ES2724998T3 - Métodos para la producción eficiente de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en especies de Rhodosporidium y Rhodotorula - Google Patents

Métodos para la producción eficiente de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en especies de Rhodosporidium y Rhodotorula Download PDF

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Abstract

Una célula huésped fúngica en donde los ácidos grasos totales están compuestos por un aumento del nivel de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), en particular ácido alfa-linolénico (ALA) o ácido gamma-linolénico (GLA), a un nivel de al menos 9 %, preferentemente más del 24 %, con la máxima preferencia más del 49 % en la célula huésped fúngica, en donde el genoma de la célula huésped fúngica se ha modificado de manera que la célula huésped fúngica ha reducido la actividad de la enzima aldehído deshidrogenasa (ALD1) nativa en comparación con una célula huésped fúngica que tiene un genoma no modificado, y en donde el huésped fúngico es una especie del género Rhodosporidium o el género Rhodotorula.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para la producción eficiente de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en especies de Rhodosporidium y Rhodotorula.
Referencia cruzada a la solicitud relacionada
La presente solicitud se refiere a y reivindica la prioridad a la solicitud de patente provisional de Estados Unidos núm. de serie 62/047,300 presentada el 8 de septiembre de 2014.
Presentación de secuencias
La presente solicitud se presenta junto con un Listado de Secuencias en formato electrónico. El Listado de Secuencias se titula 2577237PCTSequenceListing.txt, creado el 2 de julio de 2015 y tiene un tamaño de 321 kb. La información en el formato electrónico del Listado de Secuencias se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere al campo de la biotecnología de hongos, más en particular a métodos de ingeniería genética para la producción de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) omega-3 en huéspedes fúngicos seleccionados del género Rhodospordium y Rhodotorula.
Los ácidos grasos omega-3 (denominados además ácidos grasos w-3 o ácidos grasos n-3) se refieren a ácido alfalinolénico (ALA) [ácido (9Z,12Z,15Z)-9,12,15-Octadecatrienoico], a EPA (ácido eicosapentaenoico, o [ácido (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoico]) y a DHA [ácido docosahexaenoico, o ácido (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoico]. Las fuentes comunes de ácidos grasos EPA y DHA omega-3 de animales incluyen aceites de pescado, aceite de huevo, aceites de calamar y aceite de krill mientras que algunos aceites vegetales, tales como aceite de semilla y baya de espino amarillo, células de algas, semilla de lino, semilla de Chia y semilla de cáñamo, contienen altos niveles de ALA.
El ácido linoleico [ácido (9Z,12Z)-9,12-Octadecadienoico], el ácido gamma-linolénico (GLA, o ácido all-cis-6,9,12-octadecatrienoico) y el ácido araquidónico [ácido (5Z,8Z,11Z,14Z)-5,8,11,14-Eicosatetraenoico]) son ácidos grasos omega-6. GLA es un ácido graso omega-6 que se encuentra principalmente en aceites de origen vegetal tales como aceite de semilla de borraja, aceite de onagra y aceite de semilla de grosella negra.
Los ácidos grasos omega-3 son vitales para el metabolismo normal. Los omega-3 se consideran ácidos grasos esenciales, es decir, no pueden ser sintetizados por el cuerpo humano excepto por los mamíferos que tienen una capacidad limitada, cuando la dieta incluye el ácido graso omega-3 de cadena más corta ALA, de formar los ácidos grasos omega-3 de cadena larga más importantes, EPA y después de EPA, el más importante, DHA con una eficiencia aún mayor. En la actualidad se acepta que los ácidos grasos poliinsaturados omega-3, especialmente EPA y DHA juegan papeles importantes en un número de aspectos de la salud humana. Sin embargo, la pesca excesiva y las preocupaciones sobre la contaminación del ambiente marino indican una necesidad de desarrollar fuentes alternativas, sostenibles de ácidos grasos poliinsaturados de cadena muy larga (VLC-PUFA) tales como EPA y DHA [1 ]. Los ácidos grasos omega-6 se consideran ácidos grasos esenciales: Estos son necesarios para la salud humana. Junto con los ácidos grasos omega-3, el ácido graso omega-6 juega un papel importante en la función del cerebro, así como el crecimiento y desarrollo normal. Los ácidos grasos omega-3 y el ácido graso omega-6 ayudan a estimular el crecimiento de la piel y el cabello, mantienen la salud ósea, regulan el metabolismo y mantienen el sistema reproductivo [2]. Algunas investigaciones clínicas preliminares sugieren que GLA puede ser útil para la Neuropatía diabética, Artritis reumatoide, Alergias, Eczema, Presión sanguínea alta (Hipertensión), Síntomas menopáusicos, etc. La relación de la ingesta dietética de ácidos grasos esenciales omega-6 y omega-3 se considera importante para la salud de los seres humanos [3].
Hasta la fecha se han reportado una gran cantidad de microorganismos oleaginosos. El aceite que producen, frecuentemente denominado Aceite Microbiano (SCO), es similar a los de las plantas y pueden usarse para la producción de biodiesel, alimentos y productos industriales [4-6]. En la actualidad el SCO es ampliamente aceptado en el mercado y existe una conciencia creciente de los beneficios para la salud de los PUFA, tales como ácido Y-linolénico (GLA), ácido araquidónico (ARA), DHA y EPA. ARA y DHA se han usado además para la fortificación de fórmulas infantiles en muchas partes del mundo. Los aceites de pescado son fuentes ricas en DHA y EPA y una cantidad limitada de semillas oleaginosas vegetales son buenas fuentes de otros PUFA. Los protistas y dinoflagelados marinos, tales como las especies de Thraustochytrium, Schizochytrium y Crypthecodiniumson las fuentes ricas en DHA, mientras que las microalgas como Phaeodactylumy Monodus son buenas fuentes de EPA. Las especies de hongos inferiores Mortierella acumulan un alto porcentaje de ARA en la fracción lipídica [7].
Si bien la levadura Yarrowia lipolytica tal vez ha disfrutado de una larga historia de investigación y desarrollo como un huésped para transformar por bioingeniería para SCO [8-12], Rhodosporidium toruloides (conocido además como Rhodotorula glutenis) ha atraído una mayor atención debido a su capacidad de realizar una fermentación de mayor densidad celular a una rápida tasa de crecimiento, produciendo eficientemente una masa celular con un contenido de aceite de > 67 % (p/p de masa celular seca) [13-16].
El Pucciniomycotina es un subfilo de hongos en el filo de Basidiomycota [17]. Posee muchas especies que tienen importantes aplicaciones industriales. Por ejemplo, un número de especies en los géneros Rhodosporidium y Sporidiobolus, tales como Rhodosporidium toruloides (conocido además como Rhodotorula gracilis, Rhodosporidium glutinis, Rhodotorula glutinis, Torula koishikawensis y Torula rubescens) y Sporobolomyces salmonicolor, son levaduras unicelulares ricas en aceite capaces de una fermentación de alta densidad [6, 18]. Estas especies poseen gran potencial como un huésped para la producción de hidrocarburos de cadena larga, tales como triacilglicerol (TAG, o grasa), ésteres de ácidos grasos (biodiesel), alcoholes grasos, alcoholes, lactonas, terpenoides y vitaminas [14, 19-21].
Los genomas de Rhodosporidium y Rhodotorula son altamente ricos en GC, lo que se ha encontrado que influye profundamente en la transformación genética y la expresión de proteínas [22-24]. La ingeniería metabólica es una técnica eficaz para mejorar la producción de metabolitos en plantas y microbios. En términos de bioingeniería de ácidos grasos omega-3, la expresión de diversas desaturasas y elongasas, tanto en plantas como en levadura oleaginosa, es crítica para la producción de PUFA [25]. GLA se sintetiza a partir de ácido linoleico (LA; C18:2A9,12 cis) por la A6-desaturasa. El aceite de semilla de cártamo (Carthamus tinctorius) contiene alto contenido de LA y se ha modificado mediante la transformación con A6-desaturasas de Mortierella alpina y Saprolegnia diclina para lograr más del 50 % (v/v) de GLA respectivamente [26].
Tanto ALA como GLA son precursores para la producción de ácidos grasos omega-3 de cadenas más largas, tales como ácido araquidónico (AA), EPA y ácido docosahexaenoico (DHA) [7, 27]. Además, la capacidad de producir altos niveles de ALA y GLA con una alta productividad volumétrica es crucial para la bioingeniería de los PUFA de cadena más larga en Rhodosporidium toruloides. Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar especies fúngicas del género Rhodospordium y Rhodotorula que producen altos niveles de ALA y GLA que después están disponibles en las especies fúngicas para la producción de los PUFA de cadena más larga.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere al campo de la biotecnología de hongos, más en particular a métodos de ingeniería genética para la producción de ácidos grasos poliinsaturados omega-3 (PUFA) en huéspedes fúngicos seleccionados de los géneros Rhodospordium y Rhodotorula.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un huésped fúngico que tiene un ácido a-linolénico (ALA) presente en una cantidad de al menos 9 % de ácidos grasos totales en células del huésped fúngico. En una modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodospordium. En otra modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodotorula. En algunas modalidades, el huésped fúngico tiene actividad reducida de un aldehído deshidrogenasa (ALD) nativa que usa un aldehído de ácido graso como un sustrato. La ALD nativa es codificada por un gen de ALD nativa. En una modalidad el gen de ALD nativa codifica una aldehído deshidrogenasa (ALD) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:3. En otra modalidad, el gen de ALD nativa codifica una ALD que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:3. En una modalidad, el gen de ALD nativa tiene la secuencia de nucleótidos genómica expuesta en la SEQ ID NO:1. En otra modalidad, el gen de ALD nativa tiene la secuencia de nucleótidos de ADNc expuesta en la SEQ ID NO:2. En una modalidad adicional, el gen de ALD nativa tiene la secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.
En algunas modalidades, la actividad reducida de la ALD nativa es provocada por la expresión reducida del gen de ALD nativa. La expresión reducida puede ser provocada por cualquier mecanismo genético o epigenético. En una modalidad, la expresión reducida es provocada por un mecanismo del ARNi, tales como siARN, shARN, miARN y similares. En otra modalidad, la expresión reducida es provocada por un represor de la transcripción artificial. En una modalidad adicional, la expresión reducida es provocada por un mecanismo antisentido. En una modalidad, la expresión reducida es provocada por la supresión con sentido. En una modalidad adicional, la actividad reducida es provocada por una mutación del gen nativo. En una modalidad, la mutación puede ser una de sustituciones, deleción, inserciones, adición, o inversión y similares lo que da como resultado una actividad reducida. En otra modalidad, la mutación puede ser provocada mediante recombinación homóloga. En una modalidad adicional, la mutación puede ser provocada mediante la inserción del T-ADN o transposones.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un huésped fúngico que tiene un ácido a-linolénico (ALA) presente en una cantidad de al menos 49 % de ácidos grasos totales en células del huésped fúngico. En una modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodospordium. En otra modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodotorula. En algunas modalidades, el huésped fúngico tiene actividad reducida de un aldehído deshidrogenasa (ALD) nativa como se describe en la presente descripción. En otras modalidades, el genoma del huésped fúngico se ha modificado para incluir establemente dos o más genes que codifican proteínas que están implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos. Los ejemplos de tales proteínas son una acil-CoA delta-12 desaturasa, una estearoil-CoA-delta-9-desaturasa, una omega-3 desaturasa, un ácido graso elongasa, una acetil-CoA carboxilasa (ACC), una ATP: citrato liasa (ACL), una diacilglicerol aciltransferasa (DGA) o una enzima málica (MAE). En algunas modalidades, las secuencias codificantes de tales genes se han modificado para que contengan al menos 55 % de contenido de G y C, preferentemente 60 %-70 % de contenido de G y C. En otras modalidades, al menos el 70 % de los codones tienen una C o G en la tercera posición.
En una modalidad, una ATP:citrato liasa (ACL) tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:88. En otra modalidad, esta ATP:citrato liasa (ACL1) es codificada por un ácido nucleico de ADN genómico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:86. En otra modalidad, esta ATP:citrato liasa (ACL1) es codificada por un ácido nucleico de ADNc que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:87. En otra modalidad, el gen de la ATP:citrato liasa (ACL1) tiene una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En una modalidad, una diacilglicerol aciltransferasa (DGA1) tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:82. En otra modalidad, esta diacilglicerol aciltransferasa (DGA1) es codificada por un ADN genómico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:80. En una modalidad adicional, esta diacilglicerol aciltransferasa (DGA1) es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:81. En otra modalidad, el gen de la diacilglicerol aciltransferasa (DGA1) tiene la secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En una modalidad, una enzima málica (MAE1) tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:85. En otra modalidad, esta enzima málica (MAE1) es codificada por un ácido nucleico de ADN genómico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:83. En una modalidad adicional, esta enzima málica (MAE1) es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:84. En otra modalidad, un gen de la enzima málica (Am E1) tiene una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un huésped fúngico que tiene un ácido gamma-linolénico (GLA) presente en una cantidad de al menos el 30 % de los ácidos grasos totales en células del huésped fúngico. En una modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodospordium. En otra modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodotorula. En algunas modalidades, el huésped fúngico tiene actividad reducida de un aldehído deshidrogenasa (ALD) nativa como se describe en la presente descripción. En otras modalidades, el genoma del huésped fúngico se ha modificado para expresar establemente dos o más genes adicionales que codifican proteínas que están implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos. Los ejemplos de tales proteínas son una acil-CoA delta-12 desaturasa, una estearoil-CoA-delta-9-desaturasa, acil-CoA delta-6 desaturasa, un ácido graso elongasa, una acetil-CoA carboxilasa (ACC), una ATP: citrato liasa (ACL), una diacilglicerol aciltransferasa (DGA) o una enzima málica (MAE). En algunas modalidades, las secuencias codificantes de tales genes se han modificado para que contengan al menos 55 % de contenido de G y C, preferentemente 60 %-70 % de contenido de G y C. En otras modalidades, al menos el 70 % de los codones tienen una C o G en la tercera posición.
En una modalidad, una acetil-CoA carboxilasa (ACC1) tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:91. En otra modalidad, esta acetil-CoA carboxilasa (ACC1) es codificada por un ácido nucleico de ADN genómico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:89. En una modalidad adicional, esta acetil-CoA carboxilasa (ACC1) es codificada por un ácido nucleico de ADNc que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:90. En otra modalidad, el gen de la acetil-CoA carboxilasa (ACC1) tiene la secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En una modalidad, una acil-CoA delta-12 desaturasa tiene una secuencia aminoacídica expuesta en las SEQ ID NO:5 y 94. En otra modalidad, esta acil-CoA delta-12 desaturasa es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NO:4, 92 y NO:93. En otra modalidad, los genes de la acil-CoA delta-12 desaturasa tienen una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente descripción.
En una modalidad, una estearoil-CoA-delta-9-desaturasa tiene una secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:8. En una modalidad, esta estearoil-CoA-delta-9-desaturasa es codificada por un ácido nucleico genómico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:6. En otra modalidad, esta estearoil-CoA-delta-9-desaturasa es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:7. En otra modalidad, el gen de la estearoil-CoA-delta-9-desaturasa tiene una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En una modalidad, una omega-3 desaturasa tiene una secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:10. En una modalidad, esta omega-3 desaturasa es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:9. En una modalidad adicional, una omega-3 desaturasa tiene una secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:12. En una modalidad, esta última omega-3 desaturasa es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:11. En otra modalidad, el gen de la omega-3 desaturasa tiene una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En una modalidad, una acil-CoA delta-6 desaturasa tiene una secuencia aminoacídica expuesta en las SEQ ID NO:96 y 98 en donde las secuencias son codificadas por un ADN que contiene al menos G y C, preferentemente 60 %-70 % de G y C. En otras modalidades, al menos el 70 % de los codones tienen una C o G en la tercera posición. En una modalidad, la acil-CoA delta-6 desaturasa es codificada por un ácido nucleico expuesto en las SEQ ID NO:95 y 97.
En una modalidad, un ácido graso elongasa tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO:101 y 104. En otra modalidad, este ácido graso elongasa es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NO:99, 100, 102 y 103. En otra modalidad, el gen del ácido graso elongasa tiene una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En algunas modalidades, los genes descritos en la presente descripción que se han incorporado establemente en el genoma fúngico se unen operativamente a un promotor que permite la expresión eficiente en especies del género Rhodospordium y el género Rhodotorula. Los promotores para cada gen incorporado pueden ser iguales o diferentes. En algunas modalidades, los promotores son promotores encontrados en especies del género Rhodospordium y el género Rhodotorula. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, promotores de los siguientes genes que codifican las siguientes proteínas: gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GPD), proteína portadora de acil-CoA (ACP), ácido graso desaturasa, factor de alargamiento de la traducción (TEF), piruvato descarboxilasa (PDC), enolasa (2-fosfoglicerato deshidratasa) (ENO), peptidilprolil isomerasa (PPI), acetil-CoA carboxilasa (ACC) o transaldolasa. En otras modalidades, los genes descritos en la presente descripción incluyen además un terminador transcripcional de ARNm que puede encontrarse en cualquier especie eucariota y los virus de ADN.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) omega-3 y omega-6, que comprende cultivar una célula huésped fúngica descrita en la presente descripción en condiciones adecuadas para producir los PUFA. Puede usarse cualquier medio con al menos una fuente de carbono al 5 %, como glucosa, manosa, glicerol, sacarosa. El ejemplo del medio es Medio MinLG que contiene 30-100 g de glucosa, 1.5 g de extracto de levadura, 0.5 g de (NH4)2SO4 , 2.05 g de K2HPO4, 1.45 g de KH2PO4 , 0.6 g de MgSO4 , 0.3 g de NaCl, 10 mg de CaCl2 , 1 mg de FeSO4 , 0.5 mg de ZnSO4 , 0.5 mg de CuSO4 , 0.5 mg de H3BO4 , 0.5 mg de MnSO4 , 0.5 mg de NaMoO4 (por litro). El pH del medio se ajusta a 6-7. El cultivo celular se realiza a 25 °C - 32 °C.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A-1E muestran la organización de T-ADN en constructos usados en esta invención. Todos los vectores binarios tienen la misma cadena principal de pPZP200 [28]. Figura 1A: pEC3GPD-GUS. Figura 1B: pEC3Pxxx-HPT3. Figura 1C: pRH2034. Figura 1D: pRHDGA1 y pRHMAE1. Figura 1E: pRH201. LB: borde izquierdo del T-ADN; RB: borde derecho del T-ADN; Pgpd: promotor de Umgpd1 de 595 pb; Pg p d i: promotor de RtGPDI de 795 pb; Pxxx: diversos promotores; hpt-3: gen de resistencia a higromicina con codón optimizado en base al sesgo en el uso de codones en R. toruloides; GUS: gen de la p-glucuronidasa de E. coli; T35S: terminador del gen de 35S del virus del mosaico de la coliflor; Tnos: terminador del gen de la nopalina sintasa de A. tumefaciens. Se muestran los sitios de corte de enzimas de restricción únicas en el plásmido.
Las Figuras 2A-2C muestran la organización del T-ADN en los constructos usados en esta invención. Todos los vectores binarios tienen la misma cadena principal de pPZP200 [28]. Figura 2A: pRHE001. Figura 2B: pRHE002. Figura 2C: pRHE003. LB: borde izquierdo del T-ADN; RB: borde derecho del T-ADN; Pgpd: promotor de Umgpd1 de 595 pb; Pgpdú promotor de RtGPD1 de 795 pb; hpt-3: gen de resistencia a higromicina con codón optimizado en base al sesgo en el uso de codones en R. toruloides; T35S: terminador del gen de 35S del virus del mosaico de la coliflor; Tnos: terminador del gen de la nopalina sintasa de A. tumefaciens. Se muestran los sitios de corte de enzimas de restricción únicas en el plásmido.
Las Figuras 3A-3C muestran la organización del T-ADN en los constructos usados en esta invención. Todos los vectores binarios tienen la misma cadena principal de pPZP200 [28]. Figura 3A: pRHE004. Figura 3B: pRHE005. Figura 3C: pRHE006. LB: borde izquierdo del T-ADN; RB: borde derecho del T-ADN; Pgpd: promotor de Umgpd1 de 595 pb; Pgpd1: promotor de RtGPD1 de 795 pb; hpt-3: gen de resistencia a higromicina con codón optimizado en base al sesgo en el uso de codones en R. toruloides; T35S: terminador del gen de 35S del virus del mosaico de la coliflor; Tnos: terminador del gen de la nopalina sintasa de A. tumefaciens. Se muestran los sitios de corte de enzimas de restricción únicas en el plásmido.
Las Figuras 4A-4D muestran las cepas mutantes identificadas mediante genética directa. Figura 4A: Comparación de niveles promedio de ALA (C18:3n=9) en el tipo silvestre y en mutantes de T-ADN (RCM) seleccionados contra cerulenina. Figura 4B: Niveles relativos de ALA en un mutante RCM individual. Figura 4C: Comparación de la acumulación de lípidos en el tipo silvestre y en mutantes seleccionados contra violeta de tetrazolio. Figura 4D: Comparación de la acumulación de lípidos en el tipo silvestre y en mutantes seleccionados contra colorante fluorescente rojo Nilo.
Las Figuras 5A-5F muestran los estudios genéticos inversos de ALD1 en R. toruloides. Figura 5A: Diagrama esquemático de ALD1 y su estrategia de deleción. Las secuencias homólogas usadas para la deleción de ALD1 eran de 730 pb y 829 pb de longitud, entre -185 a 535 y 1948 a 2776 desde el codón de inicio de la traducción. Figura 5B: Análisis de la transferencia Southern de A a ld t. La secuencia de ADN marcada con digoxigenina (ALD1R marcada en la Figura 5A) se usó como la sonda contra el ADN genómico digerido con HincII. Figura 5C: Rendimientos relativos de lípidos en el tipo silvestre y en Aaldl el día 3 y 4. Figura 5D: Niveles relativos de ácido a-linolénico (ALA) en el tipo silvestre y en Aaldl. ** representa una diferencia muy significativa mediante la prueba t estadística (P<0.01). Figura 5E: Biomasa celular seca (Biomass) y contenidos de a LA (porcentaje de ácidos grasos totales, % de TFA) del tipo silvestre y de Aaldl. Figura 5F: Colores de células en agar de dextrosa de papa (PDA) y caldo YPD.
La Figura 6 muestra una alineación del aldehído de ácido graso deshidrogenasas de diversas especies de Basidiomycotous. Ab: Agaricus bisporus (EKM75339.1; SEQ ID NO:105); Pc: Phanerochaete camosa (EKM57674.1; SEQ ID NO:106); Mg: Malassezia globosa (XP_001730031.1; SEQ ID NO:107); Sr: Sporisorium reilianum (CBQ71609.1; SEQ ID NO:108); Um: Ustilago maydis (XP_762570.1; SEQ ID NO:109); MI: Melampsora larici-populina(EGG04055.1; SEQ ID NO:110); Pg: Puccinia graminis f. sp. tritici (XP_003338710.1; SEQ ID NO:111); Pt: Puccinia triticina(XP_003338710.1; SEQ ID NO:112); Ps: Puccinia striiformis (locus genómico CQM_00777.1; SEQ ID NO:113); Mv: Microbotryum violaceum(locus genómico MVLG_02667.1; SEQ ID NO:114); Rg2: R. glutinis ATCC 204091(SEQ ID NO:115); Rt3: R. toruloides NP11 (EMS18750.1; SEQ ID NO:116); Rt1: R. toruloides ATCC 10657 (SEQ ID NO:117). [Nota: el Listado de Secuencias incluye solo una secuencia parcial de las SEQ ID NO:112, 113, 115 y 117. Ver la Figura para las secuencias completas.]
Las Figuras 7A-7F muestran los efectos de DGA1 y MAE1 para mejorar la acumulación de lípidos. Figura 7A: Análisis de RT-PCR cuantitativo de DGA1 y MAE1 en R. toruloides ATCC 10657. Las expresiones génicas en los mutantes transformados por ingeniería genética (DGA1 y MAE1) se normalizaron contra la expresión en la cepa de tipo silvestre. Figura 7B: Rendimientos relativos de lípidos en las cepas de tipo silvestre y en dos cepas transformadas por ingeniería genética (tipo silvestre, DGA1 y MAE1). Las cantidades de lípidos se normalizaron contra las cantidades en el tipo silvestre. Figura 7C: Perfiles de ácidos grasos en las cepas anteriores. Los lípidos intracelulares se extrajeron de las cepas anteriores después de un bioproceso de 3 días. Figura 7D: Composición de ácidos grasos insaturados en las cepas anteriores. El % de TFA representa el porcentaje de ácidos grasos totales. Figura 7E: Diagrama esquemático de la deleción de DGA1. Figura 7F: Análisis de la transferencia Southern de Adgal. Los ADN genómicos del tipo silvestre y del mutante candidato se digirieron con HincII y se analizaron contra el fragmento de ADN de DGA1L marcado con DIG como se indica en la Figura 7E.
La Figura 8 muestra los perfiles de ácidos grasos en diferentes cepas de R. toruloides (R. glutinis). Rt1: R. toruloides ATCC 10657; Rt2: R. toruloides ATCC 10788; Rg1: R. glutinis ATCC 90781; Rg2: R. glutinis ATCC 204091. R. toruloides (R. glutinis) se cultivó en medio de acumulación de lípidos (MinLG) como se describió anteriormente [21]con algunas modificaciones. El medio MinLG contiene 30 g de glucosa, 1.5 g de extracto de levadura, 0.5 g de (NH4)2SO4 , 2.05 g de K2HPO4 , 1.45 g de KH2PO4 , 0.6 g de MgSO4 , 0.3 g de NaCl, 10 mg de CaCl2, 1 mg de FeSO4 , 0.5 mg de ZnSO4 , 0.5 mg de CuSO4 , 0.5 mg de H3BO4 , 0.5 mg de MnSO4 , 0.5 mg de NaMoO4 (por litro). El pH del medio se ajustó a 6.1. El cultivo celular se realizó a 28 °C durante 4 días con agitación constante (250 rpm).
Las Figuras 9A y 9B muestran los procesos de ingeniería genética para las cepas con alto contenido de ALA. Figura 9A: Contenido de a La en cepas de tipo silvestre y de desaturasas transformadas por ingeniería genética. Figura 9B: Contenido de ALA en la cepa nula de ald1 (aldle) y la cepa aldle que contiene tanto los casetes génicos RtGPD1:MaFAd2-2 y RtGPD1:LuFAD3-2.
La Figura 10 muestra el ensayo enzimático de ALD1 y de ALD1 truncada en el extremo C-terminal (ALD1n). La reacción se mezcló con tampón Tris-Cl 20 mM (pH8.0), NAD+ o NADP+ 1.5 mM, dodecanal 1.0 mM y 10 pl de enzima purificada. El ensayo se realizó a 25 °C durante 2 min.
Las Figuras 11A-11D muestran la caracterización del gen de la delta-12 desaturasa en R. toruloides ATCC 10657 (RtFAD2). Figura 11A: Análisis de la transferencia Southern de la cepa de tipo silvestre y la cepa con FAD2 inactiva (fad2A). El ADN total se digirió con PstI y la transferencia se hibridó mediante el uso de un fragmento de PCR de homología derecha marcado con digoxigenina de FAD2 (FAD2R, Figura 11C). Figura 11B: Perfil de contenido de ácidos grasos del tipo silvestre y de fad2A realizado en triplicados. Figura 11D: Perfil del contenido de ácidos grasos del tipo silvestre y de fad2A cultivados en medio YNB complementado con y sin LA (C18:2).
Las Figuras 12A-12D muestran la caracterización de los mutantes por deleción de ELO1 y ELO2 en R. toruloides ATCC 10657 (elolA y elo2A) (Figura 12A) y (Figura 12C). Análisis de la transferencia Southern de e lo lA y elo2A. El ADN total se digirió con PvuI y se hibridó contra ELO1R y ELO2L marcados con digoxigenina, respectivamente (Figura 12B) y (Figura 12D). Perfiles del contenido de ácidos grasos de e lo lA y elo2A.
Las Figuras 13A-13E muestran la ilustración esquemática de los vectores usados en la Figura 14. Figura 13A: Constructo de sobreexpresión de FAD1 (delta-9-oleato desaturasa, ELO1). Figura 13B: Constructo de sobreexpresión de FAD2 (delta-12 desaturasa). Figura 13C: Constructo de sobreexpresión de omega-3 desaturasa (delta-15 desaturasa). Figura 13D: Vector de sobreexpresión del gen doble de FAD1 y FAD2. Figura 13E: Vector de sobreexpresión del gen triple de FAD1, FAD2 y omega-3 desaturasa. LB: borde izquierdo del T-ADN; RB: borde derecho del T-Ad N; RgGPD1: promotor de GPD1 de 685 pb derivado de Rhodotorula grammis WP1; RtGPD1: promotor de GPD1 de 795 pb derivado de R. toruloides ATCC 10657; hpt-3: gen de resistencia a higromicina con codón optimizado en base al sesgo en el uso de codones en R. toruloides; TSV40: Terminador del gen del antígeno T largo del virus vacuolante de simio 40; T35S: terminador del gen de 35S del virus del mosaico de la coliflor; Tnos: terminador del gen de la nopalina sintasa de A.
tumefaciens; RtENO1: promotor de la versión de 445 pb del gen ENO1 de R. toruloides ATCC 10657; RtACCI: promotor de la versión de 805 pb del gen ACC1 de R. toruloides ATCC 10657; MaFAD2-2 es la SEQ ID NO:4, y VfFAD3-2 es la SEQ ID NO:11.
Figura 14: Perfil del contenido de ácidos grasos de cepas transformadas. Se usaron tres transformantes independientes para cada análisis excepto para Aald1-OMA2, para el cual se analizaron 18 transformantes independientes totales. Todos los transformantes se fermentaron en medio RL2 durante 5 días. WT: cepa de R. toruloides ATCC 10657 de tipo silvestre; Aaldl-: los constructos se transformaron en mutantes inactivos de ADL1; los constructos se muestran en la Figura 13. OEL1: Figura 13A; MA: Figura 13B; AF3: Figura 13C; OM2: Figura 13D; OMA2: Figura 13E.
Las Figuras 15A-15D muestran la caracterización del gen de la ATP-citrato liasa putativa en R. toruloides ATCC 10657 (RtACL1). Figura 15A: Diagrama esquemático del gen ACL1 y su estrategia de deleción. Figura 15B: Análisis de la transferencia Southern de la cepa inactiva acllA. El ADN total se digirió con PvuI y se hibridó contra ACL1L marcado con digoxigenina. M: Marcador de peso molecular de ADN marcado con digoxigenina VII (Roche Diagnosis, Estados Unidos). Figura 15C: Efectos de la alteración de ACL1 en la biomasa, los rendimientos de lípidos, el contenido de lípidos y la glucosa residual. Figura 15D: Perfil del contenido de ácidos grasos de las cepas de tipo silvestre y acllA.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al campo de la biotecnología fúngica, más en particular a métodos de ingeniería genética para la producción de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en huéspedes fúngicos seleccionados del género Rhodospordium y Rhodotorula.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que se conoce comúnmente por el experto en la técnica a la que pertenece la invención.
Como se usa en la presente descripción, "ALD1" es un aldehído deshidrogenasa que usa aldehídos de ácidos grasos como un sustrato.
Como se usa en la presente descripción, "alelo" se refiere a cualquiera de una o más formas alternativas de un locus génico, todos de cuyos alelos se relacionan con un rasgo o una característica. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen dado ocupan los loci correspondientes de cromosomas homólogos.
Un "dsARN" o "molécula de ARNi," como se usa en la presente descripción en el contexto de ARNi, se refiere a un compuesto, que es capaz de regular negativamente o reducir la expresión de un gen o la actividad del producto de tal gen en una medida suficiente para lograr un efecto biológico o fisiológico deseado. El término "dsARN" o "molécula de ARNi,"" como se usa en la presente descripción, se refiere a uno o más de un dsARN, siARN, shARN, ihpARN, shARN sintético, miARN.
El término "regulado negativamente," cuando se refiere a genes inhibidos por el método del ARNi sujeto, se refiere a una disminución del nivel de expresión de un(os) gene(s) en la presencia de uno o más constructos de ARNi cuando se compara con el nivel en la ausencia de tales constructos de ARNi. El término "regulado negativamente" se usa en la presente descripción para indicar que la expresión del gen diana disminuye en 1-100 %. Por ejemplo, la expresión puede reducirse en alrededor del 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 %.
El término "expresión" con respecto a una secuencia génica se refiere a la transcripción del gen y, según sea apropiado, la traducción del transcripto de ARNm resultante a una proteína. Por lo tanto, como será evidente a partir del contexto, la expresión de una secuencia codificante de proteína resulta de la transcripción y traducción de la secuencia codificante.
Como se usa en la presente descripción, "gen" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que abarca una región promotora 5' asociada con la expresión del producto génico, cualquiera de las regiones de intrones y exones y regiones no traducidas 3' o 5' asociadas con la expresión del producto génico.
El término "silenciamiento génico" se refiere a la supresión de la expresión génica, por ejemplo, expresión de transgenes, de genes heterólogos y/o de genes endógenos. El silenciamiento génico puede estar mediado a través de procesos que afectan la transcripción y/o a través de procesos que afectan los mecanismos postraduccionales. El silenciamiento génico puede ser específico de alelo en donde se produce el silenciamiento específico de un alelo de un gen.
Como se usa en la presente descripción, "genotipo" se refiere a la constitución genética de una célula u organismo.
El término "heterólogo" o "exógeno" cuando se usa con referencia a las porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la naturaleza en la misma relación entre sí. Por ejemplo, el ácido nucleico típicamente se produce por vía recombinante, con dos o más secuencias a partir de genes no relacionados dispuestos para preparar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor a partir de una fuente y una región de codificación a partir de otra fuente. De la misma manera, una proteína heteróloga o exógena indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la naturaleza en la misma relación entre sí (por ejemplo, una proteína de fusión).
El término "homólogo" como se usa en la presente descripción se refiere a un gen relacionado con un segundo gen por descendencia de una secuencia de ADN ancestral común. El término, homólogo, puede aplicarse a la relación entre genes separados por un evento de especiación (ortólogo) o a la relación entre genes separados por el evento de la duplicación genética (parálogo). El término homólogo se usa genéricamente para referirse a todas las especies.
Como se usa en la presente descripción, "fenotipo" se refiere a las características detectables de una célula u organismo, cuyas características son la manifestación de la expresión génica.
Los términos "polinucleótido," "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a un polímero de nucleótidos que pueden ser una disposición lineal y secuencial natural o sintética de nucleótidos y/o nucleósidos, que incluyen ácido desoxirribonucleótio, ácido ribonucleótido y derivados de estos. Esto incluye ADN cromosómico, plásmidos de autorreplicación, polímeros infecciosos de ADN o ARN y ADN o ARN que desempeña un papel principalmente estructural. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos o polinucleótidos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3', los nucleótidos se mencionan mediante sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
Los términos "polipéptido," "péptido," y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más desechos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como también a polímeros de aminoácidos de origen natural. Puede hacerse referencia a los aminoácidos mediante sus símbolos de tres letras o de una letra comúnmente conocidos. Las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
Se entiende que "unión operable" o "unido operablemente" o "unido operativamente" como se usa en la presente descripción significa, por ejemplo, la disposición secuencial de un promotor y el ácido nucleico a expresar y, si es apropiado, los elementos reguladores adicionales tales como, por ejemplo, un terminador, de una manera en que cada uno de los elementos reguladores puede completar su función en la expresión recombinante del ácido nucleico para producir dsARN. Esto no requiere necesariamente la unión directa en el sentido químico. Las secuencias de control genético tales como, por ejemplo, las secuencias potenciadoras, también pueden ejercer su función sobre la secuencia diana desde posiciones que son algo distantes, o de hecho desde otras moléculas de ADN (localización cis o trans). Las disposiciones preferidas son aquellas en las cuales la secuencia de ácido nucleico a expresar de manera recombinante se coloca aguas abajo de la secuencia que actúa como promotor, de manera que las dos secuencias se unen covalentemente entre sí. Las secuencias reguladoras o de control pueden colocarse en el lado 5' de la secuencia de nucleótidos o en el lado 3' de la secuencia de nucleótidos como se conoce bien en la técnica.
El término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor. Tal rango puede estar dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro del 50 %, con mayor preferencia dentro del 20 %, aún con mayor preferencia dentro del 10 %, e incluso con mayor preferencia dentro del 5 % de un valor o intervalo dado. La variación permisible abarcada por el término "alrededor de" o "aproximadamente" depende del sistema particular en estudio, y puede ser apreciada fácilmente por un experto en la técnica.
Como se usa en la presente descripción, el término "identidad de secuencia," "similitud de secuencia" u "homología" se usa para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de nucleótidos. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencia se determina mediante la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación tal como la longitud completa de una SEQ ID NO: de referencia, en donde la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácidos nucleicos o el residuo de aminoácido es idéntico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Se dice que una secuencia que es idéntica en cada posición en comparación con una secuencia de referencia es idéntica a la secuencia de referencia y viceversa. Se dice que una primera secuencia de nucleótidos cuando se observa en la dirección 5' a 3' es un "complemento" de, o es complementaria a, una segunda secuencia o secuencia de nucleótidos de referencia observada en la dirección 3' a 5' si la primera secuencia de nucleótidos exhibe complementariedad completa con la segunda secuencia o secuencia de referencia. Tal como se usa en la presente descripción, se dice que las moléculas de la secuencia de ácido nucleico exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las secuencias leídas en la dirección 5' a 3' es complementario a cada nucleótido de la otra secuencia cuando se lee en la dirección 3' a 5'. Una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de referencia exhibirá una secuencia idéntica a la secuencia complementaria inversa de la secuencia de nucleótidos de referencia. Estos términos y descripciones se definen bien en la técnica y se entienden fácilmente por los expertos en la técnica.
Como se usa en la presente descripción, una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, usualmente alrededor de 50 a alrededor 100, más usualmente alrededor de 100 a alrededor de 150, en el cual una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima. La ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) de alrededor de 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Los expertos en la técnica deben referirse a los métodos detallados usados para la alineación de secuencias, tal como en el Paquete de Software Release 7.0 de Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wise., Estados Unidos).
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un huésped fúngico que tiene un ácido a-linolénico (ALA) presente en una cantidad de al menos 9 % de ácidos grasos totales en células del huésped fúngico. En una modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodospordium. En otra modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodotorula. En algunas modalidades, el huésped fúngico tiene actividad reducida de un aldehído deshidrogenasa (ALD) nativa que usa un aldehído de ácido graso como un sustrato. La ALD nativa es codificada por un gen de ALD nativa. En una modalidad el gen de ALD nativa codifica una aldehído deshidrogenasa (ALD) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:3. En otra modalidad, el gen de ALD nativa codifica una ALD que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:3. En una modalidad, el gen de ALD nativa tiene la secuencia de nucleótidos genómica expuesta en la SEQ ID NO:1. En otra modalidad, el gen de ALD nativa tiene la secuencia de nucleótidos de ADNc expuesta en la SEQ ID NO:2. En una modalidad adicional, el gen de ALD nativa tiene la secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.
En algunas modalidades, la actividad reducida de la ALD nativa es provocada por la expresión reducida del gen de ALD nativa. La expresión reducida puede ser provocada por cualquier mecanismo genético o epigenético. En una modalidad, la expresión reducida es provocada por un mecanismo del ARNi, tales como siARN, shARN, miARN y similares. En otra modalidad, la expresión reducida es provocada por un represor de la transcripción artificial. En una modalidad adicional, la expresión reducida es provocada por un mecanismo antisentido. En una modalidad, la expresión reducida es provocada por la supresión con sentido. En una modalidad adicional, la actividad reducida es provocada por una mutación del gen nativo. En una modalidad, la mutación puede ser una de sustituciones, deleción, inserciones, adición, o inversión y similares lo que da como resultado una actividad reducida. En otra modalidad, la mutación puede ser provocada mediante recombinación homóloga. En una modalidad adicional, la mutación puede ser provocada mediante la inserción del T-ADN o transposones.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un huésped fúngico que tiene un ácido a-linolénico (ALA) presente en una cantidad de al menos 49 % de ácidos grasos totales en células del huésped fúngico. En una modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodospordium. En otra modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodotorula. En algunas modalidades, el huésped fúngico tiene actividad reducida de un aldehído deshidrogenasa (ALD) nativa como se describe en la presente descripción. En otras modalidades, el genoma del huésped fúngico se ha modificado para incluir establemente dos o más genes que codifican proteínas que están implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos. Los ejemplos de tales proteínas son una acil-CoA delta-12 desaturasa, una estearoil-CoA-delta-9-desaturasa, una omega-3 desaturasa, un ácido graso elongasa, una acetil-CoA carboxilasa (ACC), una ATP: citrato liasa (ACL), una diacilglicerol aciltransferasa (DGA) o una enzima málica (MAE). En algunas modalidades, las secuencias codificantes de tales genes se han modificado para que contengan al menos 55 % de contenido de G y C, preferentemente 60 %-70 % de contenido de G y C. En otras modalidades, al menos el 70 % de los codones tienen una C o G en la tercera posición.
En una modalidad, una ATP:citrato liasa (ACL) tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:88. En otra modalidad, esta ATP:citrato liasa (ACL1) es codificada por un ácido nucleico de ADN genómico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:86. En otra modalidad, esta ATP:citrato liasa (ACL1) es codificada por un ácido nucleico de ADNc que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:87. En otra modalidad, el gen de la ATP:citrato liasa (ACZ1) tiene una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En una modalidad, una diacilglicerol aciltransferasa (DGA1) tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:82. En otra modalidad, esta diacilglicerol aciltransferasa (DGA1) es codificada por un ADN genómico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:80. En una modalidad adicional, esta diacilglicerol aciltransferasa (DGA1) es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:81. En otra modalidad, el gen de la diacilglicerol aciltransferasa (DGA1) tiene la secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En una modalidad, una enzima málica (MAE1) tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:85. En otra modalidad, esta enzima málica (MAE1) es codificada por un ácido nucleico de ADN genómico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:83. En una modalidad adicional, esta enzima málica (MAE1) es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:84. En otra modalidad, un gen de la enzima mélica (MAE1) tiene una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un huésped fúngico que tiene un ácido gamma-linolénico (GLA) presente en una cantidad de al menos el 30 % de los ácidos grasos totales en células del huésped fúngico. En una modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodospordium. En otra modalidad, el huésped fúngico es una especie del género Rhodotorula. En algunas modalidades, el huésped fúngico tiene actividad reducida de un aldehído deshidrogenasa (ALD) nativa como se describe en la presente descripción. En otras modalidades, el genoma del huésped fúngico se ha modificado para expresar establemente dos o más genes adicionales que codifican proteínas que están implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos. Los ejemplos de tales proteínas son una acil-CoA delta-12 desaturasa, una estearoil-CoA-delta-9-desaturasa, acil-CoA delta-6 desaturasa, un ácido graso elongasa, una acetil-CoA carboxilasa (ACC), una ATP: citrato liasa (ACL), una diacilglicerol aciltransferasa (DGA) o una enzima málica (MAE). En algunas modalidades, las secuencias codificantes de tales genes contienen al menos 55 % de contenido de G y C, preferentemente 60 %-70 % de contenido de G y C. En otras modalidades, al menos el 70 % de los codones tienen una C o G en la tercera posición.
En una modalidad, una acetil-CoA carboxilasa (ACC) tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:91. En otra modalidad, esta acetil-CoA carboxilasa (ACC1) es codificada por un ácido nucleico de ADN genómico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:89. En una modalidad adicional, esta acetil-CoA carboxilasa (ACC1) es codificada por un ácido nucleico de ADNc que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID N:90. En otra modalidad, el gen de la acetil-CoA carboxilasa (ACC1) tiene la secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En una modalidad, una acil-CoA delta-12 desaturasa tiene una secuencia aminoacídica expuesta en las SEQ ID NO:5 y 94. En otra modalidad, esta acil-CoA delta-12 desaturasa es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NO:4, 92 y NO:93. En otra modalidad, los genes de la acil-CoA delta-12 desaturasa tienen una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente descripción.
En una modalidad, una estearoil-CoA-delta-9-desaturasa tiene una secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:8. En una modalidad, esta estearoil-CoA-delta-9-desaturasa es codificada por un ácido nucleico genómico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:6. En otra modalidad, esta estearoil-CoA-delta-9-desaturasa es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:7. En otra modalidad, el gen de la estearoil-CoA-delta-9-desaturasa tiene una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En una modalidad, una omega-3 desaturasa tiene una secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:10. En una modalidad, esta omega-3 desaturasa es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:9. En una modalidad adicional, una omega-3 desaturasa tiene una secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:12. En una modalidad, esta última omega-3 desaturasa es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:11. En otra modalidad, el gen de la omega-3 desaturasa tiene una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En una modalidad, una acil-CoA delta-6 desaturasa tiene una secuencia aminoacídica expuesta en las SEQ ID NO:96 y 98 en donde las secuencias son codificadas por un ADN que contiene al menos G y C, preferentemente 60 %-70 % de G y C. En otras modalidades, al menos el 70 % de los codones tienen una C o G en la tercera posición. En una modalidad, la acil-CoA delta-6 desaturasa es codificada por un ácido nucleico expuesto en las SEQ ID NO:95 y 97.
En una modalidad, un ácido graso elongasa tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO:101 y 104. En otra modalidad, este ácido graso elongasa es codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NO:99, 100, 102 y 103. En otra modalidad, el gen del ácido graso elongasa tiene una secuencia de nucleótidos que tiene 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción.
En algunas modalidades, los genes descritos en la presente descripción que se han incorporado establemente en el genoma fúngico se unen operativamente a un promotor que permite la expresión eficiente en especies del género Rhodospordium y el género Rhodotorula. Los promotores para cada gen incorporado pueden ser iguales o diferentes. En algunas modalidades, los promotores son promotores encontrados en especies del género Rhodospordium y el género Rhodotorula. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, promotores de los siguientes genes que codifican las siguientes proteínas: gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GPD), proteína portadora de acil-CoA (ACP), ácido graso desaturasa, factor de alargamiento de la traducción (TEF), piruvato decarboxilasa (PDC), enolasa (2-fosfoglicerato deshidratasa) (ENO), peptidilprolil isomerasa (PPI), acetil-CoA carboxilasa (ACC) o transaldolasa. En otras modalidades, los genes descritos en la presente descripción incluyen además un terminador transcripcional de ARNm que puede encontrarse en cualquier especie eucariota y los virus de ADN.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) omega-3 y omega-6 que comprende cultivar una célula huésped fúngica descrita en la presente descripción en condiciones adecuadas para producir los PUFA. Puede usarse cualquier medio con al menos una fuente de carbono al 5 %, como glucosa, manosa, glicerol, sacarosa. Un ejemplo del medio es Medio MinLG que contiene 30-100 g de glucosa, 1.5 g de extracto de levadura, 0.5 g de (NH4)2SO4 , 2.05 g de K2HPO4, 1.45 g de KH2PO4 , 0.6 g de MgSO4 , 0.3 g de NaCl, 10 mg de CaCl2 , 1 mg de FeSO4 , 0.5 mg de ZnSO4 , 0.5 mg de CuSO4 , 0.5 mg de H3BO4 , 0.5 mg de MnSO4 , 0.5 mg de NaMoO4 (por litro). El pH del medio se ajusta a 6-7. El cultivo celular se realiza a 25 °C - 32 °C.
En algunas modalidades, los genes descritos en la presente descripción que se han incorporado establemente en el genoma fúngico se unen operativamente a un promotor que permite la expresión eficiente en especies del género Rhodospordium y el género Rhodotorula. Los promotores para cada gen incorporado pueden ser iguales o diferentes. En algunas modalidades, los promotores son promotores encontrados en especies del género Rhodospordium y el género Rhodotorula. En otras modalidades, los promotores son promotores encontrados en otras especies fúngicas. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, promotores de los siguientes genes que codifican las siguientes proteínas: gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GPD), proteína portadora de acil-CoA (ACP), ácido graso desaturasa, factor de alargamiento de la traducción (TEF), piruvato decarboxilasa (PDC), enolasa (2-fosfoglicerato deshidratasa) (ENO), peptidilprolil isomerasa (PPI), acetil-CoA carboxilasa (ACC) o transaldolasa. En otras modalidades, los genes descritos en la presente descripción incluyen además un terminador transcripcional de ARNm que puede encontrarse en cualquier especie eucariota y los virus de ADN.
En algunas modalidades, un promotor adecuado es uno descrito en la publicación de solicitud de patente internacional núm. WO 2012/169969. Esta solicitud publicada describe varias secuencias polinucleotídicas derivadas de la región aguas arriba del gen de la gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GPD1), gen del factor de inicio de la traducción (TEF1), y el gen de la estearoil-CoA-delta 9-desaturasa (FAD1) que funcionan como promotores en hongos. Los promotores descritos en esta solicitud publicada se exponen en las SEQ ID NO:55-62. En otras modalidades, los promotores adicionales se describen en la solicitud de patente internacional núm. PCT/SG2014/000114 presentada el 10 de marzo de 2014. En una modalidad, las secuencias promotoras comprenden la secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO:63-79. En otra modalidad, las secuencias promotoras polinucleotídicas comprenden la secuencia promotora de cualquiera de las SEQ ID NO:63-79, es decir, la secuencia sin los sitios de clonación.
Además, los fragmentos operables de las secuencias promotoras descritas en la presente descripción pueden aislarse mediante el uso de ensayos convencionales de tamizaje de promotores y pueden tamizarse para la selección eficiente de las células fúngicas transformadas mediante el uso de las técnicas descritas en la presente descripción. En una modalidad, un fragmento operable, también denominado una porción promotora en la presente descripción, tiene alrededor de 400 pares de bases hasta alrededor de 1100 pares de bases de longitud comenzando desde la posición -1 del codón ATG. Como se usa en la presente descripción "hasta" se refiere a la longitud de la porción promotora de los promotores establecidos en las SEQ ID NO descritas. Por lo tanto, "hasta" se refiere a la longitud máxima de la secuencia promotora si hay menos de 1100 nucleótidos de los promotores de las SEQ ID NO descritas.
En una modalidad, se proporciona una secuencia promotora que tiene al menos 60 % de identidad con cualquiera de estas secuencias promotoras. En otra modalidad, se proporciona una secuencia promotora que tiene al menos 70 % de identidad con cualquiera de estas secuencias promotoras. En una modalidad adicional, se proporciona una secuencia promotora que tiene al menos 80 % de identidad con cualquiera de estas secuencias promotoras. En una modalidad adicional, se proporciona una secuencia promotora que tiene al menos 90 % de identidad con cualquiera de estas secuencias promotoras. En otra modalidad, se proporciona una secuencia promotora que tiene al menos 95 % de identidad con cualquiera de estas secuencias promotoras. En otra modalidad, se proporciona una secuencia promotora que tiene al menos 98 % de identidad con cualquiera de estas secuencias promotoras.
Los genes a incorporar establemente en el genoma fúngico están típicamente en la forma de un constructo de ADN o polinucleótidos que comprende las secuencias promotoras descritas en la presente descripción, una secuencia codificante de polipéptido unida operablemente descrita en la presente descripción y una secuencia terminadora transcripcional de ARN unida operablemente. En una modalidad, puede usarse cualquier terminador transcripcional operable en las especies de los hongos. Los terminadores se ubican típicamente aguas abajo (3') del gen, después del codón de parada (TGA, TAG o TAA). Los terminadores desempeñan un papel importante en el procesamiento y la estabilidad del ARN, así como también en la traducción. La mayoría, pero no todos los terminadores, contienen una secuencia de poliadenilación o sitio de escisión. Ejemplos de secuencias específicas de poliadenilación son AAUAAA o AAUAAU. Estas secuencias se conocen como los elementos próximos aguas arriba (NUE) (Nagaya y otros, 2010). Los NUE usualmente residen aproximadamente 30 pb de una región rica en GU (Mogen y otros, 1990; Mogen y otros, 1992; Rothnie y otros 1994), conocida con elementos lejanos aguas arriba (FUE). Los FUE potencian el procesamiento en la secuencia de poliadenilación o el sitio de escisión, que usualmente es un CA o UA en una región rica en U (Bassett, 2007). Dentro del terminador, existen elementos que aumentan la estabilidad del ARN transcrito (Ohme-Takagi y otros, 1993; Newman y otros, 1993; Gutiérrez y otros, 1999) y que también pueden controlar la expresión génica (Ingelbrecht, 1989; An y otros, 1989).
Un constructo de ADN o ácidos nucleicos que comprende un promotor operable de hongos, secuencia de ADN codificante de proteína y un terminador operable de hongos puede denominarse también en la presente descripción como un casete de expresión. El casete de expresión puede incluir otras regiones reguladoras transcripcionales como las que se conocen bien en la técnica. En otras modalidades, el constructo de ADN o ácidos nucleicos o casete de expresión comprende además un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables son bien conocidos por el experto ya que son casetes de expresión que incorporan tales marcadores seleccionables y promotores para conducir su expresión, tales como los descritos en la publicación de la solicitud de patente internacional núm. WO 2012/169969. Cualquier promotor adecuado unido operablemente a cualquier marcador seleccionable adecuado puede usarse en la presente invención.
En una modalidad, la secuencia codificante para el marcador seleccionable es una que existe ya sea de manera natural o se crea artificialmente y contiene al menos alrededor del 60 % de GC. En una segunda modalidad, la secuencia codificante para el marcador seleccionable es una que existe ya sea de manera natural o se crea artificialmente y contiene alrededor del 70 % de GC. En una tercera modalidad, la secuencia codificante para el marcador seleccionable es una que existe ya sea de manera natural o se crea artificialmente y contiene alrededor del 75 % de GC. En una modalidad, al menos alrededor del 70 % de los tripletes de codones de tales secuencias codificantes terminan en C o G. En otra modalidad, más de alrededor del 80 % de los tripletes de codones de tales secuencias codificantes terminan en C o G. En una modalidad, la secuencia codificante para un marcador seleccionable es al menos el 60 % de GC, preferentemente alrededor del 70 % de GC y con la máxima preferencia alrededor del 75 % de GC en la cual al menos el 70 % de los tripletes de codones terminan en C o G, preferentemente más del 80 % de los tripletes de codones terminan en C o G. En una modalidad, tales secuencias codificantes se componen de codones UCG en al menos alrededor del 40 % de los residuos de serina (Ser) totales.
En algunas modalidades, el marcador seleccionable es parte de un sistema libre de marcadores de la recombinación. En una modalidad, el sistema libre de marcadores de la recombinación es un sistema libre de marcadores de la recombinación Cre-lox, tal como el descrito por Zuo y otros [29]. Un sistema tal es útil para producir plantas transgénicas libres de marcadores de selección, que incluyen plantas de Jatropha transgénicas. En algunas modalidades, el sistema libre de marcadores de la recombinación se ubica entre el promotor operable de plantas y los uno o más fragmentos de ácidos nucleicos. En esta modalidad, la eliminación del gen marcador mediante el evento de recombinación coloca el promotor operable de plantas en unión operable con el uno o más fragmentos de ácidos nucleicos como se describe en la presente descripción.
En la preparación del constructo de ácido nucleico o un casete de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse, para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, según sea apropiado, en el marco de lectura apropiado. Hacia este fin, los adaptadores o enlazadores pueden emplearse para unir los fragmentos de ADN o pueden estar implicadas otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminar ADN superfluo, eliminar sitios de restricción, o similares. Para este propósito, pueden estar implicadas la mutagénesis in vitro, reparación con cebadores, restricción, apareamiento, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.
Los ácidos nucleicos de la presente invención también pueden sintetizarse, ya sea completamente o en parte, especialmente cuando sea deseable proporcionar secuencias preferidas de plantas, mediante métodos conocidos en la técnica. Por lo tanto, todo o una porción de los ácidos nucleicos de la presente invención pueden sintetizarse mediante el uso de codones preferidos por un huésped seleccionado. Los codones preferidos de especies pueden determinarse, por ejemplo, a partir de los codones usados más frecuentemente en las proteínas expresadas en una especie de huésped particular. Otras modificaciones de las secuencias de nucleótidos pueden dar como resultado mutantes que tienen actividad ligeramente alterada.
Puede ser útil generar un número de hongos individuales transformados con cualquier constructo recombinante para recuperar hongos libres de cualquier efecto posicional. También puede ser preferible seleccionar los hongos que contienen más de una copia del constructo de polinucleótido introducido de manera que se obtengan niveles altos de expresión de la molécula recombinante.
Puede ser conveniente producir líneas fúngicas que sean homocigóticas para un gen particular si es posible en las especies particulares. En algunas especies esto se logra mediante el uso de cultivos monospóricos. Al usar estas técnicas, es posible producir una línea haploide que porta el gen insertado y después duplicar el número de cromosomas de manera espontánea o mediante el uso de colchicina. Esto da lugar a un hongo que es homocigótico para el gen insertado, que puede evaluarse fácilmente si el gen insertado porta un gen de marcador de selección adecuado para la detección de los hongos que portan el gen. Alternativamente, los hongos pueden autofertilizarse, lo que conduce a la producción de una mezcla de esporas que consiste en, en el caso más simple, tres tipos, homocigotos (25 %), heterocigotos (50 %) y nulos (25 %) para el gen insertado. Aunque es relativamente fácil clasificar los hongos nulos de aquellos que contienen el gen, es posible en la práctica clasificar los hongos homocigotos de los heterocigotos mediante análisis de la transferencia Southern en el que se presta atención cuidadosa a cargar las cantidades exactamente equivalentes de ADN de la población mezclada, y se clasifica los heterocigotos por la intensidad de la señal de una sonda específica para el gen insertado. Es recomendable verificar los resultados del análisis de la transferencia Southern permitiendo que cada transformante independiente se autofertilice, dado que puede obtenerse evidencia adicional para homocigosis por el simple hecho que si los hongos eran homocigotos para el gen insertado, todas las líneas fúngicas subsecuentes del propio individuo contendrán el gen, mientras que si el hongo era heterocigoto para el gen, la generación que crece de la propia semilla contendrá líneas fúngicas nulas. Por lo tanto, con la simple autofertilización se puede seleccionar líneas fúngicas homocigotas que también pueden confirmarse por el análisis de la transferencia Southern.
La creación de líneas parentales homocigotas hace posible la producción de hongos y esporas híbridos que contendrán un componente proteico modificado. Las líneas parentales homocigotas transgénicas se mantienen con cada parental que contiene la primera o segunda secuencia de ADN recombinante unida operablemente a un promotor. También se incorpora en este esquema las ventajas de cultivar un cultivo híbrido, que incluye la combinación de los rasgos más valiosos y vigor híbrido.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, genética, inmunología biología celular, cultivo celular y biología transgénica, que están dentro del estado de la técnica. Ver, por ejemplo, Maniatis y otros, 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York); Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning, 2da Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York); Sambrook y Russell, 2001, Molecular Cloning, 3ra Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York); Green y Sambrook, 2012, Molecular Cloning, 4ta Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York); Ausubel y otros, 1992, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, incluidas las actualizaciones periódicas); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Russell, 1984, Molecular biology of plants: a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, Nueva York, 1992); Guthrie y Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, Nueva York, 1991); Harlow y Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.
1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu y otros eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6ta Edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Fire y otros, ARN Interference Technology: From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge, 2005; Schepers, RNA Interference in Practice, Wiley-VCH, 2005; Engelke, RNA Interference (RNAi): The Nuts & Bolts of siRNA Technology, DNA Press, 2003; Gott, RNA Interference, Editing, and Modification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Human Press, Totowa, NJ, 2004; Sohail, Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application, CRC, 2004.
EJEMPLOS
La presente invención se describe como referencia a los siguientes Ejemplos, que se ofrecen a modo de ilustración y no pretenden limitar la invención de ninguna manera. Se utilizaron técnicas estándar bien conocidas en la técnica o técnicas específicamente descritas a continuación.
Ejemplo 1
Cepas, químicos, medios y condiciones de cultivo
Las cepas de R. toruloides ATCC 10657 y ATCC 10788; la cepa de R. glutinis ATCC 90781 y la cepa de R. glutinis ATCC 204091 se adquirieron de ATCC (Estados Unidos). La cepa de R. graminis WP1 y la Sporobolomyces roseusFGSC 10293 (LAM13481) se obtuvieron de Fungal Genetics Stock Center (Universidad de Missouri, Estados Unidos). La cepa de A. tumefaciens AGL1 [30]se usó para la transformación mediadaporAgrobacterium tumefaceins (ATMT). La higromicina B se compró de Roche Diagnostics (Estados Unidos). Las membranas de nailon N y N+ (O 82 mm, 0.45 pm) se obtuvieron de GE Healthcare (Uppsala, Suecia). La cerulenina (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) se produjo como solución base de 5 mg/ml en DMSO. Otros químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich a menos que se indique lo contrario.
Las cepas de Rhodosporidium se mantuvieron a 28 °C en caldo YPD (extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 %, glucosa al 2 %) o en agar de patata-dextrosa sólido (PDA). A. tumefaciens se cultivó a 28 °C en medio 2YT ya sea líquido o sólido (triptona al 1.6 %, extracto de levadura al 1 %, NaCl al 0.5 %). R. toruloidesse cultivó en medio de acumulación de lípidos a 30 °C con agitación constante (200 rpm) como se describió anteriormente [21]con algunas modificaciones. El medio MinLG contiene (por litro) 30 g de glucosa, 1.5 g extracto de levadura, 0.5 g de (NH4)2SO4 , 2.05 g de K2HPO4 , 1.45 g de KH2PO4 , 0.6 g de MgSO4 , 0.3 g de NaCl, 10 mg de CaCl2 , 1 mg de FeSO4 , 0.5 mg de ZnSO4 , 0.5 mg de CuSO4 , 0.5 mg de H3BO4 , 0.5 mg de MnSO4 , 0.5 mg de NaMoO4 (pH6). Para el análisis de la expresión génica, se usó una variante con limitación de nitrógeno, MinLG-N que se modifica a partir de MinLG con las concentraciones de extracto de levadura y de sulfato de amonio reducidas a 0.3 y 0.1 g/l respectivamente. El proceso de acumulación de lípidos se realizó a 30 °C con agitación constante (200 rpm).
Ejemplo 2
Constructos de ADN
Los oligonucleótidos usados se enumeran en la Tabla 1. Todas las enzimas de restricción y modificación se adquirieron de New England Biolabs (NEB, Massachusetts, Estados Unidos). El vector binario pEX2 es un derivado de pPZP200 usado para la selección dominante mediante el uso de higromicina B [22].
Tabla 1
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Se han descrito anteriormente diversos promotores, tales como gpdl de U. maydis (Pgpd, 595 pb de longitud) [31, 32], gpdA de Aspergillus nidulans (PgpdA, 884 pb) [33], gen del factor de alargamiento traduccional 1a de Ashbya gossypii (Ptef, 348 pb) [34]y RtGPDI (1429 pb) [22]. Los fragmentos de ADN promotor se obtuvieron mediante PCR mediante el uso de ADN plasmídico como plantilla y el par de cebadores Pgpd-Sf/Pgpd-Nr, PgpdA-Sf/PgpdA-Nr, Ptef-Sf/Ptef-Nr y Rt011S/Rt012N para Pgpd, PgpdA, Ptef y PRtGPD1 respectivamente. Los fragmentos de PCR resultantes se digirieron con SpeI y NcoI y se usaron individualmente para la ligación de 3 fragmentos con el fragmento de hpt-3 sintético digerido con BspHI/SmaI de 1030 pb [22] y el vector pEC3GPD-GUS digerido con SpeI/SacI (con extremos romos) de 8855 pb (Figura 1), para generar pEC3GPD-HPT3, pEC3GPDA-HPT3, pEC3TEF-HPT3 y pEC3GPDR-HPT3, respectivamente (Figura 1).
Para generar mutantes inactivos de ALD1 y DGA1, se amplificaron secuencias codificantes completas y parciales (3 kb y 2.8 kb para ALD1 y DGA1, respectivamente) mediante el uso de ADN total de R. toruloides ATCC 10657 como la plantilla y los pares de oligos ALD1Lf/ALD1Rr y Rt113/Rt114 como cebadores respectivamente. Los productos de p Cr con extremos romos se ligaron al vector pEX2 digerido doblemente con PmeIlSacI después del tratamiento con T4 ADN polimerasa en la presencia de dNTP para generar los plásmidos intermedios pEX2ALD1 y pEX2DGA1, a los cuales se insertó el casete de resistencia a higromicina con extremos romos PGPD1.:hpt-3::Tnos amplificados a partir del plásmido pRH2031 en el sitio de XhoI/BspHI y SmaI/SpeI respectivamente para generar los plásmidos de transformación de genes pKOALD1 y pKODGA1.
El gen de la diacil glicerol acil-transferasa DGA1 (número de acceso de GenBank AB453835) y el gen de la enzima málica mitocondrial MAE1 (etiqueta del locus RTG_03106 en el andamio genómico GL989657 de Rhodotorula glutinis ATCC 204091) se amplificaron mediante el uso de la plantilla de ADNc de R. toruloides ATCC 10657 yR. glutinis ATCC 204091, respectivamente. Se usaron los pares de cebadores Rt055N/Rt056Ev y Rt057N/Rt058Ev para la amplificación de DGA1 y MAE1, respectivamente. Ambos productos de PCR se digirieron con NcoI y EcoRV, se ligaron con pRH2034 digerido doblemente con NcoI/EcoRV, el cual contenía un casete de expresión de proteínas que contenía el promotor RtGPD1 de 795 pb y el terminador del gen de 35S del virus del mosaico de coliflor y un casete de selección con higromicina Umgpd::HPT-3:nos específico de Cre-recombinasa [22]para generar pRHDGAl y pRHMAE1 (Figura 1).
Para estudios de transformación por ingeniería genética en ácido a-linolénico, los genes optimizados con codones que codifican la A12 desaturasa MaFAD2 de Mortierella alpine (SEQ ID NO:5), omega-3 desaturasa LuFAD3 de Linum usitatissimum (número de acceso de GenBank ABA02173.1; SEQ ID NO:10) y omega-3 desaturasa VfFAD3 de Vernicia fordii (conocido además como Aleurites fordii) (SEQ ID NO:12) se sintetizaron de acuerdo con la preferencia de codones de R. toruloides,generando genes sintéticos, MaFAD2-2 (SEQ ID NO:4), LuFAD3-2 (SEQ ID NO:9) y VfFAD3-2 (SEQ ID NO:11), que se insertaron a pRH2034 bajo la regulación del promotor RtGPD1 para generar pRHE001, pRHE002 y pRHE003, respectivamente (Figura 2). Para producir el casete de sobreexpresión de genes dobles FAD2-FAD3, los casetes VfFAD3-2 y LuFAD3-2 se amplificaron a partir de los plásmidos pRHE002 y pRHE003 mediante el uso de los oligos Rt012Sf/35T-Pmr, se digirieron con SpeI (con extremos romos) y PmeI y se ligaron con pRHE001 cortado con PmeI para generar los plásmidos pRHE004 y pRHE005, respectivamente (Figura 3). De manera similar, el casete de MAE1 se amplificó a partir de pRHMAE1, se digirió con (SpeI-PmeI), con extremos romos y posteriormente se ligó con pRHDGA1 cortado con PmeI para generar el plásmido pRHE006 (Figura 3).
Ejemplo 3
Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens
Los vectores binarios se electroporaron en AGL1 de A. tumefaciens (2.5 kV, 25 pF, 400 O) y posteriormente se seleccionaron con medio de agar 2YT complementado con estreptomicina (100 pg/ml). La transformación de hongos a través de ATMT se realizó como se describió anteriormente a menos que se indique lo contrario [22].
Ejemplo 4
Análisis de la transferencia Southern
El ADN genómico de R. toruloides se extrajo como se describió anteriormente [22]. El ADN genómico se digirió con PstI y se separó mediante electroforesis en geles de agarosa al 0.8 % y la sonda marcada con DIG del fragmento del gen hpt-3 parcial (de 375 a 1036 nt) se amplificó mediante el uso de los oligos HptRU y HptRSL2. Para el análisis de deleción de genes, los ADN genómicos se digirieron con HincII, PstI y HincII para los mutantes inactivos putativos Aaldl y Adgal, respectivamente. Las sondas marcadas con DIG de aproximadamente 0.6 kb de la secuencia flanqueante aguas arriba de ALD1 y DGA1se amplificaron mediante el uso de los oligos Rt148/Rt149 y Rt113/Dga1-1 respectivamente. La hibridación Southern se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Kit II iniciador del marcaje y detección de ADN con sondas con alto contenido de DIG, Roche Diagnostics).
Ejemplo 5
PCR de transcripción inversa cuantitativa (q-RT-PCR)
El ARN total de R. toruloides se extrajo como se describió anteriormente [22]. Para eliminar la traza de ADN contaminante, las muestras de ARN se trataron con DNasa I (Roche Diagnostics, Estados Unidos) seguido de la precipitación con etanol. El ADNc se sintetizó mediante el uso del sistema de transcripción inversa Improm-II (Promega, Estados Unidos) y la PCR en tiempo real se realizó en la máquina de PCR en tiempo real iCycler™ (Bio-Rad, Estados Unidos) mediante el uso de la Supermezcla de qPCR Platinum SYBR-Green (Invitrogen, Estados Unidos). Las condiciones en tiempo real fueron las siguientes: una etapa de desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 min seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, apareamiento a 58 °C durante 15 s y etapa de extensión a 72 °C durante 15 s. Los datos se adquirieron mediante el uso del software iCycler™ (Bio-Rad). El nivel de expresión del ARNm de RtGPDI se usó como la referencia para la normalización de la expresión del gen diana.
Ejemplo 6
Identificación de las posiciones de etiquetado del T-ADN
Las posiciones de las etiquetas del T-ADN en el genoma se identificaron mediante el uso de la PCR térmica de entrelazado asimétrico de alta eficiencia (hiTAIL-PCR) [35, 36]. Los cebadores específicos (HRSP1, HRSP2 y HRSP3) y el cebador arbitrario LAD1-4 se usaron para las secuencias flanqueantes del borde izquierdo (BI) del T-ADN mientras que los cebadores específicos (HRRSP1, HRRSP2 y HRRSP3) y el cebador arbitrario LAD1-4 se usaron para las secuencias flanqueantes del borde derecho (BD). Las reacciones PCR se llevaron a cabo con ADN polimerasa i-Taq (i-DNA, Singapore) en un Controlador Térmico Programable PTC-200™ (Bio-Rad, Estados Unidos). Los productos de PCR se purificaron mediante el uso del kit de extracción de gel (Qiagen) y se secuenciaron directamente mediante el uso del kit terminador BigDye (Applied Biosystems, Estados Unidos) con el oligo HRRSP3 (para BD) o HRSP3 (BI). En algunos casos, los productos de PCR se clonaron en el vector pGTM-T easy (Promega, Estados Unidos) y se secuenciaron mediante el uso de los oligos M13FP y M13RP como cebadores.
Ejemplo 7
Tamizaje de mutantes de acumulación de lípidos
El genoma de R. toruloides ATCC 90781 se sometió a mutagénesis mediante la inserción aleatoria del T-ADN de pRH201 (Figura IE). Los transformantes se seleccionaron en medio de agar YPD complementado con 300 pg/ml de cefotaxima, 150 pg/ml de higromicina y ya sea 50 pg/ml de cerulenina, 10 pg/ml de violeta de tetrazolio o 0.5 pg/ml de rojo nilo (Sigma, Estados Unidos). Después de incubarse a 28 °C durante 5 días, los transformantes que muestran tamaños más grandes (por la selección contra cerulenina), pigmentación de color púrpura más oscuro (por la selección contra violeta de tetrazolio) o mayor intensidad de fluorescencia (por el tamizaje en rojo Nilo) se transfirieron a medio YPD líquido (300 pg/ml de cefotaxima, 150 pg/ml de higromicina) para la propagación. Después de frotar en placas de PDA complementadas con los antibióticos anteriores, se usaron colonias únicas para el tamizaje secundario mediante el uso de 50 ml de cultivos para verificar los fenotipos esperados.
Ejemplo 8
Comparación de los niveles de acumulación de lípidos mediante tinción con rojo Nilo
La tinción con rojo Nilo para la estimación rápida del contenido de lípidos se realizó como se describió anteriormente [37]con algunas modificaciones. En resumen, 10 pl de cultivo celular y 2 pl de solución base de rojo Nilo (50 mM en acetona) se mezclaron con 200 pl de tampón p Bs (pH7.4) en un pocillo de una placa FluoroNunc (Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Alemania). Cada muestra se acompañó con un pocillo libre de rojo Nilo como el control de fondo. Otra fracción del cultivo celular (10 pl) se cargó a 90 pl de tampón PBS (pH7.4) en una placa transparente de fondo plano de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) para medir la densidad óptica celular. Los datos se adquirieron y se analizaron mediante el uso del lector de placas Infinite M200 (Tecan, Salzburg, Austria) mediante el uso del software iControl™ versión 3.0 (Tecan, Salzburg, Austria). La densidad óptica celular se leyó a 600 nm después de deducir el control de fondo mientras que la intensidad de fluorescencia se midió con longitudes de onda de excitación y emisión a 488 nm y 508 nm, respectivamente. El contenido relativo de lípidos se calcula mediante la normalización contra la absorción a 600 nm después de restar el control de fondo. En todas las pruebas, se incluyeron tanto los triplicados biológicos como estadísticos.
Ejemplo 9
Determinación del perfil de ácidos grasos mediante GCMS
El lípido total se extrajo como se describió anteriormente [38]con algunas modificaciones. Los cultivos celulares (1 ml) se sedimentaron y resuspendieron con 500 pl de solvente de extracción de lípidos (cloroformo:metanol = 2:1). Después de añadir 100 pg de perlas de vidrio (1 mm de diámetro, Sigma-Aldrich, Missouri, Estados Unidos), se aplicó agitación vigorosa a la mezcla durante 10 min y la fase de solvente se eliminó con una pipeta. La preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) y los análisis de cromatografía de gas-líquido (GC) se realizaron como se describió anteriormente [39]con algunas modificaciones. Los lípidos se evaporaron por rotación casi hasta la sequedad (Concentrator, Eppendorf. Estados Unidos), se disolvieron en 1 ml de metanol con H2SO4 al 5 % (vol/vol) y se incubaron en un vial de vidrio sellado a 90 °C durante 2 hr. Los ésteres metílicos de ácidos grasos se extrajeron con 300 pl de nhexano después de la adición de 1 ml de PBS en agua. Se inyectó 1 pl de la extracción con hexano en una columna capilar de sílice fundida DB-WAX (30-m de longitud, 0.25-pm de diámetro, y 0.25-mm de espesor de película) (Agilent J&W Scientific, Folsom, CA, Estados Unidos) en un espectrómetro de masas acoplado a cromatógrafo de gases (GCMS QP2010, Shimadzu, Japón). Las condiciones de corrida fueron típicamente 42.3 ml/min de flujo de nitrógeno, 180 °C para temperatura de inicio (3 min), una rampa de 15-min a 240 °C, y mantenimiento a 240 °C durante 7 min. Los picos de ésteres metílicos de ácidos grasos se identificaron mediante la búsqueda contra la biblioteca de compuestos NIST08 de Shimadzu y se cuantificaron como porcentajes de ácidos grasos totales (% de TFA).
Ejemplo 10
Identificación de ALD1 mediante Tamizaje Directo
de bibliotecas de inserción del T-ADN deR. toruloides
Se conoce que el T-ADN se integra en los genomas nucleares predominantemente como copias únicas y esta característica se ha explotado ampliamente como una herramienta de mutagénesis en plantas y hongos [32, 40-43]. Para investigar si los nuevos genes que regulan el rendimiento o la calidad del aceite pueden identificarse mediante el tamizaje directo de bibliotecas de mutantes de T-ADN, se diseñaron tres estrategias de tamizaje independientes con el objetivo de identificar cambios en los perfiles o contenidos de ácidos grasos en los mutantes de T-ADN mediante el uso de la ayuda de fármacos o de colorante fluorescente.
La cerulenina, (2S)(3R)2,3-epoxi-4-oxo-7,10-dodecadienoilamida, es un fármaco aislado del caldo de cultivo de Cephalosporium caerulens [44, 45] y se ha usado exitosamente para mejorar la acumulación de ácidos grasos poliinsaturados intracelulares [46] o el contenido de lípidos en microorganismos oleaginosos [47, 48]. Cuando se usa como un fungicida debido a su capacidad de bloquear la biosíntesis de ácidos grasos [49], se espera que los mutantes que sobrevivan a este tratamiento tengan un mayor nivel de lípidos o ácidos grasos poliinsaturados. Se tamizaron -10,000 transformantes contra 50 pg/ml de cerulenina en medio de agar YPD y se encontraron 12 mutantes que parecían ser más resistentes a cerulenina. Estos Mutantes de Cerulenina de Rhodosporidium putativos se nombraron RCM1 a RCM12, respectivamente. Aunque se encontró que los contenidos de lípidos eran poco diferentes del tipo silvestre en cultivos líquidos a pequeña escala, los RCM exhibieron niveles de ácido a-linolénico (ALA) significativamente superiores (Figura 4). Notablemente, RCM6 produjo un nivel de ALA 3 veces superior al del tipo silvestre (Figura 4B).
En segundo lugar, el rojo nilo (NR) se ha usado ampliamente como un rastreador fluorescente de lípidos [50]. Mediante el tamizaje de -10,000 mutantes de T-ADN, se identificaron cuatro candidatos que parecen mostrar una fluorescencia roja más fuerte, que se nombraron RNM1-4 (para Mutante de rojo Nilo de Rhodosporidium). La cuantificación de los rendimientos de lípidos reveló una mejora significativa en los mutantes RNM en comparación con el tipo silvestre (Figura 4D). Sin embargo, podrían observarse pequeñas diferencias en las composiciones de ácidos grasos (datos no mostrados).
De manera similar, violeta de tetrazolio, que se usa ya sea como un indicador colorante para la acumulación de lípidos [51], o como un indicador redox para el crecimiento microbiano [52] se usó como un indicador para tamizar - 3,000 transformantes, lo que condujo a la identificación de 6 mutantes pigmentados más profundos (Figura 4C). Sin embargo, el análisis repetido de los perfiles de ácido graso no permitió verificar el cambio de la acumulación de ácidos grasos (datos no mostrados).
Las posiciones de etiquetado del T-ADN en los mutantes anteriores se identificaron mediante la técnica de PCR Hi-TAIL, y los resultados demostraron que se obtuvieron y se secuenciaron exitosamente 11 de 12 RCM, 2 de 4 RNM y 6 de 6 RTM (Tabla 2). Los genes afectados se implicaron de manera dominante en el mantenimiento de la integración de la pared celular, el metabolismo de los lípidos, la transducción de señales, el plegamiento y el tráfico de proteínas, los metabolismos de los metabolitos secundarios, los aminoácidos, las vitaminas, los cofactores, etc. (Tabla 2).
Tabla 2
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Ejemplo 11
Caracterización del muíante de etiquetado del T-ADN RCM6
Para investigar más aún los mutantes tamizados mediante la genética directa, y como una prueba de principio, se abordó la genética inversa para estudios del posible efecto regulador en la acumulación de lípidos y la biosíntesis de carotenoides en los mutantes RCM6 y RAM5, respectivamente.
El análisis homólogo reveló que el T-ADN en RCM6 se integró dentro de 72542-72543 nt de 400a contig (núm. de acceso de GenBank AEVR01000400). El BLASTx de secuencias adyacentes a la posición de etiquetado del T-ADN exhibió una proteína que contiene un dominio del aldehido deshidrogenasa putativa que se alteró mediante la integración del T-ADN en RCM6 (Figura 6A). La proteína diana se localizó entre una enzima de biosíntesis de tiazol putativa (EGU11956) y una dipeptidil aminopeptidasa candidata (EGU11957), que muestran gran homología con el aldehído hidrogenasas de otras especies fúngicas tales como Streptomyces sviceus (EDY60340.1, valor E = 2E-68) y Mycobacterium sp. (YP_936108, valor E = 3E-66), etc. Por lo tanto, el aldehído hidrogenasa putativa (denominada ALD1) que codifica el gen alterado por T-ADN podría dar como resultado el fenotipo de RCM6. El análisis adicional de RT-PCR y la amplificación rápida de los extremos de ADNc (RACE) revelaron que el gen ALD1 abarca 2461 pb en contig#400, que contiene 11 exones separados por 10 intrones (Figura 5A). Su 5' UTR es de 18 nt de longitud, seguido de un tramo corto de motivo rico en CT (caja CT, datos no mostrados). El empalme del ARNm se ajusta estrictamente a la regla canónica GU-AG, que produce un ARNm de 1506 nt de longitud, que codifica una proteína de 501-aa con el motivo de huella de unión a NAD estrictamente conservado Gly-X-Gly-XX-Gly (SEQ ID NO:53) (GSGTVG, 193-198 aa; SEQ ID NO:54), aminoácido de unión a adenosina ribosa (NAD) (E148) y centro catalítico de Cys (C249) (Figura 6). En RCM6, el T-ADN se integró en la posición entre el nucleótido 2097mo y 2098vo desde el codón de inicio de ALD1, alterando el 9no exón lo que resulta en la deleción de los 58 aa del extremo C-terminal que forman parte del motivo RYPP (Figura 6).
Para demostrar más aún la función en la acumulación de lípidos, ALD1se delecionó mediante la recombinación homóloga con la ayuda de ATMT. La secuencia de nucleótidos en ALD1 en el intervalo de 536 a 1947 se reemplazó con el casete de resistencia a higromicina (PGPD1::hpt-3::Tnos, Figura 5A) y los mutantes nulos de ald1 correctos se verificaron mediante el análisis de la transferencia Southern (Figura 5B). Cuando se cultiva ya sea en caldo líquido o en medio de agar, Aaldl mostró un color pigmentado naranja al contrario del color pigmentado rosa en el tipo silvestre (Figura 5E). Aaldl creció un poco más lento que el tipo silvestre en el medio de acumulación de lípidos, pero rindió una biomasa similar cuando la fuente de carbono en los medios se agotó el 4to día (Figura 5E). Antes de que se agotara la glucosa (3er día), los mutantes Aaldl mostraron pocas diferencias con el tipo silvestre en cuanto a los rendimientos de lípidos. Cuando se agotó la glucosa, los niveles lipídicos disminuyeron en ambas cepas, sin embargo, el contenido de lípidos fue significativamente superior en el mutante Aaldl (Figura 5C y 5D). Sorprendentemente, casi la mitad de ALA se degradó en el tipo silvestre mientras que se encontró poca degradación en el mutante de Aaldl (Figura 5F). Estos resultados son consistentes con lo del mutante con etiqueta de T-ADN, RCM6 (Figura 4B).
Ejemplo 12
Mejora de la acumulación de TAG total
Niveles en R. toruloides mediante diseño racional
El triacilglicerol (TAG) es el principal lípido neutro que se produce en la mayoría de las células eucariotas y las vías de biosíntesis son altamente conservadas [53]. La ingeniería metabólica mediante diseños racionales ha sido muy exitosa en mejorar el contenido y la productividad de lípidos [54-56]. En R. toruloides, está disponible la información de secuencia para la diacilglicerol acetiltransferasa (Dga1) y la enzima málica (MAE1) (ver por ejemplo las SEQ ID NO:81 y SEQ ID NO:84, respectivamente). Los casetes de sobreexpresión para ambos genes se construyeron para que sean conducidos por el promotor de RtGPDI de 795-pb, Pg p d i::DGA1 y Pg p d i::MAE1, Figura 1D, que se integran en el cromosoma de R. toruloides ATCC 10657 mediante la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. El análisis de RT-PCR cuantitativo reveló que los niveles de transcrito de ARNm de ambos genes se potenciaron dramáticamente a través del bioproceso de 3 días (Figura 7A), dio como resultado una mejora en 2.3 y 1.8 veces del pico del rendimiento de lípidos sobre la cepa de tipo silvestre con la cepa de sobreexpresión de DGAIy Ma E1 respectivamente (Figura 7B). El perfil de ácidos grasos no cambió significativamente en ambas cepas (Figuras 7C y 7F). Como se esperaba, un mutante nulo de dgal construido (Figura 7D) tuvo una disminución dramática en la acumulación de lípidos (Figura 5E).
Ejemplo 13
Mejora de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA)
Producción en R. toruloides mediante diseño racional
En cepas de R. toruloides, el ácido oleico (C18:1) es el componente de ácido graso predominante (~ 50 %) mientras que el ácido palmitoleico (C16:1) y el ácido linoleico (C18:2) consiste en ~ 20 % de FA total. El ácido a-linolénico (C18:3n=9, ALA), un ácido graso omega-3 poliinsaturado, es un componente menor presente en el 3~4 % de los ácidos grasos totales (% de TFA) (Figura 8). Para producir ALA a partir de ácido oleico, se requiere una delta-12 desaturasa (Fad2) y una omega-3 desaturasa (Fad3) [57, 58]. Los genes de longitud completa de lino (L. usitatissimum) FAD3, tung (V. fordii) FAD3 y M. alpine FAD2 se diseñaron y se sintetizaron comercialmente de acuerdo con la preferencia en el uso de codones de R. toruloides [22], en los cuales se reemplazaron todos los codones raros por los que se usan frecuentemente en R. toruloides. El contenido de GC de los genes varió de 65.3 % en LuFAD3-2 (SEQ ID NO:9), 64.8 % en MaFAD2-2 (SEQ ID NO:4) y 63.3 % en VfFAD3-2 (SEQ ID NO:11).
El alto nivel de expresión de los tres genes sintéticos se logró mediante la unión operativa al promotor RtGPDI y al terminador 35S del virus del mosaico de la coliflor, seguido por la determinación del perfil de las composiciones de ácidos grasos de las cepas de ATMT seleccionadas. Las cepas élites que sobreexpresan LuFAD3-2 (RHE001), VfFAD3-2 (RHE002) o MaFAD2-3 (RHE003) mostraron una mejora del contenido de ALA en 1.8, 2.2 y 1.6 veces respectivamente (Figura 9A). Posteriormente, los casetes RtGPDI::afFAD3-2.35S y RtGPDI::MaFAD2-2:35S se apilaron en un único vector de T-ADN, pRHE004, el cual se transformó mediante ATMT a un derivado (RT1CE6, que contiene un gen de Cre inducible con 17p-estradiol integrado establemente en el genoma) de R. toruloides ATCC 10657. La cepa élite seleccionada (RHE004) se modificó más aún mediante la deleción del gen ALD1 mediante el uso del vector pKOALD1. La cepa resultante (denominada aldleAM) produjo 3.74 veces más ALA que el mutante nulo de ald l (aldle) (Figura 9B), con el contenido de ALA que alcanza ~ 49 % de los ácidos grasos totales.
Ejemplo 14
Análisis bioquímico de Ald1
Para caracterizar Ald1 y confirmar que la deleción de 58 residuos del extremo C-terminal como resultado de la inserción de T-ADN en el mutante RCM6 comprometía su actividad enzimática, tanto la versión de longitud completa como la truncada de las proteínas Ald1 se expresaron en E coli BL21(DE3) como una proteína de fusión con la etiqueta de 6X histidina en el extremo C-terminal. Las Ald1 y Ald1n recombinantes se purificaron con la columna HisTrap (GE healthcare, Estados Unidos) y se analizaron mediante el uso del método informado anteriormente [59]con algunas modificaciones. En resumen, la mezcla de reacción estaba compuesta de 40 pl de tampón Tris-Cl (pH8.0) 100 mM, 30 pl de NAD+ o NADP+ 10 mM (Sigma-Aldrich, Estados Unidos), 10 pl de dodecanal 20 mM (dodecil aldehído, C12-aldehído, Sigma-Aldrich, Estados Unidos), 110 pl de agua y 10 pl de enzima purificada. La reacción se realizó a temperatura ambiente (25 °C) y se inició mediante la adición de enzima. El curso temporal del valor de densidad óptica a 340 nm se leyó a través del lector de placas Infinite M200 (Tecan, Salzburg, Austria) mediante el uso del software iControl™ versión 3.0 (Tecan, Salzburg, Austria) como se describió anteriormente [40]. Como se muestra en la Figura 10, tanto Ald1 como Ald1n demostraron una clara actividad deshidrogenasa, con una ligera preferencia a NAD+. Notablemente, la proteína mutante con la deleción de 58 aa del extremo C-terminal mostró actividad enzimática significativamente menor.
Ejemplo 15
Caracterización de los genes de la biosíntesis de ácidos grasos en R. toruloides
Los homólogos de R. toruloides de diversas ácidos grasos desaturasas, elongasa y ATP-citrato liasa se identificaron mediante la búsqueda de BLAST contra las secuencias de andamio 204091 del genoma de R. toruloides ATCC 204091 (denominadas anteriormente Rhodotorula glutinis, núm. de acceso de GenBank AEVR02000000, proyecto de secuenciación en disparo del genoma completo PRJNA59971, Mississippi State University, Estados Unidos.) mediante el uso de secuencias enzimáticas de Yarrowia lipolytica y Ustilago maydis conocidas según las consultas. La manipulación genética y la caracterización de secuencias de ADN se realizaron con la cepa de R. toruloides ATCC 10657 o su derivado Rtlck, un mutante deficiente de KU70 que exhibe una eficiencia extremadamente alta en la recombinación homóloga [60]. Los oligonucleótidos usados se enumeran en la Tabla 3.
Tabla 3
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Para la deleción del homólogo FAD1 (o OLE1) del gen de la delta-9-oleato desaturasa, el fragmento flanqueante de homología izquierdo y derecho (~0.9 kb cada uno) se amplificaron mediante el uso del ADN genómico de R. toruloides ATCC 10657 con los pares de oligos DS9L-Sf/DS9L-Br y DS9R-Hf/DS9R-Str, respectivamente. Se realizó una ligación de cuatro fragmentos con el vector binario pEX2 digerido con SacI/PmeI, el fragmento flanqueante izquierdo digerido con SacI/BamHI, el casete de selección con higromicina optimizado con codones digerido con BamHI/HindIII de pDXP795hptR (PGPDi::hpt-3::Tnos [60]) y el fragmento flanqueante derecho digerido con HindIII/StuI para generar la deleción génica del plásmido pKOOLE1. Se aplicó una estrategia similar para construir tanto pKOFAD2 como pKOELO1, para la inactivación del gen de la delta-12 desaturasa putativa y el gen 1 de la elongasa, respectivamente. Los pares de oligo DS12L-Sf2/DS12L-Br2 y DS12R-Hf/DS12R-Str se usaron para amplificar el fragmento flanqueante de homología izquierdo (0.6 kb) y derecho (0.9 kb) para pKOFAD2, y ELO1 L-Sf/ELO1 L-Br y ELO1 R-Hf/ELO1 R-Str se usaron para pKOELO1 (~0.9 kb cada uno). Para ELO2, los pares de oligos ELO2L-Stf/ELO2L-Hr y ELO2R-Bf/ELO2R-Sr se usaron (-0.8 kb cada uno) y se digirieron con StuI/HindIII y BamHI/SacI para el fragmento flanqueante de homología izquierdo y derecho, respectivamente. Ambos fragmentos se usaron de manera similar en la ligación de cuatro fragmentos para generar pKOELO2.
Para la deleción del gen de la ATP-citrato liasa putativa (RtACL1), los pares de oligos ACL1L-Sf2/ACL1L-Br2 y ACL1R-Hf2/ACL1R-Str2 se usaron para amplificar los fragmentos flanqueantes de homología izquierdo y derecho (0.9 kb cada uno) para generar pKOACL1 mediante el uso de una estrategia similar descrita anteriormente.
Las secuencias de ADNc de los genes de interés se obtuvieron mediante RT-PCR, con la RACE 5' y 3' realizada mediante el uso del Kit de amplificación de ADNc BD SMARTer™ RACE (Clontech, California, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los pares de oligos OLE1U1/OLE1L1, FAD2U1/FAD2L1 se usaron como el cebador específico para RACE 5'/3' de FAD1 (OLE1) y FAD2, respectivamente.
El ORF predicho de Fad1 (Ole1) y Fad2 codifica la proteína de 545 y 451 aa de longitud, respectivamente. Ambos Fad comparten un dominio conservado común del ácido graso desaturasa de membrana (familia de proteínas núm. pfam00487, EMBL-EBI). Sin embargo, Fad2 carece del dominio de unión a hemo/esteroide como citocromo p5 (pfam00173. Las búsquedas de BLAST revelaron que Ole1 y Fad2 exhiben la identidad más alta con respecto a la estearoil-CoA desaturasa de Puccinia graminis (XP_003326562.1, 70 % de identidad), A12-ácido graso desaturasa de Ustilago maydis (XP_757193.1, 57 % de identidad), respectivamente.
Se identificaron dos elongasas. ELO1 (Seq ID. No. 99 y 100) y ELO2 (Seq ID. No. 102 y 103) codifica la proteína de 329 (Seq ID 101) y 293 aa (Seq ID 104) de longitud, respectivamente. Ambas ácido graso elongasas putativas comparten un dominio conservado común de la familia GNS1/SUR4 que está implicado en el sistema de alargamiento de ácidos grasos de cadena larga (pfam01151). Elo1 y Elo2 exhibieron la identidad más alta con respecto al ácido graso elongasa de Puccinia graminis (PGTG06945, XP_003325743.2, 43 % de identidad) y Melampsora larici-populina (MELLADRAFT_42723, XP_007407925.1, 65 % de identidad), respectivamente. El análisis de los perfiles de ácidos grasos de ELO1 y ELO2 inactivos reveló que ELO1 inactivo conduce a un pequeño cambio en el perfil excepto por una disminución moderada de C18:0 y un aumento pequeño de C16:0 y C18:1. Por el contrario, el EL02 inactivo conduce a la pérdida completa de la síntesis de ácidos graso de cadena larga (>C18) (Figura 12). Estos resultados sugieren fuertemente que OLE1 es un ácido graso de cadena corta-CoA elongasa mientras que ELO2 es capaz de alargar tanto los ácidos grasos de cadena larga y de cadena corta-CoA.
Para los estudios de sobreexpresión, el ADNc de OLE1, FAD2 y ELO2 se amplificó mediante el uso de la plantilla de ADNc de R. toruloides sintetizada mediante la transcripción inversa con los pares de cebadores Rt227Nf/Rt228Evr, Rt229Ndf/Rt230Evr y Rt259Nf/Rt260Evr, respectivamente. Los productos de PCR digeridos con NcoI/EcoRV se ligaron con el vector pKC1 digerido con NcoI/EcoRV para generar los pKC1OLE1, pKC1FAD2 y pKC1ELO2 y dio como resultado la sobreexpresión del gen debido al promotor RtGPD1 fuerte usado en el vector pKC1.
Ejemplo 16
Análisis de deleción génica
Para verificar las funciones de cada gen, los mutantes inactivos se generaron mediante la transformación mediada por Agrobacterium de los constructos inactivos respectivos; el tamizaje mediante PCR de colonias y el análisis de la transferencia Southern. La inactivación de FADIno fue exitosa en varios intentos. La deleción de FAD2 fue exitosa después de la suplementación de ácido linoleico en los medios de transformación y propagación. El ácido linoleico (C18:2, LA) y el ácido a-linolénico (C18:3, ALA) estuvieron ausentes en el mutante nulo de FAD2 mientras que el contenido de C18:1 aumentó a casi el 70 % de los ácidos grasos totales (Figura 11B). Esto confirma que el gen FAD2 (SEQ ID NO:92) codifica una A12-ácido graso desaturasa que cataliza la conversión de ácido oleico (C18:1) para formar LA. La carencia de ALA en el mutante inactivo de FAD2 sugiere que Fad2 es un ácido graso desaturasa bifuncional A12 y A15. Esto fue apoyado por la incapacidad del mutante fad2A de producir la producción de ALA incluso cuando se complementa con el precursor de LA (C18:2) (Figura 11D).
La función de FAD1 (OLE1) puede demostrarse mediante los estudios de sobreexpresión. La transformación del casete RtGDP1::OLE1 (Figura 13A) en la cepa de tipo silvestre y la cepa inactiva de ALD1 (Aaldle) dio como resultado el aumento significativo en el contenido de ácido oleico (Figura 14). En consecuencia, la apilación de RtGDP1:OLE1 a MaFAD2-2 (Figura 13D), o ambos a MaFAD2-2 y el casete de sobreexpresión VfFAD3-2 (Figura 13E) dio como resultado un aumento de LA y ALA respectivamente (Figura 14). Entre los 18 transformantes que expresaban el casete de gen triple, tres mostraron >20 % del contenido de ALA con uno que contenía ~24 % del fondo de aldle. El contenido inferior de ALA en esta serie se atribuye probablemente al promotor de ACC1 más débil usado para MaFAD2-2 a medida que el contenido de LA fue muy bajo (no mostrado).
Ejemplo 17
Caracterización de los genes de la ATP-citrato liasa (ACL1) en R. toruloides
En base a los estudios en mamíferos, se piensa que la ATP-citrato liasa (ACL) fúngica es un factor importante para la acumulación de aceites. Un gen de la ATP-citrato liasa/sintasa putativa ACL1 (seq ID No. 86 y 87) se identificó mediante la búsqueda de BLAST de las secuencias genómicas parciales de Rhodotorula glutinis ATCC 204091. La secuencia de la proteína Acl1 putativa se expone en la Seq ID. No. 88. Se generó un mutante inactivo del gen ACL1 y mostró una reducción significativa de la acumulación de aceites y del crecimiento de la biomasa (Figura 15). Esto sugiere fuertemente que la expresión de ACL1 facilita la acumulación de aceites y la producción de biomasa en R. toruloides.
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Una célula huésped fúngica en donde los ácidos grasos totales están compuestos por un aumento del nivel de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), en particular ácido alfa-linolénico (ALA) o ácido gamma-linolénico (GLA), a un nivel de al menos 9 %, preferentemente más del 24 %, con la máxima preferencia más del 49 % en la célula huésped fúngica, en donde el genoma de la célula huésped fúngica se ha modificado de manera que la célula huésped fúngica ha reducido la actividad de la enzima aldehído deshidrogenasa (ALD1) nativa en comparación con una célula huésped fúngica que tiene un genoma no modificado, y en donde el huésped fúngico es una especie del género Rhodosporidium o el género Rhodotorula.
  2. 2. La célula huésped fúngica de conformidad con la reivindicación 1, en donde la ALD1 nativa se selecciona del grupo que consiste en:
    (a) ALD1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:3; y
    (b) una ALD1 que tiene al menos 75 % de identidad o al menos 85 % de identidad o al menos 95 % de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:3.
  3. 3. La célula huésped fúngica de conformidad con la reivindicación 2, en donde la ALD1 nativa es codificada por un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:
    (a) un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:1;
    (b) un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:2;
    (c) un ácido nucleico que tiene al menos 75 % de identidad o al menos 85 % de identidad o al menos 95 % de identidad con respecto al ácido nucleico de (a); y
    (d) un ácido nucleico que tiene al menos 75 % de identidad o al menos 85 % de identidad o al menos 95 % de identidad con respecto al ácido nucleico de (b).
  4. 4. La célula huésped fúngica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la célula huésped fúngica tiene un gen defectuoso que codifica ALD1 provocando una pérdida en la actividad de la enzima Aldl.
  5. 5. La célula huésped fúngica de 4, en donde el gen defectuoso es provocado mediante la inserción del T-ADN, la recombinación homóloga o la mutagénesis dirigida a sitio.
  6. 6. La célula huésped fúngica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el genoma de la célula huésped fúngica se ha modificado para regular negativamente la expresión del gen de ALD1 nativa provocando una pérdida o reducción de la actividad de la enzima Ald1.
  7. 7. La célula huésped fúngica de conformidad con la reivindicación 6, en donde la expresión es regulada negativamente por un represor de la transcripción artificial, ARNi, siARN, shARN, miARN, supresión antisentido o con sentido.
  8. 8. La célula huésped fúngica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el genoma de la célula huésped fúngica se ha modificado más aún para incluir al menos dos casetes de expresión, en donde cada casete de expresión comprende un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica una proteína implicada en la biosíntesis de ácidos grasos y en donde las proteínas se seleccionan del grupo que consiste en: (a) una acil-CoA delta-12 desaturasa
    (b) una estearoil-CoA-delta-9-desaturasa;
    (c) una omega-3 desaturasa;
    (d) un ácido graso elongasa;
    (e) una acil-CoA carboxilasa (ACC);
    (f) una ATP: citrato liasa (Ac L);
    (g) una diacilglicerol aciltransferasa (DGA);
    (h) una enzima málica (MAE); y
    (i) acil-CoA delta-6 desaturasa;
    opcionalmente en donde el casete de expresión comprende además un terminador de la transcripción unido operativamente al ácido nucleico que codifica una proteína implicada en la biosíntesis de ácidos grasos; y opcionalmente en donde las secuencias codificantes de los ácidos nucleicos contienen al menos 55 % de C y G, preferentemente 60 %-70 % de C y G, en donde al menos el 70 % de los codones tienen una C o G en la 3ra posición.
  9. 9. La célula fúngica de conformidad con la reivindicación 8, en donde las proteínas se seleccionan del grupo que consiste en:
    (a) una acil-CoA delta-12 desaturasa que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:5 y/o SEQ ID NO:94 que tiene al menos 80 % o al menos 90 % o al menos 95 % de identidad con respecto a dicha secuencia de aminoácidos;
    (b) una estearoil-CoA-delta-9-desaturasa que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:8 o que tiene al menos 80 % o al menos 90 % o al menos 95 % de identidad con respecto a dicha secuencia de aminoácidos;
    (c) una omega-3 desaturasa que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:12 o que tiene al menos 80 % o al menos 90 % o al menos 95 % de identidad con respecto a dicha secuencia de aminoácidos;
    (d) un ácido graso elongasa que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:101 o SEQ ID NO: 104 (Elo2) o que tiene al menos 80 % o al menos 90 % o al menos 95 % de identidad con respecto a dicha secuencia de aminoácidos;
    (e) una acil-CoA carboxilasa (ACC1) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:91 o que tiene al menos 80 % o al menos 90 % o al menos 95 % de identidad con respecto a dicha secuencia de aminoácidos;
    (f) una ATP: citrato liasa (ACL1) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:88 o que tiene al menos 80 % o al menos 90 % o al menos 95 % de identidad con respecto a dicha secuencia de aminoácidos; (g) una diacilglicerol aciltransferasa (DGA1) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:82 o que tiene al menos 80 % o al menos 90 % o al menos 95 % de identidad con respecto a dicha secuencia de aminoácidos;
    (h) una enzima málica (MAE1) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:85 o que tiene al menos 80 % o al menos 90 % o al menos 95 % de identidad con respecto a dicha secuencia de aminoácidos; y (i) una acil-CoA delta-16 desaturasa que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:96 o SEQ ID NO:98, o que tiene al menos 80 % o al menos 90 % o al menos 95 % de identidad con respecto a dichas secuencias de aminoácidos.
  10. 10. La célula fúngica de conformidad con la reivindicación 9, en donde las proteínas son codificadas por ácido nucleicos seleccionados del grupo que consiste en un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:4, 6, 7, 9, 11, 80, 81, 83, 8486, 87, 89, 90, 92, 93,96, 98, 99, 100, 102 y 103 o que tiene al menos 80 % o al menos 90 % o al menos 95 % de identidad con respecto a dicha secuencia de nucleótidos.
  11. 11. La célula huésped fúngica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el promotor es un promotor aislado de un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en: gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GPD), proteína portadora de acil-CoA (ACP), ácido graso desaturasa, factor de alargamiento de la traducción (TEF), piruvato decarboxilasa (PDC), enolasa (2-fosfoglicerato deshidratasa) (ENO), peptidilprolil isomerasa (PPI), acetil-CoA carboxilasa (ACC) y transaldolasa y opcionalmente en donde el promotor se aísla de una especie del género Rhodosporidium o el género Rhodotorula.
  12. 12. La célula huésped fúngica de conformidad con la reivindicación 11, en donde el promotor es una secuencia promotora seleccionada del grupo de promotores expuesto en las SEQ ID NO:55-79.
  13. 13. La célula huésped fúngica de conformidad con la reivindicación 1 en donde los genes ELO1 o ELO2, expuestos en las Seq ID No. 99 y 102, o un ácido nucleico que tiene al menos 75 % de identidad, 85 % de identidad o 95 % de identidad con respecto a las secuencias de estos, se ha manipulado artificialmente para que tenga un nivel aumentado o reducido de la actividad del ácido graso elongasa.
  14. 14. Un método para producir ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) omega-3 y omega-6, que comprende cultivar la célula huésped fúngica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en condiciones adecuadas para producir los PUFA.
  15. 15. Un método para producir triacilglicérido (TAG) que comprende cultivar la célula huésped fúngica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en condiciones adecuadas para producir TAG.
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