario pSLJ7291. Los datos de cada constructo ser ofrecen a continuación.
Se insertó un clon de ADNc del PVX infeccioso entre el promotor CaMV 35S y el terminador transcripcional del gen de la nopalina sintasa (nos) para generar el plásmido pNCX. El fragmento NarI de 7,3 kb, que englobaba el promotor 35S, el genoma completo del PVX y la secuencia de terminación, fue ligado con el vector binario digerido con ClaI, pSLJ7291, para crear el constructo de transgén PVX (figura 1).
El fragmento Apal-Xhol de 1,4 kb de pNCX fue reemplazado por el fragmento correspondiente procedente del plásmido \DeltaG (7) para generar el plásmido pA100. El plásmido pA100 es un vector basado en pUC que codifica el promotor 35S, los ORF de PVX 1, 2, 3, 4, GUS y la secuencia de terminación. La secuencia del promotor subgenómico ACP de secuencia arriba del gen de GUS permitió que la expresión de la GUS como parte de un ARN subgenómico (7). El fragmento NarI de 8,6 kb del pA100 fue ligado con pSLJ7291 digerido por ClaI, para crear el constructo de transgén PVX/GUS (figura 1).
Se borró un fragmento Bg/II de 1,4 kb del ORF1 del PVX en el plásmido pA100 para generar pA102. El fragmento NarI de 6,9 kb procedente del pA102 fue ligado con pSLJ7291 digerido con ClaI para crear el constructo de transgén PVX/\DeltaREP/GUS (figura 1).
El fragmento Apal-XhoI de 1,4 kb del pNCX fue reemplazado por el fragmento correspondiente del plásmido p\DeltaA-pa/Apa-GUS (que es constructo GC3(7) que contiene una deleción de 324 nt en el ORF2) para generar el plásmido Pa104. El plásmido Pa104 es un vector basado en pUC que codifica al promotor 35S, el ORF1 del PVX, un ORF2 mutado, los ORF 3 y 4, GUS, CP y la secuencia de terminación. Una secuencia del promotor subgenómico de la CP duplicada secuencia arriba del gen de GUS permitió la expresión de la GUS como parte de un ARN subgenómico (7). La deleción en el ORF2 del PVX afecta al movimiento de célula a célula, pero tiene poco o ningún efecto sobre la acumulación vírica en los protoplastos (2). El fragmento NarI de 9,0 kb del Pa104 fue ligado con pSLJ7291 digerido por ClaI para crear el constructo de transgén PVX/GUS/CP (figura 1).
El constructo de 35S/GUS (figura 1) fue generado mediante la digestión de pSLJ4D4 (figura 3) con EcoRII y HindIII y el fragmento de 4,1 kb que codifica al promotor 35S, GUS y la secuencia de terminación fue ligado con el vector binario digerido de manera similar, pSLJ7292, para generar el constructo de transgén 35S/GUS (figura 1). El plásmido pSLJ7292 es idéntico a pSLJ7291, a excepción de la orientación de la secuencia poli-ligadora.
Cada constructo fue introducido en N. tabacum cv Petite havana mediante una transformación de discos foliares mediada por A. tumefaciens (15), y las plantas fueron regeneradas en un medio que contenía kanamicina (300 \mug/ml).
Para el constructo DWARF, se insertó 1 kb del extremo 5' del gen DWARF del tomate en el sitio Xhol del amplicón de 35S/PVX/GUS. El fragmento Sstl de 35S/PVX/GUS/DWARF de 9,6 kb fue ligado con pSLJ7291 cortado por Sstl. El constructo fue introducido en tomate cv Money Maker mediante una transformación de discos foliares mediada por A. tumefaciens (15), y las plantas fueron regeneradas en un medio que contenía kanamicina (300 microgramos/ml).
Se construyeron otros constructos (PVX/AtrbohD, PVX/ALBINO3 y PVX/PDS1) mediante la introducción de aproximadamente 0,5-1,0 kb de cada gen diana en el sitio Xhol del constructo del amplicón 35S/PVX/GUS. Cada constructo fue transferido al vector binario pGREEN0029 (PVX/PDS y PVX/ALBINIO3) o a pSLJ755 (PVX/
AtrbohD) e introducido en plantas de A. thaliana mediante la transformación de las flores. Los plantones transgénicos fueron seleccionados tras un tratamiento con basta.
Análisis de la actividad de la GUS
Se realizó una tinción histoquímica para la actividad de la GUS en plantas T0 y T1, según lo descrito (1). Los ensayos con MUG en las plantas T1 (de 5 semanas de vida) fueron realizados según lo descrito (7). Para cada planta, se extirparon discos foliares procedentes de tres hojas distintas y se mezcló el extracto de sabia.
Preparación de viriones de PVX y ARN de virión
La preparación de los viriones y del ARN de virión fue como se describe anteriormente (6).
Transcripción in vitro, preparación y electroporación de protoplastos, y análisis de transferencia sobre gel de ARN
Los plásmidos pTXS y pCP2 fueron linearizados con enzima de restricción Spel, y transcritos in vitro según lo descrito (7). La preparación y la inoculación de los protoplastos, así como el análisis de transferencia sobre gel de ARN fueron según lo descrito (7).
Constructos de plásmido para el bombardeo de los discos foliares
Se generaron fragmentos del genoma de PVX (figura 3) mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores de oligonucleótido que contenían un sitio de la enzima de restricción BamHI además de la secuencia de PVX. El ADN del molde era pTXS (el clon del ADNc de cadena completa de PVX_{UK3}). Las reacciones fueron realizadas según lo descrito anteriormente (7).
Los productos de ADN fueron digeridos con BamHI y ligados con pSLJ4D4 digerido con BamHI para generar los plásmidos 437, 438, 439 y 441. El fragmento Bg/II de 1,7 kb de pTXS fue ligado con pSLJ4D4 digerido con BamHI para generar el plásmido 436. La orientación de la secuencia de PVX en pSLJ4D4 fue determinada mediante análisis con enzima de restricción. Los fragmentos de PVX usados para los constructos 436, 437 y 438 fueron clonados individualmente tanto en la orientación sentido como antisentido (figura 3).
Bombardeo de discos foliares
Se cortaron discos foliares de hojas completamente expandidas de plantas de 6 semanas de vida y se colocaron en un medio de Murashige y Skoog que contenía sacarosa al 3%, y fueron inmediatamente bombardeados con partículas de oro revestidas de ADN de plásmido. Los ADN de plásmido fueron preparados usando una columna QIAGEN-tip 100 (Qiagen Inc. Dorking, Surrey) y fueron precipitados sobre partículas de oro de 0,95 \mum de diámetro según lo descrito (25), pero con una dilución de 20 veces más de la preparación. La aceleración de las partículas fue realizada usando el sistema de administración de genes ACCELL (Agracetus Inc.) bajo un vacío parcial, usando una presión de helio de 10.000 kPa. Los discos foliares fueron incubados a TA sin luz durante 24 horas y luego teñidos para la actividad de la GUS.
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Claims (45)

1. Constructo de ADN que comprende un promotor ligado operativamente a ADN que puede ser transcrito en una célula vegetal a un transcripto de ARN, incluyendo el transcripto de ARN una secuencia vírica vegetal que comprende
(i)
elementos víricos que actúan en cis y
(ii)
factores que actúan en trans codificantes de secuencias,
que confieren al transcripto de ADN la capacidad de replicarse en el citoplasma de la célula vegetal;
en el que el transcripto de ARN carece de todo o parte del genoma vírico no necesario para la replicación en el citoplasma, y en el que el transcripto de ARN incluye una secuencia de acceso que es capaz de realizar una regulación reductora de la expresión de un gen diana, siendo la secuencia de acceso, en una orientación sentido o antisentido, bien:
(a)
complementaria a una secuencia del gen diana o (b) homóloga a una secuencia del gen diana tal que haya más de un 80% de homología entre la secuencia de acceso y la secuencia del gen diana.
2. Constructo de ADN según lo reivindicado en la reivindicación 1, en el que el virus vegetal es un virus de ARN.
3. Constructo de ADN según lo reivindicado en la reivindicación 1, en el que el virus vegetal es un virus de ADN.
4. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el virus vegetal es: el virus X de la patata; el virus del mosaico del tabaco; el virus de grabado del tabaco; el virus del cascabel del tabaco; el virus del enanismo arbustivo del tomate; el virus del mosaico del bromo; el virus del mosaico de la coliflor; el virus del mosaico de la yuca africana; o el virus del mosaico dorado del tomate.
5. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el promotor es constitutivo.
6. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el promotor es: regulado en el desarrollo, inducible o específico de tejidos.
7. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el promotor se selecciona entre: CMV 355; nos; gen GST-II-27.
8. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende un terminador transcripcional.
9. Constructo de ADN según lo reivindicado en la reivindicación 1, en el que el transcripto de ARN no puede iniciar la infección sistémica de plantas no transformadas.
10. Constructo de ADN según lo reivindicado en la reivindicación 9, en el que el transcripto de ARN no codifica una cubierta proteínica del virus vegetal de la que deriva la secuencia vírica vegetal.
11. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la homología entre la secuencia de acceso y la secuencia del gen diana es mayor del 90%.
12. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la homología entre la secuencia de acceso y la secuencia del gen diana es mayor del 95%.
13. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de acceso dirige al menos el codón ATG de iniciación del gen diana.
14. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de acceso dirige una secuencia conservada de un grupo de genes diana tal que realiza la regulación reductora de la expresión de uno o más miembros de un grupo de genes diana.
15. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende más de una secuencia de acceso.
16. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de acceso es una secuencia foránea a la secuencia vírica vegetal.
17. Constructo de ADN según lo reivindicado en la reivindicación 16, en el que la secuencia foránea está sustituida por un gen vírico.
18. Constructo de ADN según lo reivindicado en la reivindicación 16, en el que la secuencia foránea es adicional al genoma vírico.
19. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que la secuencia foránea está incluida en el constructo como un marco de lectura abierto intacto tal que es transcrita desde el transcripto de ARN como un ARN subgenómico.
20. Constructo de ADN según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que el gen foráneo es: un gen vegetal endógeno, un transgén o un gen procedente de un patógeno.
21. Constructo de ADN según lo reivindicado en la reivindicación 20, en el que el gen vegetal endógeno es uno asociado con uno o más de los siguientes caracteres: maduración, formación de polen, biosíntesis de la lignina, producción de pigmentos florales, rutas reguladoras que controlan el desarrollo, respuestas medioambientales, crecimiento, resistencia a enfermedades, producción de toxinas.
22. Vector recombinante que comprende un constructo de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
23. Vector recombinante según lo reivindicado en la reivindicación 22, que es adecuado para la transformación estable de una célula vegetal.
24. Vector recombinante según lo reivindicado en la reivindicación 23, que es un vector binario de Agrobacterium.
25. Uso de un constructo de ADN o un vector recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la producción de una planta transgénica.
26. Célula hospedadora que contiene un constructo de ADN o un vector recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
27. Célula hospedadora según lo reivindicado en la reivindicación 26, que es seleccionada entre: una célula microbiana; una célula vegetal.
28. Célula hospedadora según lo reivindicado en la reivindicación 27, que es una célula vegetal que tiene incorporado en su genoma el constructo de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.
29. Procedimiento de regulación reductora de la expresión de un gen diana en una planta, que incluye la etapa de introducir un constructo o un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 en una célula vegetal tal que el constructo es incorporado establemente al genoma de la célula.
30. Procedimiento según lo reivindicado en la reivindicación 29, que comprende además la etapa de regenerar una planta a partir de una célula vegetal.
31. Célula vegetal según lo reivindicado en la reivindicación 28, que está presente en una planta.
32. Planta que comprende la célula vegetal de la reivindicación 31.
33. Planta transgénica estable que tiene incorporado en su genoma el constructo de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.
34. Planta según lo reivindicado en la reivindicación 32 o en la reivindicación 33, que es un hospedador natural del virus vegetal a partir del cual deriva la secuencia vírica vegetal del constructo.
35. Planta según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, que es: un cereal, una legumbre, maíz, trigo, patatas, tapioca, arroz, sorgo, mijo, mandioca, cebada, guisante, colza de semilla oleaginosa, remolacha, maíz, girasol, semilla de soja, sorgo, lechuga, endibia, calabaza, cebolla, brócoli, coliflor, clavel, geranio, canola, tabaco, algodón, cucurbitáceas, zanahoria, fresa, tomate, mango, melocotón, manzana, pera, plátano, melón, pimiento, crisantemo, álamo, eucalipto y pino.
36. Planta que es un clon de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35 y que comprende la célula vegetal de la reivindicación 31.
37. Planta que es un descendiente de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 y que comprende la célula vegetal de la reivindicación 31.
38. Propágulo de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 37 y que comprende la célula vegetal de la reivindicación 31.
39. Propágulo de planta según lo reivindicado en la reivindicación 38 que es una semilla.
40. Extracto o derivado de la planta o del propágulo de planta de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 39 y que comprende la célula vegetal de la reivindicación 31.
41. Procedimiento de regulación reductora de la expresión de un gen diana en una planta que incluye causar o permitir la transcripción desde un constructo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en el genoma de una célula vegetal de la planta.
42. Procedimiento según lo reivindicado en la reivindicación 41, en el que el sitio del gen diana en la planta está alejado de la célula en la que el constructo está transcrito.
43. Procedimiento para aumentar la resistencia de una planta a un patógeno que comprende el procedimiento de la reivindicación 41 o la reivindicación 42.
44. Procedimiento según lo reivindicado en la reivindicación 43, en el que el gen diana participa en la replicación y/o infecciosidad del patógeno.
45. Procedimiento según lo reivindicado en la reivindicación 42 o la reivindicación 44, en el que el patógeno es un virus.
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