ES2952733T3

ES2952733T3 - Composiciones y métodos para preparar alcaloides de bencilisoquinolina, alcaloides de morfinano, tebaína y derivados de los mismos

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Publication number: ES2952733T3
Application number: ES17735761T
Authority: ES
Inventors: Peter James Facchini; Xue Chen; Jeffrey C Colbeck; Joseph Tucker
Original assignee: Antheia Inc
Current assignee: Antheia Inc
Priority date: 2016-06-27
Filing date: 2017-06-27
Publication date: 2023-11-03
Anticipated expiration: 2037-06-27
Also published as: US20200140906A1; EP3475417B1; DK3475417T5; US20220205004A1; EP3475417A1; DK3475417T3; AU2017290594B2; WO2018005553A1; CA3029263A1; AU2022203287A1; IL263947A; EP4253531A2; EP4253531A3; IL263947B2; IL263947B; AU2017290594A1; US11142780B2

Abstract

En el presente documento se describen métodos que pueden usarse para la síntesis de alcaloides de bencilisoquinolina (BIA), como el alcaloide morfinano. Los métodos descritos se pueden usar para producir tebaína, oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona y/o buprenorfina. Se proporcionan composiciones y organismos útiles para la síntesis de BIA, incluidos polipéptidos de síntesis de tebaína, permeasas de purina y polinucleótidos que codifican los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para preparar alcaloides de bencilisoquinolina, alcaloides de morfinano, tebaína y derivados de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN

[0001] Los siguientes párrafos se proporcionan a modo de antecedentes y no como una admisión de que todo lo discutido en ellos sea estado de la técnica o parte del conocimiento de los expertos en la materia.

[0002] La tebaína, un compuesto químico también conocido como paramorfina y codeína metil enol éter, pertenece a la clase de compuestos conocidos como alcaloides de bencilisoquinolina (“BIA”), y dentro de esa clase, a una subclase BIA de compuestos conocidos como alcaloides de morfinano, y ha sido reconocido como un compuesto de materia prima útil en la producción de agentes terapéuticos, incluyendo, por ejemplo, morfina y codeína. Otros agentes que se pueden fabricar pueden incluir, entre otros, oripavina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona y neopinona. Se sabe que la tebaína in planta se produce a partir de un compuesto precursor llamado salutaridina a través de alcaloides de morfinano intermedios llamados salutaridinol y salutaridinol 7-O-acetato. Actualmente, la tebaína se puede obtener de fuentes naturales, como cápsulas de adormidera (ver, por ejemplo, Pub. Sol. Pat. EE. UU. N° 2002/0106761; ver también, por ejemplo, Poppy, the genus Papaver, 1998, pp 113, Harwood Academic Publishers, Editor: Bernáth, J.). Alternativamente, la tebaína se puede preparar sintéticamente. Este último se puede lograr mediante una secuencia de reacción que comienza con la cetalización de yodoisovainillina (ver, por ejemplo, Rinner, U. y Hudlicky, T., 2012, Top. Cur. Chem. 309; 33-66; Stork, G., 2009, J Am. Chem. Soc. 131 (32) págs. 11402 11406).

[0003] Los métodos de fabricación existentes para los BIA, incluida la tebaína y otros alcaloides de morfinano y sus derivados, tienen bajos rendimientos y/o son caros. Algunas de las metodologías conocidas para la fabricación de tebaína existen en la producción de cantidades indeseables de subproductos de alcaloides de morfinano (ver, por ejemplo, Rinner, U. y Hudlicky, J., 2012, Top. Cur. Chem. 209: 33- 66). No existen métodos para la fabricación biosintética comercial de BIA, incluida la tebaína y otros alcaloides de morfinano y sus derivados. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos mejorados para la síntesis de BIA que incluyan tebaína y otros alcaloides de morfinano y sus derivados. Choe et. al. (2012, Forensic Science International 222(1-3): 387-393) describe la conversión de saluridinol-7-O-acetato en tebaína en la amapola. Zulak et al. (2007, Planta 225: 1085-1106) divulga una secuencia de polinucleótidos (número de acceso a la base de datos FE967184) que comparte la identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 19 del presente documento. El documento US 6.573.428 describe un polipéptido con identidad de secuencia baja con SEQ ID NO: 6 en este documento.

RESUMEN

[0004] Esta solicitud describe ciertos alcaloides que pertenecen a la clase de alcaloides de bencilisoquinolina (“BIA”), alcaloides de morfinano y sus derivados, así como métodos para fabricar dichos BIA, incluidos los alcaloides de morfinano (y sus derivados). Por ejemplo, un BIA que se puede hacer es la tebaína.

[0005] Los BIA, como los alcaloides de morfinano, más específicamente la tebaína, se pueden producir a partir de azúcar (u otros sustratos). La invención proporciona una célula modificada genéticamente que comprende un polinucleótido que codifica una enzima capaz de convertir salutaridinol-7-O-acetato en tebaína, en la que la enzima es un polipéptido de síntesis de tebaína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la S^eQ ⁱD NO. 6, SEQ ID NO. 31 o SEQ ID NO. 32, donde la célula es un hongo, levadura o bacteria. La invención también proporciona el uso de un polipéptido de síntesis de tebaína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 31 o Se Q ID NO. 32 para convertir salutaridinol-7-O-acetato en tebaína in vitro. La invención proporciona además un método para producir tebaína, comprendiendo dicho método hacer crecer la célula según la invención en un medio de crecimiento que comprende un sustrato base. La enzima que convierte el salutaridinol-7-O-acetato en tebaína es un polipéptido de síntesis de tebaína (también conocido como tebaína sintasa o BetV1). En algunos casos, una permeasa de purina también está presente dentro de la célula.

[0006] El método de convertir un azúcar (u otro sustrato) en un BIA, como la tebaína, también se puede realizar in vitro. Una o más enzimas que pueden realizar cualquiera de las siguientes reacciones: i) azúcar a l-tirosina; ii) l-tirosina a lDOPA; iii) l-DOPA a dopamina; iv) dopamina a (Sj-norcoclaurina; v) (SJ-norcoclaurina a (S)/(R)-reticulina; vi) (R)-reticulina a salutardina; vii) salutardina a salutaridinol; viii) salutaridinol a salutaridinol-7-O-acetato; ix) salutaridinol-7-O-acetato a tebaína; x) tebaína a oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona y/o buprenorfina; puede ser aislado (o contenido en un extracto celular) y utilizado en una reacción in vitro. En algunos casos, algunas de las reacciones se pueden realizar in vivo (p. ej., dentro de una célula), mientras que otras se pueden realizar in vitro. Por ejemplo, el azúcar se puede convertir en salutardina in vivo, mientras que la reacción de salutardina en tebaína puede ocurrir in vitro. Si la tebaína es el producto final, se puede usar un polipéptido de síntesis de tebaína para convertir salutaridinol-7-O-acetato en tebaína in vitro.

[0007] Se puede elegir el polipéptido de síntesis de papaver tebaína. Por ejemplo, el polipéptido de síntesis de tebaína puede ser un polipéptido de síntesis de tebaína de Papaver somniferum. El polipéptido de síntesis de tebaína puede comprender una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 6, es decir, al menos un 70 % idénticos. En algunos casos, la síntesis de tebaína El polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica SEQ ID NO. 31, es decir, al menos un 70 % idénticos.

[0008] Se puede elegir una permeasa de purina del género Papaver. Por ejemplo, la permeasa de purina puede ser de Papaver somniferum. La permeasa de purina puede comprender una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 36. La permeasa de purina puede comprender una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 38. La permeasa de purina puede comprender una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO. 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 o 64. En algunos casos, la permeasa de purina puede comprender una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica SEQ ID NO. 35. En algunos casos, la permeasa de purina puede comprender una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica SEQ ID NO. 37. En algunos casos, la permeasa de purina puede comprender una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO. 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 o 63.

[0009] En algunos casos, la célula descrita en este documento puede ser un procariota, es decir, una bacteria. La célula también puede ser un eucariota en algunos casos, es decir, un hongo o una levadura. Otros microorganismos que se pueden utilizar son Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica o Escherichia coli.

[0010] También se describen en este documento vectores o polinucleótidos quiméricos que comprenden uno o más polinucleótidos capaces de controlar la expresión en una célula huésped que está unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de síntesis de tebaína. En algunos casos, un polinucleótido que codifica una permeasa de purina puede estar dentro del vector o polinucleótidos quiméricos.

[0011] Se pueden usar otros sustratos además del azúcar para hacer BIA. Por ejemplo, el método o el microorganismo puede usar azúcar, glicerol, L-tirosina, tiramina, L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), un alcohol, dopamina o una combinación de los mismos, como sustrato para fabricar BIA.

[0012] Los BIA tales como tebaína y otros alcaloides de morfinano y sus derivados obtenidos a partir de las células y/o los métodos descritos pueden usarse como un compuesto de materia prima para producir un compuesto medicinal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0013] La divulgación se encuentra en los párrafos proporcionados a continuación descritos en relación con sus Figuras. Las figuras proporcionadas en este documento se proporcionan con fines ilustrativos y no pretenden de ninguna manera ser limitativas.

FIGS. 1A-1D. FIG. 1A representa la vía de la glucosa a la L-tirosina en la levadura. TKT, transcetolasa; E4P, eritrosa 4-fosfato; (PEP) ácido fosfoenolpirúvico; PEPS (PEP sintetasa; DAHPS, DAHP sintasa; DAHP, 3-desoxiD-arabinoheptulosonato 7-fosfato; CM/PDH, corismato mutasa/prefenato deshidrogenasa; HPP, hidroxifenilpiruvato. La FIG.1B representa la ruta de glucosa a L-tirosina en E. coli. X5P, xilulosa 5-fosfato; PYR, piruvato; EPSP, 5-enolpiruvoilshikimato 3 - fosfato; CHA, corismato; PPA, prefenato; HPP, 4-hidroxifenlipiruvato; L-Glu, ácido glutámico y a-KG, a-cetoglutarato Las enzimas (en negrita) son las siguientes: PpsA, fosfoenolpiruvato sintasa; TktA, transcetolasa A; AroG, DAHP sintasa; AroB, DHQ sintasa; AroD, DHQ deshidratasa; YdiB, quinato/shikimato deshidrogenasa; AroE, shikimato deshidrogenasa; AroK/L, sikimato quinasa I/II; AroA, EPSp sintasa; AroC, corismato sintasa; TyrA, corismato mutasa/prefenato deshidrogenasa; y TyrB, tirosina aminotransferasa. QUIN y ácido gálico (GA) son productos secundarios. QUIN está formado por YdiB a partir de DHQ, mientras que g A está formado por AroE de DHS Las líneas discontinuas indican dónde ocurren las inhibiciones de retroalimentación. FIG. 1C. representa la ruta de la L-tirosina a la tebaína y otros alcaloides de morfinano como la codeína. FIG. 1D muestra otra representación de la vía biosintética de la tirosina a la morfina en la adormidera. Las enzimas enumeradas son las siguientes: TYDC, tirosina/DOPA descarboxilasa; TyrAT, tirosina aminotransferasa; NCS, norcoclaurina sintasa; 6OMT, norcoclaurina 6-O-metiltransferasa; CNMT, coclaurina N-metiltransferasa; NMCH, N-metilcoclaurina 3'-hidroxilasa; 3'-hidroxil-N-metilcoclaurina 4'-O-metiltransferasa; REPI, reticulina epimerasa; SalSyn, salutaridina sintasa; SalR, salutaridina reductasa; SalAT, salutaridinol 7-O-acetiltransferasa; THS, polipéptido de síntesis de tebaína (también conocido como tebaína sintasa o Betv1); T6ODM, tebaína 6-O-metiltransferasa, COR, codeinona reductasa; CODM, codeína O -desmetilasa.

FIG.2 representa una estructura química prototipo de un alcaloide de morfinano. Se han numerado varios átomos dentro de las estructuras para facilitar la referencia.

FIGS. 3A-C representa las estructuras químicas de alcaloides de morfinano de sustrato de ejemplo, en particular salutaridina (FIG. 3A), salutaridinol (FIG. 3B) y 7-O-acetato de salutaridinol (FIG. 3C).

FIG. 4 representa la estructura química del compuesto alcaloide morfinano tebaína.

FIG. 5 representa una reacción química que ilustra la formación de tebaína en presencia del polipéptido de síntesis de tebaína (THS) y tres subproductos no enzimáticos de alcaloides de morfinano, denominados, como se indica, Producto n.° 1, Producto n.° 2 y (7R)-salutaridinol, en ausencia de THS. Los compuestos con m/z 330 son productos de reacción alternativos de (7S)-salutaridinol-7-O-acetato y no son tebaína.

FIGS. 6A-6G. FIG. 6A muestra que la formación de tebaína se mejora utilizando extractos de proteínas de látex en ensayos acoplados con SalAT. Usando SalAT solo, se formó un producto mayoritario con m/z 330 y poca tebaína. Con la adición de extractos proteicos de látex, la formación de tebaína (m/z 312) aumentó sustancialmente y la abundancia relativa del compuesto m/z 330 disminuyó. El manitol adicional durante la extracción de proteínas de látex mejoró aún más la formación de tebaína. La proteína de látex desnaturalizada fue un control negativo. FIG. 6B muestra la caracterización por CL-EMn de los subproductos m/z 330 de los ensayos acoplados con SalAT realizados en ausencia de extractos de proteínas de látex. FIG. 6C representa la identidad propuesta y el mecanismo de reacción que conduce a la formación de los subproductos m/z 330 de los ensayos acoplados con SalAT realizados en ausencia de extractos de proteínas de látex. Cualquiera o todos los subproductos putativos m/z 330 podrían formarse. FIGS. 6D-6F muestran los perfiles de elución para cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) en una columna de butil-S sepharose (FIG. 6D), intercambio iónico (IEX) en una columna HiTrap Q (FIG. 6E) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en una columna Superdex 75 HR 10/30 (FIG. 6F). Las fracciones de elución que contienen proteína formadora de tebaína activa en ensayos acoplados con SalAT se muestran como barras grises. Las fracciones 10 - 13 del paso SEC se agruparon y se sometieron a análisis de proteómica. FIG. 6G muestra una tabla de purificación parcial para la proteína formadora de tebaína activa en ensayos acoplados con SalAT. FIG. 7A-7G. FIG. 7A representa ciertos resultados experimentales, en particular las cantidades relativas de tebaína producida por SalAT en presencia de varias fracciones de proteínas (fracciones AS, HIC, IEC y HA) del proceso de purificación, como se describe con más detalle en el Ejemplo 1. También se muestra un gel de poliacrilamida siguiendo electroforesis en gel de los mismos extractos proteicos. FIGS. 7B-7D representan una SDS-PAGE para cada paso en la purificación de la proteína formadora de tebaína activa en ensayos acoplados con SalAT. FIG. 7B muestra proteína de látex cruda, precipitado de sulfato de amonio (AS) y fracciones cromatográficas HIC e IEX resueltas en geles SDS-PAGE al 10 %. FIG.7C muestra las fracciones 10 - 13 del paso SEC resuelto en un gel SDS-PAGE al 10 %. FIG.

7D muestra las fracciones SEC combinadas 10 - 13 resueltas en un gel SDSPAGE al 14 %. FIG. 7E muestra los seis principales candidatos para la proteína formadora de tebaína activa en ensayos acoplados con SalAT a partir del análisis proteómico de las tres bandas resueltas en un gel de SDS-PAGE al 14 % de las fracciones SEC combinadas 10 - 13 (FIG. 7D). FIG. 7F representa una alineación de secuencias de proteínas de los seis principales candidatos para la proteína formadora de tebaína activa en ensayos acoplados con SalAT. Betv1-1 (SEQ ID NO. 6) también se denomina polipéptido de síntesis de tebaína o tebaína sintasa a lo largo de la divulgación. FIG. 7G muestra ciertos resultados experimentales, en particular dos geles de poliacrilamida después de la electroforesis en gel de extractos de proteínas (fracciones SEC y HA) y la purificación de las bandas de 16-18 kDa después de la inclusión del paso SEC antes del paso de hidroxiapatita (HA), con retención de la tebaína actividad de proteína de síntesis (TS), como se describe adicionalmente en el Ejemplo 1.

FIGs. 8A y 8B muestran ensayos de enzimas acopladas a SalAT de proteínas recombinantes producidas en Escherichia coli que representan los seis principales candidatos responsables de la conversión potenciada de salutaridinol en tebaína. Betv1-1 también se denomina polipéptido de síntesis de tebaína o tebaína sintasa a lo largo de la descripción. FIG. 8A muestra proteínas candidatas purificadas por afinidad con etiquetas His 6 resueltas mediante SDS-PAGE. FIG. 8B muestra cromatografías CL-EM en ensayos acoplados con SalAT que muestran tebaína mejorada (m/z 312) y formación reducida de subproductos m/z 330 por un candidato, Betv1-1. FIGS. 9A-D. FIGS. 9A-9C representan la prueba de los seis principales candidatos para la proteína formadora de tebaína activa en cultivos de Saccharomyces cerevisiae alimentados con salutaridina durante 24 horas. FIG.

9A representa la ruta que muestra la conversión de salutaridina en tebaína por las acciones sucesivas de SalR, SalAT y el polipéptido de síntesis de tebaína (THS). Betv1-1 también se denomina polipéptido de síntesis de tebaína o tebaína sintasa a lo largo de la descripción. FIG. 9B representa una inmunotransferencia que muestra la aparición de las seis proteínas candidatas en cepas de levadura independientes. FIG.9C muestra la formación de tebaína en cepas de levadura manipuladas que expresan los seis genes candidatos. Vector vacío se refiere a una cepa de levadura que expresa solo SalR y SalAT. FIG. 9D muestra los títulos de producción de tebaína a partir de extractos de E. coli que expresa SaltAT, Bet v1-1A, Bet v1-1B, PR10-3A, PR10-3B y todas las construcciones juntas. Bet v1-1A se refiere a un Cterminal HA etiquetado como Betv1, mientras que Bet v1-1B corresponde a un N-terminal HA etiquetado como Betv1. Bet v1 -1B produjo la mayor cantidad de tebaína a partir de extractos de una sola construcción, mientras que Bet v1-1A produjo un poco menos. Los extractos de E. coli que expresaban todas las construcciones juntas produjeron los títulos más altos de tebaína.

FIG. 10 muestra que la mayoría de salutaridinol no se consumió en extractos de E. coli que expresan Bet v1-1A, Bet v1-1B, PR10-3A, PR10-3B y todas las construcciones juntas. Sin embargo, con SalAT solo, se usó todo el salutaridinol y se formó un subproducto m/z 330. Bet v1-1A se refiere a un Betv1 etiquetado con HA C-terminal, mientras que Bet v1-1B corresponde a un Betv1 etiquetado con HA N-terminal.

FIGS. 11A-D. FIG. 11A muestra la organización genómica de genes que codifican dos isoformas de reticulina epimerasa (REPI), salutaridina sintasa (SalSyn), salutaridina reductasa (SalR), salutaridina 7-O-acetiltransferasa (SalAT) y polipéptido de síntesis de tebaína (THS) tal como están presentes en el Papaver somniferum. Varios otros genes no caracterizados también están físicamente vinculados al grupo de genes implicados en la conversión de (S)-reticulina en tebaína. THS1 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 80; y THS2 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO.

6. FIG. 11B muestra la alineación de las isoformas THS1 y THS2. THS1 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 80; THS1s es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 81; THS2 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por s Eq ID NO. 6; y THS2s es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 32.

FIG. 11C muestra un análisis proteómico de extractos de proteínas derivados de tallo completo, tallo sin látex y látex aislado del quimiotipo T de la adormidera. FIG. 11D representa un árbol filogenético de proteínas de la familia PR10 seleccionadas de plantas. Se seleccionaron proteínas PR10 caracterizadas con estructuras 3D resueltas de Arabidopsis thaliana, Betula péndula, Lupinus luteus, Thalictrum flavum y Vigna radíate. Se seleccionaron ortólogos de THS no caracterizados de especies de Papaver relacionadas, incluidas Papaver bracteratum, Papaverrhoeas y Papaver setigerum. Se construyó un alineamiento utilizando CLUSTALW con una matriz de costos de BLOSUM. Luego se construyó el árbol filogenético sobre la base de la alineación usando PHYML con un modelo de sustitución de LG y 100 bootstraps.

FIGS. 12A-12C. FIG. 12A es una representación esquemática que muestra la ubicación de los cebadores usados para la detección de genes THS específicos y variantes de empalme. También se muestra la ubicación de los fragmentos utilizados para el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS). THS1 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 80; THS1s es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 81; THS2 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 6, y THS2s es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 32.

FIG. 12B muestran los cebadores usados para la detección de genes THS específicos y variantes de empalme y el análisis de experimentos VIGS. (SEQ ID NO. 65 a 78) También se proporciona el fragmento de VIGS sintetizado que consta de dos secuencias de transcripción específicas de ^tH^sfusionadas. (SEQ ID NO. 79) La FIG. 12C muestra patrones de expresión específicos de tejido de genes THS y variantes de empalme dentro de Papaversomniferum. La qRT-PCR basada en SYBR Green se realizó utilizando cebadores específicos de genes. Los valores representan la desviación estándar media 6 de tres réplicas biológicas.

FIGS. 13A-13B. FIG. 13A demuestra la detección de los vectores pTRV2 (EV) y pTRV2-THS (THS) en plantas infiltradas con Agrobacterium tumefaciens. FIG. 13B muestra el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) de transcritos de THS y los efectos correspondientes sobre niveles de alcaloides seleccionados en comparación con controles de vector vacío. Los valores representan la desviación estándar media ± de tres réplicas biológicas.

FIGS. 14A y 14B muestran datos de un ensayo enzimático in vitro de isoformas de THS recombinante. THS1 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 80; THS1s es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 81; THS2 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 6, y THS2s es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 32. FIG. 14A muestra la purificación por afinidad His6-etiqueta de isoformas de THS producidas en Escherichia coli. Las proteínas purificadas se resolvieron mediante SDS-PAGE. FIG. 14B muestra ensayos enzimáticos in vitro de isoformas de THS en un ensayo acoplado con SalAT. THS1 y THS2 fueron activos y aumentaron la formación de tebaína (m/z 312) sustancialmente a expensas del (de los) compuesto(s) m/z 330. Las variantes de especias THS1s y THS2s no estaban activas.

FIGS. 15A-15B muestra la homodimerización de proteínas THS. THS1 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 80; THS1s es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 81; THS2 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por ^sE^qID NO. 6, y THS2s es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 32.

FIG. 15A es un análisis de inmunotransferencia y SDS-PAGE que muestra el entrecruzamiento de isoformas THS1 y TH₂recombinantes purificadas (asteriscos en el medio cerca de 46 kDa) y la formación de oligómeros de mayor peso molecular (asteriscos superiores), y el entrecruzamiento limitado de las variantes de empalme THS1s y TH₂s. FIG. 15B muestra una cromatografía SEC de THS2 recombinante purificado que muestra un homodímero predominante con un peso molecular de ~ 40 kDa y varios oligómeros de mayor peso molecular (asteriscos superiores).

FIGS. 16A-16B muestra ensayos de competencia de sustrato para THS2 (también conocido como polipéptido de síntesis de tebaína codificado por SEQ ID NO. 6). FIG. 16A muestra compuestos ensayados como sustratos alternativos o inhibidores competitivos de 7-O-acetato de salutaridinol. FIG. 16B muestra la conversión relativa de 7-O-acetato de salutaridinol en tebaína en ensayos estándar de THS2 usando diferentes concentraciones de sustratos alternativos o inhibidores competitivos.

FIG. 17 muestra títulos relativos de tebaína producidos a partir de levadura. Bet v1 se probó con la etiqueta del epítopo HA en el extremo C o N (Bet v1-1-HA y HA-Bet v1-1, respectivamente) y se expresó en un plásmido con muchas copias. n = 3. Bet v1 también se conoce como polipéptido de síntesis de tebaína o tebaína sintasa. FIGS. 18A-18C. FIG. 18A muestra las cepas de levadura diseñadas para la producción de salutaridina y tebaína a partir de norlaudanosolina. FIG. 18B muestra títulos de tebaína en sobrenadantes de tres cepas de levadura manipuladas (SC-2, SC-3 y SC-4). FIG. 18C muestra el área relativa del pico del producto secundario desconocido (m/z 330) en el sobrenadante en las cepas SC-3 y SC-4. La levadura se hizo crecer en medio suplementado con NLDS 2,5 mM y L-metionina 10 mM durante 96 horas. Las barras de error indican las desviaciones estándar de cuatro réplicas biológicas.

FIGS. 19A y 19B. FIG. 19A muestra los títulos relativos de tebaína producidos a partir de levaduras que expresan diversas construcciones. Las diversas construcciones incluyen PR10-3; Apuesta v1-1; PR10-4; PR10-5; PR10-7; MLP15; MLP-2; y MLP-3, con etiquetas HA C- o N-terminal. El Bet v1-1 marcado en el extremo N (HA-Betv1-1) demuestra el nivel más alto de producción relativa de tebaína. Se alimentó con salutaridina 50 mM durante 48 horas. Cada construcción se expresó en un plásmido de alto número de copias. n = 3. FIG. 19B muestra el área relativa del pico del producto secundario desconocido (m/z 330). El Bet v1-1 etiquetado en el extremo N (HA-Betv1-1) demuestra el nivel más bajo de producción relativa de m/z 330. El área de pico se muestra en relación con el control de vector vacío. Las barras de error indican las desviaciones estándar de tres réplicas biológicas.

FIGS. 20A-20C. FIG. 20A muestra títulos relativos de tebaína producidos a partir de levadura que expresa Bet v1-1 integrado. Se alimentó con salutaridina 1 mM durante 48 horas. Las variantes de empalme de Bet v1-1 se probaron a partir de una sola copia integrada en el genoma (bajo un promotor pGAL). N=4. La cepa de control contenía pGAL1 SalR y pTEA1 SalAT. Betv1-1 es un polipéptido de síntesis de tebaína representado por SEQ ID NO. 6 (es decir, BeW1-1 es lo mismo que THS2). FIG. 20B muestra relativo 7 títulos de tebaína producidos a partir de levadura que expresa Bet v1-1, Bet v1-1S y Bet v1-1L integrados. Bet v1-1S es el polipéptido de síntesis de atebaína representado por SEQ ID NO 32 (es decir, Betv1-1S es lo mismo que THS2s). Bet v1-1L es un polipéptido de síntesis de tebaína representado por SEQ ID NO 31. Se usaron las mismas condiciones. FIG. 20C muestra las secuencias de aminoácidos de las variantes de corte y empalme utilizadas en los experimentos de la FIG. 20B.

FIGS. 21A-21C. FIG 21A muestra los títulos de tebaína producidos a partir de tres cepas de levadura (Sc-2, Sc-3, Sc-4, cuyos componentes se muestran en la FIG. 18A). FIG. 21B muestra los títulos de reticulina producidos a partir de las tres cepas de levadura. FIG. 21C muestra los títulos de salutaridina producidos a partir de las tres cepas de levadura. FIGS. 22A-22C es la caracterización del péptido señal de secreción de THS1 predicho. THS1 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 80. FIG.22A muestra el efecto de la fusión de proteína fluorescente verde (GFP) sobre la función catalítica de THS1 y THS2 en levadura modificada con SalR y SalAT cromosómicamente integrados. THS2 es una isoforma polipeptídica de síntesis de tebaína representada por SEQ ID NO. 6. Se alimentó a la levadura con salutaridina y se controló la acumulación de tebaína en el medio de cultivo a las 24 horas. FIG. 22B representa la ubicación de la fluorescencia de GFP en varias cepas de levadura que contienen fusiones THS1-GFP y THS2-GFP, en comparación con una GFP nativa, y la fusión de GFP con una proteína previamente caracterizada que posee una señal de secreción N-terminal (ssp-GFP). La fluorescencia mediada por GFP solo se detectó en las células, pero no en el medio de cultivo. FIG. 22C muestra la localización celular de la fluorescencia mediada por GFP en levadura que produce GFP nativa, THS2-GFP y THS1-GFP. Sólo THS1, que posee un péptido señal de secreción putativo, dio como resultado una localización alterada de la fluorescencia asociada a la periferia de la célula de levadura.

FIGS. 23A-23D. FIGS.23A-23C muestran títulos de S-reticulina, R-reticulina y salutaridina en cepas de levadura idénticas excepto que expresan 1 de 11 permeasas de purina diferentes. Las cepas de levadura recibieron alimentación NLDS. FIG.23 muestra títulos de S-reticulina cultivados durante 24 (izquierda) y 48 (derecha) horas en presencia de una alimentación NLDS. FIG. 23B muestra los títulos de R-reticulina cultivados durante 24 (izquierda) y 48 (derecha) horas en presencia de una alimentación NLDS. FIG.23C muestra títulos de salutaridina cultivados durante 24 (izquierda) y 48 (derecha) horas en presencia de una alimentación NLDS. FIG.23D muestra títulos de NLDS y reticulina cultivados durante 24 (izquierda) y 48 (derecha) horas en presencia de una alimentación de L-DOPA. PsomPUP1-4 se expresó en un plásmido de alto número de copias bajo el control de pGAL.

FIG. 24 muestra los títulos de tebaína, salutaridinol y salutaridina en presencia de una o más copias de permeasas de purina y Betv-1 (representadas por SEQ ID NO. 6) después de 48 horas. Una secuencia de nucleótidos que codifica BetV1 se integró en el genoma de la cepa de levadura. Además, se integró una permeasa de purina (PUP-1 - SEQ ID NO 46)) en el genoma de la cepa de levadura (control - lado izquierdo). Se expresó un PsomPUP1-4 (SEQ ID NO. 51 (aminoácido) y 52 (nucleótido)) a través de un plásmido de alto número de copias (segundo desde la izquierda). Además, JcurPUP1 (SEQ ID NO: 43 (aminoácido) y 44 (nucleótido)) se integró en la cepa de control, expresando así ambas copias integradas de JcurPUP1 y PsomPUP1 (control - tercera desde la izquierda). Finalmente, se expresaron tres copias de una permeasa de purina, PsomPUP1 integrada, JcurPUP1 integrada y plásmido de alta copia que expresaba PUP1-4 (extremo derecho).

FIG. 25 muestra un gráfico que muestra las concentraciones de tebaína (μg/l/OD) presentes en un medio de crecimiento que comprende salutaridina después del crecimiento de diferentes cepas de levadura que expresan Betv-1 solo (HA_BetV1M y BetV1L_HA), o Betv-1 junto con permeasa de purina (HA_BetV1M-pp y BetV1L_HA-pp), así como un control (EV). HA_BetV1M es un polipéptido de síntesis de tebaína marcado con HA, donde el polipéptido de síntesis de tebaína está representado por SEQ ID NO. 6. BetV1L_HA es un polipéptido de síntesis de tebaína marcado con HA, donde el polipéptido de síntesis de tebaína está representado por SEQ ID NO. 31. La permeasa de purina utilizada en este experimento está representada por SEQ ID NO. 35.

FIG. 26 muestra un gráfico que muestra la salutaridina (μg/l/OD) presente en un medio de crecimiento que comprende salutaridina después del crecimiento de diferentes cepas de levadura que expresan Betv-1 solo (HA BetV1M y BetV1L_HA), o Betv-1 junto con permeasa de purina (HA_BetV1M-pp y BetV1L_HA-pp), así como un control (EV). HA_BetV1M es un polipéptido de síntesis de tebaína marcado con HA, donde el polipéptido de síntesis de tebaína está representado por SEQ ID NO. 6. BetV1L_HA es un polipéptido de síntesis de tebaína marcado con HA, donde el polipéptido de síntesis de tebaína está representado por SEQ ID NO. 31. La permeasa de purina utilizada en este experimento está representada por SEQ ID NO. 35.

FIGS. 27A y 28B representan un gráfico que muestra la reticulina (μg/l/OD) presente en un medio de crecimiento que comprende DOPA (FIG. 27A) o norlaudanosolina (NLDS) (FIG. 27B), luego del crecimiento de cepas de levadura que expresan DODC, MAO, NCS, 6OMT, CNMT y 4'OMT, y transformados con un gen que expresa una primera permeasa de purina (PUP-L) o una segunda permeasa de purina (PUP-N), cada una sola o junto con Betv-1. Betv-1 es un polipéptido de síntesis de tebaína representado por SEQ ID NO. 6. El PUP-L es una permeasa de purina representada por SEQ ID NO. 35. El PUP-N es una permeasa de purina representada por SEQ ID NO. 37.

FIGS. 28A y 28B representan un gráfico que muestra reticulina y tebaína (μg/l/OD) presentes en un medio de crecimiento que comprende (S)-reticulina en una levadura que expresa REPI, CPR y SalSyn (FIG. 28A) o REPI, CPR, SalSyn, SalAT y SalR (FIG. 28B), cada cepa de levadura transformada con una primera permeasa de purina (PUP-L) o una segunda permeasa de purina (PUP-N), cada una sola o junto con Betv-1. Betv-1 es un polipéptido de síntesis de tebaína representado por SEQ ID NO. 6. El PUP-L es una permeasa de purina representada por SEQ ID NO. 35. El PUP-N es una permeasa de purina representada por SEQ ID NO. 37. FIGS. 29A y 29B representan un gráfico que muestra reticulina y tebaína (μg/l/OD) presentes en un medio de crecimiento que comprende (RJ-reticulina en una levadura que expresa REPI, CPR y SalSyn (FIG. 29A) o REPI, CPR, SalSyn, SalAT y SalR (FIG. 29B), cada cepa de levadura transformada con una primera permeasa de purina (PUP-L) o una segunda permeasa de purina (PUPN), cada una sola o junto con Betv-1. Betv-1 es un polipéptido de síntesis de tebaína representado por SEQ ID NO. 6. El PUP-L es una permeasa de purina representada por SEQ ID NO. 35. El PUP-N es una permeasa de purina representada por SEQ ID NO. 37. FIGS. 30A y 30B representan un gráfico que muestra la tebaína (μg/l/OD) presente en un medio de cultivo que comprende salutaridina en una levadura que expresa SalR y SalAT (FIG. 30A) o REPI, CPR, SalSyn, SalAT y SalR (FIG. 30B), cada cepa de levadura se transformó con una primera permeasa de purina (PUP-L) o una segunda permeasa de purina (PUP-N), cada una sola o junto con Betv-1. Betv-1 es un polipéptido de síntesis de tebaína representado por SEQ ID NO. 6. El PUP-L es una permeasa de purina representada por SEQ ID NO.

35. El PUP-N es una permeasa de purina representada por SEQ ID NO. 37.

[0014] Las figuras, junto con la siguiente descripción detallada, hacen evidente a los expertos en la técnica cómo se puede implementar la divulgación en la práctica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN

[0015] Los BIA se pueden producir en células (es decir, hongos, levaduras o microorganismos bacterianos) mediante ingeniería genética. Por ejemplo, cuando se producen alcaloides de morfinano a partir de fermentación microbiana, se puede usar un sustrato de azúcar para producir alcaloides de morfinano. Desde el azúcar hasta la tebaína, el primer alcaloide morfinano, se requieren al menos 9 conversiones.

[0016] En la primera conversión, el azúcar, como la glucosa, se puede convertir en L-tirosina. FIG. 1A muestra la vía molecular de la glucosa a la L-tirosina en la levadura. En las bacterias, la glucosa se puede convertir en L-tirosina mediante el uso de una variedad de enzimas. FIG. 1B muestra la vía molecular de la glucosa a la L-tirosina en bacterias como E. coli.

[0017] La segunda conversión, l-tirosina en l-DOPA, se puede realizar usando una tirosina hidroxilasa (p. ej., un citocromo p450 tal como CYP76AD1) para catalizar esta reacción. La tercera conversión de l-DOPA en dopamina puede ser catalizada por una DOPA descarboxilasa (DODC). La cuarta conversión hace uso de una norcoclaurina sintasa (NCS). La quinta conversión de (SJ-norcoclaurina a (S)/(R)-reticulina aprovecha una o más de varias enzimas que incluyen, entre otras: 6OMT (6-O-metiltransferasa), CNMT (coclaurina W-metiltransferasa), NMCH (citocromo P450 W-metilcoclaurina hidroxilasa, también conocida como CYP80B1) y 4OMT (4-O-metiltransferasa). La sexta conversión de (R)-reticulina a salutardina requiere CPR (citocromo P450 reductasa) y SAS (salutaridina sintasa). La séptima conversión de salutardina a salutaridinol utiliza salutaridina reductasa. La octava conversión de salutaridinol a salutaridinol-7-O-acetato aprovecha la salutaridinol-7-O-acetiltransferasa. Anteriormente se pensaba que la novena conversión de salutaridinol-7-O-acetato en tebaína era un proceso espontáneo (p. ej., a un pH elevado). Sin embargo, los inventores del presente documento han encontrado que un polipéptido de síntesis de tebaína puede catalizar esta reacción, órdenes de magnitud sobre una reacción espontánea. Además, la adición de una permeasa de purina puede aumentar mucho más los títulos de tebaína (y otros intermedios).

[0018] La tebaína se puede convertir adicionalmente en alcaloides de morfinano derivados como oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona y/o buprenorfina. Por ejemplo, la conversión de tebaína en oripavina utiliza codeína O-desmetilasa (CODM). La oripavina se puede convertir aún más en morfinona utilizando una tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM). La morfinona se puede convertir en morfina usando codeinona reductasa (COR). COR también puede convertir la morfina en morfinona. La tebaína se puede convertir en neopinona mediante una tebaína 6-O-desmetilasa. Se cree que la reacción de neopinona en codeinona es espontánea. La codeinona se puede convertir en codeína mediante el uso de COR. La reacción inversa de codeína a codienona también puede ser catalizada por COR. La codeína se puede convertir en morfina usando un CODM.

Definiciones

[0019] Los términos “alcaloide de morfinano” o “compuesto de alcaloide de morfinano”, como se pueden usar de manera intercambiable en este documento, pueden referirse a una clase de compuestos químicos que comprenden la estructura química prototipo que se muestra en la FIG. 2. Ciertos átomos de carbono y nitrógeno específicos están numerados y pueden mencionarse aquí por referencia a su posición dentro de la estructura del alcaloide de morfinano, por ejemplo, C¹, C², N¹⁷, etc. La numeración de átomos pertinente se muestra en la FIG. 2.

[0020] El término “grupo oxo”, como se usa aquí, puede referirse a un grupo representado por “=O”.

[0021] El término “grupo O-acetilo”, como se usa aquí, puede referirse a un grupo representado por

[0022] El término “alcaloide de morfinano de sustrato”, como se usa en este documento, puede referirse a un compuesto de alcaloide de morfinano que puede convertirse en un alcaloide de morfinano tal como tebaína u otro alcaloide de morfinano o derivados del mismo. Por ejemplo, los alcaloides de morfinano de sustrato proporcionados exógena o endógenamente pueden convertirse más eficientemente en una primera mezcla de reacción in vivo o in vitro en tebaína en presencia del polipéptido de síntesis de tebaína, que en una segunda mezcla de reacción idéntica a la primera mezcla de reacción pero para el ausencia del polipéptido de síntesis de tebaína. Una conversión se considera “más eficiente” si se obtienen mayores cantidades de tebaína en la mezcla de reacción y/o si la tebaína se acumula en la mezcla de reacción a una velocidad más rápida. Los alcaloides de morfinano de sustrato incluyen, pero no se limitan a, los compuestos de alcaloides de morfinano expuestos en las Figs. 3 A-C.

[0023] El término “compuesto intermedio de alcaloide de morfinano”, como se usa en el presente documento, puede referirse a un compuesto de alcaloide de morfinano formado tras la conversión química de un compuesto de sustrato de alcaloide de morfinano, y que posteriormente se puede convertir en un BIA tal como tebaína u otros derivados de compuestos de alcaloide de morfinano.

[0024] El término “sustrato”, como se usa aquí, puede referirse a cualquier compuesto que pueda convertirse en un compuesto diferente. Por ejemplo, la l-DOPA puede ser un sustrato para DODC y puede convertirse en dopamina. Para mayor claridad, el término “sustrato” incluye todos los sustratos, incluidos, entre otros, sustratos básicos, sustratos de alcaloides de morfinano y/o compuesto intermedio de alcaloide de morfinano.

[0025] El término “sustrato base”, como se usa en el presente documento, puede referirse a cualquier compuesto de carbono orgánico proporcionado exógenamente que pueda ser metabolizado por un microorganismo para permitir que el microorganismo produzca un alcaloide, por ejemplo, un alcaloide de morfinano. Los ejemplos de sustratos básicos incluyen, sin limitación, compuestos de azúcar, como, por ejemplo, glucosa, fructosa, galactosa y manosa, así como glicerol, L-tirosina, tiramina, L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), alcoholes (p. ej., etanol), dopamina o cualquier combinación de los mismos.

[0026] El término “derivado de alcaloide de morfinano de tebaína”, como se usa en el presente documento, puede referirse a un compuesto de alcaloide de morfinano que se puede obtener por conversión química de tebaína e incluye, entre otros, oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona, buprenorfina o cualquier combinación de los mismos.

[0027] El término “polipéptido de síntesis de tebaína” puede referirse a cualquier polipéptido que pueda facilitar la conversión de un sustrato en tebaína. Por ejemplo, un polipéptido de síntesis de tebaína puede ser un polipéptido que puede convertir salutaridinol-7-O-acetato en tebaína. En un ejemplo, el polipéptido de síntesis de tebaína puede denominarse “Bet v1” (o derivados, fragmentos, variantes del mismo). El polipéptido de síntesis de tebaína también puede denominarse “tebaína sintasa” (THS). Además, las variantes/isoformas del polipéptido de síntesis de tebaína se describen en todo el documento. Por ejemplo, Betv1/Betv1M/BetV-1/THS2 puede referirse a una secuencia representada por SEQ ID NO. 6. BetV1L y BetV1-1L pueden hacer referencia a una secuencia representada por SEQ ID NO. 31. THS2s y BetV1-1S pueden hacer referencia a una secuencia que está representada por SEQ ID NO. 32. THS1 puede referirse a una secuencia que está representada por SEQ ID NO. 80. Los THS1 pueden hacer referencia a una secuencia representada por SEQ ID NO. 81. Bet v1-1A puede referirse a un terminal C con HA etiquetado como Betv1, mientras que Bet v1-1B puede corresponder a un terminal N con HA etiquetado como Betv1.

[0028] Los términos “salutaridinol 7-O-acetiltransferasa”, “SalAT” y “polipéptido SalAT” pueden usarse indistintamente en este documento y pueden referirse a cualquier polipéptido que pueda facilitar la conversión de un sustrato en salutaridinol 7-O-acetato. Por ejemplo, SalAT puede referirse a todos y cada uno de los polipéptidos que pueden convertir salutaridinol en salutaridinol-7-O-acetato.

[0029] Los términos “salutaridin reductasa”, “SalR” y “polipéptido SalR” se pueden usar indistintamente en este documento y pueden referirse a cualquier polipéptido que pueda facilitar la conversión de un sustrato en salutaridinol. Por ejemplo, SalR puede referirse a todos y cada uno de los polipéptidos que pueden convertir salutaridina en salutaridinol.

[0030] El término “polinucleótido que codifica un polipéptido de síntesis de tebaína” puede referirse a cualquiera y todas las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido de síntesis de tebaína.

[0031] Los términos “polinucleótido que codifica un SalAT” y “polinucleótido que codifica un polipéptido SalAT” se pueden usar indistintamente en este documento y pueden referirse a cualquiera y todas las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido salutaridinol 7-O-acetiltransferasa (“SalAT”).

[0032] Los términos “polinucleótido que codifica un SalR” y “polinucleótido que codifica un polipéptido SalR” se pueden usar indistintamente en este documento y pueden referirse a cualquiera y todas las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido salutaridina reductasa (“SalR”).

[0033] La frase “condiciones de hibridación al menos moderadamente estrictas” puede significar que se seleccionan condiciones que promueven la hibridación selectiva entre dos moléculas polinucleotídicas complementarias en solución. La hibridación puede ocurrir en toda o una parte de una molécula de polinucleótido. La porción de hibridación tiene típicamente al menos 15 (p. ej., 20, 25, 30, 40 ó 50) nucleótidos de longitud. Los expertos en la técnica reconocerán que la estabilidad de un dúplex de polinucleótidos, o híbridos, está determinada por la Tm, que en los tampones que contienen sodio es una función de la concentración de iones de sodio y la temperatura (Tm = 81,5 °C x 16,6 (Log10 [Na+])+0,41( % (G+C)?600/l), o ecuación similar). En consecuencia, los parámetros en las condiciones de lavado que determinan la estabilidad del híbrido son la concentración de iones de sodio y la temperatura. Con el fin de identificar moléculas que son similares, pero no idénticas, a una molécula polinucleotídica conocida, se puede suponer que un 1 % de desajuste da como resultado una disminución de aproximadamente 1 °C en la Tm, por ejemplo, si se buscan moléculas polinucleotídicas que tengan una concentración >95 % de identidad, la temperatura de lavado final se reducirá en aproximadamente 5°C. Basándose en estas consideraciones, los expertos en la técnica podrán seleccionar fácilmente las condiciones de hibridación apropiadas. En formas de realización preferidas, se seleccionan condiciones de hibridación estrictas. A modo de ejemplo, se pueden emplear las siguientes condiciones para lograr una hibridación estricta: hibridación a 53 cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC)/5xsolución de Denhardt/1,0 % SDS a Tm (basado en la ecuación anterior)-5 °C, seguido de un lavado de 0,2xSSC/0,1 % SDS a 60 °C. Las condiciones de hibridación moderadamente estrictas incluyen un paso de lavado en 3xSSC a 42 °C. Sin embargo, se entiende que se pueden lograr rigores equivalentes usando tampones, sales y temperaturas alternativas. Puede encontrar orientación adicional sobre las condiciones de hibridación en: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1989, 6.3.1.-6.3.6 y en: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989, vol. 3.

[0034] El término “sustancialmente idéntico” y sus equivalentes gramaticales en referencia a otra secuencia como se usa en el presente documento puede significar al menos un 50 % idéntico. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 55 %. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 60 %. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 65 %. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 70 %. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 75 %. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 80 %. En otros casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 81 %. En otros casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 82 %. En otros casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 83 %. En otros casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 84 %. En otros casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 85 %. En otros casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es 86 % idéntica. En otros casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 87 %. En otros casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 88 %. En otros casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es 89 % idéntica. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 90 %. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 91 %. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 92 %. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 93 %. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es idéntica en un 94 %. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es 95 % idéntica. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es 96 % idéntica. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es 97 % idéntica. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es 98 % idéntica. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es 99 % idéntica. En algunos casos, el término sustancialmente idéntico se refiere a una secuencia que es 100 % idéntica. Para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias, se alinean las dos secuencias, utilizando por ejemplo el método de alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443), revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482) de modo que se obtenga la coincidencia de mayor orden entre las dos secuencias y se determine el número de aminoácidos/nucleótidos idénticos entre las dos secuencias. Por ejemplo, los métodos para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos son generalmente reconocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos por Carillo y Lipton (SIAM J. Applied Math., 1988, 48:1073) y los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, ed Oxford University Press, Nueva York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects. En general, se emplearán programas informáticos para dichos cálculos. Los programas informáticos que pueden usarse a este respecto incluyen, entre otros, GCG (Devereux et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12: 387) Bl a St P, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Molec. Biol., 1990:215:403). Un método especialmente preferido para determinar el porcentaje de identidad entre dos polipéptidos implica el algoritmo Clustal W (Thompson, J D, Higgines, D G y Gibson T J, 1994, Nucleic Acid Res 22(22): 4673-4680 junto con la matriz de puntuación BLOSUM 62 (Henikoff S & Henikoff, J G, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89: 10915-10919 utilizando una penalización de apertura de brecha de 10 y una penalización de extensión de brecha de 0,1, de modo que se obtuvo la coincidencia de mayor orden entre dos secuencias en las que al al menos el 50 % de la longitud total de una de las dos secuencias está involucrada en la alineación.

[0035] El término “quimérico”, como se usa aquí en el contexto de los polinucleótidos, puede referirse a al menos dos polinucleótidos que no están unidos de forma natural. Los polinucleótidos quiméricos incluyen polinucleótidos enlazados de diferentes orígenes naturales. Por ejemplo, un polinucleótido que constituye un promotor de levadura unido a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de síntesis de tebaína vegetal se considera quimérico. Los polinucleótidos quiméricos también pueden comprender polinucleótidos del mismo origen natural, siempre que no estén unidos de forma natural. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos que constituye un promotor obtenido de un tipo de célula particular puede estar unida a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido obtenido de ese mismo tipo de célula, pero normalmente no está unida a la secuencia de polinucleótidos que constituye el promotor. Las secuencias polinucleotídicas quiméricas también incluyen secuencias polinucleotídicas que comprenden secuencias polinucleotídicas naturales unidas a secuencias polinucleotídicas no naturales.

[0036] El término “aislado”, como se usa en el presente documento, describe un compuesto, por ejemplo, un alcaloide de morfinano o un polipéptido, que se ha separado de los componentes que lo acompañan naturalmente. Por lo general, un compuesto se aísla cuando al menos el 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % del material total (en volumen, por vía húmeda o peso seco, o por porcentaje molar o fracción molar) en una muestra es el compuesto de interés. El porcentaje de un material de interés se puede medir por cualquier método apropiado, por ejemplo, en el caso de polipéptidos, por cromatografía, electroforesis en gel o análisis de CLA^r.

[0037] El término “heterólogo” y sus equivalentes gramaticales como se usa en el presente documento pueden significar “derivado de una especie o tipo de célula diferente”. Por ejemplo, un “gen heterólogo” puede significar un gen que es de una especie o tipo de célula diferente. Por ejemplo, un polipéptido de síntesis de tebaína heterólogo puede referirse a un polipéptido de síntesis de tebaína que está presente en una célula o tipo de célula en el que no está presente de forma natural.

[0038] El término “variante funcional”, como se usa en el presente documento, en referencia a secuencias de polinucleótidos o secuencias de polipéptidos, puede referirse a secuencias de polinucleótidos o secuencias de polipéptidos capaces de realizar la misma función que una secuencia de polinucleótidos o secuencia de polipéptidos indicada. Se contempla que para cualquiera de los polipéptidos descritos a lo largo, también se puede usar una variante funcional además del polipéptido o se puede sustituir el polipéptido.

[0039] El término “in vivo”, como se usa en el presente documento, puede referirse a una célula viva, que incluye, por ejemplo, un microorganismo o una célula vegetal.

[0040] El término “in vitro”, como se usa aquí, puede referirse al exterior de una célula viva, incluyendo, sin limitación, por ejemplo, en una placa de micropocillos, un tubo, un matraz, un vaso de precipitados, un tanque, un reactor y similares.

[0041] Cabe señalar que los términos de grado tales como “sustancialmente”, “aproximadamente” y “alrededor de”, como se usan aquí, pueden referirse a una cantidad razonable de desviación del término modificado de manera que el resultado final no cambie significativamente. Estos términos de grado deben interpretarse como que incluyen una desviación del término modificado si esta desviación no niega el significado del término que modifica. Por ejemplo, en relación con un valor numérico de referencia, los términos de grado pueden incluir un rango de valores de más o menos el 10 % de ese valor. Por ejemplo, con respecto a “aproximadamente”, la cantidad “aproximadamente 10” puede incluir cualquier cantidad de 9 a 11. Los términos de grado en relación con un valor numérico de referencia también pueden incluir un rango de valores de más o menos 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de ese valor.

[0042] Como se usa en este documento, la expresión “y/o” pretende representar un o inclusivo. Es decir, “X y/o Y” significa X o Y o ambos, por ejemplo. Como otro ejemplo, “X, Y y/o Z” pretende significar X o Y o Z o cualquier combinación de los mismos.

[0043] Como se usa aquí, la palabra “asistir” y como se usa aquí puede significar ayudar, apoyar, facilitar o similar. Por ejemplo, cuando se usa en contexto con una enzima que convierte X en Y, un polipéptido que “ayuda” a la enzima puede aumentar la eficiencia en la que X se convierte en Y. En algunos casos, el polipéptido que “ayuda” no puede convertir directamente X en Y.

IMPLEMENTACIÓN GENERAL

[0044] Ciertos alcaloides pertenecen a una clase de compuestos químicos conocidos como alcaloides de bencilisoquinolina (“BIA”). Se describen ciertos polipéptidos capaces de mediar en reacciones químicas que implican la conversión de un sustrato (p. ej., un sustrato bencilisoquinolina) en un producto (p. ej., un producto) bencilisoquinolina. La bencilisoquinolina (ya sea el sustrato o el producto) puede pertenecer a la subclase de bencilisoquinolina de alcaloides de morfinano, según el producto que se desee. Por consiguiente, se describen ciertos polipéptidos capaces de mediar en reacciones químicas que implican la conversión de un sustrato en tebaína u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano. Además, se describen métodos que representan un medio novedoso y eficaz para producir tebaína u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano.

[0045] Las vías generales desde un sustrato de azúcar hasta un BIA, como la tebaína, incluyen enzimas que pueden realizar cualquiera de las siguientes reacciones: i) azúcar a l-tirosina; ii) l-tirosina a l-DOPA; iii) l-DOPA a dopamina; iv) dopamina a (Sj-norcoclaurina; v) (Sj-norcoclaurina a (S)/(R)-reticulina; vi) (R)-reticulina a salutardina; vii) salutardina a salutaridinol; viii) salutaridinol a salutaridinol-7-O-acetato; ix) salutaridinol-7-O-acetato a la tebaína BIA; x) tebaína a otros BIA (tales como oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona y/o buprenorfina). Dependiendo del sustrato utilizado, cualquiera de los productos de la ruta puede obtenerse aumentando o disminuyendo la expresión de las enzimas que promueven la formación del producto deseado.

[0046] Algunas de las conversiones químicas pueden ser realizadas por una o más enzimas, incluidas, entre otras, tirosina hidroxilasa (TYR); DOPA descarboxilasa (DODC); norcoclaurina sintasa (NCS); 6-O-Metiltransferasa (6OMT); coclaurina W-metiltransferasa (CNMT), citocromo P450 W-metilcoclaurina hidroxilasa (NMCH) y 4-O-metiltransferasa (4OMT); citocromo P450 reductasa (CPR), salutaridina sintasa (SAS); salutaridina reductasa (SalR); salutaridinol-7-O-acetiltransferasa (SalAT); permeasa de purina (PUP); o cualquier combinación de los mismos. Además, para formar un BIA, como alcaloides de tebaína o morfinano, el producto debe ponerse en contacto con un polipéptido de síntesis de tebaína; una codeína O-desmetilasa (CODM); una tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); una codeinona reductasa (COR); o cualquier combinación de los mismos.

[0047] Algunos de los métodos del presente documento implican el uso de polipéptidos novedosos conocidos como polipéptidos de síntesis de tebaína, así como polinucleótidos novedosos que codifican los polipéptidos de síntesis de tebaína. Los polipéptidos de síntesis de tebaína descritos y utilizados en este documento son capaces de convertir salutaridinol-7-O-acetato en tebaína. Actualmente, se piensa que la reacción de conversión de salutaridinol-7-O-acetato en tebaína ocurre por una reacción espontánea a ciertos niveles elevados de pH. Sin embargo, esta reacción es extremadamente lenta y termodinámicamente desfavorable en condiciones normales. Algunos de Los métodos descritos a lo largo aprovechan el uso de un polipéptido de síntesis de tebaína que puede convertir el salutaridinol-7-O-acetato en tebaína a una velocidad acelerada.

[0048] Algunos de los métodos del presente documento implican el uso de una permeasa de purina. En algunos casos, la permeasa de purina se puede usar en combinación con otros polipéptidos, como un polipéptido de síntesis de tebaína (THS). La permeasa de purina descrita y utilizada en todo el documento puede ser un polipéptido que es capaz de aumentar los títulos de producción de tebaína u otro intermedio BIA mediante cualquier célula o método descrito en este documento.

[0049] Se pueden usar diferentes sustratos con las enzimas descritas a lo largo. Por ejemplo, uno de tales sustratos puede ser un alcaloide de morfinano que tiene la fórmula química (I):

en la que R¹representa un átomo de hidrógeno y R¹' representa un grupo O-acetilo, o en la que R¹representa un átomo de hidrógeno y R¹' representa un grupo hidroxilo, o donde, tomados juntos, R¹y R¹' forman un grupo oxo.

[0050] El sustrato también puede tener la fórmula química (II):

donde, donde Ri representa un átomo de hidrógeno y Ri' representa un grupo O-acetilo, o donde Ri representa un átomo de hidrógeno y R¹' representa un grupo hidroxilo, o donde, tomados juntos, R¹y R¹' forman un grupo oxo.

[0051] El sustrato también puede tener la fórmula química (III):

donde R¹representa un átomo de hidrógeno y R¹' representa un grupo O-acetilo, o donde R¹representa un átomo de hidrógeno y R¹' representa un grupo hidroxilo, o donde, tomados juntos, R¹y R¹' forman un grupo oxo.

[0052] El sustrato también puede tener la fórmula química (IV):

[0053] En formas de realización donde se utilizan sustratos, por ejemplo, sustratos que tienen la fórmula química representada por (I), (II), (III) o (IV), uno o más polipéptidos adicionales pueden ayudar en la reacción. Por ejemplo, el polipéptido SalAT y un polipéptido SalR se pueden usar para preparar un BIA, como la tebaína. Otros polipéptidos también pueden ayudar a producir tebaína. Sin embargo, centrándonos aquí en SalAT y SalR, el polipéptido SalAT y/o un polipéptido SalR se pueden proporcionar añadiendo los polipéptidos directamente a los medios de cultivo, transfecciones (transitorias o estables) de polinucleótidos en las células antes del cultivo u otros medios.

SÍNTESIS DE ALCALOIDES DE BENCILISOQUINOLINA (BIA)

Síntesis in vivo de BIA

[0054] Los BIA (p. ej., tebaína, oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona y/o buprenorfina) se pueden producir al menos de dos formas. La primera forma es que el BIA se sintetice dentro de una célula. Esto se conoce como la síntesis in vivo de los BIA. Esto generalmente requiere el uso de una célula que pueda producir naturalmente BIA a partir de un sustrato, o el uso de una célula genéticamente modificada que sea 1) mejorada para producir más BIA en comparación con una célula no modificada o 2) que produzca BIA a pesar de que no lo hace de forma natural.

Células modificadas genéticamente para producir BIAs

Polipéptido de síntesis de tebaína

[0055] La célula modificada genéticamente comprende un polinucleótido que codifica una enzima heteróloga capaz de convertir salutaridinol-7-O-acetato en tebaína. La enzima que es capaz de convertir salutaridinol-7-O-acetato en tebaína es un polipéptido de síntesis de tebaína. Actualmente, no se conoce ninguna enzima que convierta el salutaridinol-7-O-acetato en tebaína, ya que se cree que esta conversión se produce de forma espontánea.

[0056] El polipéptido de síntesis de tebaína se puede sintetizar artificialmente o alterar de la forma en que existe en la naturaleza.

[0057] El polipéptido de síntesis de tebaína se expresa en células en las que normalmente no se expresa, por ejemplo, un polipéptido de síntesis de tebaína de una planta se puede expresar en levadura. Esto generalmente requiere que el polipéptido de síntesis de tebaína esté bajo el control de un promotor de levadura.

[0058] El polipéptido de síntesis de tebaína puede ser de una planta. Por ejemplo, el polipéptido de síntesis de tebaína puede ser de una planta del género Papaver. Más específicamente, las plantas de Papaver que se pueden usar incluyen, entre otras, Papaver bracteatum, Papaver somniferum, Papaver cylindricum, Papaver decaisnei, Papaver fugax, Papaver nudicale, Papaver oreophyllum, Papaver orientale, Papaver paeonifolium, Papaver persicum, Papaver pseudo-orientale, Papaver rhoeas, Papaver rhopalothece, Papaver armeniacum, Papaver setigerum, Papaver tauricolum y Papaver triniaefolium. Un polipéptido de síntesis de papaver tebaína particularmente útil es un polipéptido de síntesis de papaver somniferum tebaína.

[0059] Además, los polinucleótidos de codones optimizados (para una célula huésped/organismo particular) para las secuencias mencionadas anteriormente pueden usarse en la presente memoria.

[0060] El polipéptido de síntesis de tebaína también puede ser un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que sea sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 6, es decir, al menos un 70 % idénticos. Por ejemplo, el polipéptido de síntesis de tebaína puede ser una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO. 6.

[0061] En algunos casos, el polipéptido de síntesis de tebaína puede ser un fragmento del mismo. El fragmento aún puede retener la actividad de síntesis de tebaína. En algunos casos, la actividad de síntesis de tebaína puede disminuir o aumentar en comparación con la actividad producida por SEQ ID NO. 6. En un caso, el polipéptido de síntesis de tebaína puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a SEQ ID NO. 31 o 32, es decir, al menos un 70 % idéntica.

[0062] En algunos casos, el polipéptido de síntesis de tebaína puede ser una variante o una isoforma. En algunos casos, la variante o la isoforma aún pueden retener la actividad de síntesis de tebaína. En algunos casos, la actividad de síntesis de tebaína puede disminuir o aumentar en comparación con la actividad producida por SEQ ID NO. 6.

[0063] En algunos casos, el polipéptido de síntesis de tebaína puede comprender una secuencia que codifica una señal de secreción, etiqueta HA, etiqueta myc u otra señal/etiqueta. En algunos casos, estas etiquetas o señales no afectan la actividad del polipéptido de síntesis de tebaína.

Polipéptidos que pueden ayudar al polipéptido de síntesis de tebaína

[0064] El polipéptido de síntesis de tebaína también puede estar asistido por uno o más polipéptidos. Por ejemplo, el polipéptido de síntesis de tebaína puede ser asistido (p. ej., ayudar a sintetizar más tebaína) por uno o más polipéptidos que están codificados por un polinucleótido que es sustancialmente idéntico a SEQ ID NO. 18; SEQ ID NO. 20; SEQ ID NO. 21; SEQ ID NO. 22; SEQ ID NO. 23; SEQ ID NO. 24; SEQ ID NO. 25; SEQ ID NO. 26; SEQ ID NO. 27; SEQ ID NO.

28; SEQ ID NO. 29 o SEQ ID NO. 30. Los polinucleótidos de codones optimizados (para una célula huésped/organismo particular) para las secuencias mencionadas anteriormente pueden usarse en el presente documento.

[0065] En algunos casos, el polipéptido de síntesis de tebaína también puede ser asistido por uno o más polipéptidos que son capaces de hibridarse en condiciones al menos moderadamente estrictas con un polinucleótido que es sustancialmente idéntico a SEQ ID NO. 18; SEQ ID NO. 20; SEQ ID NO. 21; SEQ ID NO. 22; SEQ ID NO. 23; SEQ ID NO. 24; SEQ ID NO. 25; SEQ ID NO. 26; SEQ ID NO. 27; SEQ ID NO. 28; SEQ ID NO. 29 o SEQ ID NO. 30, o secuencias optimizadas de codones.

[0066] En algunos casos, el polipéptido de síntesis de tebaína también puede ser asistido por uno o más polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 5; SEQ ID NO. 7; SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 9; SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 11; SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 13; SEQ ID NO. 14: SEQ ID NO. 15: SEQ ID NO. 16 o SEQ ID NO. 17

[0067] Por ejemplo, el polipéptido de síntesis de tebaína también puede ser asistido por uno o más polipéptidos que es al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ. ID NO. 5 y 7 a 17. El polipéptido de síntesis de tebaína también puede estar asistido por uno o más polipéptidos que son sustancialmente idénticos a la SEQ ID NO. 5. El polipéptido de síntesis de tebaína puede estar asistido por uno o más polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 7 también se puede utilizar. El polipéptido de síntesis de tebaína puede estar asistido por uno o más polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 8. Polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 9 puede usarse para ayudar al polipéptido de síntesis de tebaína. Un polipéptido que es sustancialmente idéntico a SEQ ID NO. 10 también se puede usar para ayudar al polipéptido de síntesis de tebaína. El polipéptido de síntesis de tebaína puede estar asistido por uno o más polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 11. Polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID n O. 12 se puede utilizar para ayudar al polipéptido de síntesis de tebaína. Un polipéptido que es sustancialmente idéntico a SEQ ID NO. 13 también se puede usar para ayudar a un polipéptido de síntesis de tebaína. El polipéptido de síntesis de tebaína puede estar asistido por uno o más polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 14. Polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 15 puede usarse para ayudar al polipéptido de síntesis de tebaína. Un polipéptido que es sustancialmente idéntico a SEQ ID NO. 16 también se puede usar para ayudar a un polipéptido de síntesis de tebaína. El polipéptido de síntesis de tebaína puede estar asistido por uno o más polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 17.

Permeasa de purina

[0068] En el presente documento se describe una célula modificada genéticamente (p. ej., un microorganismo) que comprende un polinucleótido que codifica una enzima (p. ej., una enzima heteróloga) capaz de aumentar los títulos de tebaína en comparación con una célula no modificada genéticamente. La enzima que es capaz de aumentar los títulos de tebaína puede ser una permeasa de purina. La permeasa de purina a veces puede funcionar sola o junto con un polipéptido de síntesis de tebaína u otra enzima. Por ejemplo, en algunos casos, la combinación de permeasa de purina y polipéptido de síntesis de tebaína puede aumentar significativamente los títulos de tebaína en comparación con una célula no modificada genéticamente o con células que se transforman solo con una permeasa de purina o solo con un polipéptido de síntesis de tebaína.

[0069] La permeasa de purina se puede sintetizar artificialmente o alterar de la forma en que existe en la naturaleza.

[0070] La permeasa de purina también se puede expresar en células en las que normalmente no se expresa. Por ejemplo, una permeasa de purina de una planta se puede expresar en levadura. Esto generalmente requiere que la permeasa de purina esté bajo el control de un promotor de levadura.

[0071] La permeasa de purina puede ser de una planta. Por ejemplo, la permeasa de purina puede ser de una planta del género Papaver. Más específicamente, las plantas de Papaver que se pueden usar incluyen, entre otras, Papaver bracteatum, Papaver somniferum, Papaver cylindricum, Papaver decaisnei, Papaver fugax, Papaver nudicale, Papaver oreophyllum, Papaver orientale, Papaver paeonifolium, Papaver persicum, Papaver pseudo-orientale, Papaver rhoeas, Papaver rhopalothece, Papaver armeniacum, Papaver setigerum, Papaver tauricolum y Papaver triniaefolium. Una permeasa de purina particularmente útil es una permeasa de purina de Papaver somniferum.

[0072] La permeasa de purina puede estar codificada por un polinucleótido que es sustancialmente idéntico a SEQ ID NO. 36. Por ejemplo, la permeasa de purina puede estar codificada por un polinucleótido que es al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a cualquiera de SEQ ID NO. 36. Además, los polinucleótidos de codones optimizados (para una célula huésped/organismo en particular) para las secuencias mencionadas anteriormente pueden usarse en el presente documento.

[0073] En algunos casos, la permeasa de purina puede estar codificada por un polinucleótido capaz de hibridarse en condiciones al menos moderadamente estrictas con un polinucleótido que es sustancialmente idéntico a SEQ ID NO. 36 o secuenciado con codones optimizados. Además, la permeasa de purina puede ser sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 38 o 39.

[0074] La permeasa de purina también puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 35. Por ejemplo, la permeasa de purina puede ser una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a cualquiera de SEQ ID NO. 35. Polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 35 se puede utilizar como permeasa de purina. La permeasa de purina también puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 37. Por ejemplo, la permeasa de purina puede ser una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a cualquiera de SEQ ID NO. 37. Polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 37 se puede utilizar como permeasa de purina.

[0075] En algunos casos, la permeasa de purina puede estar codificada por un polinucleótido que es sustancialmente idéntico a cualquiera de las ^sE^qID NO. 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 o 64. Por ejemplo, la permeasa de purina puede estar codificada por un polinucleótido que es al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a cualquiera de los S^eQ ID NO. 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 ó 64. Además, pueden usarse aquí polinucleótidos de codones optimizados (para una célula huésped/organismo particular) para las secuencias mencionadas anteriormente.

[0076] En algunos casos, la permeasa de purina puede estar codificada por un polinucleótido capaz de hibridarse en condiciones al menos moderadamente estrictas con un polinucleótido que es sustancialmente idéntico a cualquiera de las SEQ ID NO. 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 o 64 o secuencias optimizadas de codones.

[0077] La permeasa de purina también puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO. 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 o 63. Por ejemplo, la permeasa de purina puede ser una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a cualquiera de los SEQ ID NO. 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 ó 63. Polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 o 63 se pueden utilizar como permeasa de purina.

[0078] En algunos casos, la permeasa de purina puede ser un fragmento de la misma. El fragmento aún puede retener la actividad de permeasa de purina. En algunos casos, el fragmento puede dar como resultado una actividad de permeasa de purina que disminuye o aumenta en comparación con la actividad producida por cualquiera de SEQ ID NO. 35, 37, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 o 63.

Enzimas adicionales útiles para hacer BIA

[0079] La célula modificada genéticamente también puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido SalAT y/o un polipéptido SalR. La SalAT y/o SalR pueden ser de una planta, por ejemplo, una planta del género Papaver, o de especies de Papaver tales como Papaver bracteatum, Papaver somniferum, Papaver cylindricum, Papaver decaisnei, Papaver fugax, Papaver nudicale, Papaver oreophyllum, Papaver orientale, Papaver paeonifolium, Papaver persicum, Papaver pseudoorientale, Papaver rhoeas, Papaver rhopalothece, Papaver armeniacum, Papaver setigerum, Papaver tauricolum y Papaver triniaefolium. Un Papaver SalAT y/o SalR particularmente útil es un Papaver somniferum SalAT y/o SalR.

[0080] En ciertos casos, el polipéptido SalAT puede estar codificado por una secuencia de polinucleótidos que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 1 o un fragmento o variante funcional del mismo. Además, la SalAT puede codificarse en algunos casos por un polinucleótido capaz de hibridarse en condiciones al menos moderadamente estrictas con un polinucleótido (p. ej., SEQ ID NO. 1) que codifica un polipéptido SalAT. En algunos casos, la SalAT puede comprender una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 2.

[0081] El polipéptido SalR puede estar codificado por una secuencia de polinucleótidos que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 3 o un fragmento o variante funcional del mismo. Además, el SalR puede codificarse en algunos casos por un polinucleótido capaz de hibridarse en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier polinucleótido (p. ej., SEQ ID NO. 3) que codifica un polipéptido SalR. En algunos casos, el polipéptido SalR puede comprender una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 4.

[0082] La célula modificada genéticamente también puede comprender uno o más ácidos nucleicos que codifican una enzima capaz de catalizar una o más de las reacciones:

a) un azúcar a L-tirosina;

b) L-tirosina a L-DOPA;

c) L-DOPA a Dopamina;

d) Dopamina a (SJ-Norcoclaurina;

e) (SJ-Norcoclaurina a (S)/(R)-Reticulina;

f) (R)-Reticulina a Salutardina;

g) Salutardina a Salutaridinol;

h) Salutaridinol a Salutaridinol-7-O-acetato; o

i) tebaína a oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona, buprenorfina o cualquier combinación de los mismos.

[0083] Dependiendo del sustrato utilizado, cualquiera de los productos de la ruta puede obtenerse aumentando o disminuyendo la expresión de las enzimas que promueven la formación del producto deseado.

[0084] La célula modificada genéticamente también puede promover una o más enzimas (en algunos casos, enzimas heterólogas), incluidas, entre otras, tirosina hidroxilasa (TYR); DOPA descarboxilasa (DODC); norcoclaurina sintasa (NCS); 6-O-Metiltransferasa (6OMT); coclaurina W-metiltransferasa (CNMT), citocromo P450 W-metilcoclaurina hidroxilasa (NMCH) y 4-O-metiltransferasa (4OMT); citocromo P450 reductasa (CPR), salutaridina sintasa (SAS); salutaridina reductasa (SalR); salutaridinol-7-O-acetiltransferasa (SalAT); permeasa de purina (PUP); o cualquier combinación de los mismos. Además, para formar un BIA, tal como alcaloides de tebaína o morfinano, el contacto del producto debe ponerse en contacto con un polipéptido de síntesis de tebaína; una codeína O-desmetilasa (CODM); una tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); una codeinona reductasa (COR); o cualquier combinación de los mismos.

[0085] La expresión (o sobreexpresión) del polipéptido de síntesis de tebaína en ciertas células puede conducir a una mayor producción de BIA, como la tebaína. Además, la expresión de otras enzimas dentro de la vía azúcar ^ BIA puede resultar en una mayor producción de BIA, como la tebaína. Por ejemplo, la expresión (o sobreexpresión) de permeasa de purina en ciertas células puede conducir a una mayor producción de BIA, como la tebaína.

[0086] Los fragmentos, incluidos los fragmentos funcionales, de cualquiera y todos los polipéptidos descritos aquí, se contemplan aquí, incluso sin mencionar directamente los fragmentos de los polipéptidos. Por ejemplo, se contemplan fragmentos de polipéptidos de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina.

Polinucleótidos útiles para hacer BIA

[0087] El polinucleótido que codifica el polipéptido sintético de tebaína o cualquier enzima descrita en el presente documento puede unirse a un polinucleótido capaz de controlar la expresión del polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina (u otra enzima) en una célula. Un polinucleótido quimérico que comprende como componentes unidos operativamente: (a) uno o más polinucleótidos capaces de controlar la expresión en una célula huésped; y (b) se puede usar un polinucleótido que codifica un polipéptido sintético de tebaína y/o permeasa de purina (u otras enzimas) para expresar el polipéptido/enzima deseado.

[0088] Los polinucleótidos capaces de controlar la expresión en las células huésped que se pueden usar aquí incluyen cualquier promotor transcripcional capaz de controlar la expresión de polipéptidos en las células huésped. Generalmente, los promotores obtenidos de células bacterianas se utilizan cuando se selecciona un huésped bacteriano de acuerdo con esto, mientras que un promotor fúngico se utiliza cuando se selecciona un huésped fúngico, un promotor vegetal se utiliza cuando se selecciona una célula vegetal, y así sucesivamente. Otros elementos de polinucleótidos capaces de controlar la expresión en una célula huésped incluyen terminadores transcripcionales, potenciadores y similares, todos los cuales pueden incluirse en las moléculas de polinucleótidos (incluidos los polinucleótidos quiméricos) descritas en el presente documento. Un experto en la materia entendería que la unión operable de secuencias de polinucleótidos puede incluir la unión de promotores y secuencias capaces de controlar la expresión a secuencias codificantes en la dirección de transcripción de 5' a 3'.

[0089] Las moléculas de polinucleótidos descritas en el presente documento pueden integrarse en un vector de expresión recombinante que asegura una buena expresión en la célula huésped. Por ejemplo, los polinucleótidos del presente documento pueden comprender uno o más polinucleótidos capaces de controlar la expresión en una célula huésped y pueden unirse posteriormente a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido sintético de tebaína y/o permeasa de purina (u otra secuencia que codifica una enzima deseada). Estos vectores pueden integrarse de manera estable en el genoma de una célula deseada o simplemente transfectarse sin ninguna integración.

[0090] También se describe un vector de expresión de polinucleótidos recombinantes que comprende como componentes unidos operativamente: (a) uno o más polinucleótidos capaces de controlar la expresión en una célula huésped; y (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido sintético de tebaína y/o permeasa de purina, en el que el vector de expresión es adecuado para la expresión en una célula huésped. El término “adecuado para la expresión en una célula huésped” puede significar que el vector de expresión del polinucleótido recombinante comprende la molécula de polinucleótido quimérico unida a los elementos genéticos necesarios para lograr la expresión en una célula huésped.

[0091] Los elementos genéticos que se pueden incluir en el vector de expresión incluyen una región de terminación transcripcional, uno o más polinucleótidos que codifican genes marcadores, uno o más orígenes de replicación y similares. El vector de expresión también puede comprender elementos genéticos necesarios para la integración del vector o una parte del mismo en el genoma de la célula huésped. Por ejemplo, si se usa una célula huésped vegetal, se pueden usar las secuencias de los bordes izquierdo y derecho del T-ADN que facilitan la integración en el genoma nuclear de la planta.

[0092] El vector de expresión recombinante puede contener además un gen marcador. Genes marcadores que pueden usarse e incluirse en todos los genes que permiten distinguir las células transformadas de las células no transformadas, incluidos los genes marcadores seleccionables y detectables. Un gen marcador puede ser un marcador de resistencia tal como un marcador de resistencia a antibióticos contra, por ejemplo, kanamicina o ampicilina. Marcadores detectables que pueden emplearse para identificar transformantes a través de La inspección incluye p-glucuronidasa (GUS) (ver, por ejemplo, Pat. de EE. UU. Nos 5,268,463 y 5,599,670) y proteína verde fluorescente (GFP) (ver, por ejemplo, Niedz et al., 1995, Plant Cell Rep., 14: 403).

[0093] La preparación de los vectores puede llevarse a cabo usando técnicas comúnmente conocidas como digestión por restricción, ligadura, electroforesis en gel, secuenciación de ADN, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras metodologías. Se encuentra disponible una amplia variedad de vectores de clonación para realizar los pasos necesarios requeridos para preparar un vector de expresión recombinante. Entre los vectores con un sistema de replicación funcional en bacterias como E. coli se encuentran vectores como pBR322, la serie de vectores pUC, la serie de vectores M13 mp, pBluescript, etc. Normalmente, estos vectores de clonación contienen un marcador que permite la selección de células transformadas. Pueden introducirse polinucleótidos en estos vectores, y los vectores pueden introducirse en la célula huésped mediante la preparación de células competentes, electroporación o utilizando otras metodologías. La célula huésped puede cultivarse en un medio apropiado que incluye, entre otros, medio Luria-Broth, medio modificado con águila dulbecco (DMEM) u Opti-mem, y posteriormente recolectarse. Los vectores de expresión recombinantes se pueden recuperar de las células tras la recolección y lisis de las células. Además, puede encontrarse orientación general con respecto a la preparación de vectores recombinantes y el crecimiento de organismos recombinantes, por ejemplo, en: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, tercera edición.

Modificación de la expresión génica endógena

[0094] Las células modificadas genéticamente descritas en el presente documento pueden tener regulados sus genes endógenos. Esto puede ser útil, por ejemplo, cuando hay una respuesta negativa a la expresión de un polipéptido deseado, como un polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina. La modificación de este regulador negativo puede conducir a una mayor expresión de un polipéptido deseado.

[0095] Por lo tanto, aquí se describe un método para modificar la expresión de secuencias de polinucleótidos en una célula que expresa naturalmente un polipéptido deseado, comprendiendo el método: (a) proporcionar una célula que expresa naturalmente un polipéptido deseado; (b) mutagenizar la célula; (c) hacer crecer la célula para obtener una pluralidad de células; y (d) determinar si la pluralidad de células comprende una célula con niveles modulados del polipéptido deseado. En algunos casos, el polipéptido deseado es un polipéptido de síntesis de tebaína. En algunos casos, el polipéptido deseado es una permeasa de purina. En otros casos, el polipéptido deseado es una enzima que puede realizar cualquiera de las siguientes reacciones: i) azúcar a l-tirosina; ii) l-tirosina a l-DOPA; iii) l-DOPA a dopamina; iv) dopamina a (S)-norcoclaurina; v) (S)-norcoclaurina a (S)/(R)-reticulina; vi) (R)-reticulina a salutardina; vii) salutardina a salutaridinol; viii) salutaridinol a salutaridinol-7-O-acetato; ix) salutaridinol-7-O-acetato a tebaína; x) tebaína a oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona y/o buprenorfina.

[0096] El método puede comprender además seleccionar una célula que comprenda niveles modulados del polipéptido deseado y hacer crecer dicha célula para obtener una pluralidad de células.

[0097] En algunos casos, se desea la disminución de la expresión del polipéptido de síntesis de tebaína. Por ejemplo, un polipéptido de síntesis de tebaína endógeno puede silenciarse o anularse. Los polinucleótidos que codifican el polipéptido de síntesis de tebaína pueden usarse para producir una célula que tiene niveles modificados de expresión de un polipéptido deseado mediante silenciamiento génico. Por ejemplo, en el presente documento se describe un método para reducir la expresión del polipéptido de síntesis de tebaína en una célula, que comprende: (a) proporcionar una célula que expresa un polipéptido deseado; y (b) silenciar la expresión del polipéptido deseado en la célula. En algunos casos, el polipéptido deseado puede ser un polipéptido de síntesis de tebaína.

[0098] En algunos casos, se desea una expresión disminuida de una permeasa de purina. Por ejemplo, una permeasa de purina endógena puede silenciarse o anularse. Los polinucleótidos que codifican permeasa de purina se pueden usar para producir una célula que tiene niveles modificados de expresión de un polipéptido deseado mediante silenciamiento génico. Por ejemplo, en el presente documento se describe un método para reducir la expresión de permeasa de purina en una célula, que comprende: (a) proporcionar una célula que exprese un polipéptido deseado; y (b) silenciar la expresión del polipéptido deseado en la célula. En algunos casos, el polipéptido deseado puede ser una permeasa de purina.

[0099] La modificación de la expresión de genes endógenos puede lograrse de diversas formas. Por ejemplo, pueden usarse enfoques antisentido o de interferencia de ARN para regular a la baja la expresión de los polinucleótidos de la presente divulgación, por ejemplo, como un mecanismo adicional para modular el fenotipo celular. Es decir, pueden usarse secuencias antisentido de los polinucleótidos de la presente descripción, o subsecuencias de las mismas, para bloquear la expresión de secuencias de polinucleótidos homólogas de origen natural. En particular, las construcciones que comprenden una secuencia codificante de un polipéptido deseado, incluidos fragmentos de la misma, en orientación antisentido, o combinaciones de orientación sentido y antisentido, pueden usarse para disminuir o eliminar eficazmente la expresión del polipéptido deseado en una célula o planta y obtener una mejora. en la vida útil como se describe en este documento. En consecuencia, esto puede usarse para “desactivar” el polipéptido deseado o secuencias homólogas del mismo. Puede usarse una variedad de tecnologías sentido y antisentido, por ejemplo, como se establece en Lichtenstein y Nellen (Antisense Technology: A Practical Approach IRL Press en la Universidad de Oxford, Oxford, Inglaterra, 1997). Se pueden introducir polinucleótidos con sentido o antisentido en una célula, donde se transcriben. Dichos polinucleótidos pueden incluir tanto secuencias de oligonucleótidos simples como secuencias catalíticas tales como ribozimas.

[0100] Otros métodos para una expresión de reducción o eliminación (es decir, un “knock-out” o “knock-down”) de un polipéptido deseado (por ejemplo, polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina) en una célula o planta transgénica se puede realizar mediante la introducción de una construcción que expresa un antisentido de la hebra codificante del polipéptido deseado o un fragmento de la misma. Para la supresión antisentido, el ADNc polipeptídico deseado o fragmento del mismo se dispone en orientación inversa (con respecto a la secuencia codificante) en relación con la secuencia promotora en el vector de expresión. Además, no es necesario que la secuencia introducida siempre corresponda al gen o ADNc de longitud completa, y no es necesario que sea idéntica al gen o ADNc que se encuentra en la célula o planta que se va a transformar.

[0101] Además, la secuencia antisentido solo necesita ser capaz de hibridarse con el gen objetivo o el ARN de interés. Por lo tanto, cuando la secuencia de polinucleótidos introducida es de menor longitud, se necesitará un mayor grado de homología con la secuencia del factor de transcripción endógeno para una supresión antisentido eficaz. Aunque pueden utilizarse secuencias antisentido de varias longitudes, en algunas formas de realización, la secuencia de polinucleótidos antisentido introducida en el vector tiene una longitud de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 100 o más nucleótidos en ciertas formas de realización. La transcripción de una construcción antisentido como se describe da como resultado la producción de moléculas de ARN que comprenden una secuencia que es el complemento inverso de las moléculas de ARNm transcritas a partir del gen endógeno a reprimir.

[0102] Se pueden realizar otros métodos para reducir o eliminar la expresión mediante la introducción de una construcción que exprese ARNip que se dirija a un polipéptido deseado (p. ej., polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina). En determinadas formas de realización, los ARNpi son ^aRⁿde doble cadena (ARNbc) cortos (de 20 a 24 pb) con extremos 5' fosforilados y extremos 3' hidroxilados con dos nucleótidos salientes.

[0103] Se pueden realizar otros métodos para reducir o eliminar la expresión mediante mutagénesis por inserción usando el T-ADN de Agrobacterium tumefaciens o un casete marcador de selección o cualquier otro fragmento de ADN sin sentido. Después de generar los mutantes de inserción, los mutantes pueden seleccionarse para identificar aquellos que contienen la inserción en el gen del polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina (u otro polipéptido deseado). Las plantas que contienen uno o más eventos de inserción de transgén en el gen deseado pueden cruzarse para generar una planta homocigota para la mutación, como se describe en Koncz et al., (Methods in Arabidopsis Research; World Scientific, 1992).

[0104] La supresión de la expresión génica también puede lograrse utilizando una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen actividad endoribonucleasa altamente específica. La producción y el uso de ribozimas se describen en las patentes de EE. UU. N° 4.987.071 y Patente de EE. UU. N° 5.543.508. Las secuencias de ribozimas sintéticas que incluyen ARN antisentido se pueden usar para conferir actividad de escisión de ARN en el ARN antisentido, de modo que las moléculas de ARNm endógeno que se hibridan con el ARN antisentido se escinden, lo que a su vez conduce a una inhibición antisentido mejorada de la expresión génica endógena.

[0105] También se puede modificar un gen de una célula o planta usando el sistema Cre-lox (por ejemplo, como se describe en la Patente de EE. UU. N° 5.658.772). Un genoma celular o vegetal puede modificarse para incluir un primer y segundo sitio lox que luego se ponen en contacto con una recombinasa Cre. Si los sitios lox están en la misma orientación, se escinde la secuencia de ADN intermedia entre los dos sitios. Si los sitios lox están en la orientación opuesta, la secuencia intermedia se invierte.

[0106] Además, el enfoque de silenciamiento que usa el sistema de ARN de horquilla corta (ARNhc), y el ARN CRISPR maduro complementario (crARN) por el sistema CRISPR/Cas, y el sistema de silenciamiento génico inductor de virus (VIGS) también se puede usar para producir mutantes de sintasa regulados negativamente o eliminados. Los enfoques negativos dominantes también se pueden usar para producir polipéptidos deseados regulados negativamente o desactivados.

[0107] La endonucleasa guiada por ARN se puede derivar de un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente intercaladas (CRISPR)/asociado a CRISPR (Cas). El sistema CRISPR/Cas puede ser un sistema de tipo I, tipo II o tipo III. Los ejemplos no limitantes de proteínas CRISPR/Cas adecuadas incluyen Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (o CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8al, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, CaslO, CaslOd, CasF, CasG, CasH, Csyl, Csy2, Csy3, Csel (o CasA), Cse2 (o CasB), Cse3 (o CasE), Cse4 (o CasC), Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, CsxlO, Csxl6, CsaX, Csx3, Cszl, Csxl5, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 y Cul966.

[0108] En general, las proteínas CRISPR/Cas comprenden al menos un dominio de reconocimiento de ARN y/o unión de ARN. Los dominios de reconocimiento de ARN y/o unión de ARN interactúan con los ARN guía. Las proteínas CRISPR/Cas también pueden comprender dominios de nucleasa (es decir, dominios de DNasa o RNasa), dominios de unión a ADN, dominios de helicasa, dominios de RNAsa, dominios de interacción proteína-proteína, dominios de dimerización, así como otros dominios.

[0109] La proteína similar a CRISPR/Cas puede ser una proteína CRISPR/Cas de tipo salvaje, una proteína CRISPR/Cas modificada o un fragmento de una proteína CRISPR/Cas de tipo salvaje o modificada. La proteína similar a CRISPR/Cas se puede modificar para aumentar la afinidad y/o la especificidad de unión del ácido nucleico, alterar la actividad de una enzima y/o cambiar otra propiedad de la proteína. Por ejemplo, los dominios de nucleasa (es decir, DNasa, RNasa) de la proteína similar a CRISPR/Cas pueden modificarse, eliminarse o inactivarse. Como alternativa, la proteína similar a CRISPR/Cas se puede truncar para eliminar los dominios que no son esenciales para la función de la proteína de fusión. La proteína similar a CRISPR/Cas también se puede truncar o modificar para optimizar la actividad del dominio efector de la proteína de fusión.

[0110] Un método para silenciar un gen deseado (o un polipéptido de síntesis de tebaína y/o un gen de permeasa de purina) es el silenciamiento génico inducido por virus (conocido en la técnica como VIGS). En general, en plantas infectadas con virus no modificados, el objetivo es el genoma viral. Sin embargo, cuando los vectores virales han sido modificados para transportar insertos derivados de genes del huésped (p. ej., porciones de secuencias que codifican un polipéptido deseado, como el polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina), el proceso se dirige adicionalmente contra los ARNm correspondientes. Por lo tanto, se describe un método para producir una planta que expresa niveles reducidos de un gen deseado (como el polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina) u otro(s) gen(es) deseado(s), comprendiendo el método (a) proporcionar una planta que exprese un gen deseado (por ejemplo, un polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina); y (b) reducir la expresión del gen deseado en la planta usando silenciamiento génico inducido por virus.

Tipos de células

[0111] Las células que se pueden utilizar son hongos, levaduras o bacterias. Por ejemplo, la célula puede ser Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica o Escherichia coli.

[0112] En ciertos casos, las células vivas son células que no son naturalmente capaces de producir tebaína (u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano). En algunos casos, las células pueden producir BIA, como la tebaína, pero a un nivel bajo. Mediante la implementación de los métodos descritos en el presente documento, las células pueden modificarse de modo que el nivel de tebaína en las células sea mayor en relación con el nivel de tebaína producido en las células no modificadas. Esto también puede permitir que las células produzcan niveles más altos de otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano.

[0113] Los niveles de tebaína en las células modificadas pueden ser más altos que los niveles de tebaína en las células no modificadas.

[0114] Las células modificadas genéticamente en algunos casos son incapaces de producir un alcaloide de morfinano de sustrato, y el alcaloide de morfinano de sustrato se proporciona a las células como parte del medio de crecimiento celular. En este caso, la célula modificada genéticamente puede procesar el alcaloide de morfinano de sustrato en un producto deseado como tebaína u otro BIA.

[0115] La célula modificada genéticamente en algunos casos produce un alcaloide de morfinano de sustrato cuando se le suministra exógenamente un sustrato de base, por ejemplo, suministrado en un medio de cultivo de células huésped. En algunos casos, la célula es capaz de producir sustrato alcaloide morfinano (o capaz de producir tebaína u otros BIA) solo si se incluye un sustrato base en el medio de cultivo de la célula huésped.

[0116] La célula modificada genéticamente puede comprender una o más enzimas capaces de catalizar una o más de las reacciones: un azúcar a L-tirosina; L-tirosina a L-DOPA; L-DOPA a Dopamina; Dopamina a (S)-Norcoclaurina; (S)-Norcoclaurina a (S)/(R)-Reticulina; (R)-Reticulina a Salutardina; Salutardina a Salutaridinol; o Salutaridinol a Salutaridinol-7-O-acetato.

Niveles de producción de BIA

[0117] Las modificaciones genéticas a las células descritas a lo largo se pueden hacer para producir BIA (por ejemplo, tebaína) sobre lo que se habría hecho sin ninguna modificación genética. Por ejemplo, en comparación con una célula no alterada genéticamente, las células modificadas genéticamente descritas en este documento pueden producir BIA superiores a 1,1 veces (en comparación con los niveles de producción de una célula no modificada genéticamente). En algunos casos, las células genéticamente modificadas descritas a lo largo pueden producir BIA superiores a 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2.0; 2,5; 3,0; 3,5; 4.0; 4,5; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5; 20,0; 25,0; 30,0; 50,0; 75,0; o 100,0 veces en comparación con el nivel de producción de una célula no modificada genéticamente.

[0118] En algunos casos, el BIA puede ser tebaína. En otros casos, el BIA puede ser otro BIA descrito en este documento, como oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona, buprenorfina o cualquier combinación de los mismos.

Métodos para hacer BIA (o alcaloide morfinano, por ejemplo, tebaína)

[0119] Las células modificadas genéticamente descritas en todo el documento se pueden usar para producir BIA, incluidos los alcaloides de morfinano, por ejemplo, la tebaína. Un alcaloide de morfinano de sustrato puede ponerse en contacto con un polipéptido de síntesis de tebaína en una mezcla de reacción en condiciones de reacción que permitan una reacción mediada por el polipéptido de síntesis de tebaína que dé como resultado la conversión del alcaloide de morfinano de sustrato en tebaína u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano, en condiciones de reacción in vivo. Bajo tales condiciones de reacción in vivo, las células vivas se modifican de tal manera que producen alcaloides de morfinano, por ejemplo, tebaína u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano. Además, una permeasa de purina puede estar presente dentro de las células para aumentar los títulos generales de producción de tebaína.

[0120] Los BIA (alcaloides de morfinano, por ejemplo, tebaína) producidos pueden recuperarse y aislarse de las células modificadas. Los BIA (alcaloides de morfinano, por ejemplo, tebaína) en algunos casos pueden secretarse en el medio de un cultivo celular, en el que el BIA se extrae directamente del medio. En algunos casos, el BIA puede estar dentro de la propia célula y será necesario lisar las células para recuperar el BIA. En algunos casos, ambos casos pueden ser ciertos, donde se secretan algunos BIA y algunos permanecen dentro de las células. En este caso, se puede utilizar cualquiera de los métodos o ambos métodos.

[0121] En consecuencia, un método para preparar una tebaína (u otros BIA), el método puede comprender: (a) proporcionar un polinucleótido quimérico que comprende como componentes unidos operativamente: (i) un polinucleótido que codifica una síntesis de polipéptido de tebaína; (ii) uno o más polinucleótidos capaces de controlar la expresión en una célula huésped; (b) introducir el polinucleótido quimérico en una célula huésped que produce de forma endógena o se le suministra de forma exógena un alcaloide de morfinano de sustrato; y (c) hacer crecer la célula huésped para producir el polipéptido de síntesis de tebaína y tebaína. La célula también puede comprender además una permeasa de purina. El método puede comprender además la recuperación de tebaína de la célula huésped.

[0122] El sustrato que se puede usar en estos métodos puede ser un alcaloide de morfinano de sustrato. El sustrato alcaloide de morfinano puede ser salutaridina, salutaridinol, 7-O-acetato de salutaridinol o cualquier combinación de los mismos.

[0123] En algunos casos, las células huésped pueden ser capaces de producir un alcaloide de morfinano de sustrato, que incluye salutaridina, salutaridinol, 7-O-acetato de salutaridinol o cualquier combinación de los mismos. Si la célula huésped no puede producir un alcaloide de morfinano de sustrato, los alcaloides de morfinano de sustrato, incluidos salutaridina, salutaridinol y/o 7-O-acetato de salutaridinol, se suministran exógenamente a las células huésped para producir un BIA.

[0124] El método para producir una BIA (tebaína) puede comprender: (a) proporcionar un medio de cultivo de células huésped que comprende un sustrato base; (b) proporcionar una célula huésped capaz de (i) producir un polipéptido de síntesis de tebaína; y (ii) metabolizar el sustrato base para formar un alcaloide de morfinano de sustrato; y (c) hacer crecer la célula huésped en el medio de crecimiento en condiciones que permitan una reacción química mediada por un polipéptido de síntesis de tebaína que da como resultado la conversión del sustrato alcaloide morfinano para formar tebaína. Además, después de (ii), el método puede incluir la producción de un alcaloide de morfinano derivado de tebaína mediante la conversión de tebaína. En algunos casos, el método puede incluir además el aislamiento del derivado alcaloide de morfinano de la tebaína del cultivo de células huésped. En algunos casos, las células utilizadas en el método pueden comprender una permeasa de purina.

[0125] Los polipéptidos de síntesis de tebaína pueden usarse además para producir tebaína u otro alcaloide de morfinano diana o un derivado de alcaloide de morfinano de tebaína usando procesos que implican el crecimiento de una célula huésped que comprende los polipéptidos de síntesis de tebaína en un medio de crecimiento que comprende un sustrato base. Por lo tanto, en el presente documento se describe un método para usar un polipéptido de síntesis de tebaína para producir tebaína, alcaloide de morfinano o derivado de alcaloide de morfinano de tebaína, en una célula cultivada en un medio de crecimiento que comprende un sustrato base, en el que la célula comprende el polipéptido de síntesis de tebaína. En algún caso, la célula puede comprender una permeasa de purina.

[0126] El sustrato base utilizado en los métodos para hacer un BIA puede ser un azúcar. Por ejemplo, el azúcar puede incluir, entre otros, glucosa, fructosa, galactosa, manosa o cualquier combinación de los mismos. El sustrato base también puede ser un compuesto precursor de un alcaloide de sustrato morfinano que incluye, sin limitación, glicerol, L-tirosina, tiramina, L-3,4-dihidroxifenil alanina (L-DOPA), dopamina o cualquier combinación de los mismos.

[0127] Los métodos descritos en este documento pueden producir un alcaloide de morfinano derivado de la tebaína. Para mayor claridad, estos derivados alcaloides de morfinano de la tebaína también son BIA y pueden incluir, entre otros, oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona, buprenorfina o cualquier combinación de los mismos.

[0128] La inclusión de polipéptidos de síntesis de tebaína (y/o permeasa de purina) en mezclas de reacción que comprenden un sustrato de alcaloide de morfinano puede conducir a evitar sustancialmente la síntesis de subproductos de alcaloides de morfinano, que en ausencia de un polipéptido de síntesis de tebaína (y/o permeasa de purina) puede acumularse a expensas de la tebaína u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano. Según el conocimiento de los inventores, la divulgación actual proporciona, por primera vez, una metodología para usar técnicas recombinantes para fabricar BIA, tebaína u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano a través de un proceso que implica el uso de polipéptidos de síntesis de tebaína (y/o permeasa de purina). Las metodologías y composiciones del presente documento permiten la síntesis de BIA, tebaína u otros alcaloides de morfinano objetivo o derivados de alcaloides de morfinano, a niveles comerciales, usando células que normalmente no son capaces de sintetizar BIA, tebaína u otros alcaloides de morfinano objetivo o derivados de alcaloides de morfinano. Dichas células se pueden usar como fuente de BIA, tebaína u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano y eventualmente se pueden extraer económicamente de las propias células o de los medios de cultivo. Los BIA, tebaína u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano producidos pueden ser útiles, entre otros, en la producción de composiciones farmacéuticas.

[0129] En el presente documento también se describe un método para preparar un alcaloide de morfinano derivado de la tebaína. Este método se puede realizar proporcionando un alcaloide de morfinano de sustrato y luego poniendo en contacto el alcaloide de morfinano de sustrato con un polipéptido de síntesis de tebaína en una mezcla de reacción en condiciones de reacción que permitan primero una reacción química mediada por un polipéptido de síntesis de tebaína. Esta reacción da como resultado la conversión del sustrato alcaloide morfinano en tebaína. Si se desea, al menos una reacción química adicional puede dar como resultado la conversión de tebaína en un alcaloide morfinano derivado de la tebaína. La reacción adicional puede estar mediada por un polipéptido.

[0130] Para convertir el sustrato alcaloide morfinano en tebaína, el sustrato alcaloide morfinano se pone en contacto con un polipéptido de síntesis de tebaína en condiciones de reacción que permiten la conversión del sustrato alcaloide morfinano en tebaína. En algunos casos, se puede usar más de un polipéptido de síntesis de tebaína, por ejemplo, se puede usar uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más de los polipéptidos de síntesis de tebaína o cualquiera de sus variantes funcionales o fragmentos. En algunos casos, se puede usar una permeasa de purina junto con el polipéptido de síntesis de tebaína para aumentar los títulos de tebaína. En algunos casos, se pueden usar más permeasas de purina, por ejemplo, se pueden usar una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más de las permeasas de purina o cualquier variante funcional o fragmentos de las mismas.

[0131] Las condiciones de reacción pueden ser una condición de reacción que permita la conversión de un sustrato en un producto deseado. Las condiciones de reacción pueden incluir condiciones in vivo o in vitro, como se detalla más adelante. El polipéptido de síntesis de tebaína y otras enzimas opcionales tales como los polipéptidos permeasa de purina, SalAT y SalR se proporcionan en cantidades catalíticas. Las condiciones de reacción pueden incluir además la presencia de agua y agentes tamponantes. La reacción se puede llevar a cabo a pH neutro o pH ácido o básico suave (desde aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 9,5). Además, se pueden incluir otros aditivos en una mezcla de reacción, como cofactores como NADPH y acetil-CoA. En particular, las mezclas de reacción que comprenden SalAT comprenden además acetil-CoA, y las mezclas de reacción que comprenden SalR comprenden además NADPH.

[0132] El alcaloide de sustrato morfinano se puede convertir en tebaína a través de uno o más compuestos alcaloides de morfinano intermedios. En algunos casos, el alcaloide de morfinano de sustrato puede ser salutaridinol y el compuesto intermedio de alcaloide de morfinano puede ser 7-O-acetato de salutaridinol. En otros casos, el alcaloide de morfinano de sustrato puede ser salutaridina y los compuestos alcaloides de morfinano intermedios pueden ser salutaridinol y salutaridinol 7-O-acetato.

[0133] El período de tiempo durante el cual existe un alcaloide de morfinano de sustrato y un compuesto de morfinano de alcaloide intermedio, una vez iniciada la reacción, puede variar y puede depender de las condiciones de reacción seleccionadas. Además, se puede formar un equilibrio entre el alcaloide de morfinano de sustrato y la tebaína, o el alcaloide de morfinano o el derivado de alcaloide de morfinano, así como los compuestos alcaloides de morfinano intermedios opcionales, donde la reacción puede comprender diversas cantidades del compuesto de alcaloide de morfinano y tebaína, o alcaloide de morfinano o derivado de alcaloide de morfinano y, opcionalmente, uno o más compuestos alcaloides de morfinano intermedios. Las cantidades relativas de cada uno de estos compuestos pueden variar dependiendo de las condiciones de reacción seleccionadas. En general, de acuerdo con la presente, la cantidad de tebaína, o alcaloide de morfinano o derivado de alcaloide de morfinano, una vez completada sustancialmente la reacción, presente en la mezcla de reacción es de al menos 50 % (p/p), al menos 60 % (p/p). p), al menos el 70 % (p/p), al menos el 80 % (p/p), al menos el 90 % (p/p), al menos el 95 % (p/p) o al menos el 99 % (p/p) de los compuestos alcaloides de morfinano totales en la mezcla de reacción.

[0134] En general, la presencia del polipéptido de síntesis de tebaína en la mezcla de reacción da como resultado una conversión más eficaz del sustrato alcaloide de morfinano, es decir, cuando se compara la conversión de un sustrato de alcaloide de morfinano en una primera mezcla de reacción que comprende un polipéptido de síntesis de tebaína, con la conversión en una segunda mezcla de reacción idéntica a la primera mezcla de reacción, pero por la presencia de un polipéptido de síntesis de tebaína en ella, la conversión del compuesto alcaloide de morfinano de sustrato en tebaína se produce de una manera más eficaz en la primera mezcla de reacción. Además, la presencia de una permeasa de purina en la mezcla de reacción da como resultado una conversión más eficiente del sustrato alcaloide morfinano en un BIA, como la tebaína. A este respecto, una conversión se considera “más eficiente” si se obtienen mayores cantidades de tebaína en la mezcla de reacción al completarse sustancialmente la reacción, y/o si la tebaína se acumula en la mezcla de reacción a una velocidad más rápida. Así, por ejemplo, en ciertos casos, en presencia de un polipéptido de síntesis de tebaína (y/o permeasa de purina), pocos o ningún producto de reacción de alcaloide de morfinano recién formado, aparte de la producción objetivo, como tebaína, alcaloides de morfinano o alcaloide de morfinano. derivados, se acumulan en la mezcla de reacción. En otros casos, se acumulan en la reacción pocos o ningún compuesto de alcaloides de morfinano recién formado, aparte de los productos objetivo como tebaína, alcaloides de morfinano o derivados de alcaloides de morfinano y los compuestos intermedios de alcaloides de morfinano salutaridinol y/o salutaridinol 7-O-acetato, acumulado en la mezcla de reacción.

[0135] Con referencia ahora a la FIG. 5, allí se muestra, a modo de ejemplo, que en algunas formas de realización, en ausencia de (-) en una mezcla de reacción del polipéptido de síntesis de tebaína (TS), los subproductos de alcaloides de morfinano m/z 330 (a) y m/z 330 (b) indicado en la FIG.5 pueden acumularse en dicha mezcla de reacción. Por el contrario, en presencia (+) del polipéptido de síntesis de tebaína (THS), se acumulan en la mezcla de reacción pocos alcaloides de morfinano distintos del alcaloide de morfinano medido y, en algunas formas de realización, salutaridinol y/o 7-O-acetato de salutaridinol, en particular, ningún componente sustantivo. cantidades de los productos b del alcaloide morfinano m/z 330 (a) y m/z 330 (b) indicados en la FIG. 5 se acumulan en la mezcla de reacción.

[0136] En algunos casos, una vez completada sustancialmente la reacción, la mezcla de reacción comprende tebaína, o alcaloide de morfinano o derivado de alcaloide de morfinano, en un porcentaje en peso de al menos 50 % (p/p), al menos 60 % (p/p), en al menos el 70 % (p/p), al menos el 80 % (p/p), al menos el 90 % (p/p), al menos el 95 % (p/p) o al menos el 99 % (p/p) de compuestos alcaloides de morfinano totales en la mezcla de reacción. En algunos otros casos, una vez completada sustancialmente la reacción, la mezcla de reacción comprende tebaína u otro alcaloide de morfinano diana o derivado de alcaloide de morfinano, salutaridinol y/o 7-O-acetato de salutaridinol, juntos en un porcentaje en peso de al menos 60 % (p/p), al menos 70 % (p/p), al menos 80 % (p/p), al menos 90 % (p/p), al menos 95 % (p/p), o al menos 99 % (p/p) de compuestos alcaloides de morfinano totales en la mezcla de reacción. En algunos casos, una vez completada sustancialmente la reacción, la mezcla de reacción comprende compuestos de alcaloides de morfinano distintos de la tebaína (u otro alcaloide de morfinano objetivo o derivado de alcaloide de morfinano), en un porcentaje en peso de menos del 25 % (p/p), menos del 20 % (p/p), menos del 15 % (p/p), menos del 10 % (p/p), menos del 5 % (p/p) o menos del 1 % (p/p) del total alcaloides de morfinano en la mezcla de reacción. En otros casos, una vez completada sustancialmente la reacción, la mezcla de reacción comprende compuestos de alcaloides de morfinano distintos de la tebaína, u otro alcaloide de morfinano diana o derivado de alcaloide de morfinano, salutaridinol y/o acetato de salutaridinol en un porcentaje en peso de menos del 15 % (p/p), menos del 10 % (p/p), menos del 5 % (p/p) o menos del 1 % (p/p) del total de alcaloides de morfinano en la mezcla de reacción. En algunos casos, tras la finalización sustancial de la reacción, la mezcla de reacción comprende compuestos alcaloides de morfinano m/z 330 (a) y/o m/z 330 (b) juntos en un porcentaje en peso inferior al 25 % (p/p), menos del 20 % (p/p), menos del 15 % (p/p), menos del 10 % (p/p), menos del 5 % (p/p) o menos del 1 % (p/p) w) de alcaloides de morfinano totales en la mezcla de reacción.

[0137] El polipéptido de síntesis de tebaína (y/o permeasa de purina) puede mediar en la conversión evitando la formación de productos de reacción, distintos de tebaína, o en algunas formas de realización, productos de reacción distintos de salutaridinol o salutaridinol 7-O-acateto, en la mezcla de reacción. y en particular evitando la formación de compuestos alcaloides de morfinano m/z 330 (a) y/o m/z 330 (b). Además, el polipéptido de síntesis de tebaína (y/o permeasa de purina) puede actuar evitando ciertas reacciones de oxidación, por ejemplo, oxidación por oxígeno molecular (O²) y/o oxidación por agua (H²O). En particular, el polipéptido de síntesis de tebaína (y/o permeasa de purina) puede actuar impidiendo la oxidación del átomo de carbono C⁵para formar el compuesto alcaloide morfinano m/z 330 (b), y/o impidiendo la oxidación del átomo de carbono C¹⁴para forman el compuesto alcaloide morfinano m/z 330 (a), a expensas de la formación de tebaína.

[0138] La tebaína, otro alcaloide de morfinano diana o derivado de alcaloide de morfinano formado a partir de los métodos descritos en el presente documento puede aislarse de la mezcla de reacción. Los métodos para el aislamiento de compuestos de morfinano se pueden seleccionar según se desee. Por ejemplo, la tebaína (u otro alcaloide de morfinano objetivo o derivado de alcaloide de morfinano) se puede aislar de mezclas acuosas utilizando una extracción líquido/líquido con tolueno (ver: solicitud de patente de EE. UU. N° 2002/0106761) o acetato de etilo o acetato de etilo (ver: Lenz, R. y Zenk MH, 1995, Eur. J. Biochem, 233, 132 - 139). Se pueden encontrar técnicas y guías adicionales para el aislamiento de tebaína de la mezcla de reacción, por ejemplo, en Hansen, S.H. J. Sep. Sci. (2009), 32 (5-6), 825-834; Patente de Estados Unidos 7.094.351; y en (Rinner, U. y Hudlicky, J., 2012 Top. Cur. Chem. 209: 33-66.

Niveles de producción BIA

[0139] Los métodos descritos a lo largo se pueden utilizar para producir BIA sobre lo que se habría hecho sin ninguna modificación genética. Por ejemplo, los métodos descritos a lo largo pueden producir BIA superiores a 1,1 veces (en comparación con los niveles de los métodos estándar, por ejemplo, métodos que no utilizan células modificadas genéticamente). En algunos casos, las células genéticamente modificadas descritas a lo largo pueden producir BIA superiores a 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2.0; 2,5; 3,0; 3,5; 4.0; 4,5; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5; 20,0; 25,0; 30,0; 50,0; 75,0; o 100,0 veces en comparación con los métodos estándar (incluidos los métodos que no utilizan células modificadas genéticamente).

[0140] En algunos casos, el BIA puede ser tebaína. En otros casos, el BIA puede ser oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona, buprenorfina o cualquier combinación de los mismos.

Otros métodos y usos

Mutagénesis

[0141] La mutagénesis se puede utilizar para crear células y plantas que comprendan polipéptidos mejorados. Los polipéptidos mejorados se pueden usar para aumentar la producción de BIA (o ciertos componentes dentro de la ruta BIA) a partir de células y plantas modificadas genéticamente.

[0142] Por ejemplo, pueden usarse células, tales como células de semillas de plantas, para realizar la mutagénesis. Los agentes mutagénicos que se pueden usar son agentes químicos, incluidos, entre otros, análogos de bases, agentes desaminantes, agentes alquilantes, agentes intercalantes, transposones, bromo, azida de sodio, metanosulfonato de etilo (EMS), así como agentes físicos, incluidos, entre otros, radiación., como la radiación ionizante y la radiación UV. Después de la mutagénesis de una célula, la actividad del polipéptido deseado (por ejemplo, un polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina) puede medirse y compararse con una célula que no fue mutagenizada.

[0143] Por ejemplo, el siguiente es un método para alterar la actividad de un polipéptido de síntesis de tebaína mediante mutagénesis de una planta de formación de semillas. El método para producir una planta que produce semillas puede comprender niveles modulados de expresión del polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina en una célula vegetal que expresa naturalmente el polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina, comprendiendo el método: (a) proporcionar una planta que produce semillas polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina que expresan naturalmente; (b) mutagenizar semillas de la planta para obtener semillas mutagenizadas; (c) hacer crecer la semilla mutagenizada en la siguiente generación de plantas mutagenizadas capaces de producir la semilla de la próxima generación; y (d) obtener la semilla de la próxima generación, u otra porción de las plantas mutagenizadas, y analizar si las plantas de la próxima generación o la semilla de la próxima generación exhibe expresión modulada del polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina.

[0144] El análisis de las células o plantas mutagenizadas se puede realizar de varias maneras. Después de obtener una pluralidad de generaciones de plantas y/o semillas, se pueden analizar las porciones de plantas y/o semillas obtenidas en cualquiera o en todas dichas generaciones. El análisis se puede realizar mediante la comparación de niveles de expresión de, por ejemplo, niveles de ARN o proteína, en plantas o semillas no mutagenizadas (de tipo salvaje), con niveles de expresión en plantas o semillas mutagenizadas. El análisis se puede realizar mediante el análisis de la formación de heterodúplex entre el ADN de tipo salvaje y el ADN mutado. En algunos casos, el análisis puede comprender: (i) extraer ADN de plantas mutadas; (ii) amplificar una porción del ADN que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina para obtener ADN mutado amplificado; (iii) extraer ADN de plantas de tipo salvaje; (iv) mezclar el ADN de plantas de tipo salvaje con el ADN mutado amplificado y formar un polinucleótido heterodúplex; (v) incubar el polinucleótido heterodúplex con una nucleasa de restricción monocatenaria capaz de restringir en una región del polinucleótido heterodúplex que no coincide; y (vi) determinar el sitio de desapareamiento en el polinucleótido heterodúplex.

[0145] Los métodos que modifican los niveles de expresión del polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina (u otro gen deseado) pueden dar como resultado modulaciones en los niveles de alcaloides de morfinano vegetal, en plantas que incluyen, entre otras, tebaína, oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona, buprenorfina o cualquier combinación de los mismos.

Genotipado

[0146] Los polinucleótidos que codifican el polipéptido de síntesis de tebaína y/o la permeasa de purina pueden usarse para genotipificar plantas. En general, el genotipado proporciona un medio para distinguir los homólogos de un par de cromosomas y puede usarse para identificar segregantes en generaciones posteriores de una población de plantas. Las metodologías de marcadores moleculares se pueden utilizar para estudios filogenéticos, caracterización de relaciones genéticas entre variedades de plantas, identificación de cruces o híbridos somáticos, localización de segmentos cromosómicos que afectan a rasgos monogénicos, clonación basada en mapas y estudio de herencia cuantitativa. Véase, por ejemplo, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Capítulo 7, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlín (1997). Para metodologías de marcadores moleculares, véase en general, The DNA Revolution por Andrew H. Paterson 1996 (Capítulo 2) en: Genome Mapping in Plants (ed. Andrew H. Paterson) por Academic Press/RG Landis Company, Austin, Tex., pp.

7-21. El método particular de determinación del genotipo de acuerdo con la descripción puede implicar el empleo de cualquier técnica analítica de marcadores moleculares que incluye, entre otros, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Los RFLP reflejan diferencias alélicas entre fragmentos de restricción de ADN causadas por la variabilidad de la secuencia de nucleótidos. Como saben los expertos en la técnica, los RFLP se detectan normalmente mediante extracción de ADN genómico de plantas y digestión del ADN genómico con una o más enzimas de restricción. Normalmente, los fragmentos resultantes se separan según el tamaño y se hibridan con una sonda de ácido nucleico. Se revelan fragmentos de restricción de cromosomas homólogos. Las diferencias en el tamaño de los fragmentos entre los alelos representan un RFLP. Por lo tanto, se describe un medio para seguir la segregación de una porción de ADN genómico que codifica polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina, así como polinucleótidos cromosómicos genéticamente unidos a estos polipéptidos de síntesis de tebaína y/o polinucleótidos que codifican permeasa de purina utilizando técnicas tales como análisis RFLP. Las secuencias nucleicas cromosómicas enlazadas están dentro de 50 centiMorgans (cM), a menudo dentro de 40 o 30 cM, preferiblemente dentro de 20 o 10 cM, más preferiblemente dentro de 5, 3, 2 o 1 cM de un polinucleótido genómico que codifica el polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina Por lo tanto, el polipéptido de síntesis de tebaína y/o la permeasa de purina codificada por secuencias de polinucleótidos pueden usarse como marcadores para evaluar en una población vegetal la segregación de polinucleótidos unidos genéticamente a la misma.

[0147] Algunas plantas que pueden ser útiles para el genotipado con el método descrito en este documento son plantas que pertenecen preferiblemente al género de plantas Papaver o a las especies de plantas Papaver bracteatum, Papaver somniferum, Papaver cylindricum, Papaver decaisnei, Papaver fugax, Papaver nudicale, Papaver oreophyllum, Papaver oriental, Papaver paeonifolium, Papaver persicum, Papaver pseudoorientate, Papaver rhoeas, Papaver rhopalothece, Papaver armeniacum, Papaver setigerum, Papaver tauricolum y Papaver triniaefolium.

[0148] Las sondas de polinucleótidos empleadas para el mapeo de marcadores moleculares de genomas nucleares de plantas pueden hibridarse selectivamente, en condiciones de hibridación selectiva, con una secuencia genómica que codifica un polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina (u otro gen de interés). Las sondas se pueden seleccionar de los polinucleótidos que codifican polipéptidos de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina descritos en el presente documento. En otras palabras, las sondas se pueden diseñar para que sean complementarias a al menos una parte de las secuencias de polinucleótidos descritas en el presente documento, por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos para el polipéptido de síntesis de tebaína (por ejemplo, SEQ ID NO. 19) y/o permeasa de purina (por ejemplo, cualquiera de las S^eQ ID NO 36, 38, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 o 64). En algunos casos, SEQ iD NO. 6, 31, 32, 35, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 y/o 63 pueden ser particularmente útiles para diseñar una sonda.

[0149] Las sondas pueden ser sondas de ADNc. Las sondas también pueden tener al menos 5, 6, 7, 8 o 9 bases de longitud, más preferiblemente al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o 100 bases de longitud. Generalmente, sin embargo, las sondas tienen menos de aproximadamente 1 kilobase de longitud. Por ejemplo, las sondas pueden tener una longitud de entre 10 pb y 30 pb. Las sondas pueden ser sondas de una sola copia que hibridan con un locus único en un complemento cromosómico vegetal haploide. En algunos casos, el polinucleótido es un cebador. Algunas enzimas de restricción ejemplares empleadas en el mapeo de RFLP son EcoRI, EcoRv y SstI. Como se usa en el presente documento, el término “enzima de restricción” incluye la referencia a una composición que reconoce y, sola o junto con otra composición, escinde un polinucleótido en una secuencia polinucleotídica específica.

[0150] Se pueden usar otros métodos para diferenciar variantes polimórficas (alélicas) de los polinucleótidos utilizando técnicas de marcadores moleculares, que incluyen, sin limitación: 1) análisis de conformación monocatenario (SSCP); 2) electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE); 3) ensayos de protección de RNasa; 4) oligonucleótidos específicos de alelo (ASO); 5) el uso de proteínas que reconocen desajustes de nucleótidos, tales como la proteína mutS de E. co li; y 6) PCR específica de alelo. Otros enfoques basados en la detección de desajustes entre las dos cadenas de ADN complementarias incluyen, sin limitación, electroforesis en gel desnaturalizante sujetado (CDGE); análisis heterodúplex (HA) y escisión de desajuste químico (CMC). Por lo tanto, se divulga un método de genotipado que comprende poner en contacto, en condiciones de hibridación estrictas, una muestra que se sospecha que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina (u otros genes interesados), con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse con la misma. Por ejemplo, una muestra puede comprender material vegetal, incluida una muestra sospechosa de comprender un polinucleótido de Papaver somniferum que codifica un polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina (p. ej., gen, ARNm). La sonda de polinucleótidos hibrida selectivamente, en condiciones estrictas, con una subsecuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina que comprende un marcador polimórfico. La hibridación selectiva de la sonda polinucleotídica con el polinucleótido marcador polimórfico produce un complejo de hibridación. La detección del complejo de hibridación indica la presencia de ese marcador polimórfico en la muestra. En formas de realización preferidas, la sonda polinucleotídica comprende una parte de un polinucleótido que codifica el polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina.

Síntesis in vitro de BIA

[0151] Los BIA descritos en este documento se pueden sintetizar fuera de una célula. Por ejemplo, una o más de las enzimas (p. ej., incluyendo el polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina) descritas en este documento pueden aislarse y colocarse en el medio fuera de una célula. Estas enzimas pueden luego catalizar la reacción de un sustrato a un producto fuera de la célula. En el caso del polipéptido de síntesis de tebaína, el sustrato a veces puede ser 7-O-acetato de salutaridinol y el producto puede ser tebaína.

Enzimas y otros componentes

[0152] Para la síntesis in vitro de un BIA (tal como tebaína), un método puede incluir poner en contacto in vitro un sustrato con una o más enzimas que pueden convertir el sustrato. La una o más enzimas pueden ser cualquiera de las siguientes: una tirosina hidroxilasa (TYR); DOPA descarboxilasa (DODC); norcoclaurina sintasa (NCS); 6-O-Metiltransferasa (6OMT); coclaurina W-metiltransferasa (CNMT), citocromo P450 W-metilcoclaurina hidroxilasa (NMCH) y 4-O-metiltransferasa (4OMT); citocromo P450 reductasa (CPR), salutaridina sintasa (SAS); salutaridina reductasa (SalR); salutaridinol-7-O-acetiltransferasa (SalAT); permeasa de purina (PUP); polipéptido de síntesis de tebaína (THS); una codeína O-desmetilasa (CODM); una tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); una codeinona reductasa (COR); o cualquier combinación de los mismos.

[0153] Las formas puras de las enzimas necesarias para este método pueden obtenerse aislando el polipéptido de ciertas fuentes que incluyen, sin limitación, las plantas. Por ejemplo, las plantas que se pueden usar incluyen plantas del género Papaver, o de especies de plantas tales como Papaver somniferum. Otras plantas pueden incluir, sin limitación, especies de plantas que pertenecen a las familias de plantas de Eupteleaceae, Lardizabalaceae, Circaeasteraceae, Menispermaceae, Berberidaceae, Ranunculaceae y Papaveraceae (incluidas las que pertenecen a las subfamilias de Pteridophylloideae, Papaveroideae y Fumarioideae) y además incluye plantas que pertenecen a la género Argemone, incluida Argemone mexicana (amapola espinosa mexicana), plantas pertenecientes al género Berberis, incluida Berberís thunbergii (agracejo japonés), plantas pertenecientes al género Chelidonium, incluida Chelidonium majus (Celidonia mayor), plantas pertenecientes al género Cissampelos, incluidas Cissampelos mucronata (Abuta), plantas pertenecientes al género Cocculus, incluyendo Cocculus trilobus (Korean Moonseed), plantas pertenecientes al género Corydalis, incluyendo Corydalis chelanthifolia (Ferny Fumewort), Corydalis cava; Corydalis ochotenis; Corydalis ophiocarpa; Corydalis platycarpa; Corydalis tuberosa; y Cordyalis bulbosa, plantas pertenecientes al género Eschscholzia, incluidas Eschscholzia californica (California Poppy), plantas pertenecientes al género Glaucium, incluidas Glaucium flavum (Yellowhorn Poppy), plantas pertenecientes al género Hydrastis, incluidas Hydrastis canadensis (Goldenseseal), plantas pertenecientes al género Jeffersonia, incluida Jeffersonia diphylla (raíz del reumatismo), plantas pertenecientes al género Mahonia, incluida Mahonia aquifolium (uva de Oregón), plantas pertenecientes al género Menispermum, incluida Menispermum canadense (Canadian Moonseed), plantas pertenecientes al género Nandina, incluyendo Nandina domestica (bambú sagrado), plantas pertenecientes al género Nigella, incluyendo Nigella sativa (comino negro), plantas pertenecientes al género Papaver, incluyendo Papaver bracteatum (adormidera persa), Papaver somniferum, Papaver cylindricum, Papaver decaisnei, Papaver fugax, Papaver nudicale, Papaver oreophyllum, Papaver orientale, Papaver paeonifolium, Papaver persicum, Papaver pseudo-orientale, Papaver rhoeas, Papaver rhopalothece, Papaver armeniacum, Papaver setigerum, Papaver tauricolum y Papaver triniaefolium, plantas pertenecientes al género Sanguinaria, incluida la Sanguinaria canadensis (Bloodroot), plantas pertenecientes al género Stylophorum, incluidas Stylophorum diphyllum (Celandine Poppy), plantas pertenecientes al género Thalictrum, incluidas Thalictrum flavum (Meadow Rue), plantas pertenecientes al género Tinospora, incluidas Tinospora cordifolia (Heartleaf Moonseed), plantas pertenecientes al género Xanthoriza, incluyendo Xanthoriza simplicissima (Yellowroot) y plantas pertenecientes al género Romeria incluyendo Romeria carica. Las enzimas de los métodos también se pueden preparar con técnicas recombinantes usando un polinucleótido que codifica las enzimas. Los polipéptidos de síntesis de tebaína expresados pueden recuperarse y usarse para preparar BIA in vitro. En el presente documento se describe un método para preparar un polipéptido de síntesis de tebaína, comprendiendo el método: (a) introducir en una célula huésped un polinucleótido heterólogo que comprende (i) polinucleótidos unidos operativamente que codifican un polipéptido de síntesis de tebaína; y (ii) uno o más polinucleótidos capaces de controlar la expresión en la célula huésped; (b) hacer crecer la célula huésped para producir el polipéptido de síntesis de tebaína; y (c) recuperar el polipéptido de síntesis de tebaína de la célula huésped. Un polinucleótido que codifica para un polipéptido de síntesis de tebaína se puede obtener de acuerdo con el presente documento, incluyendo, sin limitación, de las especies de plantas enumeradas anteriormente.

[0154] Además, una permeasa de purina se puede preparar de forma recombinante expresando una secuencia que es sustancialmente idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO. 35 a 64, derivados, fragmentos o variantes de los mismos. En una forma de realización preferida, una secuencia que es sustancialmente idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO. 35 a 64, se pueden expresar derivados, fragmentos o variantes para producir una permeasa de purina. La permeasa de purina expresada se puede recuperar y usar para hacer BIA in vitro. En el presente documento se describe un método para preparar una permeasa de purina, comprendiendo el método: (a) introducir en una célula huésped un polinucleótido heterólogo que comprende (i) polinucleótidos unidos operativamente que codifican una permeasa de purina; y (ii) uno o más polinucleótidos capaces de controlar la expresión en la célula huésped; (b) hacer crecer la célula huésped para producir la permeasa de purina; y (c) recuperar la permeasa de purina de la célula huésped. Un polinucleótido que codifica una permeasa de purina se puede obtener de acuerdo con el presente documento, incluyendo, sin limitación, de las especies de plantas enumeradas anteriormente.

[0155] Las secuencias de polinucleótidos descritas en el presente documento (p. ej., SEQ ID NO. 19 o cualquier otra secuencia de THS descrita en este documento) que codifican los polipéptidos de síntesis de tebaína (o cualquier otro gen deseado) se pueden usar para examinar los genomas de especies de plantas y otros organismos, en busca de la presencia de polinucleótidos que codifican polipéptidos de síntesis de tebaína (u otros genes deseados). Por ejemplo, SEQ ID NO. 19 se puede usar para seleccionar otros polipéptidos de síntesis de tebaína. Al identificar polinucleótidos que codifican polipéptidos de síntesis de tebaína (u otros genes deseados), los genes pueden aislarse y usarse para preparar polipéptidos de síntesis de tebaína adicionales (u otros polipéptidos deseados). También se pueden usar secuencias que son sustancialmente idénticas.

[0156] Las secuencias de polinucleótidos descritas en el presente documento (p. ej., cualquiera de las SEQ ID NO. 36, 38, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 y/o 64) que codifican se puede usar una permeasa de purina (o cualquier otro gen deseado) para explorar los genomas de especies de plantas y otros organismos, para detectar la presencia de polinucleótidos que codifican una permeasa de purina (u otros genes deseados). Por ejemplo, SEQ ID NO. 36 se puede utilizar para detectar otras permeasas de purina. Además, cualquiera de SEQ ID NO. 38, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 y/o 64 pueden utilizarse para detectar otras permeasas de purina. Al identificar los polinucleótidos que codifican permeasas de purina (u otros genes deseados), los genes pueden aislarse y usarse para preparar permeasas de purina adicionales (u otros polipéptidos deseados). También se pueden usar secuencias que son sustancialmente idénticas.

[0157] La preparación (usada en el método in vitro) también puede comprender una mezcla de diferentes polipéptidos de síntesis de tebaína y/o permeasas de purina (p. ej., de diferentes fuentes o de una sola fuente que expresa múltiples polipéptidos de síntesis de tebaína y/o permeasas de purina). El polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina es un polipéptido obtenible u obtenido del género vegetal Papaver, o de la especie vegetal Papaver somniferum. El polipéptido de síntesis de tebaína puede ser un polipéptido expuesto en cualquiera de SEQ ID NO. 6 o 31. En algunos casos, SEQ ID NO. 6 o 31 es un polipéptido de síntesis de tebaína. En algunos casos, SEQ ID NO. 32 es un polipéptido de síntesis de tebaína. La permeasa de purina puede ser un polipéptido expuesto en SEQ ID NO. 35. En algunos casos, SEQ ID NO. 35 es una permeasa de purina. En otros casos, la permeasa de purina puede ser cualquier permeasa de purina descrita en este documento, como las codificadas por cualquiera de las SEQ ID NO. 37, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 y/o 63. Pueden usarse polipéptidos, derivados, fragmentos funcionales y variantes sustancialmente idénticos. La preparación también puede ser sustancialmente pura de otras proteínas que no sean polipéptidos de síntesis de tebaína y/o permeasas de purina.

[0158] También se pueden usar polipéptidos que pueden ayudar a los polipéptidos de síntesis de tebaína. Puede usarse cualquiera de los polipéptidos que ayudan al polipéptido de síntesis de tebaína descrito en todo el documento. Por ejemplo, el método in vitro puede comprender uno o más polipéptidos que están codificados por un polinucleótido que es sustancialmente idéntico a SEQ ID NO. 18; SEQ ID NO. 20; SEQ ID NO. 21; SEQ ID NO. 22; SEQ ID NO. 23; SEQ ID NO. 24; SEQ ID NO. 25; SEQ ID NO. 26; SEQ ID NO. 27; SEQ ID NO.28; SEQ ID NO. 29; SEQ ID NO.30; SEQ ID NO.

36; SEQ ID NO. 38; SEQ ID NO. 42; SEQ ID NO. 44; SEQ ID NO. 46; SEQ ID NO. 48; SEQ ID NO. 50; SEQ ID NO. 52;

SEQ ID NO. 54; SEQ ID NO. 56; SEQ ID NO. 58; SEQ ID NO. 60; SEQ ID NO. 62; o SEQ ID NO. 64. En algunos casos, el método in vitro puede comprender uno o más polipéptidos que son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO. 5; SEQ ID NO. 7; SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 9; SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 11; SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 13; SEQ ID NO. 14:

SEQ ID NO. 15: SEQ ID NO. dieciséis; SEQ ID NO. 17; SEQ ID NO. 35; SEQ ID NO.37; SEQ ID NO.41; SEQ ID NO.

43; SEQ ID NO. 45; SEQ ID NO. 47; SEQ ID NO. 49; SEQ ID NO. 51; SEQ ID NO. 53; SEQ ID NO. 55; SEQ ID NO. 57;

SEQ ID NO. 59; SEQ ID NO. 61; o SEQ ID NO. 63.

[0159] En algunos casos, los polinucleótidos que codifican un polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina pueden obtenerse u obtenerse del género vegetal Papaver o de la especie vegetal Papaver somniferum.

[0160] El polinucleótido que codifica un polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina (u otra enzima deseada) puede aislarse o prepararse usando cualquier metodología deseable. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una tebaína El polipéptido de síntesis puede obtenerse o prepararse después de la identificación y aislamiento de un polipéptido de síntesis de tebaína, como se describe con más detalle en el Ejemplo 1.

[0161] El polipéptido de síntesis de tebaína y/o la permeasa de purina (u otra enzima deseada) pueden recuperarse, aislarse y separarse de otros componentes de la célula huésped mediante una variedad de diferentes técnicas de purificación de proteínas que incluyen, p. cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa, filtración en gel, etc.

Puede encontrar más orientación general con respecto a la purificación de proteínas, por ejemplo, en: Cutler, P. Protein Purification Protocols, Humana Press, 2004, segunda edición.

[0162] En algunos casos, se puede usar más de un polipéptido de síntesis de tebaína, por ejemplo, se puede usar uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más de los polipéptidos de síntesis de tebaína o cualquiera de sus variantes funcionales o fragmentos.

[0163] La permeasa de purina puede ser cualquier permeasa de purina capaz de mediar en el aumento de los títulos de tebaína en una célula. En algunos casos, se puede usar más de una permeasa de purina, por ejemplo, se puede usar una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más de las permeasas de purina o cualquier variante funcional o fragmentos de las mismas.

[0164] Una preparación que comprende uno o más polipéptidos de síntesis de tebaína aislados y/o permeasas de purina generalmente es acuosa y contiene adicionalmente, por ejemplo, agentes tamponantes, sales, agentes reductores y elementos estabilizadores para mantener la solubilidad y estabilidad de los polipéptidos de síntesis de tebaína y/o permeasas de purina. La preparación puede estar sustancialmente libre de proteínas distintas de los polipéptidos de síntesis de tebaína y/o permeasas de purina. Así, por ejemplo, en algunas preparaciones el polipéptido de síntesis de tebaína comprende al menos el 90 % (p/p), al menos el 95 % (p/p), al menos el 96 % (p/p), al menos el 97 % (p/p) p), al menos el 98 % (p/p) o al menos el 99 % (p/p) de los constituyentes proteicos de una preparación. La preparación también puede comprender un solo polipéptido de síntesis de tebaína y está sustancialmente libre de otros polipéptidos de síntesis de tebaína. Así, por ejemplo, en algunas preparaciones un único polipéptido de síntesis de tebaína comprende al menos el 90 % (p/p), al menos el 95 % (p/p), al menos el 96 % (p/p), al menos el 97 % (p/p) /p), al menos el 98 % (p/p) o al menos el 99 % (p/p) de los constituyentes del polipéptido de síntesis de tebaína en la preparación.

[0165] En algunas preparaciones, la permeasa de purina comprende al menos el 90 % (p/p), al menos el 95 % (p/p), al menos el 96 % (p/p), al menos el 97 % (p/p), al menos el 98 % % (p/p), o al menos el 99 % (p/p) de los componentes proteicos de una preparación. La preparación también puede comprender una única permeasa de purina y está sustancialmente libre de otras permeasas de purina. Así, por ejemplo, en algunas preparaciones, una sola permeasa de purina comprende al menos el 90 % (p/p), al menos el 95 % (p/p), al menos el 96 % (p/p), al menos el 97 % (p/p), al menos el 98 % (p/p) o al menos el 99 % (p/p) de los constituyentes de permeasa de purina en la preparación.

Métodos para hacer BIA fuera de una célula

[0166] Para la síntesis in vitro de un BIA (como la tebaína), un método puede incluir (a) poner en contacto un sustrato que puede ser convertido por una o más enzimas, donde una o más enzimas comprenden una tirosina hidroxilasa (TYR);

DOPA descarboxilasa (DODC); norcoclaurina sintasa (NCS); 6-O-Metiltransferasa (6OMT); coclaurina N-metiltransferasa (CNMT), citocromo P450 W-metilcoclaurina hidroxilasa (N^mC^h) y 4-O-metiltransferasa (4OMT); citocromo P450 reductasa (CPR), salutaridina sintasa (SAS); salutaridina reductasa (SalR); salutaridinol-7-O-acetiltransferasa (SalAT); permeasa de purina (PUP); o cualquier combinación de los mismos; y (b) poner en contacto el producto de (a) con uno o más de un polipéptido de síntesis de tebaína; una codeína O-desmetilasa (CODM); una tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); una codeinona reductasa (COR); o cualquier combinación de los mismos.

[0167] Una o más de las enzimas mencionadas anteriormente también pueden estar dentro de una célula viva. Por ejemplo, TYR puede estar fuera de la célula mientras que el resto de las enzimas pueden estar contenidas en la célula. En otro ejemplo, TYR, DODC, NCS, 6OMT, CNMT, NMCH, 4OMT; CPR, SAS, SalR, PUP y SalAT están contenidos dentro de una célula viva, mientras que un polipéptido de síntesis de tebaína (THS) está fuera de la célula en el medio. Además, CODM, T6ODM y COR también pueden estar fuera de la célula en el medio.

[0168] El sustrato puede ser cualquiera de los sustratos descritos en este documento, incluidos, entre otros, un azúcar (p. ej., glucosa), glicerol, L-tirosina, tiramina, L-3,4-dihidroxifenil alanina (L-DOPA), alcohol, dopamina, o cualquier combinación de los mismos.

[0169] El sustrato se puede poner en contacto con una enzima antes de que se ponga en contacto con otra, de manera secuencial. Por ejemplo, el sustrato se puede poner en contacto con salutaridina sintasa (SAS) antes de que se ponga en contacto con un polipéptido de síntesis de tebaína.

[0170] Una vez formado el BIA, el método puede comprender recuperar el BIA.

[0171] En el caso de hacer tebaína, algunos de los métodos pueden incluir poner en contacto un alcaloide de morfinano de sustrato con un polipéptido de síntesis de tebaína en una mezcla de reacción en condiciones de reacción que permitan una reacción mediada por polipéptido de síntesis de tebaína que resulte en la conversión del alcaloide de morfinano de sustrato en tebaína. en condiciones de reacción in vitro. Bajo tales condiciones de reacción in vitro, los constituyentes de la reacción inicial se proporcionan en una forma más o menos aislada, y los constituyentes se mezclan en condiciones que permiten que la reacción prosiga sustancialmente.

[0172] También se pueden cocultivar una o más células vegetales o microorganismos con uno o más sustratos diferentes para proporcionar los constituyentes de reacción necesarios. Si se usan una o más células vegetales o microorganismos en estas reacciones in vivo, se pueden secretar los componentes necesarios de la reacción.

[0173] En caso de que se usen alcaloides de morfinano de sustrato, los alcaloides de morfinano de sustrato se pueden comprar como un compuesto químico sustancialmente puro, sintetizado químicamente a partir de compuestos precursores, o aislado de ciertas fuentes, incluidas las plantas, como del género de plantas Papaver, o de las especies de plantas tales como Papaver somniferum. Dichos compuestos pueden ser compuestos proporcionados con un alto grado de pureza, por ejemplo, una pureza de al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % o más. Otras especies de plantas que pueden usarse para obtener el alcaloide de morfinano de sustrato incluyen, sin limitación, especies de plantas que pertenecen a las familias de plantas descritas anteriormente.

[0174] Con respecto a la producción de tebaína, el polipéptido de síntesis de tebaína se puede usar para producir tebaína (u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano). Por consiguiente, se describe un uso de un polipéptido de síntesis de tebaína para producir tebaína (u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano). Además, también se puede usar una permeasa de purina sola o en combinación con un polipéptido de síntesis de tebaína para producir cantidades sustanciales de tebaína.

[0175] El polipéptido de síntesis de tebaína y/o la permeasa de purina se pueden incluir en una mezcla de reacción en la que un alcaloide de sustrato morfinano se convierte en tebaína u otros alcaloides de morfinano diana o derivados de alcaloides de morfinano. De acuerdo con el presente, para realizar una reacción en condiciones in vitro, se pone en contacto un alcaloide de morfinano de sustrato con cantidades catalíticas de polipéptido de síntesis de tebaína, en condiciones de reacción que permitan una conversión química del alcaloide de morfinano de sustrato en tebaína u otros alcaloides de morfinano diana. o derivados de alcaloides de morfinano. En algunos casos, los agentes se ponen en contacto entre sí y se mezclan para formar una mezcla. La mezcla puede ser una mezcla acuosa que comprende agua y, opcionalmente, más agentes adicionales para mediar en la reacción, incluidos agentes tamponantes, sales, agentes modificadores del pH y cofactores tales como acetil-CoA y NADPH. La reacción se puede realizar en un rango de temperaturas diferentes, que incluyen entre alrededor de 18 °C y alrededor de 50 °C, por ejemplo, entre alrededor de 18°C y alrededor de 45°C, alrededor de 25°C a alrededor de 40°C, alrededor de 32°C a alrededor de 38°C, o a alrededor de 37°C. La mezcla también puede comprender una o más permeasas de purina.

[0176] La mezcla de reacción puede comprender además SalAT y/o SalR. Las secuencias de polinucleótidos de SalAT y SalR que se pueden usar son las identificadas como SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 3, respectivamente, o secuencias que son sustancialmente idénticas. Estas secuencias pueden usarse en técnicas recombinantes para preparar polipéptidos y polinucleótidos SalAT y/o SalR que codifican SalAt y/o SalR. Alternativamente, SalAT y/o SalR pueden obtenerse de ciertas fuentes, incluso de una planta, incluidas las plantas descritas en el presente documento.

[0177] Una vez completada sustancialmente la reacción in vitro, se obtiene una mezcla de reacción que comprende tebaína. En algunos casos, se pueden obtener otros BIA. Luego se puede aislar tebaína u otro BIA de la mezcla de reacción. En algunos casos, la tebaína se deja en la mezcla de reacción para formar otros alcaloides de morfinano objetivo o derivados de alcaloides de morfinano (u otros BIA). En algunos casos, para formar otros alcaloides de morfinano objetivo o derivados de alcaloides de morfinano, se deben agregar enzimas adicionales a la mezcla de reacción.

Niveles de producción de BIA

[0178] Los métodos in vitro descritos a lo largo se pueden hacer para producir BIA sobre lo que se habría hecho con métodos estándar (incluidos los métodos que no utilizan un polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina y/u otros polipéptidos descritos a lo largo). Por ejemplo, los métodos in vitro descritos a lo largo pueden producir BIA superiores a 1,1 veces (en comparación con los métodos estándar, incluidos los métodos que no utilizan un polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina y/u otros polipéptidos descritos a lo largo). En algunos casos, los métodos in vitro descritos a lo largo pueden producir BIA superiores a 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5; 20,0; 25,0; 30,0; 50,0; 75,0; o 100,0 veces en comparación con el nivel de producción de los métodos estándar (incluidos los métodos que no usan un polipéptido de síntesis de tebaína y/o permeasa de purina y/u otros polipéptidos descritos a lo largo).

[0179] En algunos casos, el BIA puede ser tebaína. En otros casos, el BIA puede ser otro BIA descrito en este documento, como oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona, buprenorfina o cualquier combinación de los mismos.

Usos ejemplares de los BIA

[0180] Las preparaciones de BIA (p. ej., tebaína) obtenidas pueden usarse para una variedad de composiciones y métodos. Los BIA se pueden aislar y vender como productos purificados. O bien, estos productos purificados pueden ser una materia prima para producir BIA adicionales o alcaloides de morfinano.

[0181] Los compuestos alcaloides de morfinano derivados se pueden usar para producir compuestos medicinales. Así, por ejemplo, cuando se considera la tebaína, se convierte en un compuesto alcaloide de morfinano derivado seleccionado de oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona, buprenorfina o cualquier combinación de los mismos.

[0182] La tebaína (u otro BIA) puede usarse como compuesto de materia prima para producir un compuesto medicinal.

[0183] El compuesto medicinal puede ser un compuesto de alcaloide de morfinano derivado natural o, en algunos casos, un compuesto de alcaloide de morfinano derivado semisintético. Por ejemplo, la tebaína se puede convertir en oripavina, codeína, morfina, oxicodona, hidrocodona, oximorfona, hidromorfona, naltrexona, naloxona, hidroxicodeinona, neopinona, buprenorfina o cualquier combinación de las mismas, cada una de las cuales puede usarse posteriormente para preparar una formulación farmacéutica.

[0184] La descripción se describe ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Estos Ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y la descripción no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a estos Ejemplos, sino que debe interpretarse que abarca todas y cada una de las variaciones que se hacen evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en este documento.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Preparación de extractos de látex vegetal que contienen polipéptidos de síntesis de tebaína

[0185] Las plantas de adormidera se cultivaron en cámaras de crecimiento bajo una combinación de iluminación fluorescente e incandescente con un fotoperíodo de 16 h, y a 20 °C/18 °C (luz/oscuridad).

[0186] Con el fin de preparar extractos que contienen polipéptidos de síntesis de tebaína, se obtuvo una preparación de látex a partir de vainas maduras de Papaver somniferum usando el siguiente procedimiento para obtener un extracto de planta purificado que contiene extracto de polipéptido de síntesis de tebaína.

[0187] una muestra de látex de cápsulas de semillas maduras de Papaver somniferum utilizando tampón de fosfato (NaPO₄), pH 7,0, que contenía manitol 500 mM. El extracto se centrifugó y se recuperó el sobrenadante. La proteína soluble total en el sobrenadante se desalinizó usando una columna de desalinización PD-10 que consistía en resina Sephadex G-25. Se añadió sulfato de amonio a la muestra de proteína desalada hasta una saturación del 40 % (p/v). Después de la centrifugación, se añadió sulfato de amonio adicional al sobrenadante hasta una saturación del 80 % (p/v). La centrifugación posterior produjo un sedimento de proteína, que luego se resuspendió en tampón Na-PO₄, pH 7,0, produciendo el extracto de polipéptido de síntesis de tebaína crudo. El extracto de proteína se purificó aún más utilizando una serie de métodos de cromatografía. Los pasos secuenciales de purificación se describen a continuación.

[0188] Después de la precipitación con sulfato de amonio, la muestra de proteína se cargó en una columna de flujo rápido de butil-S sepharose 6 (12 mm x 100 mm; GE Healthcare) equilibrada con tampón Na-PO₄50 mM, pH 7,0, que contenía sulfato de amonio 1,7 M. La proteína se eluyó por etapas a 2 ml/min usando tampón Na-PO₄50 mM, pH 7,0, que contenía arginina-HCl 1,0 M, inicialmente al 40 % (v/v), luego aumentando al 79 % (v/v) y finalmente alcanzando 100 %. Las fracciones de elución se recogieron y se ensayaron respecto a la actividad de la proteína de síntesis de tebaína.

[0189] Las fracciones activas de la cromatografía butil-S sepharose 6 se agruparon, el tampón se cambió a Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, y se cargaron en una columna HiTrap Q HP de 1,0 ml (GE Healthcare). La elución de proteínas se realizó con Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 y NaCl 1,0 M aplicado con un gradiente lineal de 0-60 % (v/v) a un caudal de 1 ml/min durante 20 min. Las fracciones de elución se recogieron y se ensayaron respecto a la actividad de la proteína de síntesis de tebaína.

[0190] Las fracciones activas de la cromatografía HiTrap Q HP se concentraron y cargaron en dos columnas Superdex 75 HR 10/30 (GE Healthcare) conectadas en tándem. La elución isocrática se realizó con Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 0,15 M y glicerol al 10 % (v/v) a un caudal de 1 ml/min. Las fracciones de elución se recogieron y se ensayaron respecto a la actividad de la proteína de síntesis de tebaína.

[0191] Las fracciones activas de la cromatografía Superdex 75 HR 10/30 se agruparon y se aplicaron a una columna Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite TYPE I (BioRad) preequilibrada con 100 mM Na-PO₄, pH 6,7, 90 mM NaCl y 20 mg/L CaCl2. La elución paso a paso se realizó utilizando Na-PO₄500 mM, pH 6,7, que contenía NaCl 100 mM aplicado inicialmente al 7 % (v/v) durante 7 ml, luego se aumentó al 10 % (v/v) durante 7 ml y finalmente se alcanzó el 100 %. para 15 mL a un caudal de 1 mL/min.

[0192] Se observó que cuando se extraía una preparación de látex de Papaver somniferum utilizando un tampón de fosfato sin manitol, no se podía detectar la actividad del polipéptido de síntesis de tebaína. Se prepararon extractos usando un tampón de fosfato con y sin manitol 500 mM y se analizaron proteómicamente para la presencia diferencial cuantitativa de polipéptidos individuales. La presencia de cantidades relativamente mayores en el proteoma de un extracto proteico obtenido tras la extracción utilizando un tampón de fosfato con manitol se consideró indicativa de un polipéptido de síntesis de tebaína. Se identificaron varios candidatos a polipéptidos de síntesis de tebaína. Por consiguiente, los extractos de proteínas que comprenden polipéptidos que tienen las secuencias expuestas en SEQ ID NO. 5; SEQ ID NO. 6; SEQ ID NO. 7; SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 9; SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 11; y SEQ ID NO. 12 dio como resultado una reacción química mediada por un polipéptido de síntesis de tebaína que resultó en la conversión del sustrato salutaridinol en tebaína. En particular, SEQ ID NO. 6 (conocido aquí como Bet v1 (también conocido como Betv1MBetV1-1/THS2) mostró un aumento muy alto en una reacción química mediada por un polipéptido de síntesis de tebaína.

[0193] La actividad del polipéptido de síntesis de tebaína se midió incubando extractos de proteína con salutaridinol y ensayando la presencia de compuestos que tienen una m/z = 312, correspondientes a tebaína y compuestos que tienen una m/z = 330, correspondientes al alcaloide morfinano por- productos, y análisis adicionales para la posible presencia de cantidades no convertidas de salutaridinol.

[0194] Los resultados se muestran en las FIGs. 7-8. En particular, la FIG. 7 representa ciertas cantidades relativas de tebaína producida por SalAT en presencia de varias fracciones de proteínas (AS, HIC, IEC, HA, fracciones) del proceso de purificación de este Ejemplo 1. También se muestra un gel de poliacrilamida después de la electroforesis en gel de los mismos extractos de proteínas. y así mostrar la actividad de la proteína de síntesis de tebaína presente en estas fracciones. FIG. 7G representa dos geles de poliacrilamida después de la electroforesis en gel de extractos de proteínas (fracción SEC y HA) y la purificación de las bandas de 16-18 kDa después de la inclusión del paso SEC antes del paso de hidroxiapatita (HA), con retención de la actividad de la proteína de síntesis de tebaína (TS).

[0195] Los ensayos de enzimas acopladas con SalAT mostraron que menos del 10 % del sustrato de salutaridinol inicial se convirtió en tebaína (FIG. 6A). El producto principal era un compuesto, o un conjunto de compuestos, con m/z 330 que no se había informado previamente en la adormidera (FIGs. 6B y 6C). La adición de un extracto de proteína soluble de látex de adormidera a los ensayos de parejas de SalAT aumentó la formación de tebaína a expensas del compuesto m/z 330 (FIG. 6A). Curiosamente, la proteína de látex extraída con tampón de fosfato de sodio que contenía manitol 500 mM dio como resultado una formación de tebaína sustancialmente mayor en comparación con la proteína de látex extraída en ausencia de manitol.

[0196] La proteína de látex de adormidera extraída del quimiotipo T con alto contenido de tebaína y oripavina se sometió a precipitación con sulfato de amonio y, posteriormente, a una serie de tres métodos diferentes de separación cromatográfica (es decir, interacción hidrofóbica [HIC] (FIG. 6D), ion -intercambio [IEX] (FIG. 6E) y exclusión de tamaño [SEC] (FIG. 6F)). La purificación parcial resultó en un aumento de 20 veces en la actividad específica con respecto a la formación de tebaína y sugirió un peso molecular de proteína nativa de aproximadamente 40 kDa (FIG. 6G). Cuatro fracciones de elución de SEC sucesivas se resolvieron inicialmente en un gel de SDS-PAGE al 10 % (p/v) como una sola banda de proteína de aproximadamente 17 kDa (FIGS. 7B-7D). A continuación, las muestras de proteínas se agruparon y las proteínas combinadas se resolvieron en un gel SDS-PAGE al 14 % (p/v), que reveló tres bandas dominantes de aproximadamente 17 kDa (FIGS. 7B-7D). Las tres bandas de proteínas dominantes se extirparon del gel al 14 % (p/v) y se analizaron individualmente mediante CL-EM/EM. La identificación de proteínas se realizó con el software de proteómica Scaffold (Proteome Software) y una base de datos de transcriptoma de látex de adormidera traducida. Se detectaron más de 100 proteínas en las tres bandas de proteínas, pero la mayoría estuvo representada por solo unos pocos recuentos espectrales. Las seis proteínas principales que muestran los recuentos espectrales más altos (FIG. 7E) se produjeron individualmente en E. coli y Saccharomyces cerevisiae a partir de genes con codonoptimizados. Un alineamiento de secuencias de proteínas mostró que seis candidatos compartían una identidad de secuencia de aminoácidos considerable y todos pertenecían a la familia de proteínas PR10 de tipo MLP y Betvl (FIG. 7F). A continuación, se realizaron ensayos de enzimas acopladas a SalAT con proteínas recombinantes purificadas. Uno de los seis candidatos (es decir, Betv1-1) aumentó sustancialmente la formación de tebaína. La adición de 2 mg de la proteína Betv1-1 (SEQ ID NO. 6) en una reacción acoplada con SalAT de 50 ml que contenía salutaridinol 20 mM como sustrato eliminó efectivamente la producción del subproducto m/z -330 (FIGS. 8A y 8B). Betv1 (SEQ ID NO. 6) solo (es decir, sin SalAT en el ensayo) no transformó el salutaridinol en un producto. En la levadura que contenía un gen de salutaridina reductasa (SalR) y SalAT y, individualmente, cada uno de los seis candidatos expresados transitoriamente a partir de un plásmido, solo Betv1-1 (Se Q ID NO. 6) facilitó la conversión mejorada de salutaridina exógena a tebaína (FIG. 9A-9C). Betv1-1 (Se Q ID NO. 6) se designó como la tebaína sintasa primaria (THS).

Ejemplo 2 - Producción enzimática de tebaína in vitro

[0197] Bet v1-1A (correspondiente al terminal C etiquetado con HA), Bet v1-1B (correspondiente al terminal N etiquetado con HA), PR10-3A (SEQ ID NO. 33) y PR10-3B (SEQ ID NO. 34) se expresaron en E. coli (Rosetta). Bet v1 corresponde a SEQ ID NO. 6. Los transformantes se usaron para producir extractos brutos y se ensayaron para la actividad de síntesis de tebaína. Se prepararon extractos para cada construcción de expresión y se usaron para preparar varias mezclas de ensayo de tebaína, como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1

[0198] Las mezclas de ensayo se utilizaron para determinar la presencia de tebaína y m/z 330 (un producto desconocido).

[0199] Los extractos de E. coli que expresan Bet v1-1B produjeron la mayor cantidad de tebaína, mientras que Bet v1-1A produjo un poco menos. Los extractos de E. coli que expresan SaltAT, Bet v1-1A, Bet v1-1B, PR10-3A y PR10-3B produjeron los títulos más altos de tebaína. FIG. 9D.

[0200] En los ensayos que utilizaron candidatos polipeptídicos de síntesis de tebaína en extractos de E. coli, no se consumió la mayor parte del salutaridinol, mientras que con SalAT solo, se utilizó todo el salutaridinol y se formó un subproducto m/z 330. FIG. 9D.

[0201] Bet v1-1A y Bet v1-1B producen tebaína y ningún subproducto m/z 330. PR10-3A y PR10-3B producen poca o ninguna tebaína, pero tampoco tuvieron formación de subproductos m/z 330. En los casos de mezclas que contenían Bet v1-1A y Bet v1-1B o PR10-3A y PR10-3B, se inhibió el consumo de salutaridinol (FIG. 10). Con SalAT sola, todo el salutaridinol se convirtió mayoritariamente en m/z 330 (FIG. 10) y muy poca o ninguna tebaína (FIG. 9D). Ejemplo 3: el grupo de tebaína sintasa

[0202] Un proyecto de secuenciación del ADN genómico del quimiotipo Roxanne de la adormidera proporcionó información sobre la relación estructural genómica entre el THS y otros genes biosintéticos de tebaína (FIG. 11A). En un andamio genómico de aproximadamente 1 megapares de bases, se unieron físicamente copias duplicadas para cada uno de los 5 genes biosintéticos de tebaína. Los cinco productos génicos, reticulina epimerasa (REP1), salutaridina sintasa (SalSyn), SalR, SalAT y THS, convierten secuencialmente (S)-reticulina en tebaína. La duplicación de cada uno de los cinco genes en un solo grupo sugiere la ocurrencia de un reordenamiento genómico complejo para coordinar y mejorar la expresión de genes biosintéticos de tebaína. Los dos genes THS codifican dos isoformas de THS muy similares pero distintas, una (THS1; SEQ ID NO. 80) compuesta por 181 aminoácidos y la otra (THS2; SEQ ID NO. 6) que contiene 163 aminoácidos (FIG. 11B). Un codón de inicio aguas abajo críptico conservado en THS1 y THS2 produce versiones truncadas en el extremo N de cada proteína, denominadas THS1s (131 aminoácidos; SEQ ID NO. 81) y THS2s (133 aminoácidos; SEQ ID NO. 32). Se predice que 12 aminoácidos adicionales en el extremo N de THS1, en comparación con THS2, codifican un péptido señal de secreción. Además, en comparación con THS2, THS2s resulta del empalme alternativo de los primeros -130 pares de bases en el extremo 5' (incluidas las regiones UTR y ORF) de THS2, que faltan en la transcripción correspondiente. En comparación con THS2, cuatro nucleótidos adicionales cerca del comienzo de la transcripción de THS1 dan como resultado un sitio de inicio de traducción aguas arriba. El empalme alternativo en THS1 también produce el producto THS1s más corto.

[0203] Como miembro de la familia PR10, la THS de la adormidera y los ortólogos de otras especies de Papaver productoras de tebaína divergen de otras proteínas vegetales PR10, incluida la norcoclaurina sintasa (NCS), que cataliza el primer paso comprometido de la biosíntesis de BIA (FIG. 11D). El análisis de la expresión específica de tejido se realizó mediante qRT-PCR usando cebadores específicos de variantes de empalme y genes (FIG. 12A y FIG. 12B) en dos quimiotipos de adormidera, T (un alto en tebaína, alto en oripavina y sin morfina, variedad sin codeína) y Roxanne (una variedad que produce morfina, codeína, además de noscapina y papaverina). De forma similar al perfil de expresión de los genes que codifican otras enzimas de la ruta tardía de la morfina, los transcritos de THS fueron más abundantes en el látex, el tallo y la cápsula (FIG. 12C). En general, los transcritos truncados que codifican THS1 (SEQ ID NO. 81) y THS2 (SEQ ID NO. 32) se expresaron a un nivel más alto en comparación con los más largos THS1 (SEQ ID NO. 80) y THS2 (SEQ ID NO. 6) versiones.

[0204] La supresión de los niveles de transcripción de THS en plantas de adormidera se realizó mediante silenciamiento génico inducido por virus (VIGS). Las secuencias conservadas de los genes THS1 y THS2 se utilizaron como región diana (FIG. 12A). Los niveles de transcripción de THS fueron significativamente más bajos en plantas silenciadas por THS en comparación con controles en plantas infectadas con Agrobacterium tumefaciens que albergaban plásmidos de vector vacío pTRV2-THS y pTRV2, respectivamente (FIG. 13A y FIG. 13B). El contenido de tebaína en las plantas silenciadas con THS se redujo significativamente casi dos veces en comparación con los controles FIG. 13B). Por el contrario, la acumulación de los intermedios aguas arriba reticulina y salutaridinol aumentó significativamente en las plantas silenciadas con THS en comparación con las plantas de control. Curiosamente, los niveles de morfina y codeína no se vieron afectados significativamente, lo que sugiere que la actividad reducida de THS aún podía soportar la producción de tebaína suficiente para permitir la formación del producto final.

[0205] Todas las versiones de las transcripciones de THS1 y THS2 se optimizaron por codones y se expresaron en E. coli. Se añadieron proteínas THS recombinantes purificadas a ensayos de enzimas acopladas con SalAT. Los ensayos de THS 1 y THS2 aumentaron de manera similar la formación de tebaína, mientras que las versiones más cortas no mostraron actividad catalítica (FIG. 14B). La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) durante la purificación de THS a partir de látex de adormidera reveló un peso molecular de ~40 kDa, lo que sugiere que la proteína nativa se presenta como un homodímero. Se realizó el entrecruzamiento químico con las proteínas THS recombinantes purificadas para confirmar la dimerización (FIGS. 15A y 15B). Tanto THS 1 como THS2 pueden formar homodímeros y también mostrar la formación de oligómeros de mayor peso molecular en menor abundancia. Por el contrario, las versiones más cortas de THS1s y THS2s exhibieron una capacidad considerablemente menor para formar dímeros, pero produjeron oligómeros de mayor peso molecular. El sometimiento de la proteína THS2 nativa a cromatografía SEC mostró un pico principal de ~40 kDa con cantidades menores de picos de mayor peso molecular (FIGS. 15A y 15B). Para investigar más a fondo la abundancia relativa de isoformas de THS en la planta, se sometieron a análisis proteómicos extractos de proteína derivados de tallo completo, tallo sin látex y látex aislado del quimiotipo T (FIG. 11C). En los péptidos detectados con al menos una sustitución de aminoácido, los recuentos espectrales para THS2 fueron considerablemente más altos que para THS 1, de acuerdo con la mayor abundancia de transcritos de THS2, en comparación con THS 1 (FIG. 12C).

[0206] La función catalítica de THS 1 y THS2 se investigó utilizando 7-O-acetato de salutaridinol como sustrato enzimático directo. El 7-O-acetato de salutaridinol es el producto inmediato de la reacción de SalAT y normalmente no es detectable porque se convierte espontáneamente en una pequeña cantidad de tebaína y una cantidad mayor de m/z 330 compuesto(s). Aproximadamente el 70 % del 7-O-acetato de salutaridinol utilizado como sustrato para los ensayos se descompuso en 2 min en solución acuosa; por lo tanto, los ensayos de THS que utilizan 7-O-acetato de salutaridinol como sustrato se realizaron con una calidad optimizada de THS2 recombinante purificado durante 30 segundos, que estaba dentro del rango lineal de formación del producto. La enzima hervida sirvió como control en todos los ensayos enzimáticos para compensar cualquier descomposición espontánea del 7-O-acetato de salutaridinol. Se usó cloroformo como solución de almacenamiento para 7-O-acetato de salutaridinol y solución de extinción para la reacción, lo que evitó una mayor degradación. THS2 no mostró actividad con otros alcaloides de bencilisoquinolina que compartían un esqueleto similar o que contenían un resto O-acetilo (FIG. 16A). Los ensayos de competición usando estos compuestos revelaron una inhibición marginal de la actividad de THS asociada con salutaridina y salutaridinol, pero poco o ningún efecto de los compuestos O -acetilados (FIG. 16B).

[0207] La inclusión de THS2 en levadura modificada con genes biosintéticos integrados cromosómicamente que facilitan la conversión de (R, Sj-norlauranosolina en salutaridinol 7-O-acetato (Sc-3) aumentó sustancialmente el rendimiento de tebaína a partir de (R,Sj-norlauranosolina (FIGs. 18A-18C, FIGs. 21A-21C). Una cepa (Sc-2) capaz solo de producir salutaridina, debido a la falta de genes que codifican SalR y SalAT, no pudo producir tebaína. La expresión episomal de THS2 en una cepa (Sc-4) que contenía un gen THS2 integrado cromosómicamente mejoró aún más la formación de tebaína a -750 mg/l. El subproducto m/z 330 disminuyó a medida que aumentaba la producción de tebaína. Ejemplo 4 - El efecto de la etiqueta HA sobre la actividad de síntesis de tebaína de Bet v1-1 in vivo

[0208] Con el fin de probar si la etiqueta HA tenía un efecto sobre la eficacia y la eficiencia de Bet v1-1 (SEQ ID NO. 6), se expresaron 2 construcciones (N- y C-terminal HA-tagged Bet v1-1) en alto copiar plásmidos y expresarse en levadura. La levadura transformada se alimentó con salutaridina 1 mM durante 48 horas y se analizó su capacidad para producir tebaína. Como se muestra en la FIG. 17, las construcciones Bet v1-1 etiquetadas con HA N-terminal y C-terminal tenían actividad de síntesis de tebaína, sin embargo, la Bet v1-1 etiquetada con N-terminal mostró un aumento significativo en la actividad de síntesis de tebaína.

Ejemplo 5 - Producción enzimática de tebaína en levadura

[0209] Se generaron tres cepas de levadura separadas con el genotipo de la Tabla 2:

[0210] La levadura se hizo crecer en medio suplementado con NLDS 2,5 mM y L-metionina 10 mM durante 96 horas. Se midieron los títulos de tebaína de los sobrenadantes de tres cepas de levadura manipuladas (SC-2, SC-3 y SC-4). Como se ve en la FIG. 18A, SC-2 no produjo niveles detectables de tebaína. Además, SC-3 produjo una mayor cantidad de tebaína en presencia de HA-BETv1-1 integrado (versión marcada con HA N-terminal de SEQ ID NO. 6) SC-4 mostró una mayor expresión cuando tanto las copias integradas como el plásmido expresaron HA-BETv1-1 estuvieron presentes. Como se muestra en la FIG. 18B, el área relativa del pico del producto secundario desconocido (m/z 330) disminuyó en el sobrenadante en las cepas SC-3 y SC-4 en presencia de HABETv1-1. Las barras de error indican las desviaciones estándar de cuatro réplicas biológicas.

[0211] La levadura que expresa pGAL SalR y pTEA1 SalAT también se transformó con diferentes construcciones de expresión de polipéptidos de síntesis de tebaína. Véase la Tabla 3. Las construcciones polipeptídicas de síntesis de tebaína se clonaron en un vector de alto número de copias bajo pGAL. Las etiquetas del epítopo HA también estaban presentes tanto en el extremo N como en el extremo C.

Tabla 3

[0212] Las células se cultivaron en SC-Medio Completo con MES 100 mM pH 7,5 (selección G418) y se alimentaron con salutaridina 50 mM durante 48 horas. Después de 48 horas, se midieron los títulos relativos de tebaína. Los títulos relativos para Bet v1-1 (SEQ ID NO. 6) fueron los más altos (datos mostrados en la FIG. 19A). Bet v1-1 marcado con terminal N exhibió un aumento de aproximadamente 17 veces en los títulos de tebaína (en comparación con los controles de vector vacío) mientras que Bet v1-1 marcado con terminal C produjo un aumento de aproximadamente 5 veces. Además, también se midió el producto secundario desconocido m/z 330. Como se muestra en la FIG. 19B, el área del parque de m/z300 es significativamente menor en la levadura que expresa el Bet v1-1 marcado con N-terminal. El área de pico se muestra en relación con el control de vector vacío. Las barras de error indican las desviaciones estándar de tres réplicas biológicas. Ejemplo 6 - Efecto de la integración en la síntesis de tebaína

[0213] Se creó levadura que expresaba una copia integrada estable de Bet v1-1 (SEQ ID NO. 6) y se probó su capacidad para sintetizar tebaína. La levadura transformada se cultivó en medios suplementados con salutaridina 1 mM durante 48 horas. La levadura integrada mostró un aumento de aproximadamente 6 veces en la actividad de síntesis de tebaína. Véase la FIG. 12A.

[0214] Se crearon levaduras que expresan copias integradas de forma estable de las variantes de empalme de Bet v1 -1 (Bet v1-1S y Bet v1-1L) y se probaron en cuanto a su capacidad para sintetizar tebaína. Consulte la Tabla 4 y la FIG. 20C para secuencias:

[0215] Las levaduras transformadas se cultivaron en medios suplementados con salutaridina 1 mM durante 48 horas. La levadura que expresaba la variante de corte y empalme Bet v1-1S (SEQ ID NO. 32) no exhibió ninguna actividad de síntesis de tebaína. Véase la FIG. 20B. La levadura que expresa la variante de empalme Bet v1-1L (SEQ ID NO. 31) exhibió una actividad de síntesis de tebaína similar, si no mayor.

Ejemplo 7 - Títulos de tebaína, reticulina y salutaridina

[0216] Se analizó la capacidad de las cepas descritas en la Tabla 2 para producir tebaína, reticulina y salutaridina. Para cada cepa analizada, se recogieron al menos tres colonias individuales y se colocaron en 0,8 ml de medio de glutamato monosódico completo sintético (SC-MSG) que contenía glucosa al 2 % y 200 mg/l de G418 en placas de 96 pocillos profundos (Axygen Scientific). Los cultivos se cultivaron en un agitador Multitron Pro (Infors HT) a 30 °C con un 80 % de humedad.

[0217] Como se muestra en la FIG. 21A, la cepa SC-2 no produjo ningún nivel detectable de tebaína a las 24, 38 o 96 horas. La cepa SC-3 produjo cantidades significativamente mayores de tebaína entre 24 y 48 horas. La cepa SC-4 produjo los títulos de tebaína más altos de todas las cepas probadas y produjo cantidades significativamente mayores de tebaína entre 24 y 48 horas.

[0218] Todas las cepas probadas produjeron niveles significativos de títulos de reticulina. (Véase la FIG. 21B). Todas las cepas también exhibieron una mayor producción de reticulina entre 24, 48 y 96 horas.

[0219] Como se muestra en la FIG. 21C, la cepa SC-2 produjo la mayor cantidad de salutaridina comprendida en las cepas SC-3 y SC-4. En general, las cepas también exhibieron una mayor producción de salutaridina entre las 24, 48 y 96 horas.

Ejemplo 8 - Efecto de permeasas de purina sobre tebaína y otros intermedios BIA

[0220] Se transformó una cepa de Saccharomyces cerevisiae con uno de los 11 homólogos de permeasa de purina diferentes siguientes: 1) Arabidopsis thalania PUP 1 (AtPUP1; SEQ ID NO: 41 (aminoácido) y 42 (nucleótido)); 2) Jatropha curcas PUP1 (JcurPUP1 (JC_PUP1; SEQ ID NO: 43 (aminoácido) y 44 (nucleótido)); 3) Papaver somniferum PUP1-1 (PsoPUP1-1; Se Q ID NO: 45 (aminoácido) y 46 (nucleótido)); 4) Papaver somniferum PUP1-2 (PsoPup1-2; SEQ ID NO: 47 (aminoácido) y 48 (nucleótido)); 5) Papaver somniferum p Up 1-3 (PsoPUP1-3; SEQ ID NO: 49 (aminoácido) y 50 (nucleótido)); 6) Papaver alpinum P^{u p}1 (PalpPUP1; SEQ ID NO: 53 (aminoácido) y 54 (nucleótido)); 7) Papaveratlanticum PUP1 (PatlPUP1; Se Q ID NO: 55 (aminoácido) y 56 (nucleótido)); 8) Papaver miyabeanum PUP1 (PmiyPUP1; SEQ ID NO: 57 (aminoácido) y 58 (nucleótido)); 9) Papaver nudicale PUP1 (PnudPUP1; SEQ ID NO: 59 (aminoácido) y 60 (nucleótido)); 10) Papaver radicatum ^pU^p1 (PradPUP1; SEQ ID NO: 61 (aminoácido) y 62 (nucleótido)); y 11) Papaver trinifolium PUP1 (PtriPUP 1; SEQ ID NO: 63 (aminoácido) y 64 (nucleótido)). Las cepas se cultivaron en medios suplementados con NLDS 2,5 nM y metionina 1 mM durante 24 y 48 horas. Se midieron los títulos de los respectivos productos finales y se ajustó la DO. Como se ve en la FIG. 23A, los niveles de S-reticulina fueron generalmente más altos en todas las cepas que expresaron una permeasa de purina. De manera similar, como se ve en la FIG. 23B, los niveles de R-reticulina fueron generalmente más altos en general para aquellas cepas que expresaron una permeasa de purina. Como se ve en la FIG. 23C, los niveles de salutaridina aumentaron en presencia de permeasa de purina PsoPUP1-1 y PsoPUP1-3. En presencia de una alimentación de L-DOPA, como se ve en la FIG. 23D, los niveles de NLDS permanecieron prácticamente sin cambios, mientras que los niveles de reticulina generalmente aumentaron en presencia de permeasas de purina.

[0221] Las cepas se transformaron con una o más permeasas de purina de Papaver somniferum y se midieron los títulos de tebaína, salutaridinol y salutaridina. Todas las cepas se transformaron con BETV1 (SEQ ID NO. 6) en combinación con una o más permeasas de purina durante 48 horas. Una secuencia de nucleótidos que codifica BetV1 se integró en el genoma de la cepa de levadura. Además, se integró una permeasa de purina (PUP-1 - SEQ ID NO 46)) en el genoma de la cepa de la levadura (control - lado izquierdo). Se expresó un PsomPUP 1-4 (SEQ ID NO. 51 (aminoácido) y 52 (nucleótido)) a través de un plásmido de alto número de copias (segundo desde la izquierda). Además, JcurPUP1 (SEQ ID NO: 43 (aminoácido) y 44 (nucleótido)) se integró en la cepa de control, expresando así ambas copias integradas de JcurPUP1 y PsomPUP1 (control - tercera desde la izquierda). Finalmente, se expresaron tres copias de una permeasa de purina, PsomPUP1 integrada, JcurPUP1 integrada y plásmido de alta copia que expresaba PUP1-4 (extremo derecho). Como se ve en la FIG. 24, las cepas de levadura que expresaron una copia de plásmido de PsomPUP1-4 (SEQ ID NO.

52), más una copia integrada de PsomPUP1-1 (SEQ ID NO. 46) y BetV1, produjeron niveles significativamente altos de títulos de tebaína, en comparación con controles que no expresan PsomPUP1-4. Sin embargo, cuando PsomPUP1-1, PsomPUP1-4 y JcurPUP1 se expresaron en una cepa de levadura, la producción de tebaína disminuyó significativamente y fue similar a la expresión de un solo PsomPUP1-1. Significativamente, cuando se expresaron tres permeasas de purina, el flujo total de carbono a tebaína, salutaridinol y salutaridina disminuyó aproximadamente un 50 %.

Ejemplo 9 - Expresión de Betv-1 en levadura que expresa genes SalAT y SalR, y alimentada con salutaridina, y coexpresión de Betv-1 y permeasa de purina en levadura que expresa genes SalAT y SalR, y alimentada con salutaridina.

[0222] Una cepa CENPK102-5B de Saccharomyces cerevisiae que expresa los genes de salutaridinol 7-O-acetiltransferasa (SalAT) y salutaridin reductasa (SalR) integrados en el genoma de la levadura se transformó con un vector de expresión de levadura pEV-1 que alberga varias construcciones de polinucleótidos que expresan Betv-1 (SEQ ID N° 6) y polipéptidos de permeasa de purina como sigue: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica Betv-1 solo (SEQ.ⁱD N°: 6) (HA_BetV1M); (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica Betv-1 solo (SEQ. ID NO: 31) (BETV1L_HA); una secuencia de ácido nucleico que expresa Betv-1 (SEQ ID NO: 6) y permeasa de purina (SEQ ID NO: 35) (HA_BetV1M-pp); y (iv) una secuencia de ácido nucleico que expresa Betv-1 (SEQ ID NO: 31) y permeasa de purina (SEQ ID NO: 35) (BetV1L_HA-pp). Las cepas, así como una cepa de control con pEV-1 que no comprende secuencias de ácido nucleico que codifican Betv-1 o permeasa de purina (EV), se cultivaron por separado en medio de crecimiento SD-Leu-His en presencia de salutaridina 100 mM durante 24 horas. Una alícuota de 5 ml de medio de cultivo se sometió a análisis de espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución LTQ-Orbitrap XL. A continuación, se determinó la concentración de tebaína en el medio de cada cepa según una curva estándar de tebaína. Los resultados se muestran en la FIG. 25. Como puede verse en la FIG. 25, la producción de tebaína aumentó 6 veces (hasta aproximadamente 600 μg/L/OD) en el medio que contenía cepas transformadas solo con un Betv-1 (HA_BetV1M y BETV1L_HA) en comparación con las cepas que expresaban solo SalAT y SalR. Sin embargo, y sorprendentemente, se detectó un exceso de 9000 μg/L/OD de tebaína en el medio que contenía cepas transformadas tanto con Betv_1 como con permeasa de purina (HA_BetV1M-pp y BetV1L_HA-pp), generando así un aumento adicional de 16 veces en comparación con cepas con sólo un Betv-1 (HA_BetV1M y BETV1L_HA). La producción de tebaína aumentó aproximadamente 100 veces en las cepas transformadas tanto con Betv_1 como con permeasa de purina (HA_BetV1M-pp y BetV1L_HA-pp) en comparación con las cepas que expresan solo SalAT y SalR.

Ejemplo 10 Expresión de Betv-1 en levadura y coexpresión de Betv-1 y permeasa de purina en levadura alimentada con salutaridina.

[0223] Se transformó una cepa CENPK102-5B de Saccharomyces cerevisiae con un vector de expresión de levadura pEV-1 que albergaba varias construcciones de polinucleótidos que expresaban Betv-1 y polipéptidos de permeasa de purina de la siguiente manera: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica Betv-1 solo (SEQ ID NO: 6) (HA_BetV1M); (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica Betv-1 solo (SEQ. ID NO: 31) (BETV1L_HA); una secuencia de ácido nucleico que expresa Betv-1 (SEQ ID NO: 6) y permeasa de purina (SEQ ID NO: 35) (HA_BetV1M-pp); y (iv) una secuencia de ácido nucleico que expresa Betv-1 (SEQ Id NO: 31) y permeasa de purina (SEQ ID NO: 35) (BetV1L_HA-pp). Las cepas, así como una cepa de control con pEV-1 que no comprende secuencias de ácido nucleico que codifican Betv-1 o permeasa de purina (EV), se cultivaron por separado en medio de crecimiento SD-Leu-His en presencia de salutaridina 100 mM durante 24 horas. Las células de levadura se recogieron por centrifugación, se extrajeron en 500 ml de metanol, de los cuales 5 ml se sometieron a análisis de espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución LTQ-Orbitrap XL. A continuación, se determinó la concentración de salutaridina en las células de cada cepa según una curva estándar de salutaridina. Los resultados se muestran en la FIG. 26. Como puede verse en la FIG. 26, la acumulación de salutaridina aumentó 8 veces (hasta aproximadamente 132 μg/L/OD) en las células de las cepas transformadas con Betv-1 (HA_BetV1M y BETV1L_HA) y una permeasa de purina (HA_BetV1M-pp y HA_BetV1L-pp). En comparación con el control de vector vacío (EV), la acumulación de salutaridina no aumentó en las células transformadas solo con Betv-1 (HA_BetV1M y BETV1L_HA).

Ejemplo 11 - Expresión de permeasas de purina (PUP-L) y (PUP-N) en levadura que expresa los genes DODC, MAO, NCS, 6OMT, CNMT y 4'OMT, y alimentada con L-DOPA o norlaudanosolina (NLDS), y co - expresión de PUP-L y PUPN con un Betv1 en levadura que expresa los genes DODC, MAO, NCS, 6OMT, CNMT y 4'OMT, y alimentada con D^oPA o norlaudanosolina (NLDS).

[0224] Una cepa CENPK102-5B de Saccharomyces cerevisiae que expresa dopa descarboxilasa (DODC), monoaminooxidasa (MAO), norcoclaurina sintasa (NCS), norcoclaurina 6-O-metiltransferasa (6OMT), coclaurina N-metiltransferasa (CNMT) y 3'hidroxi-N -genes de metiltransferasa 4'-O-metiltransferasa (4'OMT) integrados en el genoma de la levadura se transformó con un vector de expresión de levadura pEV-1 que alberga varias construcciones de polinucleótidos que expresan polipéptidos de permeasa de purina y Betv1 como sigue: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un permeasa de purina que contiene una extensión C-terminal ausente en una permeasa de purina unida a un grupo de 10 genes biosintéticos de noscapina (Winzer, T., Gazda, V., Hc Z., Kaminski F., Kern M., Larson TR, Li Y., Meade F., Teodor R., Vaistij FE, Walker C., Bowser TA, Graham, IA (2012) Un grupo de 10 genes de Papaver somniferum para la síntesis del alcaloide anticancerígeno noscapina Science 336(6089): 1704-1708) solo (SEQ. ID NO: 35) (PUP-L); (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina unida a un grupo de 10 genes biosintéticos de noscapina (Winzer et al., 2012) solos (SEQ ID NO: 37) (PUP-N) (secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 38 se optimizó el codón y se marcó con myc en el extremo C para obtener la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 39 (secuencia myc-tag SEQ ID NO: 40)); (iii) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-L (SEQ. ID NO: 35) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-L); y (iv) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-N (SEQ. ID NO: 37) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-N). Las cepas, así como una cepa de control con pEV-1 que no comprende secuencias de ácido nucleico que codifican Betv-1 o permeasa de purina (EV), se cultivaron por separado en medio de crecimiento SD-Leu-His en presencia de L-DOPA 100 μM o norlaudanosolina 100 mM (NLD^s) durante 24 horas. Una alícuota de 5 ml de medio de cultivo se sometió a análisis de espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución LTQ-Orbitrap XL. A continuación, se determinó la concentración de reticulina en el medio de cada cepa según una curva estándar de reticulina. Los resultados se muestran en la FIG.27. Como puede verse en la FIG.27, la producción de reticulina no se vio afectada en el medio de cepas transformadas con solo una permeasa de purina (PUP-L o PUP-N) o una permeasa de purina y un Betv1 (Betv1_PUP-L y Betv1_PUP-N) en comparación con las cepas que expresan solo DODC, MAO, NCS, 6OMT, CNMT y 4'OMT. Sin embargo, y sorprendentemente, la producción de reticulina aumentó 25 veces a más de 1000 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas tanto con PUP-L como con PUP-L y Betv1. Ni PUP-N ni Betv1 por sí solos afectaron la producción de reticulina en comparación con los controles de vector vacío.

Ejemplo 12 - Expresión de permeasas de purina (PUP-L) y (PUP-N) en levadura que expresa genes REPI, CPR y SalSyn o genes REPI, CPR, SalSyn, SalR y SalAT, y alimentada con (S)-reticulina, y co -expresión de PUP-L y PUP-N con un Betv1.

[0225] Una cepa CENPK102-5B de Saccharomyces cerevisiae que expresa genes de reticulina epimerasa (REPI), citocromo P450 reductasa (CPR) y salutaridina sintasa (SalSyn) integrados en el genoma de la levadura se transformó con un vector de expresión de levadura pEV-1 que alberga varias construcciones de polinucleótidos que expresan permeasa de purina y Betv1 polipéptidos como sigue: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina que contiene una extensión C-terminal ausente en una permeasa de purina unida a un grupo de 10 genes biosintéticos de noscapina (Winzer et al., 2012) solos (SEQ ID NO: 35) (CACHORRO-L); (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina unida a un grupo de 10 genes biosintéticos de noscapina (Winzer et al., 2012) solos (SEQ. ID NO: 37) (PUP-N); (iii) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-L (SEQ. ID NO: 35) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-L); y (iv) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-N (SEQ. ID NO: 37) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-N). Las cepas, así como una cepa de control con pEV-1 que no comprende secuencias de ácido nucleico que codifican Betv-1 o permeasa de purina (EV), se cultivaron por separado en medio de crecimiento SDLeu-His en presencia de (S)-reticulina 100 μM para 24 horas. Una alícuota de 5 ml de medio de cultivo se sometió a análisis de espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución LTQ-Orbitrap XL. A continuación, se determinaron las concentraciones de salutaridina y tebaína en el medio de cada cepa según las curvas estándar de salutaridina y tebaína, respectivamente. Los resultados se muestran en la FIG. 28A. Como puede verse en la FIG. 28A, la producción de salutaridina no se vio afectada en el medio de las cepas transformadas con PUP-N o PUP-N y Betv1 (Betv1_PUP-N) en comparación con las cepas que expresan solo REPI, CPR y SalSyn. Sin embargo, y sorprendentemente, la producción de salutaridina aumentó 3 veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a más de 150 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-L solo o PUP-L y un Betv1 (Betv1_PUP -L). B, Una cepa de Saccharomyces cerevisiae CENPK102-5B que expresa genes de reticulina epimerasa (REPI), citocromo P450 reductasa (CPR), salutaridina sintasa (SalSyn), salutaridina reductasa (SalR) y salutaridina acetiltransferasa (SalAT) integrados en el genoma de la levadura se transformó con un vector de expresión de levadura pEV-1 que alberga varias construcciones polinucleotídicas que expresan permeasa de purina y polipéptidos Betv1 de la siguiente manera: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina que contiene una extensión C-terminal ausente en una permeasa de purina unida a un grupo de 10 biosintéticos de noscapina genes (Winzer et al., 2012) solos (SEQ. ID NO: 35) (PUP-L); (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina unida a un grupo de 10 genes biosintéticos de noscapina (Winzer et al., 2012) solos (SEQ. ID NO: 37) (PUP-N); (iii) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-L (SEQ. ID NO: 35) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-L); y (iv) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-N (SEQ. ID NO: 37) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-N). Las cepas, así como una cepa de control con pEV-1 que no comprende secuencias de ácido nucleico que codifican Betv-1 o permeasa de purina (EV), se cultivaron por separado en medio de crecimiento SD-Leu-His en presencia de 100 mM (S)-reticulina por 24 hrs. Una alícuota de 5 μl de medio de cultivo se sometió a análisis de espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución LTQ-Orbitrap XL. A continuación, se determinaron las concentraciones de salutaridina y tebaína en el medio de cada cepa según las curvas estándar de salutaridina y tebaína, respectivamente.

Los resultados se muestran en la FIG. 28B. Como puede verse en la FIG. 28B, la producción de salutaridina y tebaína no afectada en el medio de cepas transformadas con PUP-N en comparación con cepas que expresan solo REPI, CPR, SalSyn, SalR y SalAT. Sin embargo, y sorprendentemente, la producción de salutaridina aumentó dos veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a aproximadamente 150 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-L solo o PUP-L y un Betvl (Betv1_PUP- L). La producción de tebaína aumentó 4 veces en comparación con el control de vector vacío (EV) en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-L solo. La producción de tebaína aumentó casi 20 veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a aproximadamente 95 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUPL y un Betv1 (Betv1_PUP-L). La producción de tebaína aumentó aproximadamente 2 veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a aproximadamente 12 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-N y un Betv1 (Betv1_PUP-L) debido a la actividad formadora de tebaína de Betv1.

Ejemplo 13 - Expresión de permeasas de purina (PUP-L) y (PUP-N) en levadura que expresa genes REPI, CPR y SalSyn 0 genes REPI, CPR, SalSyn, SalR y SalAT, y alimentada con (R)-reticulina, y coexpresión de PUP-L y PUP-N con Betv1.

[0226] Una cepa CENPK102-5B de Saccharomyces cerevisiae que expresa genes de reticulina epimerasa (REPI), citocromo P450 reductasa (CPR) y salutaridina sintasa (SalSyn) integrados en el genoma de la levadura se transformó con un vector de expresión de levadura pEV-1 que alberga varias construcciones de polinucleótidos que expresan permeasa de purina y Betv1 polipéptidos como sigue: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina que contiene una extensión C-terminal ausente en una permeasa de purina unida a un grupo de 10 genes biosintéticos de noscapina (Winzer et al., 2012) solos (SEQ ID NO: 35) (CACHORRO-L); (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina unida a un grupo de 10 genes biosintéticos de noscapina (Winzer et al., 2012) solos (SEQ. ID NO: 37) (PUP-N); (iii) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-L (SEQ. ID NO: 35) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-L); y (iv) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-N (SEQ. ID NO: 37) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-N). Las cepas, así como una cepa de control con pEV-1 que no comprende secuencias de ácido nucleico que codifican Betv-1 o permeasa de purina (EV), se cultivaron por separado en medio de crecimiento SDLeu-His en presencia de (R)-reticulina 100 mM para 24 horas. Una alícuota de 5 μl de medio de cultivo se sometió a análisis de espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución LTQ-Orbitrap XL. A continuación, se determinaron las concentraciones de salutaridina y tebaína en el medio de cada cepa según las curvas estándar de salutaridina y tebaína, respectivamente. Los resultados se muestran en la FIG. 29A. Como puede verse en la FIG. 29A, la producción de salutaridina no se vio afectada en el medio de las cepas transformadas con PUP-N o PUP-N y Betv1 (Betv1_PUP-N) en comparación con las cepas que expresan solo REPI, CPR y SalSyn. Sin embargo, y sorprendentemente, la producción de salutaridina aumentó 3 veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a más de 150 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-L solo o PUP-L y un Betv1 (Betv1_PUP -L). B, Una cepa de Saccharomyces cerevisiae CENPK102-5B que expresa genes de reticulina epimerasa (REPI), citocromo P450 reductasa (CPR), salutaridina sintasa (SalSyn), salutaridina reductasa (SalR) y salutaridina acetiltransferasa (SalAT) integrados en el genoma de la levadura se transformó con un vector de expresión de levadura pEV-1 que alberga varias construcciones de polinucleótidos que expresan polipéptidos de permeasa de purina y Betv1 de la siguiente manera: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina que contiene una extensión C-terminal ausente en una permeasa de purina unida a un grupo de 10 biosintéticos de noscapina genes (Winzer et al., 2012) solos (SEQ. ID NO: 35) (PUP-L); (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina unida a un grupo de 10 genes biosintéticos de noscapina (Winzer et al., 2012) solos (SEQ. ID NO: 37) (PUP-N); (iii) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-L (SEQ. ID NO: 35) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-L); y (iv) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-N (SEQ. ID NO: 37) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-N). Las cepas, así como una cepa de control con pEV-1 que no comprende secuencias de ácido nucleico que codifican Betv-1 o permeasa de purina (EV), se cultivaron por separado en medio de crecimiento SD-Leu-His en presencia de 100 mM (R)- reticulina por 24 hrs. Una alícuota de 5 μl de medio de cultivo se sometió a análisis de espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución LTQ-Orbitrap XL. A continuación, se determinaron las concentraciones de salutaridina y tebaína en el medio de cada cepa según las curvas estándar de salutaridina y tebaína, respectivamente. Los resultados se muestran en la FIG. 29B. Como puede verse en la FIG. 29B, la producción de salutaridina y tebaína no se vio afectada en el medio de las cepas transformadas con PUP-N en comparación con las cepas que expresan solo REPI, CPR, SalSyn, SalR y SalAT. Sin embargo, y sorprendentemente, la producción de salutaridina aumentó dos veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a aproximadamente 150 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-L solo o PUP-L y un Betv1 (Betv1_PUP- L). La producción de tebaína aumentó 4 veces en comparación con el control de vector vacío (EV) en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-L solo. La producción de tebaína aumentó casi 20 veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a aproximadamente 95 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUPL y un Betv1 (Betv1_PUP-L). La producción de tebaína aumentó aproximadamente 2 veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a aproximadamente 12 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-N y un Betv1 (Betv1_PUP-N) debido a la actividad formadora de tebaína de Betv1.

Ejemplo 14 Expresión de permeasas de purina (PUP-L) y (PUP-N) en levadura que expresa genes SalAT y SalR o REPI, CPR, SalSyn, SalR y genes SalAT, y alimentados con salutaridina y coexpresión de PUP-L y PUP-N con un Betv1.

[0227] Una cepa CENPK102-5B de Saccharomyces cerevisiae que expresaba genes de salutaridina reductasa (SalR) y salutaridina acetiltransferasa (SalAT) integrados en el genoma de la levadura se transformó con un vector de expresión de levadura pEV-1 que albergaba varias construcciones de polinucleótidos que expresaban polipéptidos de permeasa de purina y Betv1 de la siguiente manera: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina que contiene una extensión C-terminal ausente en una permeasa de purina unida a un grupo de 10 genes biosintéticos de noscapina (Winzer et al., 2012) solos (SEQ ID NO: 35) (PUP-L); (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina unida a un grupo de 10 genes biosintéticos de noscapina (Winzer et al., 2012) solos (SEQ. ID NO: 37) (PUP-N); (iii) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-L (S^eQ. ID NO: 35) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-L); y (iv) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-N (SEQ. ID NO: 37) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-N). Las cepas, así como una cepa de control con pEV-1 que no comprende secuencias de ácido nucleico que codifican Betv-1 o permeasa de purina (EV), se cultivaron por separado en medio de crecimiento SD-Leu-His en presencia de salutaridina 100 mM durante 24 horas. Una alícuota de 5 ml de medio de cultivo se sometió a análisis de espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución LTQOrbitrap XL. A continuación, se determinó la concentración de tebaína en el medio de cada cepa según una curva estándar de tebaína. Los resultados se muestran en la FIG. 30A. Como puede verse en la FIG. 30A, la producción de tebaína no se vio afectada en el medio de las cepas transformadas con PUP-N en comparación con las cepas que expresaban únicamente SalR y SalAT. Sin embargo, y sorprendentemente, la producción de tebaína aumentó 27 veces y ⁶⁰veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a más de 1600 y 3500 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-L solo o PUP-L y un Betv1 (Betv1_PUP-L), respectivamente. La producción de tebaína aumentó aproximadamente 4 veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a aproximadamente 250 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-N y un Betv1 (Betv1_PUP-N) debido a la actividad formadora de tebaína de Betv1. B, Una cepa de Saccharomyces cerevisiae CENPK102-5B que expresa genes de reticulina epimerasa (REPI), citocromo P450 reductasa (CPR), salutaridina sintasa (SalSyn), salutaridina reductasa (SalR) y salutaridina acetiltransferasa (SalAT) integrados en el genoma de la levadura se transformó con un vector de expresión de levadura pEV-1 que alberga varias construcciones de polinucleótidos que expresan polipéptidos de permeasa de purina y Betv1 de la siguiente manera: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina que contiene una extensión C-terminal ausente en una permeasa de purina unida a un grupo de 10 biosintéticos de noscapina genes (Winzer et al., 2012) solos (SEQ. ID NO: 35) (PUP-L); (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una permeasa de purina unida a un grupo de 10 genes biosintéticos de noscapina (Winzer et al., 2012) solos (SEQ. ID NO: 37) (PUP-N); (iii) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP- L (SEQ ID NO: 35) y Betv1 (Se Q ID NO: 6) (Betv1-PUP-L); y (iv) una secuencia de ácido nucleico que expresa PUP-N (Se Q. ID NO: 37) y un Betv1 (SEQ. ID NO: 6) (Betv1-PUP-N). Las cepas, así como una cepa de control con pEV-1 que no comprende secuencias de ácido nucleico que codifican Betv-1 o permeasa de purina (EV), se cultivaron por separado en medio de crecimiento SD-Leu-His en presencia de salutaridina 100 mM durante 24 horas. Una alícuota de 5 ml de medio de cultivo se sometió a análisis de espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución LTQ-Orbitrap XL. A continuación, se determinó la concentración de tebaína en el medio de cada cepa según una curva estándar de tebaína. Los resultados se muestran en la FIG. 30B. Como puede verse en la FIG. 30B, la producción de tebaína no se vio afectada en el medio de las cepas transformadas con PUP-N en comparación con las cepas que expresan únicamente REPI, CPR, SalSyn, SalR y SalAT. Sin embargo, y sorprendentemente, la producción de tebaína aumentó 10 y 25 veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a aproximadamente 1000 y 2500 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-L solo o PUPL y un Betv1 (Betv1_PUP-L), respectivamente. La producción de tebaína aumentó aproximadamente 2 veces en comparación con el control de vector vacío (EV) a aproximadamente 200 μg/L/OD en el medio que contenía cepas transformadas con PUP-N y un Betv1 (Betv1_PUP-N) debido a la actividad formadora de tebaína de Betv1.

Ejemplo 15 - Métodos generales

[0228] Los siguientes métodos se usaron a lo largo de los ejemplos descritos anteriormente.

[0229] Expresión de proteínas recombinantes en Escherichia coli. Todos los genes expresados en E. coli se optimizaron por codones, se añadió una etiqueta His 6 de forma independiente al extremo N-terminal y al extremo C-terminal, y los genes sintéticos se clonaron en el vector pACE. Los vectores de expresión se transformaron en E. coli tinción Rosetta (DE3) μLysS (EMD Chemicals), que posteriormente se indujeron durante la noche utilizando isopropil p-D-tiogalactósido (IPTG) 1 mM (p/v) a 16 °C. Las células se recogieron por centrifugación y se sonicaron en fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, NaCl 300 mM y glicerol al 10 % (v/v). Después de centrifugar a 20.000 g durante 10 min, el sobrenadante se cargó en resina de afinidad de cobalto Talon (Clontech). La purificación se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las proteínas recombinantes purificadas se desalinizaron usando un filtro centrífugo Amicon (Millipore) con un límite de peso molecular de 30 kDa y se almacenaron en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, NaCl 50 mM y glicerol al 10 % (v/v). La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad) usando albúmina de suero bovino como estándar.

[0230] Experimentos de entrecruzamiento. Se utilizó suberato de bis[sulfosuccinimidilo] (BS3) como reactivo de entrecruzamiento y se preparó en tampón PBS a una concentración de 10 mM, del cual se agregaron 2 μL a 20 μL de proteína recombinante purificada (1 μg/μL). Después de la incubación en hielo durante 1 h, se añadieron 5 μL de 5X SDS (10 % p/v) para extinguir la reacción. A continuación, las muestras se hirvieron durante 5 min y se sometieron a SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia.

[0231] Ensayos enzimáticos. Los ensayos de THS acoplado con SalAT se realizaron en una reacción de 50 ml que contenía proteína de látex o THS recombinante purificado, salutaridinol 10 μM, acetil-CoA 50 μM y 0,2 μg de SalAT en fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0, a 30 °C durante 30 min. El ensayo se inactivó con 200 μL de acetonitrilo y se centrifugó a 17000 g durante 40 min. El sobrenadante se sometió a análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (CL-EM/EM). Los ensayos directos de THS se realizaron en una reacción de 50 ml que contenía THS recombinante purificado, tampón de fosfato, pH 7,0 y salutaridinol-7-O-acetato a 30 °C durante 30 segundos. Luego se añadió cloroformo (200 μL) para detener la reacción y proteger cualquier salutaridinol-7-O-acetato residual de la hidrólisis.

[0232] Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (CL-EM/EM). Las muestras se analizaron usando un CL-EM de triple cuadrupolo 6410 (Agilent Technologies). La separación por cromatografía de líquidos se realizó utilizando una columna CLAR Poroshell 120 SB-C18 (Agilent Technologies) con un caudal de 0,6 ml/min y un gradiente de disolvente A (0,05 % [p/v] de hidróxido de amonio, pH 6,5) y disolvente B (100 % acetonitrilo) de la siguiente manera: 0 % de solvente B de 1 min, 0-20 % de solvente B de 1 a 3 min, isocrático 99 % de solvente B de 6 a 8 min, 99-0 % de solvente B de 8 a 8,1 min, 0 % disolvente B de 8,1 a 11,1 min. Se realizaron análisis de masa de barrido completo (rango m/z 50-200) y experimentos de colisión EM/EM como se describió anteriormente (Nature Chemical Biology 11, 728-732, 2015).

[0233] Silenciamiento génico inducido por virus (VIGS). Se seleccionaron dos regiones conservadas en los genes THS, pero distintas de los homólogos de Betv1 similares, como objetivo de VIGS. El primer fragmento estaba ubicado en el medio de la región de codificación y el segundo fragmento incluía el extremo 3' del marco de lectura abierto y parte de la región 3' no traducida (FIG. 12A). Los dos fragmentos se sintetizaron como un fragmento de ADN y se clonaron en el vector pTRV2. Los vectores pTRV2 y pTRV2-THS se movilizaron de forma independiente en Agrobacterium tumefaciens, que posteriormente se cultivaron e infiltraron en plántulas de adormidera como se describió anteriormente (Nature Chemical Biology 11, 728-732, 2015). Se recogieron muestras de látex y tallo de ~30 plantas maduras. Para confirmar la infiltración con A. tumefaciens, se realizó una PCR con un par de cebadores TRV2-MSC (sitio de clonación múltiple) (FIG.

12B) para detectar la aparición de un fragmento movilizado del vector pTRV2 usando ADNc aislado de muestras de tallos individuales. Los alcaloides se extrajeron en acetonitrilo de látex liofilizado y se analizaron por CL-EM/EM. La abundancia relativa de transcritos de THS2 (SEQ ID NO. 6) en la planta VIGS se determinó mediante qRT-PCR usando cebadores específicos de genes (FIG. 12B).

[0234] Extracción de ARN, síntesis de ADNc y qRT-PCR. El ARN total se extrajo usando bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) de muestras de tejido de adormidera congeladas finamente molidas usando un TissueLyser (Qiagen). La síntesis de ADNc se realizó en una reacción de 10 μl que contenía aproximadamente 1 μg de ARN total utilizando All-in-One RT mastermix (ABM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó SYBR-green qRT-PCR para cuantificar los niveles de transcripción de genes. Las reacciones de 10 μl contenían una mezcla maestra 1X PowerUp SYBR Green (Applied biosystems), 500 nM de cada cebador y 2 μL de una muestra de ADNc diluida 20 veces. Para realizar qRT-PCR en un QuantiStudio Real-Time PCR System 3 (Applied Biosystems). Se usaron cebadores específicos de genes para todos los experimentos de qRT-PCR (FIG. 12B). Todos los pares de cebadores utilizados en qRT-PCR se analizaron mediante el análisis de la curva de disociación de amplicón (95 °C durante 15 s a una velocidad de rampa de 1,6 °C/seg, 60 °C durante 1 min a una velocidad de rampa de 1,6 °C/seg, y 95 °C durante 15 segundos a una velocidad de rampa de 0,15 °C/s) para confirmar la rigurosidad de la amplificación.

[0235] Preparación de proteínas para análisis de proteómica. La proteína soluble (~0,3 mg) se precipitó durante la noche utilizando 3 volúmenes de TCNacetona enfriado con hielo (13,3: 100, vol/vol) a -20°C. El sedimento de proteína se recogió mediante centrifugación a máxima velocidad durante 20 min a 4 °C y se lavó tres veces con acetona al 75 % (v/v) enfriada con hielo. Los gránulos de proteínas o las bandas de gel extirpadas de SDS-PAGE se enviaron al centro de espectrometría de masas del sur de Alberta en la Universidad de Calgary para el análisis proteómico.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula modificada genéticamente que comprende un polinucleótido que codifica una enzima capaz de convertir salutaridinol-7-O-acetato en tebaína, donde la enzima es un polipéptido de síntesis de tebaína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 31 o SEQ ID NO. 32, donde la célula es un hongo, levadura o bacteria.

2. La célula genéticamente modificada de la reivindicación 1, donde el polipéptido de síntesis de tebaína:

(a) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % idéntico o 100 % idéntico a SEQ ID NO.

6, SEQ ID NO. 31 o SEQ ID NO. 32; o

(b) consta de SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 31 o SEQ ID NO. 32.

3. La célula modificada genéticamente de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además un ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar al menos una de las siguientes conversiones:

a) un azúcar a L-tirosina;

b) L-tirosina a L-DOPA;

c) L-DOPA a dopamina;

d) Dopamina a (SJ-Norcoclaurina;

e) (SJ-Norcoclaurina a (S)/(R)-Reticulina;

f) (R)-reticulina a salutardina;

g) salutardina a salutaridinol;

h) Salutaridinol a Salutaridinol-7-O-acetato; o

4. La célula modificada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además una o más enzimas seleccionadas de tirosina hidroxilasa (TYR); DOPA descarboxilasa (DODC); norcoclaurina sintasa (NCS); 6-O-metiltransferasa (6OMT); coclaurina N-metiltransferasa (CNMT), citocromo P450 N-metilcoclaurina hidroxilasa (NMCH) y 4-Ometiltransferasa (4OMT); citocromo P450 reductasa (CPR), salutaridina sintasa (SAS); salutaridina reductasa (SalR); salutaridinol-7-oacetiltransferasa (SalAT); permeasa de purina (PUP); o cualquier combinación de los mismos.

5. La célula modificada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la célula comprende además un polinucleótido adicional que codifica un polipéptido que ayuda a un polipéptido de síntesis de tebaína, en el que dicho polinucleótido

(i) es sustancialmente idéntico a cualquiera de las SEQ ID NO. 18 o 20 a 30; o

(ii) codifica una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO. 5 o 7 a 17.

6. La célula modificada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además una permeasa de purina, opcionalmente en la que dicha permeasa de purina

(i) está codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a SEQ ID NO. 36, 38, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 o 64; o

(ii) comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a SEQ ID NO. 35, 37, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 o 63.

7. La célula genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que:

(a) el hongo o la levadura es Saccharomyces cerevisiae o Yarrowia lipolytica; o

(b) la bacteria es Escherichia coli.

8. Uso de un polipéptido de síntesis de tebaína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la Se Q iD NO. 6 , SEQ ID NO. 31 o s Eq ID NO. 32 para convertir salutaridinol-7-O-acetato en tebaína in vitro, o en una célula fúngica, de levadura o bacteriana.

9. Un método para producir tebaína, comprendiendo dicho método hacer crecer la célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en un medio de crecimiento que comprende un sustrato base.

10. El método de la reivindicación 9, en el que el método comprende además convertir tebaína en oripavina, codeína, codeinona, neopinona, morfinona y/o morfina usando uno o más de: una codeína O-desmetilasa (CODM), una tebaína 6-O- desmetilasa (T6ODM), una codeinona reductasa (COR) o cualquier combinación de las mismas.

11. El método de la reivindicación 9 o reivindicación 10, donde el sustrato es glucosa, L-tirosina, tiramina, L-3,4-dihidroxifenil alanina (L-DOPA), dopamina, salutaridina, salutaridinol o salutaridinol 7-O-acetato