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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft Verfahren zum Einführen von genetischem Material
von Interesse in Pflanzen und insbesondere Verfahren, welche eine
Transformation und Linienkonversion von Pflanzenspezies, die sich
auf genetischer Ebene als schwierig zu manipulieren erwiesen haben,
umfassen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Während der
letzten zwanzig Jahre sind Methodiken entwickelt worden, um Pflanzen
gentechnologisch zu modifizieren. Im Allgemeinen basieren sie entweder
auf einer direkten DNA-Einführung
in Pflanzenzellen oder einem indirekten Transfer, welcher durch
Agrobacterium tumefaciens vermittelt wird. Verfahren, welche einen
direkten Transfer umfassen, umfassen Partikel-Bombardement von kultivierten Pflanzengeweben
und eine DNA-Einführung
in nackte Pflanzenzellen, d. h. Protoplasten, unter Verwendung von
Polyethylenglycol oder Elektroporation. Siehe z. B. Sawahel & Cove, Biotech.
Adv. 10: 394-412 (1992); Christou, Cur. Opinion Biotech. 4: 135-141
(1993); Gelvin, Cur. Opinion Biotech. 9: 227-232 (1998) und Birch,
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 297-326 (1997).
Die meisten Verfahren sind sortenspezifisch, da sie auf einer Verwendung
von in vitro kultivierten regenerierbaren Pflanzensystemen, die
wiederum sortenspezifisch sind, basieren. Mit Ausnahme von einigen
wenigen wirtschaftlich wichtigen Feldfrüchten, wie Kartoffel, Tomate
und Canola, funktionieren verfügbare
Transformationsverfahren üblicherweise
nur bei einer Handvoll Sorten.
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Das
traditionelle zur Züchtung
eingesetzte Rückkreuzungsverfahren
hat einen Mechanismus für den
Transfer eines Merkmals von einer Linie (dem Spender oder Donor)
zu einer anderen Linie (dem Rückkreuzungselter)
bereitgestellt. Siehe z. B. Harlan und Pope, J. Heredity, 13: 319-322
(1992). Es ist für
Mais, Sojabohne und Baumwolle besonders nützlich gewesen. Eine erfolgreiche
Rückkreuzungszüchtung erfordert:
einen zuvor abgeleiteten Rückkreuzungselter;
Aufrechterhaltung des Merkmals von Interesse während einer Selektion; ausreichende Rückkreuzungen,
um das Genom des Rückkreuzungselters
zu rekonstituieren. Allard, Principles of Plant Breeding, Wiley
and Sons (1960). Während
des Rückkreuzungsprogramms
wird die hybride Population zunehmend homozygot für Gene des
Rückkreuzungselters
mit einer Rate, die beschrieben wird durch die Formel: Anteil von Homozygotie = 1–0,5m,wobei
m die Anzahl von Rückkreuzungsgenerationen ist.
Unter Verwendung dieser Formel kann man berechnen, dass nach sechs
Generationen mehr als 98% des hybriden Genoms hinsichtlich Genen
des Rückkreuzungselters
homozygot sein wird. Die Formel beschreibt jedoch nur Regionen des
Genoms, die in Bezug auf die Gene, die durch Introgression eingeführt werden
sollen, keine Kopplung aufweisen. Die Rate, mit welcher gekoppelte
Regionen Homozygotie erreichen, hängt von der Chromosomenrekombinationsfrequenz
ab. In einer der detailliertesten Untersuchungen, welche die Wirksamkeit
der traditionellen Rückkreuzungszüchtung untersuchte,
wurden acht Tm-2-konvertierte isogene Linien von Tomate bei neun
flankierenden Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Loci
untersucht. Siehe Young und Tanksley, Theor. Appl. Genet. 77: 353-359 (1989).
Das minimale Donor-Chromosomenfragment, welches nach 10 Generationen
von Rückkreuzung
gefunden und ohne Verringerung der Größe für zusätzliche neun Generationen aufrechterhalten
wurde, war 4 cM groß,
die sogar nach 11 Generationen gefundene maximale Größe betrug
51 cM (d. h. mehr als die Hälfte
des entsprechenden Chromosoms). Bei einer Marker-unterstützten Selektion,
welche auf einfachen Sequenzwiederholungen („simple sequence repeats"; SSR) oder RFLP
basiert, könnte die
Rekonstruktion schneller und sauberer ausgeführt werden, sie würde aber
das Screenen von Populationen von Nachkommenschaft, deren Größe bestimmt
werden kann, unter Verwendung von relativ teuren Methoden erfordern
und würde
durch die zufällige
Insertion von Transgenen in unabhängigen primären Transformanten verkompliziert
werden.
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Einfang
gesagt, ist die Rückkreuzung
keine einfache Aufgabe, da für
die meisten Feldfruchtpflanzen Hunderte von Linien, Hybriden oder
Sorten gleichzeitig benötigt
werden. Beispielsweise bestand 1998 der U.S.-amerikanische Sojabohnensamen-Markt
aus mehr als 500 Sorten und der U.S.-Maissamen-Markt umfasste über 600
Hybride. Ein anderer Hauptnachteil des Rückkreuzungsverfahrens besteht
darin, dass es sehr zeitaufwändig
ist. Eine Linienkonversion durch wiederholte Rückkreuzung erfordert normalerweise
3 bis 5 anschließende Rückkreuzungen,
wodurch mindestens zwei und manchmal bis zu vier Jahre zur Sortenentwicklungszeit
hinzukommen.
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Es
gibt viele Nachteile, die mit gegenwärtigen Transformationsmethoden
verbunden sind. Beispielsweise ist die Linienkonversion ein Verfahren, durch
welches heterologe DNA von einer Pflanzenspezies oder Sorte zu einer
anderen transferiert wird unter Verwendung von verschiedenen Formen
von sexueller (d. h. Bestäubung)
oder somatischer (d. h. zellulärer)
Hybridisierung. Da gegenwärtige
Verfahren spezies- und sortenspezifisch sind, können sie kommerziell nur in
Verbindung mit Linienkonversionstechniken, die einen Transgen-Transfer
von einer primären
Transformante zu einer Mehrzahl von Sorten von Interesse erlauben,
verwendet werden. Zusätzlich
führen
sie zu einer zufälligen
Transgen-Insertion in das Wirtsgenom. Dementsprechend ist ein intensives
Screening von zahlreichen unabhängigen Transformationsereignissen
erforderlich, um die Ereignisse zu identifizieren, die stabil, vererbbar
sind und eine korrekte Transgen-Expression erlauben. Nachfolgende
Transgen-Insertionen können
nicht zielgerichtet an derselben Stelle ausgeführt werden, wodurch die Züchtung verkompliziert
wird. „Linkage drag" (d. h. gleichzeitige
Vererbung von unerwünschten
Merkmalen) und eine begrenzte Fähig keit,
eine Mehrzahl von unabhängigen
Transgen-Merkmalen handzuhaben, werfen sogar noch weitere Schwierigkeiten
auf.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
Anmelder haben ein Verfahren zum Einführen von Nukleinsäuren in
Pflanzen und zum Herstellen von gentechnologisch modifizierten Pflanzen erfunden.
Die Verfahren sind anwendbar auf Pflanzen, wie Mais und Weizen,
die durch existierende Techniken relativ schwierig genetisch zu
modifizieren gewesen sind. Zusätzlich
stellt das Verfahren eine signifikante Verbesserung gegenüber Rückkreuzungsverfahren
dar, da es die gleichen oder bessere Ergebnisse in einem viel kürzeren Zeitraum
erzielt.
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Die
Nukleinsäure
von Interesse wird in die Pflanze von Interesse oder das, was als
Empfänger bezeichnet
wird, nicht direkt eingeführt.
Vielmehr wird sie zuerst zu einer anderen Pflanze umgeleitet, welche
von dem Empfänger
verschieden ist und welche als der Donor oder die Zwischenablage-Spezies („clipboard"-Spezies) bezeichnet
wird. Die Nukleinsäure
wird dann von dem Donor zu dem Empfänger bewegt. Ein Verfahren
umfasst eine sexuelle Hybridisierung oder „Kreuzung" der beiden Pflanzen. Pollen von dem
Donor wird verwendet, um eine Empfängerpflanze zu bestäuben. Ein
anderes Verfahren wird auf der zellulären Ebene ausgeführt, wobei
Zellen oder Protoplasten der Donor- und der Empfängerpflanze fusioniert werden.
Ein Merkmal der Erfindung ermöglicht,
dass die Nukleinsäure
von dem Donor zu dem Empfänger
ohne Transfer von jeglicher nativer genomischer DNA des Donors bewegt
wird. Dies wird bewerkstelligt aufgrund der Auswahl von Donor/Empfänger-Paaren,
die normalerweise instabile Hybride erzeugen. Dies bedeutet, dass
die jeweiligen Genome instabil sind und dementsprechend sich nicht
unter Erzeugung einer „hybriden" Pflanze miteinander
vermischen. Dieses Phänomen
wird nachfolgend als „Erzeugen
von instabiler Nachkommenschaft oder Demonstrieren von präferentieller
Segregation oder Auslese" bezeichnet.
Während
der zeitweiligen Coexistenz der Chromosome des Donors und des Empfängers wird
die Nukleinsäure
oder das Gen von Interesse zu dem Genom der Empfängerpflanze bewegt. Ein anderes
Merkmal der Erfindung bewerkstelligt eine zufällige oder ortsspezifische
Einführung
von Nukleinsäure,
indem die Nukleinsäure von
Interesse mit flankierenden Sequenzen, die eine Transposition der
Nukleinsäure
an eine zufällige
Position ermöglichen
oder die Insertion der Nukleinsäure
an einer speziellen Position in dem Genom des Empfängers dirigieren,
umgeben wird.
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Dementsprechend
ist ein Aspekt der Erfindung auf ein Verfahren zum Einführen von
genetischem Material in Pflanzen gerichtet, welches umfasst:
Herstellen
einer ersten Pflanze, die mit einer heterologen Nukleinsäure transformiert
ist, welche ausschneidbare flankierende 5'- und 3'-Sequenzen, die eine Bewegung der heterologen
Nukleinsäure
von einem Genom zu einem anderen ermöglichen, aufweist;
Kreuzen
einer zweiten Pflanze und der transformierten ersten Pflanze, wobei
die erste und die zweite Pflanze nach dem Kreuzen instabile Nachkommenschaft
erzeugen oder präferentielle
Segregation oder Auslese demonstrieren; und
Selektieren von
Nachkommenschaft der zweiten Pflanze von (b), die die heterologe
Nukleinsäure
enthält.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
umfassen die ausschneidbaren flankierenden 5'- und
3'-Sequenzen ein
transponierbares Element und die erste Pflanze, die zweite Pflanze
oder sowohl die erste Pflanze als auch die zweite Pflanze produzieren
eine für
das transponierbare Element spezifische Transposase. In einer anderen
bevorzugten Ausführungsform
sind die ausschneidbaren flankierenden 5'- und 3'-Sequenzen Rekombinationsstellen und
die erste Pflanze, die zweite Pflanze oder sowohl die erste als auch
die zweite Pflanze produzieren eine für die Rekombinationsstellen
spezifische Rekombinase.
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In
anderen bevorzugten Ausführungsformen ist
die erste Pflanze, welche auch als die Donor- oder Zwischenablage
(„clipboard")-Spezies bezeichnet wird,
Tripsacum und ist (in) die zweite Pflanze, welche auch als der Empfänger bezeichnet
wird, Mais, Weizen, Gerste oder Hafer. In einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
ist der Donor Orychophragmus und ist der Empfänger ein Kreuzblütler, wie
Canola. Andere bevorzugte Donor/Empfänger-Paare sind: Glycine tomentella/Sojabohne,
Solanum phreja/Kartoffel, Mais/Weizen, Mais/Gerste, Mais/Hafer, Pennisetum/Weizen,
Pennisetum/Gerste, Hordeum bulbosum/Gerste, Hordeum bulbosum/Weizen,
Nicotiana digluta/Nicotiana tabacum und Oryza minuta/Reis.
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In
anderen bevorzugten Ausführungsformen trägt die Donor-
und/oder die Empfängerpflanze
eine Se-Hemigamie-Mutation. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen
ist die Donor- und/oder Empfängerpflanze
Sojabohne, die eine ms-Mutation, welche Polyembryonie hervorruft,
trägt.
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In
anderen bevorzugten Ausführungsformen des
Verfahrens werden Transgene zu speziellen, vorab definierten Genomstellen
durch zielgesteuerte Rekombination als ein integrativer Genort dirigiert.
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Ein
verwandter Aspekt der Erfindung ist auf ein Verfahren zum Einführen von
genetischem Material in Pflanzen, das auf einer somatischen Ebene ausgeführt wird,
gerichtet. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
Herstellen
einer Zelle oder eines Protoplasten von einer ersten Pflanze, die
bzw. der mit einer heterologen Nukleinsäure transformiert ist, welche
ausschneidbare flankierende 5'-
und 3'-Sequenzen,
die eine Bewegung der heterologen Nukleinsäure von einem Genom zu einem
anderen erlauben, aufweist;
Fusionieren der Zelle oder des
Protoplasten mit einer Zelle oder einem Protoplasten einer zweiten
Pflanze, um eine fusionierte Zelle oder einen fusionierten Protoplasten
zu erzeu gen, wobei die erste und die zweite Pflanze beim Kreuzen
instabile Nachkommenschaft erzeugen oder präferentielle Segregation oder
Auslese zeigen;
Regenerieren von vollständigen Pflanzen ausgehend von
der fusionierten Zelle oder dem fusionierten Protoplasten; und
Selektieren
von Nachkommenschaft von den regenerierten Pflanzen, die die heterologe
Nukleinsäure
enthalten. Die fusionierten Zellen oder Protoplasten per se werden
ebenfalls bereitgestellt. Ferner erzeugen die Verfahren der Erfindung
Pflanzen, die eine unterschiedliche genetische Ausstattung als transgene Pflanzen,
die durch andere Verfahren hergestellt worden sind, aufweisen, da
das Endergebnis des Verfahrens eine individuelle Pflanze ist, die
genetisch frei von jeglicher standortfesten DNA der primären Transformante
(d. h. des Donors) ist. Es werden auch Nachkommenschaft der Pflanze,
Pflanzenteile und Samen und Samenteile von der Pflanze bereitgestellt.
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Die
Verfahren der Erfindung ermöglichen eine
Transgen-Manipulation in im Wesentlichen allen Feldfrucht-Spezies,
speziell den wirtschaftlich wichtigen Sorten. Die Verfahren sind
nicht nur allgemein auf im Wesentlichen alle Feldfrucht-Spezies
anwendbar, sondern sie sind schnell (eine bis zwei Kreuzungen),
frei von „linkage
drag" und sortenunabhängig. Zusätzlich sind
die beschriebenen Verfahren das einzige sortenunabhängige Verfahren
zur Transformation und Linienkonversion, das für die gentechnologische Modifizierung
von komplexen Linien/Hybriden, die nach Kreuzungen mit anderen Sorten
nicht zurückgewonnen
werden können,
verwendet werden kann.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine lineare Plasmid-Karte von pIC156;
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2 ist
eine lineare Plasmid-Karte von pIC216;
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3 ist
eine lineare Plasmid-Karte von pIC312;
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4 ist
eine lineare Plasmid-Karte von pIC31A2;
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5 ist
eine lineare Plasmid-Karte von pIC401; und
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6 ist
eine lineare Plasmid-Karte von pIC411.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Verfahren der Erfindung erzeugen transformierte Pflanzen durch Transformieren
einer Donor-Spezies oder -Mutante mit einem Konstrukt, welches zu
einer Exzision/Reinsertion in der Lage ist, vorzugsweise durch einen
Transposon-vermittelten oder homologe oder nicht-homologe Rekombinations-Mechanismus,
Kreuzen des Donors mit einem Empfänger, wohingegen Donor- und
Empfänger-Organismen
ausgehend von Spezies/Mutanten-Kombinationen ausgewählt worden
sind, die bei sexueller/somatischer Hybridisierung Hybride erzeugen,
die instabil sind und Genominstabilität und Segregation von einem
oder beiden reinen parentalen Genotypen zeigen, Induzieren einer
oder Selektieren auf eine Exzision der heterologen Nuk leinsäure aus
dem Empfänger
und Integration in das parentale Donor-Chromosom und zuletzt Selektieren
einer Nachkommenschaft, die im Wesentlichen eine genetisch reine
Empfängerpflanze,
die das fragliche Transgen trägt,
ist. Der Fluss von heterologem genetischem Material ist vollständig von
dem Fluss von standortfesten Genen während genetischer Manipulationen getrennt,
indem Spezies- oder Mutanten-Kombinationen von Empfänger- und
Donororganismen eingesetzt werden, die bei sexueller/somatischer
Hybridisierung Hybride erzeugen, die keine Rekombination zwischen
homologen/homologen Chromosomen zeigen und die instabil sind und
die nach mitotischen oder meiotischen Teilungen reine Elterngenome
von einer oder beiden Arten aussortieren.
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Von
dem Begriff „Pflanze" sollen alle blühenden Pflanzen
und alle Formen, Linien und Sorten der Pflanze umfasst werden. „Transformiert" wird hier verwendet,
um durch das Einbringen von heterologer DNA in Zellen genetisch
modifiziert zu bezeichnen. Mit dem Begriff „heterolog" ist DNA, welche normalerweise in der
Empfängerpflanze
nicht gefunden wird, gemeint.
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Eine
Spezies-spezifische Chromosomen-Eliminierung (Genomsegregaton) in
zwischenartlichen/intergenerischen Hybriden ist ein gut dokumentiertes
Phänomen.
In vielen Fällen
waren jedoch instabile Hybride von begrenztem Interesse, da die hauptsächlichen
Züchtungsbemühungen auf
einen Chromosomenaustausch zwischen zwei elterlichen Genomen als
ein Verfahren zur Introgression von fremdem chromosomalem Material
gerichtet waren. Vor dem Zeitpunkt, zu welchem die Erfindung gemacht
wurde, waren instabile Hybride, welche elterliche Genome segregieren,
nur beschrieben worden in Bezug auf Systeme, die haploide Pflanzen
erzeugen (zwischenartliche, intergenerische Kreuzungen für die Erzeugung
von haploidem Weizen, haploider Gerste, haploider Kartoffel), oder
in Bezug auf negative Ergebnisse von Versuchen, eine Introgression von
chromosomalem Material aus Wildspezies in kultivierte Feldfrüchte (wie
von Tripsacum zu Mais oder Glycine tomentella zu Sojabohne) zu erzielen.
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Allgemein
gibt es für
jede Feldfruchtspezies (einschließlich aller Sorten und Linien
davon) einen wilden Verwandten oder eine mutierte Form, die nach Hybridisierung
eine instabile Hybride bildet und als eine Donor- oder Zwischenablage-Pflanze,
wie hier definiert, dienen kann. Ein empirischer Weg, um einen solchen
Organismus zu identifizieren, umfasst das Kreuzen einer Feldfruchtspezies
von Interesse mit einer Anzahl von verwandten Spezies und das Testen
der genetischen Ausstattung der resultierenden Nachkommenschaft.
Verfahren zur vorläufigen Identifizierung
von Nachkommenschaft, die überwiegend
uniparental ist, sind in der Literatur bekannt und basieren auf
verschiedenen selektiven oder nicht-selektiven Merkmalen. Verfahren
zur breiten und verlässlichen
Genotypisierung der Nachkommenschaft sind zahlreich, einfach und
beruhen auf einer Analyse von verschiedenen Markern in genomischer
DNA. Basierend auf einem solchen primären Screening und nachfolgender
Genotypisierung können
geeignete Zwischenablage-Spezies schnell identifiziert werden. Über dieses
grundlegende Kriterium hinaus werden die Donor/Empfänger-Paare
so ausgewählt, dass
eine adäquate
Dauer des hybriden Zustands in Zellen einer primären Hybride oder von deren
Nachkommenschaft sichergestellt ist. Obwohl eine vollständige Eliminierung
ein gewünschter
Endzustand ist, ist eine relative Dauer einer Coexistenz von Chromosomen
von beiden Spezies in derselben Zelle wichtig, da sie ausreichend
Zeit für
das Herausschneiden eines Transgen-Genorts aus dem „Zwischenablage"-Organismus und dessen
Integration in das Chromosom des Chromosoms des Empfängers bereitstellt.
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Körperliche
Wechselwirkung und insbesondere ein Austausch von chromosomalem
Material zwischen elterlichen Genomen in einer Hybride kann auf
verschiedene unterschiedliche Weisen ausgeschlossen oder minimiert
werden. Der am besten bekannte Ansatz beruht auf der Verwendung
einer zwischenartlichen oder intergenerischen Hybridisierung – die erzeugten
Hybride zeigen wenig, wenn überhaupt
irgendwelche Paarung von homologen Chromosomen, wodurch ein Überkreuzungsaustausch begrenzt
wird. Zusätzlich
sind viele von derartigen Hybriden mehr oder weniger genetisch instabil
und zeigen eine Tendenz zu einer schnellen Eliminierung von einem
elterlichen Genom. Als Ergebnis können durch eine Verwendung
einer solchen Kreuzung die Chromosome von zwei entfernten elterlichen
Organismen in einen hybriden Nukleus eingebracht werden, um einen
hybriden Zustand für
einen gesteuerten Austausch von Transgen-Material zwischen den Eltern
zu erzeugen. Jedoch wechselwirkt standortfestes Chromosomenmaterial
der beiden Eltern im Wesentlichen nicht und eine nachfolgende Chromosomeneliminierung
wird die Eliminierung von einem Elternteil, sobald F0-,
F1- oder BC1-Nachkommenschaft
auftritt, ermöglichen.
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Zusätzlich zu
einer Hybridisierung zwischen entfernten Spezies als ein Verfahren,
welches einen zeitweiligen hybriden Zustand, gefolgt von der schnellen
Rückgewinnung
von reinen elterlichen Genomen, ermöglicht, gibt es andere Ansätze, die ähnliche
Ergebnisse erzielen. Ein solcher Ansatz basiert auf der Verwendung
von Mutanten, die einen Chromosomen-Überkreuzungsaustausch
verringern oder eliminieren und/oder jenen, welche eine Segregation von
reinen elterlichen Genomen bei intraspezifischen wie auch interspezifischen
Kreuzungen bewirken. Ein Beispiel ist Hemigamie bei Baumwolle, eine
Mutation, welche bewirkt, dass der Sperma-Zellkern in die Eizelle
eintritt, aber eine nachfolgende Kernverschmelzung vermutlich nicht
stattfindet und beide Kerne sich unabhängig teilen, was zu F1-Pflanzen führt, die hinsichtlich Sektoren
von haploiden Geweben vom väterlichen
und mütterlichen
Typ chimär sind.
Siehe Turcotte und Feaster, J. Hered. 58: 55-57 (1967). Ein anderer
Ansatz ist das gut charakterisierte Oenothera-System, in welchem
alle Chromosomen an Translokationen in einer solchen Weise beteiligt
sind, dass die F1-Kreuzungen mit normalem Stammmaterial
bei der Meiose einen Ring, welcher die gesamte haploide Anzahl von
Chromosomen enthält,
aufweisen werden, wodurch ein Aussortieren von unabhängigen Chromosomen
ausgeschlossen wird. Ein weiterer Ansatz zur Verwendung von chemischen/physikalischen
Behandlungen, wie Bestrahlung (Pandey, N. Z. J. Bot, 18: 203-207
(1980)) oder andere Maßnahmen,
von einem Elternteil, die zu einer Schädigung und nachfolgenden präferentiellen Eliminierung
von geschädigtem
Genom führen.
Ein solcher Ansatz war bei der Herstellung von gynogenetischen Zwiebelpflanzen
nach Bestäubung
mit gammabestrahltem Pollen behilflich gewesen. Siehe Dore & Marie, Plant
Breeding 111: 142-147 (1993).
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Um
die Erfindung für
eine jegliche gegebene Pflanze auszuführen, kann ein wilder oder
entfernter Verwandter gefunden werden, der genetisch instabile Hybride,
die durch eine schnelle Genomsegregation gekennzeichnet sind, ermöglicht.
Gut charakterisierte Kombinationen, welche aus wirtschaftlicher
Sicht wichtige Feldfrüchte
umfassen, werden nachfolgend zusammengefasst.
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Insoweit
dikotyledone Feldfrüchte
betroffen sind, ist der am besten untersuchte Fall für Kartoffel eine
Hybridisierung zwischen kommerziellen Sorten von Kartoffel, Solanum
tuberosum, und einer Wildspezies Solanum phureja, die zu einer hohen
Frequenz von Haploid-Erzeugung
als Ergebnis einer frühzeitigen
Eliminierung des phureja-Chromosoms im hybriden Embryo führt – Hougas
et al., Crop. Sci. 4: 593-595 (1964); Clulow et al., Theor. Appl.
Genet. 82: 545-551 (1991). In Bezug auf Canola/Rübsamen wird eine somatische
Trennung der elterlichen Genome in Hybriden zwischen Brassica napus
und Orychophragmus violaceous in Li, Z., et al., Theor. Appl. Genet.
91: 131-136 (1995); Li et al., Hereditas 125: 69-75 (1996), Li et
al., Theor. Appl. Genet. 96: 251-265 (1998); Wu, J. et al., Plant
Breeding 116: 251-257 (1997) beschrieben. Die Hybride ist morphologisch
intermediär,
ist aber selbstfertil und erzeugt nach Selbstbefruchtung hauptsächlich B.
napus-Nachkommenschaft. Das Orychophragmus-Verfahren funktioniert auch mit Brassica
juncea und Brassica carinata, zwei anderen Brassica-Spezies von wirtschaftlicher
Bedeutung. Es wird auch mit anderen wirtschaftlich bedeutenden Kreuzblütlern, wie B.
oleracea, B. campestris, Raphanus sativus, funktionieren. In Hinblick
auf Sojabohne ist eine Eliminierung des Genoms der Wildspezies in
der Nachkommenschaft einer Hybride zwischen Sojabohne und Glycine
tomentella in Shoemaker et al., Theor. Appl. Genet. 80: 17-23 (1990)
dokumentiert. Noch andere Beispiele von matroklinen Pflanzen resultieren
aus Kreuzungen zwischen Fragaria vesca (Erdbeeren) und Fragaria
chiloens oder F. virginiana (Ichijma, Genetics, 11: 590-604 (1926))
wie auch patrokline Pflanzen aus Kreuzungen zwischen Nicotiana digluta
und N. tabacum (Tabak, Clausen und Lammerts, Amer. Nat. 63: 279-322
(1929)).
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Was
monokotyledone Feldfrüchte
angeht, zeigten Galinat, Ann. Rev. Genet., 5: 447-478 (1971), und
Galinat, Evolution, 27: 644655 (1973), dass bei einer Kreuzung zwischen
einem diploiden Mais und einem diploiden Tripsacum dactyloides die
F1-Hybride die erwartete amphihaploide Chromosomenzahl aufwies.
Tripsacum-Chromosome konnten sich jedoch in der Meiose nicht paaren
und da Tripsacum-Chromosome dazu tendieren, während der Mitose wie der Meiose
verloren zu gehen, wurde bereits als BC1 diploider
Mais erhalten. Diese Ergebnisse sind in zahlreichen Züchtungslaboratorien
in der ganzen Welt routinemäßig reproduziert
worden.
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Wenn
Weizen oder Gerste mit Hordeum bulbosum-Wildspezies gekreuzt wird,
wird eine hohe Frequenz von Haploiden als Ergebnis von Bestäubung und
nachfolgender Eliminierung von bulbosum-Genom erhalten (Kasha und
Kao, Nature 225: 874-876 (1970); Barclay, Nature 256: 410-411 (1975)).
Das Verfahren ist für
die Haploid-Erzeugung von zahlreichen Sorten von beiden Feldfrüchten weithin
verwendet worden. Das bulbosum-Verfahren ist durch breite Kreuzungen
ersetzt worden, in welchen Weizen- (sowohl Triticum estivum als
auch T. turgidum), Triticale- oder Gerstenpflanzen durch Pollen von
Mais, Sorghum, Federähre
oder Tripsacum bestäubt
werden. Die resultierenden Hybride sind hochgradig instabil und
sich entwickelnde Pflanzen behalten in der Regel nur das mütterliche
Genom bei. Dieses Haploidie-Verfahren funktioniert mit Dutzenden von
Weizensorten und ist im Wesentlichen sortenunabhängig. Laurie und Gennett, Theor.
Appl. Genet. 76: 393-397 (1988); Ohkawa et al., Jap. J. Breed. 42: 891-894
(1992); Ushiyama et al., Jap. J. Breed. 41: 353-357 (1991); Furusho
et al., Jap. J. Breed. 41: 175-179 (1991); Laurie, Genome, 32: 1063-1067 (1989).
Das gleiche Verfahren ist auch anwendbar für die Erzeugung von Haploiden
in Hafer. Siehe Rines und Dahleen, Crop. Sci. 30, 1073 (1990). Eine
präferentielle
Genomsegregation tritt auch in Nachkommenschaft von interspezifischen
Reis (Oryza)-Kombinationen, wie O. sativa und O. minuta, auf. Siehe Mariam
et al., Theor. Appl. Genet. 93: 664-671 (1996).
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Zusammengefasst
stellt die Literatur Beispiele von zahlreichen, gut charakterisierten
Hybridisierungskombinationen bereit, die, wenn sie gemäß der Erfindung
verwendet werden, die Erzeugung eines zeitweiligen hybriden Zustands,
während
welchem heterologes genetisches Material ausgetauscht werden kann,
erlauben. Zusätzlich
können viele
wilde Spezies als Transgen-Donoren für einen schnellen und „linkage
drag"-freien Transgen-Transfer
in eine Vielzahl von Spezies von wichtigen Feldfrüchten verwendet
werden. Wilde Spezies umfassen Tripsacum (z. B. für Mais,
Weizen, Gerste und Hafer); Oryza minuta (z. B. für Reis), Orychophragmus (z.
B. für
Canola und andere wirtschaftlich bedeutende Kreuzblütler); Solanum
phureja (z. B. für
Kartoffel) und Glycine tomentella (z. B. für Sojabohne). Mutanten, wie
eine Hemigamie-Mutante
von Baumwolle oder eine ms-Mutation, welche Polyembryonie in Sojabohne
hervorruft, können
auch für
den gleichen Zweck verwendet werden. Ähnliche Spezies-Kombinationen
oder Mutanten können
für andere
wichtige Feldfrucht-Spezies, einschließlich Zuckerrüben, Erbsen
und Tomaten, leicht identifiziert werden. Die Donor-Spezies wird
mit einem exogenen oder heterologen Konstrukt transformiert, das
genetische Information, die genetischen Instruktionen, die notwendig sind,
um das Herausschneiden des fraglichen Transgens und dessen Reintegration
in ein anderes Chromosom basierend auf Mechanismen von entweder homologer
oder nicht-homologer Rekombination zu steuern, und die DNA von Interesse
enthält.
Um die Selektion von erfolgreichen Transformanten zu vereinfachen,
enthält
das Konstrukt auch DNA, welche einen selektierbaren Marker kodiert,
wie ein Merkmal, das überwacht
werden soll (z. B. Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz oder einen
phänotypischen Marker,
insbesondere beta-Glucuro nidase und/oder das „green fluorescent protein"). Die DNA von Interesse
kann ein oder mehrere Gene, welche unterschiedliche Proteine kodieren,
enthalten. Die Expression der Gene in Nachkommenschaft von der Empfängerpflanze
kann zu einer höheren
Resistenz gegen pilzliche, virale und/oder bakterielle Erkrankungen,
Schädlinge,
Insektizide oder Umweltbelastungen führen oder kann zu verbessertem
Geschmack, verbesserter Lagerung oder verbesserten Nahrungseigenschaften
führen.
Der Empfängerorganismus kann
eine untransformierte Pflanze oder eine Pflanze, die transformiert
worden ist, so dass sie in ihrem Genom spezifische Stellen, die
für einen
auf homologer Rekombination basierenden Austausch mit den exogenen
DNA-Inserts im Donor-Genom erforderlich sind, enthält, sein.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
wird die heterologe DNA von dem Donor zu dem Empfänger über ein
System bewegt, welches auf (1) einem Transposon-vermittelten nicht-homologen Transgentransfer
oder (2) einem zielgerichtet erfolgenden Transfer unter Einsatz
von homologe Rekombinations-Mechanismen basiert. Transposons sind
mobile genetische Elemente, die einen substantiellen Teil des Genoms
einer Pflanze ausmachen können
und extreme phänotypische
Diversität
erzeugen. Transponierbare Elemente sind mobile Segmente von DNA,
welche zu Herausschneiden und Reinsertion in einen anderen Genort
auf einem Chromosom in der Lage sind. Pflanzentransposons befinden
sich unter den ersten beschriebenen mobilen DNA-Elementen und eine
Anzahl von transponierbaren Elementen aus Pflanzen, die kloniert
worden sind, wie Ac/DS, Mu und En/Spm, sind für eine Verwendung im Rahmen
der Erfindung bevorzugt. Diese transponierbaren Elemente werden
gegenwärtig
als genetische Hilfsmittel („Tools") in der Molekularbiologie
der Pflanzen und der Biotechnologie verwendet. Sie dienen als unschätzbare Hilfsmittel
für Pflanzenentwicklungsuntersuchungen
und für
die Pflanzengenomanalyse und Pflanzengenisolierung durch die sogenannte
Insertionsmutagenese und -markierung. Siehe z. B. Walbot, Ann. Rev.
Plant Mol. Biol. 43: 49-82 (1992). Andere Beispiele von transponierbaren
Elementen zur Verwendung in der Erfindung werden in Fedoroff,
U.S.-Patent 4,732,856 ; Doonerk
et al., PCT-Anmeldung
WO 91/156074 u.
s. w.), Yoder und Lassner, PCT-Anmeldung
WO 92/01370 und Ebinuma et al., PCT-Anmeldung
WO 96/15252 beschrieben.
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Für die Zwecke
der Erfindung ist auf Transposons basierende(s) Herausschneiden
und Reinsertion von Transgenen ein System, welches die Entkopplung
der Transgen-Bewegung von der Bewegung des standortfesten Pflanzengens
während Kreuzungen
ermöglicht,
während
ein zusätzlicher wichtiger
Vorteil von vollständigen
Instruktionen, welche das Herausschneiden des Transgens und die Reinsertion
in nur ein genetisches Konstrukt und über einen Transformationsschritt
steuern, bereitgestellt wird. Dementsprechend erfordert das System keine
gentechnologische Modifizierung von Insertions- oder Landungs-(„landing"-)stellen in Empfängerorganismen.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
wird die heterologe DNA in eine spezifische Stelle des Empfängergenoms
integriert durch die Verwendung einer Kombination einer Rekombinase und
einer Rekombinationsstelle. Ortsspezifische Rekombinasen aus Bakteriophagen
und Hefen werden weithin als Hilfsmittel für das Manipulieren von DNA sowohl
im Teströhrchen
als auch in lebenden Organismen verwendet. Bevorzugte Rekombinasen/Rekombinationsstellen-Kombinationen
für eine
Verwendung in der Erfindung sind Cre-Lox, FLP-FRT und R-RS, wobei
Cre, FLP und R Rekombinasen sind und Lox, FRT und RS die Rekombinationsstellen sind.
Andere geeignete Systeme umfassen die Intron-kodierte Hefe-Endonuklease
ISce, können
verwendet werden. Siehe Choulika et al., Mol. Cell Biol. 15: 1968-1973
(1995). Um in Pflanzen funktionsfähig zu sein, benötigen diese
Stellen 7–8
Basenpaare (bp) einer Kernsequenz zwischen 12–13 bp invertierten Sequenzwiederholungen;
die asymmetrische Kernstelle determiniert die Orientierung der Stelle
und dementsprechend die Arten von Rekombinationsprodukt. Unabhängig davon,
ob Rekombinationsstellen auf oder innerhalb eines einzelnen DNA-Moleküls in gleicher
oder entgegengesetzter Orientierung platziert sind oder auf nicht-verknüpften linearen
oder zirkulären
DNA-Molekülen
platziert sind, kann die entsprechende Rekombinase den reziproken
Austausch katalysieren, um ein Deletions-, Inversions-, Translokations-
oder Cointegrationsereignis zu erzeugen. Siehe Bollag et al., Ann.
Rev. Genet. 23: 199-225 (1989);
Kilby et al., Trends Genet. 9: 413-421 (1993); und Ow, Curr. Opinion
Biotech., 7: 181-186 (1996). In der Erfindung tritt eine Rekombinase-vermittelte
ortsspezifische Translokation zwischen unterschiedlichen und insbesondere
nicht-homologen Chromosomen auf. Dieser in trans-Rekombinaseeffekt
ist essentiell, um einen Transfer von Transgenen zwischen zwei Chromosomen,
die zu unterschiedlichen Eltern gehören, in einer Hybride zu bewirken.
Siehe Dale und Ow, Gene 91: 79-85 (1990); Odell et al., Mol. Gen.
Genet. 223: 369-378 (1990); Dale und Ow, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88: 10558-10562 (1991); Russell et al., Mol. Gen Genet. 234:
49-59 (1992); Lyznik et al., Plant J. 8: 177-186 (1995); Albert
et al., Plant J. 7: 649-659 (1995); van Deuersen et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92: 7376-7380 (1995).
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Beispiele
von geeigneten homologe Rekombinations-Systemen zur Verwendung in
der Erfindung werden in der Literatur offenbart, einschließlich des
Cre-Lox-Systems (Sauer,
U.S.-Patent 4,959,317 ;
Odell et al.,
U.S.-Patent 5,658,772 ;
Odell et al., PCT
WO 91/09957 )
und des FLP-FRT-Systems (Hodges und Lyznik,
U.S.-Patent 5,527,695 ). Ein besonderer
Nutzen von bekannten Rekombinationssystemen zum Transgen-Management
in Pflanzen ist das zielgerichtete Herausschneiden eines Transgens
aus einem Pflanzengenom, eine Vorgehensweise, die eine Eliminierung
von unerwünschtem
heterologem genetischem Material, wie Antibiotika-Selektionsmarkern,
aus einer kommerziellen Sorte, erlaubt (Ow und Dale, PCT
WO 93/01283 ). Diese Systeme
richten sich jedoch an ein vollständig unterschiedliches Nützlichkeitsgebiet,
nämlich
die Verwendung von homologer Rekombination, um unerwünschte Abschnitte
von heterologer DNA zu eliminieren, anstatt die Trennung von Bewegungen
von Transgenen und standortfesten Pflanzengenen zu ermöglichen.
Ein anderer Nutzen wird in Hooykaas und Mozo,
U.S.-Patent 5,635,381 , und Offringa
et al.,
U.S.-Patent 5,501,967 ,
beschrieben, die auf die Verwendung von homologe Rekombinations-Systemen, um
eine ortsspezifische zielgerichtete Integration von DNA in Pflanzengenome über eine
Agrobacterium-vermittelte Transformation zu erzielen, gerichtet sind.
Diese Fälle
sind auch auf einen zielgerichteten Transfer zwischen Bakterien
und Pflanzenzellen anstatt zwischen zwei Pflanzenorganismen begrenzt.
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Ein
auf homologer Rekombination basierendes Transgen-Verschieben weist
sowohl eindeutige als auch starke Vorteile auf. Indem eine präzise Zielsteuerung
(„Targeting") über aufgrund
von Homologie angesteuerte DNA-Stellen eingesetzt wird, können Transgen-„Landungsstellen" erzeugt werden,
die vorab sorgfältig
ausgewählt
und charakterisiert werden. Als Ergebnis wird ein höheres Ausmaß an Vorhersagbarkeit
und Reproduzierbarkeit von Transgen-Verhalten, einschließlich Vererbbarkeit,
Expressionsniveau, Abwesenheit von Silencing bzw. Stilllegung u.
s. w., erzielt. Auch können
spätere
Versionen der Transgen-Kassette zu der gleichen Stelle dirigiert werden,
wobei sie alte Versionen von Transgenen durch neuere ersetzen. Ein
nachfolgendes Züchten des
Materials mit einer vorab ausgewählten
und bestimmten und kartierten Integrationsstellen ist viel einfacher
und geradliniger. Die Fachleute auf diesem Gebiet werden erkennen,
dass dieses System nur verwendet werden kann, wenn alle Empfänger „vorab
verdrahtet" worden
sind, so dass sie Integrationsstellen enthalten. Eine solche Introgression
ist möglich
durch Verwendung von anderen Transfermechanismen, beispielsweise
einem Transposon-vermittelten Transfer oder einer klassischen Introgression durch
Rückkreuzung.
In spezielleren Fällen
kann auch ein Rekombinase-Gen in Akzeptor-Spezies zusätzlich zu
deren Rekombinationsstelle eingeführt werden. In solchen Fällen wird
das Rekombinase-Gen unter der Kontrolle eines künstlichen Transkriptionsfaktor-vermittelten
Promotors stehen, wobei der Transkriptionsfaktor konstitutiv durch
das Gen, welches in der Donor (Zwischenablage)-Pflanze lokalisiert
ist, exprimiert wird. Rekombinase kann nur während der Coexistenz von zwei
Genomen in instabilen Hybriden produziert werden. Alternativ kann
die Rekombinase in der Zwischenablage-Pflanze lokalisiert sein,
aber der Transkriptionsfaktor wird konstitutiv in der Empfängerpflanze
exprimiert.
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Die
heterologe DNA kann in die Donorpflanze gemäß Standardtechniken eingeführt werden. Transformationstechniken
für dikotyledone
Pflanzen sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt und umfassen auf
Agrobacterium basierende Techniken und Techniken, die Agrobacterium
nicht benötigen. Nicht-Agrobacterium-Techniken
umfassen die Aufnahme von exogenem genetischem Material direkt durch
Protoplasten oder Zellen. Diese Techniken umfassen eine durch PEG
oder Elektroporation vermittelte Aufnahme, eine durch Partikelbombardement vermittelte
Abgabe und Mikroinjektion. Beispiele von diesen Techniken werden
in Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984), Potrykis et al.,
Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology
4: 1001-1004 (1986), und Klein et al. Nature 327: 70-73 (1987) beschrieben.
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In
jedem Falle werden die transformierten Zellen zu vollständigen Pflanzen
unter Verwendung von Standardtechniken regeneriert.
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Eine
Agrobacterium-vermittelte Transformation ist eine bevorzugte Technik
zur Transformation von dikotyledonen Pflanzen aufgrund von ihrer
hohen Transformationseffizienz und ihrer breiten Nützlichkeit
gegenüber
vielen unterschiedlichen Spezies. Die zahlreichen Feldfrucht-Spezies,
die durch Agrobacterium routinemäßig transformierbar
sind, umfassen Tabak, Tomate, Sonnenblume, Baumwolle, Ölsamen-Raps,
Kartoffel, Sojabohne, Alfalfa und Pappel (
EP 0 317 511 (Baumwolle),
EP 0 249 432 (Tomate),
WO 87/07299 (Brassica),
U.S.-Patent 4,795,855 (Pappel)).
Eine Agrobacterium-Transformation umfasst typischerweise den Transfer
des binären
Vektors, der die fremde DNA von Interesse trägt, (z. B. pCIB200 oder pCIB2001)
zu einem geeigneten Agrobacterium-Stamm, der von dem Komplement
von vir-Genen, die durch den Agrobacterium-Wirtsstamm entweder auf
einem gleichfalls standortfesten (coresidenten) Plasmid oder chromosomal
getragen werden (z. B Stamm CIB542 für pCIP200 (Uknes et al., Plant
Cell 5: 159-169 (1993)), abhängen
kann. Der Transfer des rekombinanten binären Vektors zu Agrobacterium
wird bewerkstelligt durch eine Drei-Eltern-Paarungsprozedur unter
Verwendung von E. coli, welches den rekombinanten binären Vektor
trägt, eines
E. coli-Helferstamms, der ein Plasmid, wie pRK2013, trägt, das
in der Lage ist, den rekombinanten binären Vektor zu dem Agrobacterium-Zielstamm zu
mobilisieren. Alternativ wird der rekombinante Vektor zu Agrobacterium
durch DNA-Transformation transferiert (Höfgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16, 9877
(1988)).
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Eine
Transformation der Zielpflanzenspezies durch rekombinantes Agrobacterium
umfasst üblicherweise
eine Cokultivierung des Agrobacteriums mit Explantaten von der Pflanze
und folgt Protokollen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind. Transformiertes
Gewebe wird auf selektierbarem Medium regeneriert, welches einen
Antibiotikum- oder Herbizidresistenzmarker, der zwischen den T-DNA-Grenzen des
binären
Plasmids vorhanden ist, trägt.
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Bevorzugte
Transformationstechniken für monokotyledone
Pflanzen umfassen einen direkten Gentransfer in Protoplasten unter
Verwendung von PEG- oder Elektroporationstechniken und Partikelbombardement
in Kallusgewebe. Eine Transformation kann mit einer einzelnen DNA-Spezies
oder einer Mehrzahl von DNA-Spezies (d. h. Cotransformation) vorgenommen
werden und diese beiden Techniken sind für eine Verwendung mit dieser
Erfindung geeignet. Eine Cotransformation kann den Vorteil haben, dass
eine komplexe Vektorkonstruktion vermieden wird und transgene Pflanzen
mit nicht-gekoppelten Genorten für
das Gen von Interesse und den selektierbaren Marker erzeugt werden,
was die Entfernung des selektierbaren Markers in nachfolgenden Generationen
ermöglicht,
sollte dies als wünschenswert angesehen
werden. Jedoch ist ein Nachteil der Verwendung einer Cotransformation
die weniger als 100%-ige Frequenz, mit welcher separate DNA-Spezies
in das Genom integriert werden (Schocher et al., Biotechnology 4:
1093-1096 (1986)).
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Die
veröffentlichten
Patentanmeldungen
EP 0 292 435 ,
EP 0 392 225 und
WO 93/07278 beschreiben
Techniken für
die Herstellung von Kallus und Protoplasten von Mais, die Transformation
von Protoplasten unter Verwendung von PEG oder Elektroporation und
die Regeneration von Maispflanzen aus transformierten Protoplasten.
Gordeon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) und Fromm et al., Biotechnology
11: 194-200 (1993) beschreiben Techniken für die Transformation von Elite-Inzuchtlinien
von Mais durch Partikelbombardement.
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Eine
Transformation von Reis kann auch durch direkte Gentransfer-Techniken
unter Einsatz von Protoplasten oder Partikelbombardement vorgenommen
werden. Eine Protoplasten-vermittelte Transformation ist für Japonica-Typen
und Indica-Typen beschrieben worden (Zhange et al., Plant Cell Rep.
7: 739-384. (1988); Shimamoto et al., Nature 338: 274-277 (1989);
Datta et al., Biotechnology 8: 736-740 (1990)). Beide Typen sind
auch unter Verwendung von Partikelbombardement routinemäßig transformierbar
(Christou et al., Biotechnology 9: 957-962 (1991)).
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Die
Patentanmeldung
EP 0 332 581 beschreibt
Techniken für
die Erzeugung, Transformation und Regeneration von Pooideae-Protoplasten. Darüber hinaus
wird eine Transformation von Weizen in Vasil et al., Biotechnology
10: 667-674 (1992) unter Verwendung von Partikelbombardement in
Zellen von über
lange Zeit hinweg regenerierbarem Kallus vom Typ C beschrieben,
Vasil et al., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993) und Weeks et al.,
Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993) beschreiben ein Partikelbombardement
von unreifen Embryos und von unreifem Embryo abgeleitetem Kallus.
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Eine
Transformation von monokotyledonen Zellen, wie Zea mays, wird erzielt,
indem die monokotyledonen Zellen in Kontakt gebracht werden mit einer
Mehrzahl von nadelartigen Körpern,
auf welche diese Zellen aufgespießt werden können, was einen Bruch in der
Zellwand bewirkt, wodurch der Eintritt von transformierender DNA
in die Zellen ermöglicht wird.
Siehe
U.S.-Patent 5,302,523 .
Transformationstechniken, die sowohl auf monokotyledone als auch
dikotyledone Pflanzen anwendbar sind, werden auch in den folgenden
U.S.-Patenten offenbart: 5,240,855 (Partikelkanone);
5,204,253 (mittels kaltem
Gasschock beschleunigte Mikroprojektile);
5,179,022 (biolistische Apparatur);
4,743,548 und
5,114,854 (Mikroinjektion); und
5,149,655 ,
5,120,647 (durch beschleunigte Partikel
vermittelte Transformation);
5,066,587 (durch
Gas angetriebener Mikroprojektil-Beschleuniger);
5,015,580 (Partikel-vermittelte Transformation
von Sojabohnenpflanzen);
5,013,660 (Laserstrahl-vermittelte
Transformation);
4,849,355 und
4,663,292 .
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Die
so transformierten Pflanzenzellen oder das so transformierte Pflanzengewebe
werden dann zu vollständigen
Pflanzen gemäß Standardtechniken kultiviert.
Von transgenen blühenden
Pflanzen kann gemäß Standardtechniken
transgenes Saatgut erhalten werden. In ähnlicher Weise können nicht-blühende Pflanzen,
wie Kartoffel und Zuckerrüben,
durch verschie dene bekannte Verfahren vermehrt werden. Siehe z.
B. Newell et al., Plant Cell Rep. 10: 30-34 (1991) (welches die
Transformation von Kartoffel durch Sprosskultur offenbart).
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird die heterologe Nukleinsäure von dem Donor zur dem Genom
der Empfängerpflanze
transferiert über
eine Fusion von somatischen Zellen oder Protoplasten. Ein Vorteil
dieser Ausführungsform
ist, dass einige der Hybridisierungsbarrieren, welche eine geschlechtliche
Kreuzung beschränken,
umgangen werden. Diese Technologie ist jedoch komplexer als eine
geschlechtliche Kreuzung und sie kann nur für Kreuzungen zwischen Spezies,
die ausgehend von einem Protoplasten regeneriert werden können, verwendet
werden. Es ist dementsprechend bevorzugt, Donor- und Empfängerpflanzen
zu verwenden, die nicht verwandt sind. Beispiele von solchen Paarungen
umfassen Arabidopsis/Baumwolle, Arabidopsis/Sojabohne, Arabidopsis/Reis
und Tabak/Sojabohne. Andererseits ist, obwohl Hybride zwischen entfernt
verwandten Spezies (intergenerisch, intertribal und interfamiliär) unter
Verwendung einer Protoplasten-Hybridisierung erzeugt worden sind,
die Fähigkeit
von zwei phylogenetisch entfernten Genomen, in einer hybriden Zelle
zu kooperieren, begrenzt gewesen und hybride Zellen sind oftmals
instabil und verlieren schnell genetisches Material von einer der Elternspezies.
Siehe Gleba & Sytnik,
Monogr. Theor. Appl. Genet. 8: 1-220
(1984); Dudits et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8434-8438 (1987);
und Babiychuck et al., Mol. Gen. Genet. 84: 87-91 (1992). Dementsprechend
sind Paarungen von verwandten Donor- und Empfängerpflanzen, die entfernt
verwandt sind, mehr bevorzugt.
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Die
nachfolgend beschriebenen Experimente sind Zusammenfassungen einer
erfolgreichen Transformation und Linienkonversion für vier wichtige
Feldfruchtspezies (Canola, Kartoffel, Mais und Weizen) basierend
auf einer Verwendung von speziellen Spezies-Hybridisierungskombinationen und einer
entweder auf Transposons oder homologer Rekombination basierenden
Transgen-Exzision/Reinsertion. Diese Beispiele werden lediglich
aufgeführt, um
spezielle Ausführungsformen
der Erfindung zu veranschaulichen, und sollen der Erfindung keinerlei Einschränkungen,
die nicht in den Ansprüchen
aufgeführt
sind, auferlegen.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Transformation/Linienkonversion von Brassica-Spezies
-
Gestaltung der Konstrukte
-
Binäre Vektoren,
welche Komponenten des transponierbaren Elements Spm von Z. mays
innerhalb von T-DNA-Grenzen enthalten, wurden hergestellt, wie nachfolgend
beschrieben.
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Das
Plasmid pIC012 wurde mit Xho1 und Sma1 verdaut, das große Fragment
wurde mittels eines Gels gereinigt und mit einem durch Xho1- und Cla1/Klenow-Behandlung
hergestellten RS-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid pIC013,
enthaltend pNOS-RS-3'OCS
in pUC118, wurde mit Pst1 und Bcl1 verdaut, mittels eines Gels gereinigt
und mit dem großen Fragment
von pIC017, das mit den gleichen Enzymen verdaut worden war, ligiert.
Das Plasmid pIC23, enthaltend das Element dSpm mit pNOS-RS-3'OCS, wurde nachfolgend
mit HindIII/Klenow und BamH1/Klenow behandelt, um HindIII- und BamHI-Stellen
zu entfernen. Das große
Cla1-Fragment von pIC23 (-BamH1;-HindIII) wurde in die Cla1-Stelle
von pIC201 kloniert, was ein dSpm-Element flankiert durch p35S und
GUS-3'NOS ergab (pIC132).
Das Plasmid pIC132 wurde mit EcoRI und HindIII verdaut. Das große Fragment
wurde mittels eines Gels gereinigt und in die EcoRI- und HindIII-Stellen
eines auf pRK290 basierenden binären Vektors,
welcher das NPTII-Gen als Pflanzentransformationsmarker trug, kloniert.
Das resultierende Plasmid pIC141 wurde mit Ecl136II und HindIII
verdaut, mit dem 0,3 kb-Xho1-BamHI1-Fragment von pIC022 und dem 7,7 kb Xho1-Sma1-Fragment
von pIC023 ligiert, um die Spm-Transposase
unter der Kontrolle des 35S-Promotors in den binären Vektor einzuführen. Es
wurde das Plasmid pIC156 erhalten und in Transformationsexperimenten
verwendet. Auf eine ähnliche
Weise wurde das Plasmid pIC216 hergestellt, aber das Xho1-BamH1-Fragment
von pIC022 wurde durch das 0,2 kb-Xho1-Bg/II-Fragment (pSpm) von
pIC61 ersetzt.
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Die
Klonierungsschritte für
weitere vier Vektoren unterschieden sich von dem oben beschriebenen
nur durch die Schritte, dass das dSpm-Element mit entweder pNOS:
BAR-OCS3' oder mit
pNOS: BAR-OCS3',
worin BAR durch zwei RS-Stellen flankiert wurde, ausgestattet wurde.
Das Plasmid pIC132 wurde mit Pst1, Bcl1 verdaut, mittels eines Gels
gereinigt und mit dem 1,5 kb-Pst1-Bcl1-Fragment von pIC016 ligiert,
wodurch das dSpm-Element mit pNOS: BAR-OCS3' erhalten wurde.
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Für die Konstrukte
pIC401 und pIC411 wurde das große
Xho1-Nco1-Fragment von pIC01 mit dem kleinen Fragment des BspH1-BamH1-Fragments von
pIC018 und zwei RS-Fragmenten,
die von Nco1-BspH1- bzw. Bg/II-Xho1-Stellen flankiert wurden, ligiert.
Das resultierende Plasmid pIC38 besteht aus dem BAR-Gen, welches
von zwei RS-Stellen flankiert wird. Das kleine XhoI-Fragment von
pIC36 wurde in die Xho1-Stelle von pIC334 umkloniert, was das Plasmid
pIC342 mit pNOS: RS-BAR-RS-OCS3' ergab.
Die letzte Kassette wurde in das dSpm-Element, wie oben beschrieben, umkloniert.
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Zusammengefasst
bestehen die erhaltenen Konstrukte aus einem Transformationsmarker
(NPTII-Gen, welches Resistenz gegen Kanamycin verleiht), einer Quelle
von Spm-Transposase
unter der Kontrolle von entweder 35S oder ihrem eigenen Promotor,
einem nicht-autonomen
dSpm-Element, inseriert in den p35S: GUS-Exzisionsmarker. Es wurden drei
unterschiedliche Versionen des dSpm-Elements hergestellt:
- a) dSpm enthält den NOS-Promotor getrennt durch
eine RS-Stelle (Rekombinationsstelle, die durch R-Rekombinase aus
Z. rouxii erkannt wird) von dem Transkriptionsterminator des OCS-Gens (siehe:
pIC156 und pIC216, 1 und 2).
- b) dSpm enthält
pNOS: BAR-OCS3'.
(pIC312, pIC31A2, 3 und 4).
- c) dSpm enthält
pNOS: BAR-OCS3',
aber das BAR-Gen wird durch zwei gleichgerichtete RS-Stellen flankiert
(pIC401, pIC411, 5 und 6).
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Die
Konstrukte wurden in Arabidopsis unter Verwendung einer in planta-Transformationsprozedur
getestet. Die dSpm-Exzision kann in primären Transformanten durch das
Vorhandensein von GUS+-Sektoren nach Anfärben von Pflanzengeweben mit
X-gluc leicht überwacht
werden. Alle Konstrukte zeigten hohe Transpositionsaktivität in Arabidopsis
und wurden verwendet, um mehrere Orychophragmus violaceus-Transformanten
zu erhalten und zu charakterisieren.
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Linienkonversion unter Verwendung von
O. violaceus
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Saatgut
von Orychophragmus violaceus wurde sterilisiert und in vitro gekeimt.
Die Transformation von in vitro kultivierten Pflanzen der Spezies erfolgte,
wie zuvor für
Brassica-Spezies
beschrieben (De Block et al., Plant Physiol., 91, 694-701 (1989). Die
verwendeten Konstrukte waren auf Agrobacterium basierende Konstrukte,
welche Spm-Transposase zusammen mit verschiedenen Versionen eines nicht-autonomen
dSpm-Elements, inseriert zwischen den 35S-CaMV-Promotor und das
GUS-Gen (siehe 1), trugen. Die Plasmide wurden
verwendet, um transformierte Orychophragmus-Pflanzen herzustellen.
Es wurden mehrere transgene Pflanzen hergestellt und charakterisiert.
Zwei unabhängige
Transformanten, welche eine Einzelkopie-Insertion enthielten, sind
als männliche
Eltern mit verschiedenen Brassica-Spezies (B. nigra, B. juncea, B. napus,
B. carinata) und Sinapis alba, wie zuvor beschrieben, gekreuzt worden.
Insgesamt erfolgten ungefähr
600 Kreuzungen. Die resultierenden Hybride ließ man selbstbefruchten und
die F1-Nachkommenschaft wurde hinsichtlich
des Vorhandenseins des dSpm-Elements selektiert (PCR-Analyse oder
Phosphinotricin-Resistenz). Jene Selektion von überlebenden Pflanzen wurde
weiter auf einen reinen Brassica-Phänotyp und auf das Fehlen von
GUS-Aktivität gescreent
und schließlich
auf das Fehlen von entweder Transposase-Sequenzen oder Spezies-spezifischen
Orychophragmus-Sequenzwiederholungen getestet. Schließlich ist
eine Cosegregation von dSpm mit einem für das Brassica-Chromosom spezifischen
RFLP-Muster etabliert worden, indem die F2-Nachkommenschaft
analysiert wurde.
-
Linienkonversion unter Verwendung von
Arabidopsis thaliana
-
In
den folgenden Beispielen wurden alle Experimente ausgeführt, wie
oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass anstelle von O. violaceus
A. thaliana-Pflanzen als männliche
Eltern verwendet wurden. Arabidopsis ist leicht zu transformieren
und weist einen kurzen Lebenszyklus auf. Diese Merkmale machen Arabidopsis
zu einem hervorragenden Kandidaten für die Zwischenablage-Spezies.
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Beispiel II
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Transformation/Linienkonversion von Brassica
napus
-
Saatgut
von Brassica napus, var, und jenes von Orychophragmus violaceus
wurden sterilisiert und in vitro gekeimt. Die Transformation wurde
ausgeführt,
wie in (De Block et al., Plant Physiol. 91: 694-701 (1989) beschrieben.
Orychophragmus-Saatgut wurde mit dem auf Agrobacterium basierenden
Vektor pII2, welcher das Gen für
R-Rekombinase und ein promotorloses Gen für Hygromycin-Resistenz, flankiert
von zwei rsx-Rekombinationsstellen, enthielt, transformiert. Ein
Rübsamen-Organismus
wurde mit dem Vektor pII3, enthaltend einen 35S-CaMV-Promotor mit einer RS-Rekombinationsstelle,
so dass eine korrekte Rekombination ein aktives HPT-Gen, welches
Hygromycin-Resistenz verleiht, erzeugen würde, transformiert. Basierend auf
einer molekularen Analyse der transgenen Pflanzen wurden zwei unabhängige transformierte
Pflanzen von jeder Spezies ausgewählt. Kreuzungen und eine Analyse
der Nachkommenschaft wurden wie in Beispiel II ausgeführt.
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Beispiel III
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Transformation/Linienkonversion von Kartoffel
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Die
Experimente wurden ausgeführt,
wie oben (Beispiel 1), mit der Ausnahme, dass transgenes Solanum
phureja als Pollenpartner verwendet wurde. Die Kreuzungen wurden
ausgeführt,
wie in Hermsen et al., Euphytica 22: 244-259 (1973) beschrieben,
und primäre
konvertierte Linien wurden als diploidisierte F0-Dihaploide
selektiert.
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Beispiel IV
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Transformation/Linienkonversion von Mais
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In
diesem Experiment wurde die Tripsacum dactyloides-Linie als Transgen-Donor
verwendet. Die verwendeten Konstrukte basierten auf Agrobacterium,
wie in 1 gezeigt, wobei sie die Spm-Transposase zusammen
mit einem nicht-autonomen dSpm-Element, inseriert zwischen den 35S-CaMV-Promotor
und das GUS-Gen, trugen, wobei das dSpm entweder eine RS-Rekombinationsstelle
oder einen selektierbaren Marker (BAR) mit (pIC401, pIC411) oder
ohne (pIC312, pIC31A2) RS-Stellen enthielt. Eine Transformation
des Elternmaterials wurde im Wesentlichen ausgeführt, wie in Hiei et al., Plant
Mol. Biol. 35: 205-218 (1997) beschrieben. Transgene Pflanzen wurden
mit Mais, var., gekreuzt und die resultierende Nachkommenschaft
selbstbefruchtet. Unter den BC1, die Phosphinotricin-Resistenz
oder ein dSpm-spezifisches PCR-Signal zeigten, wurde auf reine Segregate
vom Mais-Typ gescreent. Jene überlebende
Selektion wurde weiter auf einen reinen Mais-Phänotyp und auf Fehlen von GUS-Aktivität gescreent
und schließlich auf
Fehlen von entweder Transposase-Sequenzen oder Spezies-spezifischen Tripsacum-Wiederholungssequenzen
getestet. Schließlich
wurde eine Cosegregation von entweder Phosphinotricin-Resistenz oder
dSpm-spezifischem PCR-Signal mit einem für das Mais-Chromosom spezifischen
RFLP-Muster etabliert, indem die BC/F2-Nachkommenschaft analysiert wurde.
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Beispiel V
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Transformation/Linienkonversion von Weizen
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Die
Experimente wurden ausgeführt
wie in dem vorherigen Beispiel (Beispiel IV) mit der Ausnahme, dass
die Kreuzungen ausgeführt
wurden, wie in Riera-Lizararu & Mujeeb-Kazi,
Crop Sci. 33: 973-976 (1993) beschrieben. Primäre konvertierte Linien wurden
als diploidisierte F0-Haploide, welche aus
den Kreuzungen hervorgingen, selektiert.
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INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
-
Die
Erfindung ist nützlich
bei der Herstellung von gentechnologisch modifizierten Pflanzen,
die ein breites Spektrum von Eigenschaften, die eine verstärkte Resistenz
gegen Viren, Pilze, bakterielle Erkrankungen, Schädlinge,
Pestizide oder Umweltbelastungen umfassen können, zeigen, wie auch für die Verstärkung von
anderen kommerziell wünschenswerten
Eigenschaften, wie verbesserter Geschmack, verbesserte Lagerung
oder Nahrungseigenschaften.
-
Alle
Veröffentlichungen,
die in dieser Anmeldung erwähnt
werden, sind ein Hinweis auf das Qualifizierungsniveau der Fachleute
auf dem Gebiet, auf welches sich die Erfindung bezieht. Alle diese
Veröffentlichungen
werden in diese Unterlagen durch Bezugnahme aufgenommen in dem gleichen
Ausmaß, als
ob angegeben worden wäre,
dass jede individuelle Veröffentlichung
spezifisch und individuell durch Bezugnahme aufgenommen werden soll.
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Verschiedene
Modifizierungen der hier beschriebenen Erfindung werden den Fachleuten
auf diesem Gebiet ersichtlich werden. Solche Modifizierungen sollen
unter den Umfang der beigefügten
Ansprüche
fallen.