BR112013031723B1 - construção de polinucleotídeo, método para transformação de uma célula fúngica e promotor isolado - Google Patents

Abstract

CONSTRUÇÃO DE POLINUCLEOTÍDEO,MÉTODOS PARA TRANSFORMAÇÃO DE UMA CÉLULA FÚNGICA, DIRECIONAMENTO DE GENE APRIMORADO EM UM GENOMA FÚNGICO ALVO E PARA REDUZIR TRANSFORMANTES FALSOS EM UM GENOMA ALVO. A presente invenção refere-se à aplicação de promotores isolados e construções de seleção dominantes sintéticos e intensificadores para direcionamento de gene para produção eficiente de células geneticamente modificadas em uma espécie selecionada dos subfilos Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina, em particular, uma espécie selecionada dos gêneros Rhodosporidium, Sporisorium, Sporobolomyces ou Ustilago.

Description

[0001] O presente pedido está relacionado a e reivindica a prioridade para o pedido provisório de patente sob o n° de série US61/495.619, depositado em 10 de junho de 2011. Este pedido é incorporado no presente documento a título de referência.

APRESENTAÇÃO DE SEQUÊNCIA

[0002] O presente pedido está sendo depositado junto com uma Listagem de Sequência em formato eletrônico. A Listagem de Sequência é intitulada 2577207SequenceListing.txt, foi criada em 11 de abril de 2012 e tem 31 kb de tamanho. As informações no formato eletrônico da Listagem de Sequência constituem parte do presente pedido e são incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se ao campo de biologia molecular vegetal, mais particularmente, à manipulação genética de alta eficiência e sistema de expressão gênica fortes em espécies dos subfiles Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina.

[0004] As publicações e outros materiais usados no presente documento para esclarecer os antecedentes da invenção e, em particular, casos para fornecer detalhes adicionais a respeito da prática, são incorporadas a título de referência e, por conveniência, são mencionadas no seguinte texto pelo autor e data e são listadas alfabeticamente pelo autor na bibliografia em anexo.

[0005] Os Pucciniomycotina são um subfilo de fungo no filo de Basidiomycota (Kirk et al., 2008). Isso contém muitas espécies que possuem aplicações industriais importantes. Por exemplo, inúmeras espécies nos gêneros Rhodosporidium e Sporidiobolus, tais como Rhodosporidium toruloides (também conhecido como Rhodotorula gracilis, Rhodosporidium glutinis, Rhodotorula glutinis, Torula koishikawensis e Torula rubescens) e Sporobolomyces salmonicolor, são leveduras de célula única ricas em óleo com capacidade de fermentação de alta densidade (Hu et al., 2009; Meng et al., 2009). Essas espécies detêm grande potencial como um hospedeiro para a produção de hidrocarbonetos de cadeia longa, tal como triacilglicerol (TAG ou gordura), ésteres de ácido graxo (biodiesel), alcoóis graxos, alcoóis, lactonas, terpenoides e vitaminas (Wu et al., 2010a; Wu et al., 2010b; Zhao et al., 2010a; Zhao et al., 2010b). Embora um método com base na transfecção mediada por PEG de protoplasto tenha sido relatado em Rhodosporidium toruloides(Tully e Gilbert, 1985), o método é altamente não confiável e requere um mutante auxotrófico para a transformação. O vetor de transformação não pode ser aplicado à manipulação genética de cepas industriais devido à instabilidade do plasmídeo pHG2, que contém o gene de codificação de Phenylalanina Ammonia-lyase(PAL) de R. toruloides e o gene LEU2 de Saccharomyces cerevisiae como um marcador de seleção e o padrão específico de sítio de integração de vetor de DNA. De modo similar, não existem promotores funcionais que possam ser usados para acionar a expressão de genes ou marcadores de seleção úteis em Rhodosporidium. A situação similar é encontrada em Sporobolomyces (laniri et al., 2011). Em um outro exemplo, as espécies no subfile Ustilaginomycotina, em particular, gêneros Ustilago e Pseudozyma, são conhecidas por produzirem glicolipídeos, que podem funcionar como um tensoativo ou fungicida (Hewald et al., 2005; Teichmann et al., 2010).

[0006] Um sistema completo de manipulação e expressão genética é tipicamente composto de promotores que são constitutivos ou induzíveis; marcadores de seleção; vetores de DNA; métodos para introduzir o DNA na célula hospedeira, integrar no genoma ou replicar como um epissoma; e métodos para inibir ou bloquear a expressão de genes de interesse.

[0007] A transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT) é um método conveniente para a transformação de muitas espécies fúngicas (De Groot et al., 1998). A eficiência de transformação pode ser aprimorada através da otimização do valor de pH para o Agrobacterium,da razão e do valor absoluto de células recipientes e células doadoras durante o cocultivo (Ji et al., 2010) e do uso use de sequências de DNA intensificadoras derivadas de T-DNA (YE e Gilbertson, 2009). Em ATMT de espécies vegetais, tem sido relatadas as várias técnicas para aprimorar a transformação, incluindo sonificação e infiltração a vácuo de tecidos vegetais (de Oliveira et al., 2009); promotores mais fortes para acionar a expressão de marcadores de seleção (Maehara et al., 2010) e controle de resposta de defesa de hospedeiro (Khanna et al., 2007; Vega et al., 2008). Os efeitos dessas modificações não foram confirmados no ATMT dos fungos.

[0008] É bem sabido que as células fúngicas também podem ser transformadas por eletroporação de células intactas ou protoplasto (Wu e Letchworth, 2004); e transfecção de um protoplasto (Meyer, 2008; Turgeon et al., 2010) ou indução química simples para aumentar a permeabilidade da parede celular (Gietze Woods, 2002; Hill et al., 1991; Ito et al., 1983). A mutagênese de inserção aleatória é uma ferramenta potente para a identificação rápida de genes desconhecidos. Embora a integração mediada por enzima de restrição (REMI) possa ser usada para aprimorar a integração de vetores de DNA linearizados em um protocolo de transformação mediada por PEG (Bõlker et al., 1995; Maier e Schafer, 1999), esse método é prejudicado por deleções grandes de DNA genômico, múltiplas inserções e mutagênese não marcada incluindo redisposições cromossômicas (Bõlker et al., 1995; Meyer et al., 2003; Sweigard etal., 1998). Por outro lado, o ATMT foi reconhecido como uma ferramenta superior nesse aspecto (Choi et al., 2007; Soltani et al., 2008).

[0009] A seleção de transformantes fúngicos tem sido demonstrada com construções artificiais que expressam uma proteína que modifica o antibiótico e herbicida. Os genes comumente usados incluem higromicina fosfotransferase (hpt) que confere resistência à Higromicina B (Bundock et al., 1995); nourseotricina acetiltransferase (nat) que confere resistência a Nourseotricina (Ji et al., 2010; Krugel et al., 1988), aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (aph) ou Neomicina fosfotransferase (npt) que confere resistência a Kanamicina ou G418 ou Neomicina (Goldstein e McCusker, 1999; Scorer et al., 1994), gene de Streptoalloteichus hindustanus bleomicina (ble) que confere resistência a Zeocina (Pfeifer et al., 1997; Takeno et al., 2005); gene de 5- enolpiruvil-3-fosfoshikimato sintetase (aroA) confere resistência ao herbicida Glifosato (Cornai et al., 1983); fosfinotricina acetil transferase (pat)que confere resistência ao herbicida bialafos (Goldstein e McCusker, 1999); gene de acetolactato sintase (acs) que confere resistência ao herbicida Sulfonilureias (Haughn et al., 1988).

[00010] A deleção e substituição de gene são técnicas vitais de direcionamento de gene na genética moderna. Entretanto, é muitas vezes muito desafiador gerar tais mutantes devido à frequência de direcionamento de gene baixa. As técnicas que aprimoram significativamente são altamente procuradas em muitos organismos.

[00011 ] No sistema de junção de extremidade não homóloga de DNA eucariota superior (NHEJ), a holoenzima de proteína quinase dependente de DNA (DNA-PK) compreende um heterodímero de polipeptídeo de aproximadamente 70 e 80 kDa, conhecido como Ku70 e Ku80, que se liga a rupturas de filamento de DNA, recrutando e ativando assim a subunidade catalítica de 470 kDa, chamada de DNA- PKcs (Smith e Jackson, 1999). Enquanto que Rad51 e Rad52 são essenciais para o reparo de DSB na via HR (van Attikum et al., 2003), o complexo DNA-PKcs/Ku e XRCC4/ligase IV são vitais na via NHEJ em sistemas de mamíferos (van Attikum et al., 2001). Entretanto, a homologia para a subunidade de DNA-PKcs permanece não identificada em fungos. Nos últimos anos, houve vários relatos de sucesso no aprimoramento de frequência de deleção de gene através da ruptura da via NHEJ através da deleção de um ou mais de seus componentes importantes (Kück e Hoff, 2010). Essa técnica é trabalhosa para ser aplicada.

[00012] Por outro lado, um número grande de compostos tem sido relatado para inibir a atividade de DNA-PK, incluindo wortmanina (Boulton et al., 1996), LY294002 (Rosenzweig et al., 1997), vanilina (Durant e Karran, 2003), NU1025 (Boulton et al., 1999), PD128763 (Tentori et al., 2002), AG14361 (Skalitzky et al., 2003), NU7026 [2- (morfolin-4-il)-benzo[h]comen-4-ona; 2-(4-morfolinil)-4H-naftol[1,2- b]piran-4-ona] e NU7441 [8-(4-dibenzotienil)-2-(4-morfolinil)-4H-1- benzopiran-4-ona]. Acredita-se que os dois últimos sejam inibidores mais potentes e específicos de DNA-PK em animais (Veuger et al., 2003; Willmore et al., 2004). Na ausência de DNA-PK em fungos, não sabe-se se existem compostos que irão facilitar o direcionamento de gene.

[00013] Atualmente, a transformação genética de espécies nos gêneros Rhodosporidium, Sporobolomyces, Sporisorium e Ustilago está completamente indisponível ou é ineficiente e é o principal obstáculo para o avanço de biocombustíveis e produtos químicos renováveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00014] A presente invenção refere-se a construções sintéticas e a métodos de transformação que permitem a produção altamente eficiente de uma célula transformada selecionada a partir de uma espécie nos subfiles Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina. As espécies de particular relevância são aquelas nos gêneros Rhodosporidium, Sporisorium, Sporobolomyces e Ustilago, nas quais residem inúmeras espécies com ótimo potencial para a bioconversão de recursos renováveis em produtos de valor alto, tal como triglicerídeo, biodiesel, álcool graxo, vitaminas, lactona, terpenoides e biotensoativos.

[00015] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece sequências de polinucleotídeo que funcionam como um promotor forte de expressão de gene, por exemplo, para os genes higromicina fosfotransferase (hpt) e nourseotricina acetiltransferase (nat) e permite a seleção eficaz de células transformadas em espécies selecionadas a partir dos gêneros Rhosporidium, Sporisorium e Ustilago. Em uma modalidade, o promotor compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 1. Em uma outra modalidade, o promotor compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade adicional, o promotor compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade adicional, o promotor compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 4. Em uma outra modalidade, o promotor é um promotor de tefde Ashibia gossipii e compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade adicional, o promotor compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 51. Em uma modalidade adicional, o promotor compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 55. Em uma outra modalidade, o promotor é um promotor de estearoil-CoA delta9-desaturase de Rhodotrula glutinis e compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 56. Cada um desses promotores é eficaz na execução de expressão de gene forte nos gêneros Rhosporidium, Sporisorium, Sporobolomyces, Rhodoturula, Pseudozyma e Ustilago. Os promotores fortes adicionais podem ser identificados a partir de outras espécies nos gêneros Aspergillus, Rhosporidium, Rhodotorula, Sporobolomyces, Sporisorium, Pseudozyma e Ustilago com o uso das técnicas descritas no presente documento para identificar tais promotores. Além disso, os fragmentos operáveis desses promotores podem ser isolados com o uso de ensaios de triagem de promotor convencionais e podem sertriados para seleção eficiente de células fúngicas transformadas com o uso das técnicas descritas no presente documento.

[00016] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece construções de seleção dominantes sintéticas que compreendem um promotor isolado derivado de uma espécie selecionada a partir dos gêneros Aspergillus, Rhosporidium, Sporobolomyces, Sporisorium, Rhodoturula, Pseudozyma e Ustilago, à qual o promotor é ligado de modo funcional a uma sequência de codificação para um marcador adequado que é ligado de modo funcional a um terminador transcricional. Tais construções são eficazes em facilitar a produção de uma célula transformada em uma espécie selecionada a partir dos gêneros Rhosporidium, Sporisorium, Sporobolomyces, Rhodoturula, Pseudozyma ou Ustilago. Em uma modalidade, um marcador adequado é uma proteína que confere resistência a antibiótico. Em uma outra modalidade, um marcador adequado é uma proteína que confere resistência a herbicida. Em uma modalidade, uma sequência de codificação para o marcador que satisfaz essa função é uma que é naturalmente existente ou artificialmente criada e contém pelo menos cerca de 60% de GC. Em uma segunda modalidade, uma sequência de codificação para o marcador que realiza essa função é uma que é naturalmente existente ou artificialmente criada e contém cerca de 63% de GC. Em uma terceira modalidade, uma sequência de codificação para o marcador que realiza essa função é uma que é naturalmente existente ou artificialmente criada e contém cerca de 70% de GC. Em uma modalidade, pelo menos cerca de 70% dos tripletos de códon de tais sequências de codificação terminam com C ou G. Em uma outra modalidade, mais que cerca de 80% dos tripletos de códon de tais sequências de codificação terminam com C ou G. Em uma modalidade, tais sequências de codificação são compostas de códons de UCG em pelo menos cerca de 40% do total de resíduos de Serina (Ser). Em uma modalidade, a sequência de codificação para resistência a fármaco compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 6. Em uma outra modalidade, a sequência de codificação para resistência a fármaco compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade adicional, a sequência de codificação para resistência a fármaco compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, qualquer terminador transcricional operável em uma espécie fúngica pode ser usado.

[00017] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um método de transformação que é baseado na seleção dominante para uma espécie selecionada a partir dos subfiles Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina, em particular, uma espécie no gênero Rhosporidium, Sporisorium, Ustilago, Rhodoturula,Pseudozyma ou Sporobolomyces (Sporidiobolus).Em uma modalidade, o método de transformação é transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens(ATMT). Em uma outra modalidade, o método de transformação é eletroporação. Em uma modalidade adicional, o método de transformação é transfecção. Em uma modalidade adicional, o método de transformação é biolístico.

[00018] De acordo com a modalidade de ATMT, o método compreende as etapas: (a) criar uma construção sintética de DNA que compreende (i) um promotor derivado dos gêneros Aspergillus, Rhosporídium, Sporobolomyces, Sporisorium, Rhodoturula, Pseudozyma ou Ustilago ligado de modo funcional a (ii) uma sequência de codificação para um marcador selecionável ligado de modo funcional a (iii) um terminador transcricional que são ligados de modo funcional; (b) inserir a construção de DNA em um vetor binário de T-DNA; (c) introduzir o vetor de T-DNA resultante em uma cepa de Agrobacterium- (d) cocultivar as células de Agrobacterium com células fúngicas em um meio sólido ou em uma membrana que é assentada na parte superior de um meio sólido, de preferência na presença de indutor de virulência de Agrobacterium, tal como acetosinringona (AS) para transformar células fúngicas; (e) selecionar uma colônia transformada diretamente em um meio sólido ou em uma membrana que é assentada no topo de um meio sólido. O meio de seleção pode ser adicionalmente suplementado com agentes a uma concentração que suprime completamente o crescimento de Agrobacterium e células fúngicas não transformadas. Em uma modalidade, o promotor é um descrito no presente documento. Em uma outra modalidade, a sequência de codificação para um marcador selecionável é um descrito no presente documento. Em uma modalidade, os meios de seleção ou cocultivo contêm pelo menos cerca de 1,5% de ágar. Em uma outra modalidade, os meios de seleção ou cocultivo contêm entre cerca de 2% e cerca de 3% de ágar.

[00019] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece um método aprimorado para direcionamento de gene em fungos. Em particular, um inibidor de proteína quinase dependente de DNA de mamífero (DNA-PK) pode ser suplementado em uma quantidade substancial para um meio usado para transformação. Em uma modalidade, o inibidor de DNA-PK é NU7026 (2-(morfolin-4-il)- benzo[h]comen-4-ona; 2-(4-morfolinil)-4H-naftol[1,2-b]piran-4-ona). Em uma outra modalidade, a quantidade de NU7026 no meio está entre cerca de 0,1 pM e cerca de 50 pM. Em uma modalidade adicional, o inibidor de DNA-PK pode ser usado com qualquer protocolo de transformação, tal como ATMT, eletroporação, transfecção, biolística e similares.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00020] As Figuras 1A a 1D mostram ilustrações de vetores de transformação. Figura 1A: pEX2; Pgpd se refere a promotor gpd de Ustilago maydis. Figura 1B: pEC3. Figura 1C: pEC3PxxxhptR; Pxxx indica vários promotores localizados no P box. Figura 1D: pEX3GPDA- EGFP. LB e RB são a borda esquerda e a borda direita de T-DNA respectivamente. T35S: terminador de gene 35S mosaico da couve-flor; Tnos: terminador transcricional de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens; egfp: gene de Proteína de Florescência Verde Intensificada.

[00021] As Figuras 2A-2D mostram o efeito de marcadores de seleção em ATMT de R. toruloides. A seleção para transformantes foi executada com 100 pg/ml de Higromicina B tanto para U maydis quanto para R. toruloides. Figura 2A: R. toruloides cocultivados com AGL1. Figura 2B: R. toruloides cocultivados com AGL1(pEX2). Figura 2C: PCR de colônia de transformantes putativos. Figura 2D: PCR de colônia de transformantes putativos que usam nat como um marcador de seleção.

[00022] As Figuras 3A e 3B mostram a expressão de GFP em colônias resistentes a higromicina. Figura 3A: Colônias selecionadas por 8 dias com 100 pg/ml de higromicina B; Figura 3B: Colônias selecionadas por 8 dias com 200 pg/ml de higromicina B.

[00023] A Figura 4 mostra Southern blot de transformantes de R. toruloides obtidos sob vários pHs de meio de cocultivo. WT; R. toruloides do tipo selvagem. O blot foi sondado em relação a hpt-3.

[00024] A Figura 5 mostra a análise de Southern blot de transformantes de Sporisorium scitamineum. 0 DNA genômico foi digerido com BamHl e sondado com um fragmento de DNA de hpt 32 identificado com [ P], As faixas 1 a 18 são DNA de transformantes putativos. A faixa 19 é DNA do tipo selvagem de Sporisorium scitamineum. Os marcadores moleculares são indicados à esquerda.

[00025] A Figura 6 mostra Southern blot de transformantes de R. glutenis com diferentes promotores. PgpdUm, PgpdARt, PgpdAAn e Ptef^9 se referem ao promotor de gpd de Ustilago maydis, R. toruloides, Aspergillus nidulans e Ashibia gossipii,respectivamente. O blot foi sondado em relação a hpt-3.

[00026] A Figura 7 mostra a estrutura do inibidor de DNA-PK é NU7026 (2-(morfolin-4-il)-benzo[h]comen-4-ona; 2-(4-morfolinil)-4/-/- naftol[1,2-b]piran-4-ona).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00027] Salvo se definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um elemento de conhecimento comum na técnica à qual a invenção pertence.

[00028] O termo "seleção eficiente" conforme usado no presente documento significa a seleção direta para pelo menos dois transformantes verdadeiros em uma placa Petri de 90 mm que usa quaisquer isolados fúngicos.

[00029] O termo "expressão forte" conforme usado no presente documento significa a expressão de um marcador proteína ou mRNA para um nível detectável com o uso de métodos de detecção conhecidos, por exemplo, florescência para GFP, ensaio de atividade para os genes GUS e lacZ.

[00030] A presente invenção se refere a construções sintéticas e métodos de transformação que permite a produção altamente eficiente de uma célula transformada selecionada a partir de uma espécie dos subfilos Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina. As espécies de relevância particular são aquelas nos gêneros Rhodosporidium, Sporobolomyces, Sporisorium, Rhodoturula, Pseudozyma e Ustilago, nos quais residem inúmeras espécies com grande potencial para a bioconversão de recursos renováveis em produtos de alto valor, tais como triglicerídeos, biodiesel, álcool graxo, lactona, terpendoide e vitaminas e biotensoativos. Os exemplos de tais cepas incluem, mas não são limitados a, Rhodosporidium toruloides, Rhodosporidium azoricum, Rhodosporidium babjevae, Rhodosporidium concentricum, Rhodosporidium diobovatum, Rhodosporidium fluvial, Rhodosporidium kratochvilovae, Rhodosporidium lusitaniae, Rhodosporidium paludigenum, Rhodosporidium sphaerocarpum, Rhodosporidium toruloides, Sporobolomyces roseus, Sporobolomyces carnicolor, Sporobolomyces salmoneus, Sporisorium scitamineum, Ustilago maydis, Pseudozyma Antarctica, Pseudozyma aphidis.

[00031] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma construção de polinucleotídeo que compreende um promotor ligado de modo funcional a uma sequência de codificação para um marcador selecionável ligado de modo funcional a um terminadortranscricional. O promotor é derivado de uma espécie fúngica selecionada do grupo de uma espécie do gênero Ustilago, uma espécie do gênero Aspergilluse uma espécie do gênero Rhodosporidium e fornece a expressão forte da sequência de codificação em célula fúngica transformada dos subfilos Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina. A construção de polinucleotídeo fornece a seleção eficiente de células fúngicas transformadas dos subfilos Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina. A construção de polinucleotídeo é particularmente útil para a seleção eficiente de células fúngicas transformadas dos gêneros Rhodosporidium, Sporisorium, Ustilago, Rhodoturula, Pseudozyma e Sporobolomyces (Sporidiobolus).

[00032] Em uma modalidade, o promotor é derivado de um gene que codifica gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (gpd) ou de um gene que codifica fator de alongamento de tradução de proteína (tef).

[00033] Em uma modalidade, o promotor compreende uma sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 1. Em uma outra modalidade, o promotor compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade adicional, o promotor compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade adicional, o promotor compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 4. Em uma outra modalidade, o promotor é o promotor tef de Ashibia gossipii apresentada em SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade adicional, o promotor compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 51. Em uma modalidade adicional, o promotor compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 55. Em uma outra modalidade, o promotor é um promotor estearoil-CoA delta9- desaturase de Rhodotrula glutinis e compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 56. Os promotores fortes adicionais podem ser identificados a partir de outras espécies nos gêneros Aspergillus, Rhosporidium, Rhodotorula, Sporobolomyces e Ustilago com o uso das técnicas descritas no presente documento para identificar tais promotores. Além disso, os fragmentos operáveis desses promotores podem ser isolados com o uso de ensaios de triagem de promotor convencionais e podem ser triados para seleção eficiente de células fúngicas transformadas com o uso das técnicas descritas no presente documento.

[00034] A hibridização de ácido nucleico, uma técnica bem conhecida por aqueles elementos versados na técnica de manipulação de DNA, pode ser usada para identificar outros polinucleotídeos adequados. De acordo com a invenção, outros promotores adequados para uso podem ser obtidos pela identificação de polinucleotídeos que hibridizam seletivamente para os promotores descritos acima através da hibridização sob condições de baixa estringência, condições de estringência moderada ou condições de estringência alta. As sequências de hibridização seletiva tipicamente têm pelo menos 50% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 70%, 80% ou 90% de identidade de sequência, e com máxima preferência 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência uma com a outra.

[00035] As pesquisas de base de dados e as pesquisas de homologia de bases de dados de genoma e nucleotídeo identificam moléculas de DNA ou RNA similares com base no alinhamento de nucleotídeos com o uso de algoritmos ou programas de computador e essas técnicas bem conhecidas por aqueles elementos versados na técnica. De acordo com a invenção, outros polinucleotídeos adequados para uso podem ser obtidos pela identificação in silico de polinucleotídeos para sequências regulatórias com pelo menos 50% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 70%, 80% ou 90% de identidade de sequência, e com máxima preferência 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência uma com a outra.

[00036] Em uma modalidade, o promotor compreende (i) a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, (ii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 60% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, (iii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 70% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, (iv) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 80% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, (v) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, (vi) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 95% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, e (vii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 98% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2.

[00037] Em uma outra modalidade, o promotor compreende (i) a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 51, (ii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 60% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 51, (iii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 70% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 51, (iv) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 80% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 51, (v) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 51, (vi) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 95% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 51, e (vii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 98% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 51.

[00038] Em uma modalidade adicional, o promotor compreende (i) a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 55, (ii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 60% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 55, (iii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 70% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 55, (iv) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 80% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 55, (v) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 55, (vi) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 95% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 55, e (vii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 98% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 55.

[00039] Em uma outra modalidade, o promotor compreende (i) a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 56, (ii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 60% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 56, (iii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 70% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 56, (iv) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 80% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 56, (v) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 56, (vi) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 95% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 56, e (vii) a promotor que compreende a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 98% de identidade com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 56.

[00040] A sequência de codificação para um marcador selecionável codifica um marcador selecionável. As sequências de codificação de marcador selecionável são utilizadas para a seleção de células ou tecidos transformados. Usualmente, as sequências de codificação de marcador selecionável irão codificar a resistência a antibiótico, com sequências de codificação adequadas incluindo pelo menos um conjunto de sequências de codificação que codificam a resistência ao antibiótico espectinomicina, sequência de codificação para resistência a zeomicina, o gene de estreptomicina fosfotransferase (spt) que codifica resistência a estreptomicina, o gene de neomicina fosfotransferase (nptll) que codifica resistência a geneticina ou canamicina, o gene de higromicina fosfotransferase (hpt ou aphiv) que codifica resistência a higromicina, os genes de acetolactato sintase (ais) ou o gene de nourseotricina acetiltransferase (nat) que codifica resistência a neurseotricina. Alternativamente, as sequências de codificação de marcador selecionável de planta irão codificar a resistência a herbicida tal como resistência aos herbicidas do tipo sulfonilureia, glufosinato, glifosato, amónio, bromoxinila, imidazolinonas, e 2,4- diclorofenoxiacetato (2,4-D), incluindo genes que codificam a resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação de glutamina sintase tal como fosfinotricina ou basta (por exemplo, o gene bar). Consulte, em geral, a publicação internacional n° WO02/36782, patente n° US7.205.453 e publicação de pedido de patente n° US2006/0218670, US2006/0248616, US2007/0143880 e US20090100536 e as referências citados nesses documentos. Consulte também, Jefferson et al. (1991); De Wet et al. (1987); Goff et al. (1990); Kain et al. (1995) e Chiu et al. (1996). Essa lista de genes marcadores selecionáveis não se destina a ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado.

[00041] Em uma modalidade, a sequência de codificação para o marcador selecionável é uma naturalmente existente ou artificialmente criada e contém pelo menos cerca de 60% de GC. Em uma segunda modalidade, a sequência de codificação para o marcador selecionável é uma naturalmente existente ou artificialmente criada e contém cerca de 70% de GC. Em uma terceira modalidade, a sequência de codificação para o marcador selecionável é uma naturalmente existente ou artificialmente criada e contém cerca de 75% de GC. Em uma modalidade, pelo menos cerca de 70% dos tripletos de códon de tais sequências de codificação terminam com C ou G. Em uma outra modalidade, mais que cerca de 80% dos tripletos de códon de tais sequências de codificação terminam com C ou G. Em uma modalidade, a sequência de codificação para um marcador selecionável é pelo menos 60% de GC, de preferência cerca de 70% de GC e com máxima preferência cerca de 75% de GC em que pelo menos 70% dos tripletos de códon terminam com C ou G, de preferência mais que 80% dos tripletos de códon terminam com C ou G. Em uma modalidade, tais sequências de codificação são compostas de códons de UCG em pelo menos cerca de 40% dos resíduos de serina total (Ser).

[00042] Em uma modalidade, a sequência de codificação para um marcador selecionável compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 6. Em uma outra modalidade, a sequência de codificação para resistência a fármaco compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade adicional, a sequência de codificação para resistência a fármaco compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 8.

[00043] Em uma modalidade, qualquer terminador transcricional operável na espécie dos fungos pode ser usado. Os terminadores são tipicamente localizados a jusante (3') do gene, após o códon de parada (TGA, TAG ou TAA). Os terminadores desempenham um papel importante no processamento e na estabilidade de RNA bem como em tradução. A maioria, mas não todos os terminadores, contém uma sequência de poliadenilação ou sítio de clivagem. Os exemplos de sequências de poliadenilação específicos são AAUAAA ou AAUAAU. Essas sequências são conhecidas como os elementos a montante próximos (NUEs) (Nagaya et al., 2010). Os NllEs usualmente residem aproximadamente 30 bp na direção contrária a uma região rica em GU (Mogen et al., 1990; Mogen et al., 1992; Rothnie et al. 1994), conhecido como elementos a montante distantes (FUEs). Os FUEs intensificam o processamento na sequência de poliadenilação ou no sítio de divagem, que é usualmente um CA ou UA em uma região rica em U (Bassett, 2007). Dentro do terminador, existem elementos que aumentam a estabilidade do RNA transcrito (Ohme-Takagi et al., 1993; Newman et al., 1993; Gutiérrezetatl., 1999) e também podem controlar a expressão de gene (Ingelbrecht, 1989; An et al., 1989).

[00044] A hibridização de ácido nucleico, uma técnica bem conhecida por aqueles elementos versados na técnica de manipulação de DNA, pode ser usada para identificar outros terminadores adequados. De acordo com a invenção, outros promotores adequados para uso podem ser obtidos através da identificação de terminadores que hibridizam seletivamente para os promotores descritos acima através da hibridização sob condições de baixa estringência, condições de estringência moderada ou condições de estringência alta. As sequências de hibridização seletiva tipicamente têm pelo menos 50% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 70%, 80% ou 90% de identidade de sequência, e com máxima preferência 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência uma com a outra.

[00045] As pesquisas de base de dados e as pesquisas de homologia de bases de dados de genoma e nucleotídeo identificam moléculas de DNA ou RNA similares com base no alinhamento de nucleotídeos com o uso de algoritmos ou programas de computador e essas técnicas bem conhecidas por aqueles elementos versados na técnica. De acordo com a invenção, outros terminadores adequados para uso podem ser obtidos pela identificação in silico de terminadores para sequências regulatórias com pelo menos 50% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 70%, 80% ou 90% de identidade de sequência, e com máxima preferência 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência uma com a outra.

[00046] Um DNA de interesse pode ser adicionado à construção de polinucleotídeo. O DNA de interesse é ligado de modo funcional a um promotor e um terminador. Quaisquer promotor e terminador operáveis nas espécies dos subfiles Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina podem ser usados. Em algumas modalidades, o DNA de interesse pode ser usado para inserir ou modificar vias metabólicas, tais como biossíntese de ácido graxo, biossíntese de lipídeo, biossíntese de triglicerídeo e similares. O DNA de interesse pode ser inserido no genoma das células fúngicas para intensificar a bioconversão de recursos renováveis em produtos de alto valor, tais como triglicerídeos, biodiesel, álcool graxo, vitaminas, biotensoativos, lactona, terpenoide e similares.

[00047] O DNA de interesse pode ser selecionado para inibir a expressão de uma sequência de DNA nativa dentro de um tecido vegetal para alcançar um fenótipo desejado. Nesse caso, tal inibição pode ser realizada, por exemplo, com a transformação da célula fúngica para compreender um promotor ligado a uma sequência de nucleotídeo antissentido, hairpin, RNA de interferência ou outra molécula de ácido nucleico, de tal modo que a expressão preferencial de tecido da molécula interfere na tradução do mRNA da sequência de DNA nativa ou, de outro modo, inibe a expressão da sequência de DNA nativa em células fúngicas. Para descrição adicional de técnicas de RNAi, consulte, por exemplo, patentes n° US5.034.323; US6.326.527; US6.452.067; US6.573.099; US6.753.139; e US6.777.588. Vide também publicações de patente internacionais WO 97/01952, WO 98/36083, WO 98/53083, WO 99/32619 e WO 01/75164; e publicações de patente US2003/0175965, US2003/0175783, US2003/0180945, US2004/0214330, US2005/0244858, US2005/0277610, US2007/0265220, US2009/0215860, US2009/0308041 e US2010/0058498.

[00048] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um método para a transformação de uma célula fúngica de uma espécie dos subfiles Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina. Em uma modalidade, a célula fúngica é uma espécie do gênero Rhodosporidium ou Sporobolomyces. Em uma outra modalidade, a célula fúngica é uma espécie do gênero Ustilagoou Sporisorium. Em uma modalidade adicional, a célula fúngica é uma espécie do gênero Rhodoturulaou Pseudozyma. De acordo com esse aspecto, o método compreende transformar uma célula fúngica com a construção de polinucleotídeo descrito no presente documento e selecionar uma colônia fúngica transformada. Em uma modalidade, o método de transformação é transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT). Em uma outra modalidade, o método de transformação é eletroporação. Em uma modalidade adicional, o método de transformação é transfecção. Em uma modalidade adicional, o método de transformação é biolístico.

[00049] Por exemplo, a construção de polinucleotídeo pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula fúngica com o uso de técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de célula vegetal ou as construções de polinucleotídeo podem ser introduzidas diretamente no tecido fúngico com o uso de métodos balísticos, tal como bombardeio de partícula de DNA. Alternativamente, as construções de polinucleotídeo podem ser combinadas com regiões de flanqueamento de T-DNA adequadas e introduzidos em um vetor hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens convencional. As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens irão direcionar a inserção da construção no DNA de célula fúngica quando a célula é infectada pelas bactérias. Dessa forma, qualquer método, que fornece a transformação/transfecção eficaz pode ser empregado. Consulte, por exemplo, as patentes n° US7.241.937, US7.273.966 e US7.291.765 e publicações de patente n° US2007/0231905 e US2008/0010704 e referências citadas nesses documentos. Consulte também, os pedidos publicados internacionais n° WO 2005/103271 e WO 2008/094127 e referências citadas nesses documentos.

[00050] Em uma modalidade, a etapa de transformação compreende cocultivar a célula fúngica com Agrobacterium tumefaciens que contém vetor que compreende a construção de polinucleotídeo. Em uma modalidade, o cocultivo é executado em um meio de cocultivo sólido ou em uma membrana de cocultivo que é assentada na parte superior de um meio sólido. Em uma modalidade, a etapa de seleção é executada através da sobreposição de um meio de seleção sólido na parte superior do meio de cocultivo sólido que tem células fúngicas transformadas nisso ou através da transferência da membrana de cocultivo que tem células fúngicas transformadas nisso para um meio de seleção sólido. Em uma modalidade, o meio de cocultivo e o meio de seleção contêm pelo menos 1,5% de ágar, de preferência entre 2% e 3% de ágar.

[00051] Em uma modalidade, a modalidade de ATMT, o método compreende as etapas: (a) criar uma construção de DNA sintético que compreende (i) um promotor derivado dos gêneros Aspergillus, Rhosporidium, Sporobolomyces, Sporisorium, Rhodoturula, Pseudozyma ou Ustilago ligado de modo funcional a (ii) uma sequência de codificação para um marcador selecionável ligado de modo funcional a (iii) um terminador transcricional que é ligado de modo funcional; (b) inserir a construção de DNA em um vetor binário de T-DNA; (c) introduzir o vetor de T-DNA resultante em uma cepa de Agrobacterium-, (d) cocultivar as células de Agrobacterium com células fúngicas em um meio sólido ou em uma membrana que é assentada na parte superior de um meio sólido, de preferência na presença de indutor de virulência de Agrobacterium, tal como acetosinringona (AS) para transformar as células fúngicas; (e) selecionar uma colônia transformada diretamente em um meio sólido ou em uma membrana que é assentada no topo de um meio sólido. O meio de seleção pode ser adicionalmente suplementado com agentes em uma concentração que suprime completamente o crescimento de Agrobacteriume células fúngicas não transformadas. Em uma modalidade, o promotor é um descrito no presente documento. Em uma outra modalidade, a sequência de codificação para um marcador selecionável é uma descrita no presente documento. Em uma modalidade, os meios de seleção ou cocultivo contêm pelo menos cerca de 1,5% de ágar. Em uma outra modalidade, os meios de seleção ou cocultivo contêm entre cerca de 2% e cerca de 3% de ágar.

[00052] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um método aprimorado para direcionamento de gene em fungos. Em particular, um inibidor de proteína quinase dependente de DNA (DNA- PK) pode ser suplementado em uma quantidade substancial para um meio usado para a transformação. Em uma modalidade, o inibidor de DNA-PK é NU7026 (2-(morfolin-4-il)-benzo[h]comen-4-ona; 2-(4- morfolinil)-4/-/-naftol[1,2-b]piran-4-ona; Figura 7). Em uma outra modalidade, a quantidade de NU7026 no meio está entre cerca de 0,1 pM e cerca de 50 pM. Em uma modalidade adicional, o direcionamento de gene requer uma região de homologia de uma sequência genômica fúngica alvo de pelo menos 50 nucleotídeos, de preferência, mais que 500 nucleotídeos. Em uma modalidade adicional, o inibidor de DNA-PK pode ser usado com qualquer protocolo de transformação, tal como ATMT, eletroporação, transfecção, biolística e similares.

[00053] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece um método para reduzir transformantes falsos em genoma alvo. De acordo com esse aspecto, o método compreende projetar uma sequência de codificação para um marcador selecionável em que a sequência de codificação contém preferência de uso de códon que corresponde àquele genoma alvo. O método também compreende ligar de modo funcional a sequência de codificação projetada a um promotor forte e a um terminador transcricional para criar uma construção. O método adicionalmente compreende transformar uma célula do genoma alvo com a construção. Finalmente, o método compreende selecionar células transformadas sob concentração máxima de agentes de seleção. Em uma modalidade, a sequência de codificação é conforme descrito no presente documento. Em uma outra modalidade, o promotor forte é conforme descrito no presente documento. Em uma modalidade adicional, o terminador é um descrito no presente documento. Em uma modalidade, o genoma é um de uma espécie fúngica no gênero Ustilago ou Sporisorium. Em uma outra modalidade, a espécie fúngica é uma espécie do gênero Rhodosporidium ou Sporobolomyces. Em uma modalidade adicional, a espécie fúngica é uma espécie do gênero Rhodoturula ou Pseudozyma.

[00054] Os fungos transformados são transferidos para meios de crescimento padrão (por exemplo, meios de nutriente sólidos ou líquidos, grão, vermiculite, adubo, turfa, madeira, serragem de madeira, palha, etc.) e desenvolvidos ou cultivados de uma maneira conhecida pelos versados na técnica.

[00055] Após o polinucleotídeo ser estavelmente incorporado nos fungos transformados, o mesmo pode ser transferido para outros fungos por cruzamento sexual. Qualquer uma dentre inúmeras técnicas de reprodução padrão pode ser usada, dependendo da espécie a ser cruzada.

[00056] Pode ser útil gerar inúmeros fungos transformados individuais com qualquer construção recombinante A fim de recuperar os fungos livres de quaisquer efeitos posicionais. Também pode ser preferencial para selecionar fungos que contêm mais que uma cópia da construção de polinucleotídeo introduzida de tal modo que os níveis de expressão altos da molécula recombinante sejam obtidos.

[00057] Pode ser desejável produzir linhas fúngicas que são homozigotas para um gene particular se possível na espécie particular. Em algumas espécies, isso é realizado pelo uso de culturas de monoesporos. Através do uso dessas técnicas, é possível produzir uma linhagem haploide que porta o gene inserido e, então, duplicar o número de cromossomo espontaneamente ou através do uso de colquicina. Isso gera um fungo que é homozigoto para o gene inserido, que pode ser facilmente ensaio se o gene inserido portar com isso um gene de marcador de seleção adequado para detecção de fungos que portam aquele gene. Alternativamente, os fungos podem ser autofertilizados, levando à produção de uma mistura de esporas que consiste em, no caso mais simples, três tipos, homozigoto (25%), heterozigoto (50%) e nulo (25%) para o gene inserido. Embora seja relativamente fácil classificar os fungos nulos daqueles que contêm o gene, é possível na prática classificar o homozigoto de fungos heterozigotos pela análise Southern blot em que uma atenção cuidadosa é voltada para o carregamento de quantidades exatamente equivalentes de DNA da população misturada e classificação de heterozigotos pela intensidade do sinal de uma sonda específica para o gene inserido. É aconselhável verificar os resultados da análise Southern blot permitindo-se que cada transformante independente autofertilize, uma vez que a evidência adicional para homozigosidade pode ser obtida pelo simples fato de que se os fungos forem homozigotos para o gene inserido, todas as linhagens fúngicas subsequentes do indivíduo autopolinilizado irá conter o gene, enquanto se o fungo foi heterozigoto para o gene, a geração desenvolvida a partir da semente autopolinilizada irá conter linhagens fúngicas nulas. Portanto, com a simples autopolinização, pode-se selecionar as linhagens fúngicas de homozigoto que também podem ser confirmadas por análise Southern blot.

[00058] A criação de linhas parentais de homozigoto torna possível a produção de fungo híbrido e esporas que irão conter um componente de proteína modificado. As linhagens parentais transgênicas são mantidas com cada parente que contém a primeira ou segunda sequência de DNA recombinante ligada de modo funcional a um promotor. Também são incorporadas nesse esquema as vantagens de desenvolvimento de uma safra híbrida, incluindo a combinação de tratos mais valorosos e vigor híbrido.

[00059] A prática da presente invenção emprega, salvo se indicado de outro modo, técnicas convencionais de química, biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante, genética, imunologia, biologia celular, cultura celular e biologia transgênica, que estão incluídas no escopo da técnica. Consulte, por exemplo, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EDA); Sambrook etal., 1989, Molecular Cloning,2a Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EDA); Sambrook e Russell, 2001, Molecular Cloning,3aEd. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EDA); Ausubel etal., 1992), Current Protocols in Molecular Biology {John Wiley & Sons, incluindo atualizações periódicas); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford, Reino Unido); Russell, 1984, Molecular biology of plants: a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EUA); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomas, (Academic Press, New York, EUA, 1992); Guthrie e Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, EUA, 1991); Harlow e Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EUA); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); a pesquisa, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y., EUA); Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer e Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes l-IV (D. M. Weire C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6a Edição, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Reino Unido, 1988; Fire et al., RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido, 2005; Schepers, RNA Interference in Practice, Wiley-VCH, 2005; Engelke, RNA Interference (RNAi): The Nuts & Bolts of siRNA Technology, DNA Press, 2003; Gott, RNA Interference, Editing, and Modification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Human Press, Totowa, NJ, EUA, 2004; Sohail, Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application, CRC, 2004.

EXEMPLOS

[00060] A presente invenção é descrita a título de referência aos seguintes Exemplos, que são oferecidos por meio de ilustração e não pretendem limitar a invenção de qualquer maneira. As técnicas padrão bem conhecidas na técnica ou as técnicas especificamente descritas abaixo foram utilizadas. EXEMPLO 1 Cultura de Cepas Microbiais e Métodos Moleculares Básicos

[00061] As cepas ATCC10657, ATCC10788 de R. toruloides e cepa ATCC90781 de R. glutinis foram originadas da American Type Culture Collections (ATCC). A cepa de Ustilago maydis e a cepa de Agrobacterium tumefaciens AGL-1 foram descritas (Ji et al., 2010; Lazo et al., 1991). O haploide de Sporisorium scitamineum S10 é uma cepa haploide originada da China. A cepa XL1-Blue de Escherichia coli foi usada para amplificação e manipulação de plasmideo de rotina. Rhodosporidium e U. maydis foram cultivadas a 28°C em caldo de YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glicose) ou em ágar de batata-dextrose sólido (PDA). A. tumefaciens foi cultivada a 28°C em meio de 2YT líquido ou sólido (1,6% de triptona, 1% de extrato de levedura, 0,5% de NaCI). E. colifoi desenvolvido em caldo de LB ou em ágar de LB sólido. Para produção de lipídeo, R. toruloides foi cultivada em meio de acumulação de líquido conforme descrito anteriormente (Wu et al., 2010a) a 30°C com agitação constante (200 rpm). Os antibióticos de Higromicina B, Nourseotricina, Carboxina e Zeocina foram adquiridos junto a Roche (EUA), Werner BioAgents (Alemanha), Sigma-Aldrich (EUA) e Invitrogen (EUA), respectivamente.

[00062] O DNA genômico de R. toruloides foi extraído com base no método descrito para U. maydis (Ji et al., 2010) com algumas modificações. Em suma, a cultura celular em fase exponencial foi coletada e lavada com 1 M de sorbitol. As células foram ressuspensas em 0,1 ml de tampão de SCS (1 M de sorbitol, 20 mM de citrato de sódio, pH 5,8) e suplementado com microesferas de vidro (1 mm em diâmetro, Sigma-Aldrich, EUA). A lisa das células produzidas por vórtice e o DNA genômico foi isolado após a extração de fenol/clorofórmio e o etanol precipitado. O DNA extraído foi quantificado com o Espectrofotômetro NanoDrop® ND-1000 (Nanodrop Technologies, EUA) e a qualidade do DNA analisada por eletroforese de gel de agarose. Para análise Southern blot, o DNA genômico foi digerido com BamHI e separado por eletroforese em 0,8% de géis de agarose. A hibridização Southern foi executada de acordo com as instruções do fabricante para identificação de DNA de DIG-High prime e Kit II iniciador de detecção (Roche Diagnostics, EUA) com o uso de produto de PCR identificado com DIG de gene hpt-3(Roche diagnostics, EUA).

[00063] As posições de marcação de T-DNA no genoma foram determinadas com o uso de PCR Inversa (Ochman et al., 1988) ou PCR Integrada Assimétrica Térmica (hiTAIL-PCR) (Liu e Chen, 2007; Liu e Whittier, 1995). Os oligos HptRU/HptRSL (SEQ ID NO: 38/SEQ ID NO: 39) e GAPSL/Tnos-Sf (SEQ ID NO: 46/SEQ ID NO: 47) foram usados para as primeira e segunda PCR de rodada inversa respectivamente. P)ara HiTAIL-PCR, os iniciadores específicos Rsp1 (SEQ ID NO: 40), Rsp2 (SEQ ID NO: 41) e Rsp3 (SEQ ID NO: 42 ) e o iniciador arbitrário LAD1-1 (SEQ ID NO: 43) ou LAD1-4 (SEQ ID NO: 44), AC1 (SEQ ID NO: 45). Todas as reações de PCR foram executadas com o uso de polimerase de Taq DNA (Qiagen, EUA) em um Controlador Térmico Programável PTC-200™ (BioRad, EUA). Os produtos de PCR específicos foram extraídos com o uso de kit de extração de gel (Qiagen) e sequenciados com o método BigDye após a subclonagem em pGTM-T Easy (Promega, EUA).

EXEMPLO 2 Construções de DNA

[00064] Os oligonucleotídeos usados são SEQ ID NOs:11-47. Oligos LoxP1 (SEQ ID NO: 11) e LoxP2 (SEQ ID NO: 12) foram anelados e ligados com pPZP200 digerido duplo EcoRVXba\ (Hajdukiewicz et al., 1994) para criar pEXO, que contém dois sítios de reconhecimento de Cre recombinase (/oxP) que flanqueam dois sítios de restrição exclusivos, EcoRV e Xho\. O sítio Nco\ entre o promotor de gpd e a sequência de codificação de hpt em pGH1 (Ji et al., 2010) foi eliminada através da alteração para o quarto nucleotídeo do gene hpt de G a A por mutagênese mediada por oligo para criar pGH4, a partir do qual o fragmento de Spe\-Sph\ 1854 bp teve terminação cega com polimerase de T4 DNA e inserido no sítio EcoRV de pEXO para criar pEX1. Todo o cassete de Pgpd::hpt::T35S de pEX1 foi amplificado por PCR com o uso de oligos RB-S (SEQ ID NO: 13) e 35TLU2 (SEQ ID NO: 14), digerido com Pst\ e inserido entre o sítio Xbal e Pstl de pPZP200 para criar pEX2.

[00065] Os promotores do gliceraldeído fosfato desidrogenase A (gpdA) e fator de alongamento de traduçãoA (tefA)foram amplificados a partir de DNA genômico de Aspergillus niger SG1 com o uso de iniciadores GAPU/GAPL(SEQ ID NO: 15/SEQ ID NO: 16) e TEFU/TEFL (SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 18), respectivamente. Um gene hpt de códon otimizado (hpt-2) (SEQ ID NO: 6) ligado ao terminador transcricional 35S foi amplificado com iniciadores HPTU (SEQ ID NO: 19) e T35SL (SEQ ID NO: 20) de um vetor de pCambial305.1 modificado, que foi digerido com SspHI e com terminação cega e quinase na extremidade 3' antes da ligação individual com o produto de PCR de promotor digerido duplo de Sal\INco\ e EcoRV/Xholdigerido pEXO para criar pEX3 e pEX4, respectivamente. pEX3GPDA-EGFP e pEX4GPDA-EGFP foram construídos a partir de pEX3 e pEX4 através da inserção de um cassete gpdA::egfp:trpCque contém um promotor de gpdA de 884 bp de Aspergillus nidulans de pAN7-1 (n° de acesso ao GenBank Z32698.1) (Punt et al., 1987) que aciona a expressão de eGFP, respectivamente.

[00066] O pEX2 foi digerido por Pst\, com terminação cega por polimerase de T4 DNA e subsequentemente digerido com Spel, a partir do qual o fragmento de 6,7 kb foi ligado com the A/col-cut, com terminação cega e Spel-cut pMF2-3c (uma doação generosa do Prof. Dr. Michael Feldbriigge, Institute for Microbiologym, Universitãtsstrasse, Alemanha) para criar pEC2. Vários sítios de restrição em pEC2 foram removidos através da autoligação do produto de terminação cega com Nco\-Pme\ duplo digerido e com terminação cega para criar pEC3. O pEC3PgpdU-eGFP foi gerado através da ligação de Sacl-Pacl digerido e com terminação cega pEC3 com o cassete de Pgpc/u::eg/p::Tnos que foi amplificado com o uso de pEX1GPD-eGFP como o modelo e Pgpd- Sf e Tnos-Pmr como iniciadores. Pgpdu se refere ao promotor de gap de U. maydis(Smith e Leong, 1990); egfp oGreen Fluorescence Proteína de Florescência Verde intensificado que codifica o gene da medusa Aequorea victoria e Trios o terminador de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (Hentges et al., 2005). Os plasmideos pEC3PgpdR-hpt3, pEC3PgpdA-hpt3 e pEC3Ptef-hpt3 são derivados de pEC3Pgpdll-eGFP, que contém o variante de gene hptsintetizado, hpt- 3 (SEQ ID NO: 7) sob a regulação de promotor de gpdAoriginado da R. toruloides gpd (gpdARt) (SEQ ID NO: 2), Aspergillus nidulans (gpdAAn) (SEQ ID NO: 3) e o promotor tef de Ashbya gossypii (SEQ ID NO: 5) (Steiner e Philippsen, 1994), respectivamente. A Figura 1 mostra alguns das construções usadas.

EXEMPLO 3 Transformação de R. toruloides através de Eletroporação

[00067] Os protoplastos de R. toruloides foram preparados de acordo com o método descrito anteriormente (Heiser, 2000; Kuo et al., 2004) com algumas modificações. Em suma, as células fúngicas foram digeridas com enzimas de lise de Trichoderma harzianum (Sigma) e lavadas com tampão Hepes (1 mM de Hepes, 0,6 de mannitol, pH 7,5). Os protoplastos (1 x 108) foram misturados com DNA de plasmídeo (5 pg), resfriados em gelo por 10 min. e submetidos à eletroporação em um BIO-RAD GENE PULSER® II equipado com Controlador Plus e Extensor de Capacitância Plus. Uma série de parâmetros foi testada com o uso de pEC3PgpdU-hpt3 com intensidade de campo variada de 1,25 kV/cm a 2,5 kV/cm; capacitor de 10 pF a 50 pF e resistência de 100 Ω a 600 Ω. Nenhum transformante verdadeiro foi obtido em várias tentativas.

EXEMPLO 4 Transformação Mediada por PEG de Protoplastos de R. toruloides

[00068] A transformação de protoplast© de mediada por PEG foi executada conforme descrito anteriormente (Schulz et al., 1990; Tully e Gilbert, 1985) com algumas modificações. Em suma, as células cultivadas de R. toruloides de fase exponencial em meio de YPD foram colhidas, lavadas e ressuspensas com tampão SCS (20 mM de tampão de citrato de sódio, pH 5,8, 1 M de sorbitol). A parede da célula fúngica foi degradada com o uso de enzimas de lise de Trichoderma harzianum (Sigma) em tampão de SCS como uma concentração de 10 mg/ml e misturada moderadamente à temperatura ambiente até que os protoplastos foram formados (1,5 a 2 h). Os protoplastos foram peletizados, lavados duas vezes com SCS e uma vez com STC (10 mM de Tris-HCI, pH 7,5, 100 mM de CaCh, 1M de sorbitol). Os protoplastos foram ressuspensos em STC a uma concentração de 2 x 108/ml e mantidos a -80°C. Para a transformação, 1 a 5 pg de DNA (em menos que 5 pl) foram misturados com 1 pl de heparina (15 mg/ml) e 50 pl de protoplastos. Após a incubação da mistura em banho de gelo por 10 min., 500 pl de PEG-4000 (40% p/v em STC) foram adicionados e incubados em gelo por 15 min. Os protoplastos foram misturados com 5 ml de ágar macio (0,7% de ágar em YPD, 1 M de sorbitol) que foi mantido a 45°C e derramado sobre uma placa recém-preparada que contém 10 ml de meio que foi composto de 1,5% de ágar em YPD, 1 M de sorbitol, 200 pg/ml de higromicina B. As placas foram incubadas a 28°C por 5 a 7 dias. A transformação com o uso de diferentes plasmídeos, por exemplo, pEX2, pEC3PgpdU-hpt3 e produtos de PCR que contêm o cassete PgpdAu::hpt:Tnos derivado de pEX2 ou o cassete Pgpdu..hpt-3'.Tnos derivado de pEC3PgpdU-hpt3, falhou na geração de quaisquer transformantes.

EXEMPLO 5 Identificação de gpdA de R. toruloides

[00069] Para obter a sequência de gpdA de R. toruloides, os iniciadores de degeneração Rtgpdf, 5-AAYGGNTTYGGNCGNATHGGNCG-3' (SEQ ID NO: 21) e Rtgpdr, 5-CCNACNGCYTTNGCNGCNCCNGT-3' (SEQ ID NO: 22), que alvejam o motivo altamente conservado NGFGRIGR (SEQ ID NO: 23) e TGAAKAVG (SEQ ID NO: 24), respectivamente, foram usados para amplificar um fragmento por RT-PCR com o uso de RNA total de R. toruloides como o modelo. Uma pesquisa BLASTx confirmou o produto de PCR codifica a região alvo. Para obter o comprimento completo da sequência de gene RtgpdA, os pares oligo Rtgpd-1P2f/Rtgpd-lP1 r (SEQ ID NO: 26/SEQ ID NO: 25) e Rtgpd-IP2f/Rtgpd-IP2r (SEQ ID NO: 26/SEQ ID NO: 27) foram projetados de acordo com a sequência de DNA genômico parcial acima e usados para 2 xPCRs inversas. Os produtos de PCR limpos de 2,5 kb, 2,8 kb e 1,1 kb poderiam ser produzidos a partir de modelos de DNA digeridos com BamHI, EcoRI e Psfl, respectivamente. Como resultado, uma sequência de 3568 bp foi obtida. Para definir a sequência de mRNA, 5'RACE e 3'RACE foram executados com iniciador específico Rt007 SEQ ID NO: 28) e Rtgpd-IP1r (SEQ ID NO: 25), que produziu um produto de PCR de 0,9 e 0,7 kb, respectivamente. O mRNA de comprimento completo é mostrado em SEQ ID NO: 10. A pesquisa BlastN de SEQ ID NO: 10 revelou isso como o mais relacionado ao gpd de Ustilago maydis 521 (n° Genbank UM02491.1) com 81% de identidade por uma região de 810 nucleotídeos.

EXEMPLO 6 Análise de Atividade de Promotor Rtgpd

[00070] Como o gene gpd de Ustilago maydis é altamente relacionado a Rhodosporidium toruloides, foi concluído que Ustilago maydis seria um hospedeiro adequado para analisar a função do promotor de RtgpdA. Foram serialmente truncados os fragmentos de DNA a montante de RtgpdA, fundidos em quadro com sequência de codificação de eGFP (Spellig et al., 1996) e integrados no lócus ip locus de U. maydis. As leituras de intensidade de fluorescência verde dos transformantes são mostradas na Tabela 1. Notavelmente, o promotor de 791 bp foi comparável com o promotor gpd de U. maydis. Importantemente, a sequência tão curta quanto 176 bp mostrou expressão consideravelmente forte de GFP. TABELA 1 Análise de Deleção de Promotor Rtgpd

1 O comprimento se refere ao tamanho do fragmento a montante do sítio de iniciação transcricional. 2 O promotor de 795 bp foi definido a 100%. Os resultados foram a média de triplicatas.

EXEMPLO 7 Projeto de hpt-2 e hpt-3 para Transformação de Sporisorium scitamineum e R. toruloides

[00071] Muitas tentativas para transformar R. toruloides e Sporisorium scitamineum falharam na geração de transformantes com o uso do pTHR1 e protocolo de transformação relacionado (Ji et al., 2010). Interessantemente, um outro vetor de transformação, pANTGFP7-1, em que o the hpt estava sob o controle de promotor gpdA de Aspergillus nidulans e terminador trpC mostraram resultado muito melhor (Tabela 2). Entretanto, quase metade dos transformantes foi falso positivo conforme revelado por análise Southern blot. Com base nessas informações, foi criado pEX1GPD-EGFP, em que o gene hpt foi colocado sob o controle de promotor gpd de U maydis e terminador transcricional do vírus mosaico da couve-flor 35S. Conforme esperado, a eficiência de transformação foi quase duplicada e os falsos positivos reduziram adicionalmente para cerca de 21%. Esses resultados indicaram que a expressão fraca de marcador de seleção foi a causa de eficiência de transformação baixa e falsos positivos altos. Consequentemente, dá-se ênfase adicionalmente no aumento da expressão da proteína Hpt por otimização de códon. Uma análise da sequência de codificação hpt de E coli (SEQ ID NO: 9) revelou que isso tem um teor de GC de 57,5%, que está próximo ao do gene gpd (gap)de U. maydis (GC 58%). Dentre os 342 códons usados, 62,6% terminaram com C ou G. Portanto, foi projetado um variante de gene hpt, hpt-2, que teve um teor de GC maior (62,4%) e 83,3% dos códons terminaram com C ou G. Conforme esperado, o uso de hpt-2 levou à eficiência de transformação drasticamente aumentada e à redução adicional de falsos positivos em Sporisorium scitamineum. TABELA 2 Comparação de Marcadores de Seleção

1 O cocultivo foi feito em IM com 2,5% de ágar por 63 h e selecionado com 300 pg/ml de cefotaxoma e 200 pg mH de higromicina B. As colônias foram classificadas após 7 dias em meio de seleção. CFU significa o número médio de transformantes entre três placas ± erro padrão. * Derivado de gpdA promotor e trpC terminador of A. nidulans. " Promotores derivados de A. niger.

[00072] Uma situação similar foi observada em ATMT de R. toruloides. Nesse caso, as construções que compõem o promotor gpd de U maydis e hpt ou hpt-2 geraram resultados de transformação deficientes com quase 100% de falsos positivos sob as condições de seleção em que nenhuma colônia resistente a higromicina B pode ser gerada (Figuras 2 e 3).

[00073] Com base na experiência na transformação de Sporisorium scitamineum que produz o teor de GC alto e a preferência de códon de R. toruloides, foi projetado hpt-3, com o teor de GC aumentado adicionalmente para 70,4% e com 100% de extremidades de códons com C ou G. Conforme esperado, as colônias transformadas verdadeiras foram obtidas fundidas de modo funcional com gpdA, promotor de Ustilago maydis, Aspergillus nudulans ou Rhodosporidium toruloides (Tabela 3). As construções de T-DNA que contêm hpt-2 e hpt- 3 foram integrados nos genomas (Figuras 4 e 5). Conforme esperado, as construções com hpt-3 foram capazes de transformar R. glutinis ATCC90781. TABELA 3 Transformação de R. toruloides Com o Uso de Vários Marcadores de seleção

[00074] Tanto o promotor de gpd de gpdA de A. nidulans (PgpdAAn) quanto o promotor RigpdA nativo (gpdARt) exibiram altas frequências de transformação. Entretanto, gpdUm de U. maydis foi o mais fraco.

EXEMPLO 8 Transformação Mediada por Aqrobacterium tumefaciens (ATMT)

[00075] As culturas de Agrobacteriumforam misturadas com R. toruloides a uma razão de volume de 2:1 e espalharam em meio de ágar IM com 100 pM de acetosiringona em uma membrana. Após o cocultivo a 24°C por 2 dias, a membrana foi transferida para uma placa de YPD que contém 300 pg/ml de cefotaxima e 100 pg/ml de higromicina B e as placas foram incubadas a 28°C por 3 a 5 dias.

[00076] Para Sporisorium scitamineum, as células foram cultivadas em meio de YPD até 0,5 a 0,8 de OD600 e 150 pl das mesmas fossem misturados com 100 pl de uma cultura de Agrobacterium pré-induzida antes de serem espalhadas uniformemente sobre um disco de membrana com 0,45 pm de Hybond N (Amersham Pharmacia) que foi colocado em uma placa de IM. O cocultivo foi feito a 24 °C no escuro por 48 a 96 horas. Subsequentemente, as membranas foram transferidas sobre uma placa de YPD que contém 300 pg ml-1 de cefatoxima (Sigma-Aldrich) e 50 a 200 pg ml-1 de higromicina B (Roche) para selecionar os transformantes. Tanto a placa de IM quanto a placa de YPD contêm pelo menos 2,5% de ágar e devem ser secas no ar por 20 a 30 minutos antes do uso.

[00077] Para aprimorar a eficiência de transformação, vários parâmetros foram usados no ATMT de Rhodospoirium e Sporisorium scitamineum. Dentre os fatores ambientais que influenciaram significativamente na eficiência de transformação e taxa de falso positivo, o tipo de membrana e a concentração de agente de solidificação e pH de meio de cocultivo foram classificados como altos (Tabelas 4, 5 e 6). Nylon N+ e membrana de acetato de celulose exibiram a melhor eficiência de transformação enquanto o pH de cocultivo ideal foi entre 5,3 e 5,7. A concentração de ágar teve também um efeito principal na eficiência de transformação, particularmente para Sporisorium scitamineum. TABELA 4 Efeito de pH de Cocultivo e Concentração de Agente de Solidificação em Transformação de Sporisorium scitamineum

1 O cocultivo foi executado a 24°C por 52 h no pH de IM indicado com o uso de AGL1 que porta pEX1GPD-eGFP como um doador. A seleção foi feita em meio de YPD com 300 pg ml'1 de cefotaxoma e 200 pg ml'1 de higromicina B. CFU significa o número médio de transformantes. Os Resultados são derivados de 3 repetições. 2 NA: não aplicável TABELA 5 Efeitos de pH de Cocultivo e Concentração de Agente de Solidificação em Transformação de R. Toruloides

[00078] Nota: 100 pl de células de AGL1 pré-induzidas transformadas com pEC3Pgpdll-hpt-3 foram cocultivados com 100 pl de R. toruloides (ATCC 10657) e cocultivados em uma membrana de Nylon N+ por 48 horas. TABELA 6 Efeito de Membranas em Eficiência de Transformação

[00079] Nota: 100 pl de células de AGL1 pré-induzidas transformadas com pEC3Pgpdll-hpt-3 foram cocultivados com 100 pl de R. toruloides (ATCC 10657) e cocultivados em várias membranas por 48 horas.

EXEMPLO 9 Seleção Com o Uso de Nourseotricina

[00080] Para demonstrar a possibilidade do uso de um gene natural de resistência a fármaco em transformação de Rhodosporidium, foi executado ATMT com o uso de pNGR1 que demonstrou ser eficaz em selecionar transformantes em U. maydis (Ji et al., 2010). Com o uso do protocolo otimizado acima, muitas colônias resistentes a nourseotricina foram produzidas quando selecionadas contra 50 pg/ml de ClonNAT ~80% das mesmas contiveram o T-DNA conforme identificado por PCR de colônia (Figura 2D). TABELA 7 ATMT Com o Uso de nat como um Marcador de seleção

[00081] Nota: 100 pl de células AGL1 pré-induzidas transformadas com pNGR1 foram cocultivados com 100 pl de R. toruloides (ATCC 10657) e cocultivados em uma membrana de Nylon N+ por 48 horas.

EXEMPLO 10 Gene Knockout em U maydis

[00082] Os genes cyp1 (um11812) e prf1 (um02713) foram escolhidos para a comparação de frequência de direcionamento de gene, que pode ser monitorada pela perda de produção de ácidos ustilágicos (UA) e pela perda de colônias Fuz+,respectivamente. As construções de deleção de gene, pKOcypl e pKOprfl, foram feitas pela ligação de uma etapa de quatro fragmentos. pKOcypl é composto do fragmento Hind\\\-Pac\ de 2,0 kb que contém o cassete Pgpd::hpt, o fragmento Nco\-Kpn\ de 8,7 kb de pEX2tk, o Nco\-Hind\\\ de 1405 bp e o produto de PCR Pac\-Kpn\ de 1076 bp derivado das regiões a montante e a jusante do cyp1 ORF. Os pares oligo Cyp1L-Nf/Cyp1L-Hr (SEQ ID NO: 29/SEQ ID NO: 30) e Cyp1R-Pf/Cyp1R-Kr (SEQ ID NO: 31/SEQ ID NO: 32) foram usados para a amplificação das regiões a montante e a jusante, respectivamente. pKOprfl foi feito de modo similar exceto pelo fato de que o produto de PCR dos pares oligo Prf 1L- Nf/Prf 1 L-Hr (SEQ ID NO: 33/SEQ ID NO: 34) e Prf 1 R-Pf/Prf1 R-Kr (SEQ ID NO: 35/SEQ ID NO: 36) foi usado como a região de homologia a montante e a jusante, respectivamente. As cepas corretas foram identificadas por PCR de colônia com o uso de Taq DNA polimerase com base no tamanho esperado das construções com o uso de oligos LB/Cyp1L-Nf (SEQ ID NO: 37/SEQ ID NO: 29) e LB/Prf1L-Nf (SEQ ID NO: 37/SEQ ID NO: 33) para cyp1Δe prf1Δrespectivamente. As mesmas técnicas de construção e identificação foram aplicadas para gerar outros mutantes de deleção de gene nesse estudo.

EXEMPLO 11 Aprimoramento de Frequência de Direcionamento de Gene com NU7026

[00083] A transformação mediada por PEG de esferoplastos de U maydis foi feita conforme descrito anteriormente (Kãmper, 2004). Em suma, os cassetes de deleção de gene cyp1 e prf1 de 4,5 foram amplificados a partir de pKOcypl e pKOprfl com o uso do Expand Long System (Roche Diagnosis, EUA) e dos oligos Cyp1 L-Nf/Cyp1 R-Kr (SEQ ID NO: 29/SEQ ID NO: 32) e Prf 1 L-Nf/Prf 1 R-Kr (SEQ ID NO: 33/SEQ ID NO: 36), respectivamente. Os produtos de PCR foram purificados com gel (Qiagen, Alemanha) e usados para a transformação. Um inibidor químico de proteína quinase dependente de DNA (DNA-PK), NU7026 (2-(morfolin-4-il)-benzo[h]comen-4-ona; 2-(4-morfolinil)-4/-/-naftol[1,2- b]piran-4-ona), foi adicionado tanto na parte superior quanto na parte inferior dos meios de ágar de regeneração a 1 pM tanto na parte superior quanto na parte inferior dos meios de regeneração e cultivado por 3 dias. Os mutantes de deleção de gene verdadeiros foram confirmados por Southern blotting e PCR de colônia fúngica (dentre 288 transformantes). Tanto em cyp1 quanto em prf1, a frequência de inativação de gene foi aumentada em cerca de 3 vezes (Tabela 8). TABELA 8 Efeitos de NU7026 em Transformação Mediada por PEG

[00084] Os resultados similares foram obtidos quanto a inativação foi executada através da transformação de ATMT (Tabela 9). TABELA 9 Efeitos de NU7026 em Frequência de Knockout de Gene em ATMT

[00085] Nota: A cepa AGL1 que abriga pKOprf1 e pKOcy11 foi cocultivada com U. maydis L8 e SG200 por 2 dias na presença de NU7026 em várias concentrações.

[00086] Os números entre parênteses indicam o número total de transformantes obtidos em 5 placas de transformação.

EXEMPLO 12 Análise de Composição de Nucleotídeo e Uso de Códon

[00087] A identificação de RtgpdApermitiu analisar a composição de nucleotídeo e o uso de códon nesse gene importante que são usualmente expressadas de maneira intensa. O ORF tem um teor de CG de 62,6% e 87,3% dos tripletos de códon terminam com C ou G. No geral, C é muito mais preferencial que G na 3aposition de nucleotídeo que contabiliza 64,2% de todos os códons. Uma exceção notável é a serina, que é codificada com o códon UCG na frequência de 69,6% (16 dentre 23). Dados similares foram encontrados em 8 outros genes de Rhodosporidium toruloides que foram listados no GenBank, incluindo L- fenilalanina amônia-liase (n° de acesso ao GenBank E01543.1); orotidina 5'-fosfato descarboxilase (ura3, EU693529.1); cefalosporina esterase(AF025410.1); epóxido hidrolase (EPH1, AY227047.1J, rodotorucinaA1 (RHA1, M28121.1); rodotorucina A2 (RHA2, M28122.1); rodotorucina A3 (RHA3, M28123.1); D-aminoácido oxidase (AF003339.1). Dentre os 8 genes, o teor de GC é 63% e 82,3% dos códons terminam com C ou G. A preferência para C ou G na 3a posição é mais forte em RtgpdA que a média de 8 genes (Tabela 10). Em contraste, o gene gpd (gap)de Ustilago maydis (UM02491.1) tem um teor de GC de 58% e 44,5% dos códons terminam com C ou G. Um resultado surpreendente foi encontrado na expressão de eGFP (SEQ ID NO: 48) em Rhodosporidium toruloides. Embora isso tenha um teor de CG de 59,9% e 64,3% dos códons terminem com C e 26% terminem com G (total de códons que terminam com C e C 90,3%), nenhuma florescência verde pode ser observada quando isso foi acionado com o promotor RtgpdA forte. Uma comparação de padrão de uso de códon entre RtgpdA e eGFP revelou que os códons preferenciais UCG (Serina), GUC (Valina) e CUC (Leucina) não foram usados em eGFP. Devido ao fato de que as construções que contêm hpt-2 falharam em transformar Rhodosporidium toruloides, foi analisado o uso de códon em htp-2. A preferência de códons para prolina (CCA), arginina (AGG), serina (AGC) e valina (GUG) foi drasticamente diferentes de RtgpdA. A diferença mais óbvia entre hpt-2 e hpt-3 é o uso de códon para serina (Tabela 10).

[00088] A análise de três genes disponíveis na base de dados do Genbank, fator de alongamento de tradução 1-alfa (GenBank: DQ352829.1), gpdA (GenBank: DQ352817.1) e actina (GenBank: FJ514819.1), mostrou uma preferência similar ao C ou G em uso de códon. Mais notavelmente, UCG é o códon mais preferencial para serina. Para observar se Sporobolomyces tem padrão similar de uso de códon, as atividades de Glicerol-3-fosfato desidrogenase, Piruvato carboxilase (estExt_Genewise1 ,C_20242), gw1.13.90.1 (ID de Proteína: 5205) Citrato sintase e ID de Proteína 12137; arcabouço_4:2114010-2115782; estearoil-CoA 9-desaturase foram recuperadas a partir de http://genoma.jgi-psf.org/Sporo1/Sporo1.home.htmle analisadas. Esses quatro CDS têm um teor de CG de 55,5% e 43,7% dos códons terminam com C e 19,6% terminam com G (total de códons que terminam com C e G 63,3%). De modo similar, o códon UCG foi fortemente orientado para serina, contabilizando 43,1% dos códons de serina (Tabela 10).

[00089] As análises do uso de códon na espécie Pseudozyma revelou padrão de uso de códon altamente similar com aqueles de Rhodosporidium e Sporisorium scitamineum. Por exemplo, os genes de Pseudozyma flocculosaque codificam 3 proteínas abundantes Actina (n° Genbank DQ913895); gpdA (EF030711) e EF1a (GQ922837) têm um teor de CG de 62,95% com 100% de resíduos de isoleucina codificados por AUC, 36,5% de Serina codificados por UCG; 11,3% de serina codificados por UCC e 100% de resíduos de histidina codificados por CAC. TABELA 10 Análise de Preferência de Códons

45/58 Petição 870200053835. de 30/04/2020. pág. 49/78 TABELA 10 – continuação

EXEMPLO 13 Clonagem de Promotores Adicionais para Acionar a Expressão Forte de Gene nos Subfilos Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina

[00090] A fim de expressar estavelmente múltiplos genes em espécies de interesse nos subfilos Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina, foi pesquisada a base de dados por genes potenciais que podem ser fortemente expressos. A sequência de genoma parcial de Rhodoturula graminisWPl foi liberada recentemente (http://genoma.jgi-psf.org/Rhoba1_1/Rhoba1_1.home.html). Arcabouço_18:19976-22436/1-2861 (+) e arcabouço_3:1454178- 1456821/1-3044 (+) foram anotados putativamente para codificar Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenases. O alinhamento de SEQ ID NO: 10 com o CDS previsto das duas sequências revelou que o Arcabouço_18:19976-22436/1-2861 (+) é provavelmente os homólogos de RtgpdA com 81,52% de identidade de nucleotídeo enquanto que o arcabouço_3:1454178-1456821/1-3044 (+) compartilha apenas 61,38% de identidade de nucleotídeo. Para clonar o promotor, os iniciadores de SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50 foram usados para amplificar por PCR o DNA genômico de Rhodoturula graminis WP1, que resultou na amplificação de um promotor que tem SEQ ID NO: 51 que foi usada para fundir com uma sequência de codificação de eGFP aprimorada (SEQ ID NO: 52) sintetizada de acordo com o uso de códon de Rhdospoiridium toruloides em um vetor de T-DNA (Tabela 10).

[00091] De modo similar, foi identificado o promotor gpdA de Sporobolomyces roseus com base nas informações em http://qenoma.jqi-psf.org/Sporo1/Sporo1.home.html. Entretanto, o promotor clonado de acordo com a anotação não demonstrou atividade para acionar a expressão de SEQ ID NO: 52. Dessa forma, foi executado 5'RACE e concluído que a iniciação de códon anotada na base de dados foi localizada no primeiro íntron. O promotor foi clonado por PCR com o uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54, que levam à clonagem do promotor que tem SEQ ID NO: 55.

[00092] Adicionalmente, foi executado 5'RACE para identificar as 5'UTRs e o códon de iniciação de tradução de vários outros genes. As informações resultantes foram usadas para clonar os promotores correspondentes. Dentre os mesmos, o promotor de gene de Estearoil- CoA deltaθ-desaturase (SEQ ID NO: 56) de Rhodotorula glutinis ATCC 204091 (GenBank: GL989638.1) foi clonado com o uso de oligonucleotídeos de SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58.

[00093] A florescência de GFP após transformado em Rhodotorula glutinis ATCC90781 foi observada no promotor mencionado abaixo, embora exista autoflorescência alta. A intensidade de GFP foi medida com o uso de um leitor de microplaca Tecan Infinate M200. A florescência de vetor de controle com gene GFP sem promotor e terminador transcricional nos foi definida em 1. A intensidade de GFP relativa após a subtração da cepa WT e normalizada com densidade de célula (QD600) é mencionada na Tabela 11. TABELA 11 Comparação de Atividade de Promotor

EXEMPLO 14 Transformação de Sporídiobolus roseus, Pseudozyma alphidis e Rhodotorula glutinis

[00094] Várias transformações por ATMT foram feitas com sucesso com o isso do gene htp-3 aprimorado. Notavelmente, a eficiência de transformação alta com raros falsos positivos foi observada em Sporobolomyces roseus FGSC 10293 (IAM 13481) com o uso de PgpdUm::hpt-3 como um marcador de seleção. Isso está em absoluto contraste com o que fora relatado anteriormente com o uso da mesma cepa e do método de transformação (laniri et al, 2011). Resultados similares foram encontrados com Pseudozyma aphidsATCC 32657 e 3 outras cepas de Rhodotorula e Rhodosporidium (Tabela 12). TABELA 12 ATMT de Várias Espécies de Pucciniomycotina com o uso de 3 Versões de hpt

[00095] Note: Cocultivo por 3 dias e a seleção foi feita com 300 pg/ml de cefotaxima e 300 pg/ml de higromicina. O resto foi selecionado contra 150pg/ml de higromicina. Os números entre parênteses são a taxa de falso positivo conforme determinado por PCR de colônia de 24 transformantes. FGSC: Fungal Genetics Stock Centre, University of Missouri, EUA. NT: Não testado. **: Unidades de formação de colônia por placa de 90 mm.

[00096] O uso dos termos "um" e "uma" e "o(s)" e referentes similares no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) deve ser interpretado para abranger tanto o singular quanto o plural, salvo se indicado de outro modo no presente documento ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "que compreende", "que tem", "que inclui", e "que contém" devem ser interpretados como termos de interpretação livre (isto é, o que significa "incluindo, mas não limitado a",) salvo se indicado ao contrário. A menção de faixas de valores no presente documento é meramente destinada a servir como um método de abreviatura de referência individual a cada valor separado que se enquadra naquela faixa, salvo se indicado de outro modo no presente documento e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como individualmente mencionado no presente documento. Todos os métodos descritos no presente documento podem ser executados em qualquer ordem adequada salvo se indicado de outro modo no presente documento ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") fornecidos no presente documento é destinado meramente a melhor esclarecer a invenção e não impõe uma limitação sobre o escopo da invenção salvo se reivindicado de outro modo. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[00097] As modalidades desta invenção são descritas no presente documento, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para executar a invenção. As variações destas modalidades podem se tornar evidentes para aqueles elementos de conhecimento comum na técnica mediante a leitura da descrição supracitada. Os inventores esperam que os elementos versados empreguem tais variações conforme apropriado e os inventores pretendem que a invenção seja colocada em prática de outro modo diferente do especificamente descrito no presente documento. Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes da matéria mencionada nas reivindicações anexas no presente documento conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis dos mesmos é abrangida pela invenção salvo se indicado de outro modo no presente documento ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. 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Claims (8)

1. Construção de polinucleotídeo, caracterizada pelo fato de que compreende um promotor ligado de modo funcional a uma sequência de codificação para um marcador selecionável ligado de modo funcional a um terminador transcricional, em que o promotor é derivado de uma espécie fúngica selecionada dentre uma espécie do gênero Rhodosporidium-, em que o promotor derivado de uma espécie do gênero Rhodosporidium é SEQ ID NO: 51 ou 56, em que a construção de polinucleotídeo fornece uma seleção dominante de uma célula fúngica transformada dos subfilos Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina quando transformadas em uma célula fúngica dos referidos subfilos.

2. Construção de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que que a sequência de codificação codifica uma proteína que confere resistência a um antibiótico, tal como, Higromicina B, Nourseotricina e Zeocina, ou em que a sequência de codificação codifica uma proteína que confere resistência a um herbicida, preferivelmente em que a sequência de codificação é selecionada do grupo que consiste em uma sequência de codificação que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 6, uma sequência de codificação que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 7 e uma sequência de codificação que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 8.

3. Construção de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a sequência de codificação para um marcador selecionável é pelo menos 60% de GC, de preferência pelo menos 70% de GC e de mais preferência pelo menos 75% de GC; em que pelo menos 70% dos tripletos de códon terminam com C ou G, de preferência mais que 80% dos tripletos de códon terminam com C ou G, preferencialmente em que a sequência de codificação para um marcador selecionável é composta de códons UCG em pelo menos 40% dos resíduos de serina.

4. Método para transformação de uma célula fúngica de uma espécie dos subfilos Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula fúngica com a construção como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e (b) selecionar uma colônia fúngica transformada.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a transformação compreende a etapa de cocultivar a dita célula fúngica com Agrobacterium tumefaciensque contém um vetor que compreende a referida construção e em que o cocultivo é executado em um meio de cocultivo sólido ou em uma membrana de cocultivo que é assentada na parte superior de um meio sólido, preferencialmente em que o meio de cocultivo contêm pelo menos 1,5% de ágar, de preferência, entre 2% e 3% de ágar.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, carac-terizado pelo fato de que a seleção é executada através da sobreposição de um meio de seleção sólido na parte superior do meio de cocultivo sólido ou através da transferência da membrana de cocultivo para um meio de seleção sólido, preferencialmente em que o meio de cocultivo contêm pelo menos 1,5% de ágar, de preferência, entre 2% e 3% de ágar.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a célula fúngica é uma espécie do gênero Rhodosporidium, Rhodoturula, Pseudozyma, Sporisorium ou Sporobolomyces.

8. Promotor isolado, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: (i) um promotorque consiste na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 56.

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