CN109401988B - 一株圆红冬孢酵母及其在生产红酵母红素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株圆红冬孢酵母及其在生产红酵母红素中的应用。本发明采用农杆菌转化法使野生型圆红冬孢酵母np11突变，获得一株圆红冬孢酵母A1‑15‑BRQ，保藏号为CGMCC No.16638。该圆红冬孢酵母A1‑15‑BRQ在生产红酵母红素中的应用包括以下步骤：S1：菌种活化，得种子液；S2：将种子液接种到液体培养基中，在28～30℃、180～200rpm/min培养48～96h，所得发酵液中红酵母红素较野生型圆红冬孢酵母np11发酵所得比例和产量分别提高1.5～2.5和4.0～9.6倍，可用于红酵母红素的工业化生产，具有良好的应用前景和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一株圆红冬孢酵母及其在生产红酵母红素中的应用。
背景技术
红酵母是担子菌门，锈菌纲，担孢目，锁掷酵母科，红酵母属的一类微生物。红酵母为多边芽殖，同时具有产油和产类胡萝卜素的能力。红酵母菌体富含蛋白质、肝糖、高级不饱和脂肪酸、虾青素和维生素等天然物质，故可作为优良的饲料和添加剂。圆红冬孢酵母为常见的红酵母之一，它能以废水和工厂废料为碳源和氮源生产油脂和类胡萝卜素，起到处理废水和肥料，保护环境的作用。
红酵母红素是类胡萝卜素中的一种，是维生素A和荷尔蒙的重要前体物质，它具有清除自由基、淬灭单线态氧、抗衰老和抑制癌症、增强免疫系统等活性。目前类胡萝卜素的常见生产工艺主要包括植物提取、化学合成以及微生物发酵。相比于前两种生产工艺，微生物发酵生产类胡萝卜素不易受到地域、气候的影响，并且更安全。目前利用微生物发酵生产β-胡萝卜素已经在一些国家实现了工业化生产，但是还未见关于红酵母红素实现工业化生产的报道。红酵母是生产红酵母红素的常用菌株，它主要生产红酵母红素、红酵母烯、γ-胡萝卜素以及β-胡萝卜素，但是根据目前的报道过的红酵母中，红酵母红素的产量及比例较低，这就使分离提纯红酵母红素存在一定难度，所以获得一株高选择性生产红酵母红素的菌株就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于解决现有红酵母在红酵母红素生产中存在产量低的问题，提高红酵母菌株中红酵母红素的比例及产量。
为达到上述目的，本发明提供一株圆红冬孢酵母A1-15-BRQ(Rhodosporidiumtoruloides)，该菌株于2018年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No.16638，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明的另一个目的在于，提供所述圆红冬孢酵母A1-15-BRQ在于生产红酵母红素中的应用。
一种使用圆红冬孢酵母A1-15-BRQ生产红酵母红素的方法，包括如下步骤：
S1、菌种活化：将圆红冬孢酵母A1-15-BRQ进行菌种活化，获得圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液；
S2、发酵：将圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液按体积百分比5％～20％接种到生产红酵母红素的液体培养基中，在28～30℃，180～200rpm/min培养48～96h，得到含有红酵母红素的发酵液；其中，所述生产红酵母红素的液体培养基成分为：26～30g/L葡萄糖，2～3g/L硫酸铵，5～7g/L氢氧化钾，0.15～0.3g/L硫酸镁和8～10mL/L微量元素溶液，其余成分为水；所述微量元素溶液pH5.9～6.2、成分为4g/L二水氯化钙，0.52g/L柠檬酸，0.55g/L七水硫酸铁，0.076g/L一水硫酸锰，0.10g/L七水硫酸锌，100μL/L质量分数98％硫酸，其余成分为水。
优选方式下，步骤S1所述圆红冬孢酵母A1-15-BRQ菌种活化具体为：圆红冬孢酵母A1-15-BRQ冻存于-80℃，用接种环挑取少量冰碴，划线于YEPDH平板(20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，50mg/L潮霉素，pH5.9～6.2)，在28℃培养2天后，为第一代，挑取第一代的单菌落，再次划线于YEPDH平板，在28℃培养4天后，为第二代，挑选第二代的单菌落，接种入50mL YEPD液体培养基(20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，pH5.9～6.2)，在28～30℃、180～200rpm/min培养24h，得圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液。
优选方式下，步骤S2所述发酵具体为：圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液按体积百分比10％接种到生产红酵母红素的液体培养基中，在28℃，200rpm/min培养72h，得到含有红酵母红素的发酵液；
其中，所述生产红酵母红素的液体培养基成分为29.6g/L葡萄糖，2g/L硫酸铵，5g/L氢氧化钾，0.15g/L硫酸镁和10mL/L微量元素溶液，其余成分为水；所述微量元素溶液pH6.0、成分为4g/L二水氯化钙，0.52g/L柠檬酸，0.55g/L七水硫酸铁，0.076g/L一水硫酸锰，0.10g/L七水硫酸锌，100μL/L质量分数98％硫酸。
优选方式下，所述使用圆红冬孢酵母A1-15-BRQ生产红酵母红素的方法，包容如下步骤：
S1、菌种活化：挑取冻存于-80℃的圆红冬孢酵母A1-15-BRQ菌株，即挑取适量菌株冰碴，划线于YEPDH平板，在28℃下培养2天，得到第一代，挑取第一代的单菌落划线于YEPDH平板，在28℃下培养4天，得到第二代；挑选第二代的单菌落，接种入50mL YEPD液体培养基(20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，pH6.0)，在28℃、200rpm/min下于250mL摇瓶中培养24h，得圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液；
S2、发酵：将圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液按体积百分比10％接种到70mL生产红酵母红素的液体培养基中，在28℃、200rpm/min下于250mL摇瓶中培养72h，得到含有红酵母红素的发酵液；
其中，所述生产红酵母红素的液体培养基成分为29.6g/L葡萄糖，2g/L硫酸铵，5g/L氢氧化钾，0.15g/L硫酸镁和10mL/L微量元素溶液，其余成分为水；所述微量元素溶液pH6.0、成分为4g/L二水氯化钙，0.52g/L柠檬酸，0.55g/L七水硫酸铁，0.076g/L一水硫酸锰，0.10g/L七水硫酸锌，100μL/L质量分数98％硫酸，其余成分为水。
本专利有益效果是：
本发明采用农杆菌转化法，致使野生型圆红冬孢酵母np11突变，获得了一株红酵母红素比例及产量皆较高的突变株圆红冬孢酵母A1-15-BRQ。采用该菌株在28～30℃、180～200rpm/min、培养48～96h，所得发酵液中红酵母红素较野生型圆红冬孢酵母np11发酵所得红酵母红素比例和产量分别提高1.5～2.5和12～14倍，可用于红酵母红素的工业化生产，具有良好的应用前景和经济价值。生产的红酵母红素可广泛应用于食品工业、医药生产和化妆品工业中。
附图说明
图1为本发明实施例4生产的A1-15-BRQ发酵液中含有类胡萝卜素的高效液相色谱；其中，红酵母红素的出峰时间为4.90min。
具体实施方式
以下实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，有助于了解本专利，但本发明的实施方案不受所述实施例的限制，本发明的保护范围有权利要求来决定。
实施例1
采用农杆菌转化法，致使野生型圆红冬孢酵母np11突变，获得圆红冬孢酵母A1-15-BRQ
一、农杆菌介导转化：
(a)、农杆菌稀释液准备
挑取农杆菌工程菌AGL1-HYG1单菌落接种到5mL LB肉汤培养基中(含25μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素)，在28℃、200rpm/min下过夜培养15～16h，收集菌体，使用灭菌蒸馏水重悬菌体至OD600nm＝0.6，得农杆菌稀释液。
其中，使用农杆菌AGL1感受态细胞(购自于北京华越洋生物GX9131-100)，依照下述文献中的方法制备农杆菌工程菌AGL1-HYG1：Lin X,Wang Y,Zhang S,et al.Functionalintegration of multiple genes into the genome of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides[J].Fems Yeast Research,2014,14(4):547-555.
(b)、酵母菌稀释液准备
挑取圆红冬孢酵母np11单菌落接种到5mL YEPD液体培养基中，在28℃、200rpm/min下过夜培养15～16h，收集菌体，使用灭菌蒸馏水重悬菌体至OD600nm＝0.6，得酵母菌稀释液。
其中，所述圆红冬孢酵母np11可以选用广东省微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为：GDMCC 2.224圆红冬孢酵母np11。
(c)、共培养
取上述酵母菌稀释液及农杆菌稀释液各100μL，混匀，将滤纸铺于IM诱导平板表面(40mL/L MM盐溶液，0.5g/L甘油，200μmol/L乙酰丁香酮，40mmol/L4-吗啉乙磺酸，2.0g/L琼脂粉，pH5.2～5.4；MM盐溶液：10mmol/L磷酸氢二钾，10mmol/L磷酸二氢钾，2.5mmol/L氯化钠，2mmol/L硫酸镁，0.7mmol/L氯化钙，9μmol/L七水硫酸铁，4mmol/L硫酸铵，10mmol/L葡萄糖，PH＝6.9～7.1)，用涂布棒将混合后的菌液均匀地涂在滤纸上，平板正面朝上，24℃，培养2天；将滤纸转移至筛选平板YEPDH(20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，50mg/L潮霉素，pH5.9～6.2)上，于28℃进行培养，直至转化子出现。
二、转化子的挑选
将步骤(c)所得转化子单菌落接种到SD(葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，pH5.9～6.1)液体培养基中，在28℃、200rpm/min下培养36h，得种子液。将圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液按体积百分比10％接种到50mL生产红酵母红素的液体培养基中，在28℃、200rpm/min下于250mL摇瓶中培养216h，得到含有红酵母红素的发酵液。从所得发酵液中提取类胡萝卜素，使用HPLC进行测定，最终筛选得到圆红冬孢酵母A1-15-BRQ，菌落呈圆形、橙红色、表面光滑、质地均匀、边缘整齐、易挑取。
其中，所述HPLC测定方法根据下述文献中的方法进行：Lin,X.P.；Gao,N.；Liu,S.S.；Zhang,S.F.；Song,S.；Ji,C.F.；Dong,X.P.；Su,Y.C.；Zhao,Z.B.K.；Zhu,B.W.Characterization the carotenoid productions and profiles of threeRhodosporidium toruloides mutants from Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation.Yeast.2017,34,335-342.
如表1所述，与野生型圆红冬孢酵母np11相比，圆红冬孢酵母A1-15-BRQ发酵液中，红酵母红素的产量和比例分别提高10.3倍和2.0倍。
表1红酵母红素的产量
实施例2
使用圆红冬孢酵母A1-15-BRQ生产红酵母红素中的方法，包括以下步骤：
S1、制备种子液：挑取冻存于-80℃的圆红冬孢酵母A1-15-BRQ菌株，即挑取适量菌株冰碴，划线于YEPDH平板，在28℃下培养2天，得到第一代平板，挑取单菌落划线于YEPDH平板，在28℃下培养4天，得到第二代平板；挑选第二代平板上的单菌落，接种入50mL YEPD液体培养基(20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，pH5.9)，在28℃、180rpm/min培养24h，得种子液；
S2、发酵：将圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液按体积百分比5％接种到70mL生产红酵母红素的液体培养基中，在29℃、180rpm/min下于250mL摇瓶中培养48h，得到含有红酵母红素的发酵液；
其中，所述生产红酵母红素的液体培养基成分为：26g/L葡萄糖，2.5g/L硫酸铵，6g/L氢氧化钾，0.2g/L硫酸镁和9mL/L微量元素溶液，其余成分为水；所述微量元素溶液pH5.9、成分为4g/L二水氯化钙，0.52g/L柠檬酸，0.55g/L七水硫酸铁，0.076g/L一水硫酸锰，0.10g/L七水硫酸锌，100μL/L 98％硫酸，其余成分为水。
本实施例所得含有红酵母红素的发酵液中，红酵母红素的产量为13.9mg/L，比例为84.2％。
实施例3
使用圆红冬孢酵母A1-15-BRQ生产红酵母红素中的方法，包括以下步骤：
S1、菌种活化：挑取冻存于-80℃圆红冬孢酵母A1-15-BRQ菌株，即挑取适量菌株冰碴，划线于YEPDH平板，在28℃下培养2天，得到第一代平板，挑取单菌落划线于YEPDH平板，在28℃下培养4天，得到第二代平板；挑选第二代平板上的单菌落，接种入50mL YEPD液体培养基(20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，pH6.2)，在30℃，200rpm/min下于250mL摇瓶中培养24h，得圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液；
S2、发酵：将圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液按体积百分比20％接种到100mL生产红酵母红素的液体培养基中，在30℃、190rpm/min下于250mL摇瓶中培养96h，得到含有红酵母红素的发酵液；
其中，所述生产红酵母红素的液体培养基成分为：30g/L葡萄糖，3g/L硫酸铵，7g/L氢氧化钾，0.3g/L硫酸镁和8mL/L微量元素溶液，其余成分为水；所述微量元素溶液pH6.2、成分为4g/L二水氯化钙，0.52g/L柠檬酸，0.55g/L七水硫酸铁，0.076g/L一水硫酸锰，0.10g/L七水硫酸锌，100μL/L质量分数98％硫酸，其余成分为水。
本实施例所得含有红酵母红素的发酵液中，红酵母红素的产量为19.2mg/L，比例为65.6％。
实施例4
使用圆红冬孢酵母A1-15-BRQ生产红酵母红素中的方法，包括以下步骤：
S1、菌种活化：挑取冻存于-80℃的圆红冬孢酵母A1-15-BRQ菌株，即挑取适量菌株冰碴，划线于YEPDH平板，在28℃下培养2天，得到第一代平板，挑取单菌落划线于YEPDH平板，在28℃下培养4天，得到第二代平板；挑选第二代平板上的单菌落，接种入50mL YEPD液体培养基(20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，pH6.0)，在28℃、200rpm/min下于250mL摇瓶中培养24h，得圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液；
S2、发酵：将圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液按体积百分比10％接种到70mL生产红酵母红素的液体培养基中，在28℃、200rpm/min下于250mL摇瓶中培养72h，得到含有红酵母红素的发酵液；
其中，所述生产红酵母红素的液体培养基成分为29.6g/L葡萄糖，2g/L硫酸铵，5g/L氢氧化钾，0.15g/L硫酸镁和10mL/L微量元素溶液，其余成分为水；所述微量元素溶液pH6.0、成分为4g/L二水氯化钙，0.52g/L柠檬酸，0.55g/L七水硫酸铁，0.076g/L一水硫酸锰，0.10g/L七水硫酸锌，100μL/L 98％硫酸，其余成分为水。
本实施例所得含有红酵母红素的发酵液中，红酵母红素的产量为22.3mg/mL，比例为90.5％，高效液相色谱图如图1所示。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一株圆红冬孢酵母A1-15-BRQ(Rhodosporidium toruloides)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No.16638。
2.如权利要求1所述圆红冬孢酵母A1-15-BRQ的应用，其特征在于，用于生产红酵母红素。
3.一种使用权利要求1所述圆红冬孢酵母A1-15-BRQ生产红酵母红素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、菌种活化：将圆红冬孢酵母A1-15-BRQ进行菌种活化，获得圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液；
S2、发酵：将圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液按体积百分比5％～20％接种到生产红酵母红素的液体培养基中，在28～30℃、180～200rpm/min培养48～96h，得到含有红酵母红素的发酵液；
其中，所述生产红酵母红素的液体培养基成分为：26～30g/L葡萄糖，2～3g/L硫酸铵，5～7g/L氢氧化钾，0.15～0.3g/L硫酸镁和8～10mL/L微量元素溶液，其余成分为水；所述微量元素溶液成分为4g/L二水氯化钙，0.52g/L柠檬酸，0.55g/L七水硫酸铁，0.076g/L一水硫酸锰，0.10g/L七水硫酸锌，100μL/L质量分数98％硫酸，其余成分为水，pH5.9～6.2。
4.根据权利要求3所述使用圆红冬孢酵母A1-15-BRQ生产红酵母红素的方法，其特征在于，步骤S1所述菌种活化具体为：用接种环挑取冻存于-80℃的圆红冬孢酵母A1-15-BRQ，划线于YEPDH平板，在28℃培养2天后，为第一代，挑取第一代中的单菌落，再次划线于YEPDH平板，在28℃培养4天后，为第二代，挑选第二代中的单菌落，接种入50mL YEPD液体培养基，在28～30℃、180～200rpm/min培养24h，得圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液。
5.根据权利要求3所述使用圆红冬孢酵母A1-15-BRQ生产红酵母红素的方法，其特征在于，步骤S2所述发酵具体为：圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液按体积百分比10％接种到生产红酵母红素的液体培养基中，在28℃，200rpm/min培养72h，得到含有红酵母红素的发酵液；
其中，所述生产红酵母红素的液体培养基成分为29.6g/L葡萄糖，2g/L硫酸铵，5g/L氢氧化钾，0.15g/L硫酸镁和10mL/L微量元素溶液，其余成分为水；所述微量元素溶液pH6.0、成分为4g/L二水氯化钙，0.52g/L柠檬酸，0.55g/L七水硫酸铁，0.076g/L一水硫酸锰，0.10g/L七水硫酸锌，100μL/L质量分数98％硫酸。
6.根据权利要求3所述使用圆红冬孢酵母A1-15-BRQ生产红酵母红素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、菌种活化：挑取冻存于-80℃的圆红冬孢酵母A1-15-BRQ菌株，划线于YEPDH平板，在28℃下培养2天，得到第一代，挑取第一代中的单菌落划线于YEPDH平板，在28℃下培养4天，得到第二代；挑选第二代中的单菌落，接种入50mL YEPD液体培养基，在28℃、200rpm/min下于250mL摇瓶中培养24h，得圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液；
所述YEPD液体培养基的组成包括20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，pH6.0；
S2、发酵：将圆红冬孢酵母A1-15-BRQ种子液按体积百分比10％接种到70mL生产红酵母红素的液体培养基中，在28℃、200rpm/min下于250mL摇瓶中培养72h，得到含有红酵母红素的发酵液；
其中，所述生产红酵母红素的液体培养基成分为29.6g/L葡萄糖，2g/L硫酸铵，5g/L氢氧化钾，0.15g/L硫酸镁和10mL/L微量元素溶液，其余成分为水；所述微量元素溶液pH6.0、成分为4g/L二水氯化钙，0.52g/L柠檬酸，0.55g/L七水硫酸铁，0.076g/L一水硫酸锰，0.10g/L七水硫酸锌，100μL/L质量分数98％硫酸，其余成分为水。
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| GR01 | Patent grant | ||
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