KR910006487A - 조절 dna 서열 - Google Patents

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KR910006487A
KR910006487A KR1019900014407A KR900014407A KR910006487A KR 910006487 A KR910006487 A KR 910006487A KR 1019900014407 A KR1019900014407 A KR 1019900014407A KR 900014407 A KR900014407 A KR 900014407A KR 910006487 A KR910006487 A KR 910006487A
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주니어 프레드릭 마인스
신시 히데아끼
노이하우스 제안-마르크
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베르너 발데그
시바-가이기 아게
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Description

조절 DNA 서열
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 pSCH12의 유전자 지도를 도시함.
제2도는 pCIB200의 제한 지도를 도시함.
제3도는 플라스미드 pSCH12의 일반적 작성도임.

Claims (74)

  1. 식물 키니나제 유전자의 5`비번역 영역으로부터 수득할 수 있고 또 발현 DNA 및 식물 세포내에서 활성인 발현 시그널에 작용 가능하게 결합되어 있는 한 식물 숙주로 형질 전환시, 작용 가능하게 결합된 발현 DNA의 발현 수준을 현저히 증가시키는 조절 DNA 서열.
  2. 제1항에 있어서, 담배의 염기성 키티나제 유전자의 5'비번역 영역으로부터 수득된 조절 DNA 서열.
  3. 제2항에 있어서, 상기 서열 부분이 55% 이상의 A/T로 구성된 A/T가 풍분한 영역인 조절 DNA 서열.
  4. 제2항에 있어서, 상기 서열 부분이 70% 이상의 A/T로 구성된 A/T가 풍분한 영역인 조절 DNA 서열.
  5. 제2항에 있어서, 1 개 이상의 염기 돌연변이를 기본으로 하지만 하기 서열과 실질적으로 상동이면서 여전히 출발 서열의 특수한 조절, 발현 증가 특성을 갖는 DNA 서열의 모든 유도체를 포함한, 하바나425 품종 담배 작물의 염기성 키티나제 유전자의 5`비번역 영역으로부터 수득될 수 있고 또 하기와 같은 DNA 서열을 필수적으로 갖는 조절 DNA 서열.
    5'-TTGCATTCACCAGTTTACTACTACATTAAA-3'
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA 서열이 실질적으로 순수한 형태인 조절 DNA 서열.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 하나에 따른 조절 DNA 서열 또는 이들 DNA 서열의 유도체 중 어느 하나로부터 수득할 수 있고 또 출발 물질의 특수한 조절, 발현 증가 특성을 갖고 있는 단편 또는 부분적 서열.
  8. 제7항에 있어서, 1개 이상의 염기의 돌연변이를 기본으로 하지만 상기 서열에 실질적으로 상동이고 또 출발 서열의 특수한 조절, 발현 증가 특성을 갖고 있는 DNA 서열의 모든 유도체를 포함한 하기 DNA 서열을 갖는 부분적 서열;
    5`-ACTACTACATTAAA-3`
  9. 5` 비번역 영역에서 하기와 같은 특수한 구조적 특징을 갖는 하바나425 품종의 담배 작물로부터 수득할 수 있는 염기성 키티나제.
    (a) 위치 1967 내지 1971의 CTACT 서열내에 있는 전사 개시 부위; (b) 전사 개시 부위 11bp 하루, 위치 1980에 있는 제1개시 코돈; (c) 5`-측 영역의 위치 -28 내지 -23에 있는 전사 개시 부위의 상류 TAAATA 서열("TATA박스") (d) 위치 -114에 있는 CCAATT 서열; (f)위치 -152 내지 -228에서 10bp로 구성된 완전 반복 서열(ATGTCCAAAC); (e) 위치 -140에서 6bp로 구성된 불완전 역향 반복 서열(GCCGAATTCGAGC); (g) 위치 -166 내지 -569에서 20bp로 구성된 불안전 동방향 반복 서열(TTTTAACTAAATCTATGTCC); (h) 위치 -191 내지 -217에서 25bp로 구성된 불안전 동방향 반복 서열(CAACTTTCAAAAATTATTTTTTAAA); (i) 위치 -289에서 20bp로 구성된 팔린드롬(TAAAATATGAITCATGTTTTA); (j) 위치 -435 내지 -480에서 11bp로 구성된 완전 동방향 반복 서열(TAAGAGCCGCC); (k) 위치 -514 내지 -644에서 15bp로 구성된 불완전 동방향 반복 서열(TAAAATACACGTCGA); (l) 5`-측 영역에서 번역 중지 서열의 하류인 위치 52 내지 120에 있는 2개의 AATAAA 서열.
  10. 제6도에 도시된 뉴클레오티드 서열을 갖는, 하반425 품종의 담배 직물로부터 수득할 수 있는 염기성 키티나제 유전자.
  11. 제1항 내지 제8항중 어느 하나에 따른 조절 DNA 서열이 발현 DNA 및 식물 세포에서 활성인 발현 시그널과 작용 가능하게 결합되어 있어 식물 숙주로 형질 전환시, 작용 가능하게 결합된 발현 DNA의 발현 수준을 현저히 증가시키는 키메라 유전자 구조물인 재조합 DNA 분자.
  12. 제11항에 있어서, 스페이서(spacer) 서열이 프로모터 서열 및 그와 인접하는 조절 DNA 서열 사이에 삽입되며 또 스페이서의 길이는 프로모터와 조절 DNA 사이의 거리가 결합된 구조 유전자의 발현에 적합한 거리로 선택되는 재조합 DNA 분자.
  13. 제12항에 있어서, 스페이서 서열이 1bp 내지 100bp로 구성된 재조합 DNA 분자.
  14. 제11항에 있어서, 발현 시그널이 식물 또는 식물 비루스의 유전자로부터 유래하는 재조합 DNA 분자.
  15. 제11항에 있어서, 발현 시그널이 세균성 발현 시그널인 재조합 DNA 분자.
  16. 제14항에 있어서, 발현 시그널이 꽃양배추 모자이크 비루스 유전자(CaMV)의 프로모터 및/또는 전사 종결 서열인 재조합 DNA 분자.
  17. 제15항에 있어서, 발현 서열이 아그로박테륨 튜메파시엔스의 Ti-플라스미드로부터의 노팔린 합성 효소 유전자(nos) 및/또는 옥토핀 합성 효소 유전자(OCS)의 발현 시그널인 재조합 DNA 분자.
  18. 제11항에 있어서, 결합된 DNA 서열을 식물 세포내에서 유도 또는 억제의 의미로 조절할 수 있는 추가의 조절 DNA 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조절 서열이 식물 호르몬, 열 충격, 화학물질, 병원체, 산소결핍 및 광으로 구성된 군에서 선정된 여러가지 내부 및/또는 외부 요인에 의해 유도된 재조합 DNA 분자.
  20. 제11항에 있어서, 조절 DNA 서열과 결합된 발현 DNA가 형질 전환된 세포 및 그로부터 발달된 조직, 및 특히 식물상에 병원체 화학 물질 및 유해한 환경 요인에 대한 보호 작용을 부여하는 구조 유전자인 재조합 DNA 분자.
  21. 제20항에 있어서, 상기 구조 유전자가 식물 세포에서 키티나제를 발현하는 유전자인 재조합 DNA 분자.
  22. 제20항에 있어서, 상기 구조 유전자가 식물 세포에서 글루카나제를 발현하는 유전자인 재조합 DNA 분자.
  23. 제20항에 있어서, 상기 구조 유전자가 식물 세포에서 프로테아제 억제제를 발현하는 유전자인 재조합 DNA 분자.
  24. 제20항에 있어서, 상기 구조 유전자가 제초제 내성 유전자인 재조합 DNA 분자.
  25. 제20항에 있어서, 상기 구조 유전자가 식물 세포에서 바실루스 트린지엔시스로부터의 d-엔도톡신을 발현하는 유전자인 재조합 DNA 분자.
  26. 제11항에 있어서, 조절 DNA 서열과 결합된 구조 유전자가 형질 전환된 식물 세포 그 자체 또는 조직, 기관, 캘러스 및 배 및 전체 식물로 구성된 군으로부터 선정된 고등 기관 단위 부위에서 발현시 소망하는 유용 화합물의 생산을 증가시키는 재조합 DNA 분자.
  27. 제11항에 있어서, 상기 발현 DNA 서열이 안티-센스 DNA인 재조합 DNA 분자.
  28. 제11항에 있어서, 선택 표현형 마커를 코딩하는 DNA 서열을 추가로 함유하는 재조합 DNA 분자.
  29. 제28항에 있어서, 상기 선택 표현형 마커가 암피실린, 테트라시클린, 히그로마이신, 카나마이신, 메토트렉세이트, G418 및 네오마이신으로 구성된 군으로부터 선택된 항생물질 내성인 재조합 DNA 분자.
  30. 제11항에 있어서, 미생물에서 복제를 허용하는 복제기점을 함유하는 재조합 DNA 분자.
  31. 제30항에 있어서, 상기 복제 기점이 대장균, 아그로박테륨 또는 이를 모두에서 작용하는 재조합 DNA 분자.
  32. 제11항 내지 제31항중 어느 하나에 따른 재조합 DNA 분자를 함유하는 클로닝 벡터.
  33. 제11항 내지 제31항중 어느 하나에 따른 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질 전환 벡터.
  34. 대장균 및 아그로박테륨 모두에서 안정하게 복제할 수 있는 제31항에 따른 재조합 DNA 분자를 함유하는 셔틀 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 키메라 유전자 구조물이 왼쪽 경계 서열(LB) 및 오른쪽 경계 서열(RB) 사이에 클론된, 에이. 튜메파시엔스의 Ti-플라스미드로부터 수득할 수 있는 셔틀 벡터.
  36. 제11항 내지 제31항중 어느 하나에 따른 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 생물.
  37. 제32항 내지 제35항중 어느 하나에 따른 벡터를 함유하는 숙주 생물.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 세균인 숙주 생물.
  39. 제36항 또는 제37항에 있어서, 숙주 생물이 원형질, 세포, 캘러스, 조직, 기관, 종자, 배, 화분, 배주, 접합자 등으로 구성된 군에서 선정된 식물 물질인 숙주 생물.
  40. 제11항 내지 제31항에 따른 재조합 DNA 분자를 함유하는, 유성 및 무성 후대를 포함한 트랜스제닉 식물.
  41. 형질 전환된 세포 및/또는 조직에서 단백질 함량이 야생형과 비교하여 현저히 증가된, 유성 및 무성 후대를 포함한 트랜스제닉 식물.
  42. 제41항에 있어서, 야생형에 비하여 키티나제 함량이 현저히 증가된, 유성 및 무성 후대를 포함한 트랜스 제닉 식물.
  43. 제41항에 있어서, 야생형에 비하여 글루카나제 함량이 현저히 증가된, 유성 및 무성 후대를 포함한 트랜스 제닉 식물.
  44. 제39항에 따른 형질 전환된 식물 물질로부터 재분화된 트랜스제닉 식물.
  45. 제40항 내지 제44항중 어느 하나에 있어서, 트랜스제닉 식물이 수정 가능한 식물인 트랜스제닉 식물.
  46. 제40항 내지 제45항중 어느 하나에 따른 트랜스제닉 식물의 증식 물질.
  47. 제40항 내지 제45항중 어느 하나에 따른 트랜스제닉 식물의 부위.
  48. 염기성 키티나제 유전자의 5'비번역 영역으로부터 DNA 서열을 단리하거나 또는 공지 방법으로 합성하는 것을 포함하는 제1항에서 정의된 조절, 발현 증가 DNA 서열의 제조 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 조절 DNA 서열이, 1개 이상의 염기 돌연변이를 기본으로 하지만 하기 서열과 실질적으로 상동이면서 여전히 출발 서열의 특수한 조절, 발현 증가 특성을 갖는 DNA 서열의 모든 유도체를 포함한, 하기와 같은 뉴클레오티드 서열인 방법.
    5'-TTGCATTTCACCAGTTTACTACTACATTAAA-3'
  50. 제48항에 있어서, (a) 키티나제를 발현할 수 있는 조직으로부터 게놈 DNA를 추출 및 정제하고; (b) 추출 및 정제된 DNA 제제를 클로닝 벡터에 삽입하기에 적합한 크기의 단편으로 분해시키며; (c) 단편화된 DNA를 클로닝 벡터에 클로닝하여 유전자 라이브러리를 생성하고; (d) 탐침 분자를 사용하여 키티나제 유전자 또는 그의 일부를 함유하는 클론을 분리하며; (e) 강한 혼성화 신호를 나타내는 클론을 탐침 분자를 사용하여 단리하고; (f) 상기 (e)에서 단리된 클론을 생화학적 방법에 의해 특징화시키며; 및 (g) 발현 증가에 관련있는 조절 DNA 서열을 확인하여 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 게놈 유전자 라이브러리를 제조하기 위해 발현 벡터를 사용하는 방법.
  52. 제50항에 있어서, 공지된 키티나제 클론 또는 그의 부분을 탐침자로 사용하는 방법.
  53. 제48항에 있어서, 상기 조절 DNA 서열 및 그로부터 유도된 동일 기능을 갖는 유도체가 화학적 공정으로 합성되는 방법.
  54. 제1항에 따른 조절 DNA 서열을 소망하는 구조 유전자의 개시 코돈 앞에 직접적으로 삽입하고 또 이 구조물을 식물 세포에서 활성인 발현 시그널에 작용 가능하게 결합시키는 것을 포함하는, 제11항에 따른 재조합 DNA 분자의 제조 방법.
  55. 제54항에 있어서, 스페이서 서열이 프로모터와 조절 DNA 서열 사이에 삽입된 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 구조 유전자가 키티나제 또는 글루타나제 유전자인 방법.
  57. 제54항에 있어서, 상기 구조 유전자가 프로테아제 억제제를 코딩하는 유전자인 방법.
  58. 제54항에 있어서, 상기 구조 유전자가 제초제 내성 유전자인 방법.
  59. 제54항에 있어서, 상기 구조 유전자가 바실루스 투린지엔시스로부터의 d-엔도톡신 유전자인 방법.
  60. (a) 조절 DNA 서열을 소망하는 발현 DNA의 개시 코돈 바로 앞에 삽입하고; 또 (b) 식물 세포에서 활성인 발현 시그널 사이에 형질 전환체 선택에 적합한 마커 유전자를 함유할 수 있는 공지 식물 발현 벡터에 상기 구조물을 작용 가능한 방식으로 삽입시키는 것을 포함하는, 제1항에 따른 조절 DNA 서열과 작용 가능하게 결합되어 식물 세포에서 발현할 수 있는 DNA를 함유하는 발현 벡터의 제조 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 구조물을 식물 발현 벡터의 프로모터와 터미네이터 사이에 존재하는 폴리링커 영역에 삽입시키는 방법.
  62. 식물을 제11항 내지 제31항중 어느 하나에 따른 재조합 DNA 분자를 사용한 공지 방법으로 형질 전환시키는 것을 포함하는, 형질 전환된 세포 및/또는 조직에서 단백질 함량이 야생형에 비하여 증가된 트랜스제닉 식물의 제조 방법.
  63. 제62항에 있어서, 식물을 제21항에 따른 재조합 DNA 분자를 사용하여 형질 전환시키고 삽입된 키티나제 유전자를 발현시키는 것을 포함하는, 키티나제 함량이 야생형에 비하여 현저히 증가된 트랜스제닉 식물의 제조 방법.
  64. 제62항에 있어서, 식물의 제22항에 따른 재조합 DNA 분자를 사용하여 형질 전환시키고 또 삽입된 글루카나제 유전자를 발현시키는 것을 포함하는 글루카나제 함량이 야생형에 비하여 현저히 증가된 트랜스제닉 식물의 제조 방법.
  65. 식물의 제21항에 따른 재조합 DNA 분자를 사용하여 형질 전환시키고 또 병원체를 치사시키거나 또는 병원체를 조절하에 유지하기에 충분한 양으로, 삽입된 키티나제 유전자를 발현시키는 것을 포함하는, 키틴 함유 병원체에 대하여 식물을 보호하는 방법.
  66. 식물을 제22항에 따른 재조합 DNA 분자를 사용하여 형질 전환시키고 또 병원체를 치사시키거나 또는 병원체를 조절하에 유지하기에 충분한 양으로, 삽입된 글루카나제 유전자를 발현시키는 것을 포함하는, 키틴 함유 병원체에 대하여 식물을 보호하는 방법.
  67. 병원체를 제21항 또는 제22항에 따른 재조합 DNA 분자를 사용하여 형질 전환된 트랜스제닉 식물 또는 식물 부분과 접촉시키고, 또 병원체를 치사시키거나 또는 병원체를 조절하에 유지하기에 충분한 양으로, 삽입된 키티나제 또는 글루카나제 유전자를 발현시키는 것을 포함하는 키틴 함유 병원체의 제어 방법.
  68. (1) 키티나제를 발현할 수 있는 조직으로부터 게놈 DNA를 추출 및 정제하고; (2) 추출 및 정제된 DNA 제제를 클로닝 벡터에 삽입하기에 적합한 크기의 단편으로 분해시키며; (3) 단편화된 DNA를 클로닝 벡터에 클로닝하여 유전자 라이브러리를 생성하고; (4) 탐침 분자를 사용하여 키티나제 유전자 또는 그의 일부를 함유하는 클론을 분리하며; (5) 강한 혼성화 신호를 나타내는 클론을 탐침 분자를 사용하여 단리하고; 또 (6) 상기 (5)에서 단리된 클론을 생화학적 방법에 의해 특징화시키는 단계를 포함하는 제9항에 따른 염기성 키티나제 유전자의 제조 방법.
  69. 제68항에 있어서, 게놈 유전자 라이브러리를 생성하기 위해 발현 벡터를 사용하는 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 앞서 단리된 cDNA 클론을 탐침으로 이용하거나 또는 특정 번역산물의 확인을 기본으로 한 면역학적 확인 방법을 이용한 플라크 혼성법 또는 감별 콜로니 혼성법에 의해 게놈 유전자 라이브러리를 스크링하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 cDNA 클론이 pCHN48 또는 pCHN50 또는 이들의 기능적 상당물인 방법.
  72. 게놈 또는 cDNA 유전자 라이브러리를 작성하고 또 조절 DNA 서열을 탐침 분자로 사용하여 탐침 분자와 혼성될 수 있는 동종 DNA 서열이 존재하는가에 대해 조사함으로써 동일 기능을 갖는 동종 DNA 서열을 확인하기 위해 제1항 내지 제8항중 어느 하나에 따른 조절 DNA 서열 또는 그의 부분적 서열을 사용하는 것을 포함하는, 조절 DNA 서열의 확인 방법.
  73. 식물 물질에서 유전자 발현을 증가시키기 위한 제1항에 정의된 조절 DNA 서열의 용도.
  74. 게놈 유전자 라이브러리를 제조하고 또 조절 DNA 서열을 탐침 분자로 사용하여 탐침 분자와 혼성될 수 있는 동종 DNA 서열이 존재하는가에 대하여 조사하는 것을 포함하는, 동일 기능을 갖는 동종 DNA 서열을 확인하기 위한 제1항에 정의된 조절 DNA 서열의 용도.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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