BR112014014029B1

BR112014014029B1 - Polinucleotídeo compreendendo um promotor bidirecional

Info

Publication number: BR112014014029B1
Application number: BR112014014029-4A
Authority: BR
Inventors: Sandeep Kumar; Diaa Alabed; Sara Bennett; Manju Gupta; Susan Jayne; Terry Wright
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2012-11-12
Publication date: 2021-12-14
Also published as: AR089511A1; CN104135850B; IN2014DN03383A; TW201329241A; ZA201402991B; CA2855125C; KR20140109909A; EP2797407A1; IL233453A0; JP6301265B2; CA2855125A1; CN104135850A; US20130198898A1; US9453235B2; AU2012363063B2; RU2014131447A; TWI620820B; RU2627595C2; EP2797407A4; SA112340163B1

Abstract

polinucleotídeo compreendendo elemento promotor de núcleo mínimo de gene de ubi- quitina-1 de zea mays ou zea luxurians e sequência de promotor do vírus baciliforme da cana de açúcar (scbv), bem como construto de ácido nucléico e vetor binário, e métodos para produção de célula e planta transgênicas e para expressão de múltiplos genes nas mesmas a presente invenção refere-se a polinucleotídeo sintético compreendendo elemento promotor de núcleo mínimo de gene de ubiqui- tina-1 de zea mays ou zea luxurians e sequência de nucleotídeos de promotor funcional de promotor do vírus baciliforme da cana de açúcar (scbv), a construto de ácido nucléico para expressão de múltiplos genes em células e/ou tecidos de plantas, e a vetor binário para transformação mediada por agrobacterium . a presente invenção refere-se ainda ao método para a produção de célula transgênica utilizando o referido polinucleotídeo e para gerar planta ou célula transgênica, bem como a método para a expressão de sequência de nucleotídeos de interesse em célula de planta e para a expressão de múltiplos genes em células e/ou tecidos de plantas.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos Serial No. 61/582.148 arquivado em 30 de dezembro de 2011. Este pedido também reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos Serial No. 61/641.956 arquivado em 3 de maio de 2012.

CAMPO TÉCNICO

[002] Esta invenção refere-se de modo geral ao campo da biologia molecular de plantas, e mais especificamente ao campo de expressão estável de múltiplos genes em plantas transgênicas.

ANTECEDENTES

[003] Muitas espécies de plantas são capazes de ser transformadas com transgenes de outras espécies de modo a introduzir traços ou características agronomicamente desejáveis, por exemplo, aumentando a qualidade do valor nutricional, aumentando a produção, conferindo a resistência a pragas ou doenças, aumentando a tolerância à seca e ao stress, aumentando as qualidades da horticultura (tais como pigmentação e crescimento), conferindo resistência a herbicida, possibilitando a produção de compostos e/ou materiais industrialmente úteis a partir da planta, e/ou possibilitando a produção de produtos farmacêuticos. A introdução de transgenes em células de plantas e a subsequente recuperação de plantas transgênicas férteis que contêm uma cópia do transgene integrada de modo estável pode ser usada para produzir plantas transgênicas que possuem os traços desejáveis.

[004] O controle e a regulação da expressão genética podem ocorrer através de numerosos mecanismos. A iniciação da transcrição de um gene é um mecanismo de controle predominante da expressão genética. A iniciação da transcrição geralmente é controlada por sequências de poli-nucleotídeos localizadas na região 5‘- flanqueante ou a montante do gene transcrito. Estas sequências são referidas coletivamente como promotores. Os promotores geralmente contêm sinais para a RNA polimerase iniciar a transcrição de modo a que o RNA mensageiro (mRNA) possa ser produzido. mRNA maduro é traduzido pelo ribossoma, deste modo sintetizando proteínas. As proteínas de ligação de DNA interagem especificamente com sequências de DNA promotores de modo a estimular a formação de um complexo transcricional e iniciar o processo de expressão genética. Existe uma variedade de promotores eucarióticos isolados e caracterizados a partir de plantas que são funcionais para acionar a expressão de um transgene em plantas. Têm sido isolados e caracterizados promotores que afetam a expressão genética em resposta a estímulos ambientais, à disponibilidade de nutrientes, ou a condições adversas incluindo choque térmico, anaerobiose, ou a presença de metais pesados. Também existem promotores que controlam a expressão genética durante o desenvolvimento ou em um modo específico para tecido ou órgão. Além disso, têm sido isolados e caracterizados promotores procarióticos isolados a partir de bactérias e vírus que são funcionais para acionar a expressão de um transgene em plantas.

[005] Um promotor eucariótico típico consiste em um promotor mínimo e outros elementos cis-. O promotor mínimo é essencialmente uma região TATA box onde RNA polimerase II (polII), proteína de ligação a TATA (TBP), e fatores associados a TBP (TAFs) podem ligar para iniciar a transcrição. No entanto, na maioria dos casos, elementos de sequências diferentes do motivo TATA são requeridos para transcrição precisa. Foi visto que os elementos de sequência (por exemplo, reforçadores) elevam o nível de expressão geral dos genes próximos, frequentemente em uma maneira independente da posição e/ou da orientação. Outras sequências próximas ao sítio de iniciação de transcrição (por exemplo, sequências INR) de alguns genes polII podem proporcionar um sítio de ligação alternativa para fatores que também contribuem para a ativação transcricional, mesmo proporcionando alternativamente os sítios de ligação de promotor de núcleo para transcrição em promotores que carecem de elementos TATA funcionais. Vide, por exemplo, Zenzie-Gregory et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 2823-30.

[006] Outros elementos reguladores genéticos incluem sequências que interagem com fatores de ligação de DNAs específicos. Estes motivos de sequências algumas vezes são referidos como elementos cis-, e são geralmente dependentes da posição e da orientação, embora possam ser encontrados 5‘ ou 3‘ a uma sequência genética codificante, ou em um íntron. Os elementos cis- referidos, aos quais ligam fatores de transcrição tecido-específicos ou desenvolvimento-específicos, individualmente ou em combinação, podem determinar o padrão de expressão espaço-temporal de um promotor no nível transcricional. A disposição de elementos cis- a montante, seguidos por um promotor mínimo, tipicamente estabelece a polaridade de um promotor em particular. Os promotores em plantas que têm sido clonados e amplamente usados tanto para pesquisa básica quanto para aplicação biotecnológica são geralmente unidirecionais, direcionando somente um gene que tenha sido fundido em sua extremidade 3‘ (isto é, a jusante). Vide, por exemplo, Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9; e a Patente dos Estados Unidos No. 6.388.170.

[007] Muitros elementos cis- (ou "sequências reguladoras a montante") têm sido identificados em promotores de plantas. Estes elementos cis- variam amplamente no tipo de controle que exercem sobre genes operavelmente ligados. Alguns elementos agem aumentando a transcrição de genes operavelmente ligados em resposta a respostas ambientais (por exemplo, temperatura, umidade, e ferimento). Outros elementos cis- podem responder a sinais de desenvolvimento (por exemplo, germinação, maturação de sementes, e floração) ou a informação espacial (por exemplo, especificidade tecidual). Vide, por exemplo, Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23. O tipo de controle de elementos promotores específicos é tipicamente uma qualidade intrínseca do promotor; isto é, é provável que um gene heterólogo sob o controle de um promotor semelhante seja expressado de acordo com o controle do gene nativo a partir do qual o elemento promotor foi isolado. Estes elementos tipicamente também podem ser trocados com outros elementos e manter seus controle intrínseco característico sobre a expressão genética.

[008] Frequentemente é necessário introduzir múltiplos genes em plantas para engenharia metabólica e empilhamento de traços, cujos genes são frequentemente controlados por promotores idênticos ou homólogos. No entanto, é provável que surja silenciamento genético à base de homologia (HBGS) quando múltiplos transgenes introduzidos têm promotores homólogos dirigindo os mesmos. Vide, por exemplo, Mol et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:287-94. Foi reportado que HBGS ocorre extensivamente em plantas transgênicas. Vide, por exemplo, Vaucheret e Fagard (2001) Trends Genet. 17:29-35. Vários mecanismos têm sido sugeridos para explicar o fenômeno do HBGS, todos os quais incluem a característica de que a homologia de sequência no promotor dispara mecanismos de reconhecimento celular que resultam em silenciamento dos genes repetidos. Vide, por exemplo, Matzke e Matzke (1995) Plant Physiol. 107:679-85; Meyer e Saedler (1996) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:23-48; Fire (1999) Trends Genet. 15:358-63; Hamilton e Baulcombe (1999) Science 286:950-2; e Steimer et al. (2000) Plant Cell 12:1165-78.

[009] As estratégias para evitar HBGS em plantas transgênicas frequentemente envolvem o desenvolvimento de promotores sintéticos que são funcionalmente equivalentes, mas têm mínima homologia de sequência. Quando os promotores sintéticos referidos são usados para a expressão de transgenes em plantas de culturas, podem ajudar a evitar ou reduzir HBGS. Vide, por exemplo, Mourrain et al. (2007) Planta 225(2):365-79; Bhullar et al. (2003) Plant Physiol. 132:988-98. Os promotores referidos podem ser gerados introduzindo elementos cis- conhecidos em um trecho de DNA novo ou sintético, ou alternativamente por "permuta de domínio"(domain swapping), em que domínios de um promotor são substituídos com domínios funcionalmente equivalentes de outros promotores heterólogos.

[0010] Portanto, existe a necessidade de constructos e métodos para expressão estável de múltiplos transgenes de modo eficaz com mínimo risco para recombinação ou perda de transgenes através de reprodução ou múltiplas gerações em plantas transgênicas.

DESCRIÇÃO

[0011] São descritos aqui, neste pedido de patente, promotores sintéticos particulares compreendendo um promotor mínimo de Ubi1. Em modalidades, um promotor sintético compreendendo um promotor mínimo de Ubi1 compreende adicionalmente no mínimo um elemento de sequência de um promotor do SCBV ou equivalente funcional do mesmo. Em alguns exemplos, um promotor sintético semelhante (um "promotor do SCBV sintético") pode ser um promotor que é capaz de controlar a transcrição de uma sequência de nucleotídeos ligada operavelmente em uma célula de planta. Em outros exemplos, um promotor do SCBV sintético pode ser um promotor do SCBV bidirecional sintético, por exemplo, um ácido nucléico compreendendo sequências de nucleotídeos de um elemento promotor de Ubi1 mínimo orientadas na direção oposta com respeito aos elementos promotores do SCBV que é capaz de controlar a transcrição em uma célula de planta de duas sequências de nucleotídeos ligadas operavelmente que flanqueiam o promotor. Elementos adicionais que podem ser manipulados de modo a serem incluídos em um promotor bidirecional do SCBV sintético incluem íntrons (por exemplo, um íntron de álcool desidrogenase (ADH)), éxons, e/ou toda ou parte de uma região promotora a montante. Em determinados exemplos, um promotor bidirecional sintético pode compreender mais de um de qualquer um dos precedentes.

[0012] Modalidades particulares da invenção incluem células (por exemplo, células de plantas) compreendendo um promotor do SCBV sintético ou equivalente funcional do mesmo. Por exemplo, modalidades específicas podem incluir uma célula compreendendo um promotor do SCBV bidirecional sintético ou equivalente funcional do mesmo. Células de plantas de acordo com modalidades particulares podem estar presentes em uma cultura celular, em um tecido, em uma parte da planta, e/ou em uma planta inteira. Deste modo, uma planta (por exemplo, uma monocotiledônea ou dicotiledônea) compreendendo uma célula tendo um promotor do SCBV sintético ou equivalente funcional do mesmo está incluída em algumas modalidades.

[0013] Outras modalidades da invenção incluem um meio para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente. Os meios para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente incluem o promotor do SCBV bidirecional sintético de SEQ ID NO: 5.

[0014] Também são proporcionados constructos e métodos para a expressão de múltiplos genes em células de plantas e/ou tecidos de plantas. Os constructos proporcionados comprise no mínimo um promotor bidirecional ligado a múltiplos cassetes de expressão genética, em que o promotor bidirecional compreende uma sequência de nucleotídeos de promotor funcional do promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar (SCBV). Em algumas modalidades, os constructos e métodos proporcionados empregam um promotor bidirecional com base em um elemento promotor de núcleo mínimo de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays, ou um equivalente funcional do mesmo, e elementos da sequência de nucleotídeos de um promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar. Em algumas modalidades, os constructos e métodos proporcionados possibilitam a expressão de genes entre três e vinte.

[0015] Em um aspecto, é proporcionado um polinucleotídeo sintético compreendendo um elemento promotor de núcleo mínimo de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou de Zea luxurians e uma sequência de nucleotídeos de promotor funcional de um promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar. Em uma modalidade, o elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos que é no mínimo 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou a seu complemento. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 16 a 40. Em uma modalidade adicional, o elemento promotor de núcleo mínimo compreende a SEQ ID NO: 1 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional, o elemento promotor de núcleo mínimo consiste essencialmente na SEQ ID NO: 1 ou de seu complemento. Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende adicionalmente um éxon de um gene de Ubiquitina-1 e um íntron de um gene de Ubiquitina-1. Em uma modalidade adicional, o éxon é de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou de Zea luxurians. Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende adicionalmente um íntron de um gene de álcool desidrogenase. Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende adicionalmente uma sequência reguladora a montante do promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar. Em outra modalidade, a sequência de nucleotídeos de promotor funcional de um promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar e o gene de álcool desidrogenase compreende uma sequência de polinucleotídeos que é no mínimo 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 6 ou a seu complemento. Em uma modalidade adicional ou alternativa, a sequência de nucleotídeos de promotor funcional de um promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar e o gene de álcool desidrogenase compreende a SEQ ID NO: 6 seu complemento. Em uma modalidade adicional, a sequência de nucleotídeos de promotor funcional de um promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar e o gene de álcool desidrogenase consiste essencialmente na SEQ ID NO: 6 ou de seu complemento.

[0016] Em uma modalidade, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende adicionalmente no mínimo um elemento selecionado entre uma lista compreendendo uma sequência reguladora a montante (URS), um elemento reforçador, um éxon, um íntron, um sítio de iniciação de transcrição, uma TATA box, um elemento de consenso de choque térmico, e uma sequência de nucleotídeos de START (início) e/ou STOP (fim) de translação. Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende adicionalmente um elemento selecionado entre o grupo consistindo em uma sequência reguladora a montante (URS), um elemento reforçador, um éxon, um íntron, um sítio de iniciação de transcrição, uma TATA box, um elemento de consenso de choque térmico, uma sequência de nucleotídeos de START e/ou STOP de translação, e combinações dos mesmos. Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos de interesse ligada operavelmente ao elemento promotor de núcleo mínimo. Em outra modalidade, o elemento promotor de núcleo mínimo de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays e a sequência de nucleotídeos de promotor funcional de um promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar estão em orientação complementar reversa com respeito um ao outro no polinucleotídeo.

[0017] Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende um éxon de um gene de Ubiquitina-1, um íntron de um gene de Ubiquitina-1, e um íntron de um gene de álcool desidrogenase. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende uma segunda sequência de nucleotídeos codificante de interesse ligada operavelmente à sequência de nucleotídeos de promotor funcional de um promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar. Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende uma sequência de polinucleotídeos que é no mínimo 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 5 ou à seu complemento. Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende a SEQ ID NO: 5 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo sintético proporcionado consiste essencialmente na SEQ ID NO: 5 ou de seu complemento. Em uma modalidade adicional, o éxon ou o éítron é de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou de Zea luxurians.

[0018] Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende uma primeira sequência de nucleotídeos codificante de interesse ligada operavelmente ao elemento promotor de núcleo mínimo de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays. Em outra modalidade adicional, o polinucleotídeo sintético proporcionado compreende uma segunda sequência de nucleotídeos codificante de interesse ligada operavelmente à sequência de nucleotídeos de promotor funcional de um promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar.

[0019] Em outro aspecto, é proporcionado um método para a produção de uma célula transgênica, o método compreendendo transformar a célula com o polinucleotídeo proporcionado aqui, neste pedido de patente. Em uma modalidade, a célula é uma célula de planta. Em outro aspecto, é proporcionada uma célula de planta compreendendo o polinucleotídeo proporcionado aqui, neste pedido de patente. Em outro aspecto, é proporcionada uma planta compreendendo a célula de planta proporcionada aqui, neste pedido de patente.

[0020] Em outro aspecto, é proporcionado um método para a expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula de planta, o método compreendendo introduzir na célula de planta a sequência de nucleotídeos de interesse ligada operavelmente a um meio para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente. Em uma modalidade, o método proporcionado compreende introduzir na célula de planta um ácido nucléico compreendendo (a) a sequência de nucleotídeos de interesse ligada operavelmente ao meio para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente; e (b) uma segunda sequência de nucleotídeos de interesse ligada operavelmente ao meio para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente.

[0021] Em uma modalidade, o meio para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente compreende a SEQ ID NO: 5 ou seu complemento. Em outra modalidade, o meio para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente compreende a SEQ ID NO: 5. Em outra modalidade, o meio para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente compreende o complemento reverso de SEQ ID NO: 5. Em outra modalidade, o ácido nucléico é introduzido na célula de planta de modo a direcionar para um sítio predeterminado no DNA da célula de planta a sequência de nucleotídeos de interesse ligada operavelmente ao meio para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente. Em uma modalidade adicional ou alternativa, a sequência de nucleotídeos de interesse ligada operavelmente ao meio para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente é direcionada para o sítio predeterminado utilizando recombinação mediada por nuclease de dedo de Zinco.

[0022] Em algumas modalidades, o éxon é de um gene de Ubiquitina-1 de uma Zea spp. Em algumas modalidades, o íntron é de um gene de Ubiquitina-1 de uma Zea spp. Em algumas modalidades, a Zea spp.é Zea mays ou Zea luxurians.

[0023] Em outro aspecto, é proporcionado um constructo de ácido nucléico para a expressão de múltiplos genes em células e/ou tecidos de plantas. O constructo de ácido nucléico compreende (a) um promotor bidirecional, em que o promotor bidirecional compreende uma sequência de nucleotídeos de promotor funcional do promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar (SCBV); e (b) dois cassetes de expressão genética sobre extremidades opostas do promotor bidirecional; em que no mínimo um dos cassetes de expressão genética compreende dois ou mais genes ligados através de uma troca de translação (translation switch).

[0024] Em uma modalidade, o promotor bidirecional compreende no mínimo um reforçador. Em outra modalidade, o promotor bidirecional não compreende um reforçador. Em outra modalidade, o constructo de ácido nucléico compreende um vetor binário para transformação mediada por Agrobacterium. Em uma modalidade, o promotor bidirecional compreende um elemento selecionado entre o grupo consistindo em uma sequência reguladora a montante (URS), um elemento reforçador, um éxon, um íntron, um sítio de iniciação de transcrição, uma TATA box, um elemento de consenso de choque térmico, e combinações dos mesmos. Em outra modalidade, o promotor bidirecional compreende um elemento promotor de núcleo mínimo de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou de Zea luxurians. Em outra modalidade, o elemento promotor de núcleo de um gene de Ubiquitina-1 e a sequência de nucleotídeos de promotor do promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar (SCBV) estão em orientação complementar reversa com respeito um ao outro. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos no mínimo 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou a seu complemento. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 16 a 40. Em uma modalidade adicional, o elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 16 a 35. Em uma modalidade adicional, o elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 16 a 30. Em uma modalidade adicional, o elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 16 a 25. Em uma modalidade adicional, o elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 16 a 20. Em uma modalidade adicional, o elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 1.

[0025] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o promotor bidirecional compreende um éxon de um gene de Ubiquitina-1 e/ou um íntron de um gene de Ubiquitina. Em outra modalidade, o promotor bidirecional compreende um íntron de um gene de álcool desidrogenase. Em uma modalidade, o constructo de ácido nucléico é transformado de modo estável em plantas transgênicas. Em uma modalidade, as plantas são plantas monocotiledôneas. Em outra modalidade, as plantas são plantas dicotiledôneas. Em outra modalidade, as plantas não são plantas monocotiledôneas. Em outra modalidade, as plantas não são plantas dicotiledôneas.

[0026] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o promotor bidirecional compreende uma sequência reguladora a montante de um gene de Ubiquitina ou do promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar (SCBV). Em uma modalidade adicional, o promotor bidirecional compreende uma sequência reguladora a montante de um gene de Ubiquitina. Em outra modalidade, o promotor bidirecional compreende uma sequência reguladora a montante de um gene de Ubiquitina ou do promotor do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar (SCBV).

[0027] Em uma modalidade adicional, o promotor bidirecional compreende um polinucleotídeo no mínimo 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 5 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional, o promotor bidirecional compreende um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional, o promotor bidirecional compreende um polinucleotídeo no mínimo 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 6 ou a seu complemento. Em uma modalidade adicional, o promotor bidirecional compreende um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 6 ou seu complemento.

[0028] Em uma modalidade, os dois cassetes de expressão genética compreendem dois ou mais genes ligados através de uma troca de translação. Em uma modalidade adicional ou alternativa, a troca de translação é selecionada entre o grupo consistindo em um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES), um sítio de emenda (splicing) alternativo, um sítio de clivagem de ribozima, uma sequência de polinucleotídeos codificando um peptídeo 2A, uma sequência de polinucleotídeos codificando um peptídeo 2A-like, uma sequência de polinucleotídeos codificando uma inteína, uma sequência de polinucleotídeos codificando um sítio de clivagem de protease, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade adicional ou alternativa, a troca de translação compreende um elemento de hidrolase de ação cis- (CHYSEL). Em uma modalidade adicional, o CHYSEL é uma sequência de peptídeo 2A ou 2A-like. Em outra modalidade, um gene a montante da troca translacional não compreende um códon de parada (stop codon) de translação. Em outra modalidade, o constructo de ácido nucléico ativa ou permite a expressão de no mínimo quatro genes. Em uma modalidade adicional, todos os quatro genes são transgenes. Em outra modalidade, o constructo de ácido nucléico ativa a expressão de genes entre três e vinte. Em outra modalidade, o constructo de ácido nucléico ativa a expressão de genes entre quatro e oito. Em uma modalidade adicional ou alternativa, os genes são transgenes. Em outra modalidade, no mínimo um cassete de expressão genética compreende uma sequência de polinucleotídeos codificando uma proteína de fusão. Em uma modalidade adicional, a proteína de fusão compreende três a cinco genes.

[0029] Em algumas modalidades, a expressão de genes a partir do promotor bidirecional é no mínimo quatro vezes maior em comparação com um promotor uni-direcional. Em algumas modalidades, a expressão de genes a partir do promotor bidirecional é de três a dez vezes maior em comparação com um promotor uni-direcional. Em algumas modalidades, a expressão de genes a partir do promotor bidirecional é de quatro a oito vezes maior em comparação com um promotor uni-direcional. Em algumas modalidades, um gene marcador de seleção é colocado na extremidade distante do promotor (isto é, na extremidade 3‘ de um cassete de expressão genética a jusante de outro gene).

[0030] Em outro aspecto, é proporcionado um método para gerar uma planta transgênica compreendendo transformar uma célula de planta com o constructo de ácido nucléico proporcionado aqui, neste pedido de patente. Em outro aspecto, é proporcionado um método para gerar uma célula transgênica compreendendo transformar a célula com o constructo de ácido nucléico proporcionado aqui, neste pedido de patente. Em outro aspecto, é proporcionada uma célula de planta compreendendo o constructo de ácido nucléico proporcionado aqui, neste pedido de patente. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o constructo de ácido nucléico é transformado de modo estável na célula de planta. Em outro aspecto, é proporcionada uma planta transgênica compreendendo o constructo de ácido nucléico proporcionado aqui, neste pedido de patente. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o constructo de ácido nucléico é transformado de modo estável em células da planta transgênica. Em outro aspecto, é proporcionado um método para a expressão de múltiplos genes em células e/ou tecidos de plantas, compreendendo introduzir nas células e/ou nos tecidos de plantas o constructo de ácido nucléico proporcionado aqui, neste pedido de patente. Em uma modalidade adicional ou alternativa, as células e/ou os tecidos de plantas são transformados de modo estável com o constructo de ácido nucléico proporcionado aqui, neste pedido de patente. Em outro aspecto, é proporcionado um vetor binário para transformação mediada por Agrobacterium. Em uma modalidade, o vetor binário compreende o constructo de ácido nucléico proporcionado aqui, neste pedido de patente. Em outra modalidade, o vetor binário compreende o polinucleotídeo sintético proporcionado aqui, neste pedido de patente. Em outro aspecto, é proporcionada a utilização do promotor bidirecional proporcionado aqui, neste pedido de patente, para a expressão de múltiplos transgenes em plantas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E SEQUÊNCIAS

[0031] A FIG. 1 mostra um exemplo de (não está na escala) promotor de Ubi1 do milho (ZmUbi1), o qual compreende um Elemento a montante de aproximadamente 900 bp localizado 5‘ do sítio de iniciação de transcrição (TSS). O elemento a montante contém uma TATA box (localizada aproximadamente a -30 bp do TSS), e dois elementos de consenso de choque térmico em sobreposição (localizados aproximadamente a -200 bp do TSS). Este promotor também compreende cerca de 1100 bp 3‘ da região do TSS. Esta região 3‘ contém uma sequência líder adjacente (éxon ZmUbi1), e um íntron.

[0032] A FIG. 2 mostra um exemplo de modalidade do promotor bidirecional de Ubi1 sintético proporcionado, o qual inclui um elemento de núcleo mínimo minUbi1P clonado a montante de um promotor de ZmUbi1.

[0033] A FIG. 3 mostra um exemplo de desenho esquemático dos cassetes de expressão genética YFP e GUS, os quais são cada um ligados operavelmente ao promotor bidirecional de Ubi1 sintético.

[0034] A FIG. 4 mostra um mapa de plasmídeo representativo de pDAB105801.

[0035] A FIG. 5 mostra um desenho esquemático exemplar de um promotor bidirecional do Vírus Baciliforme da Cana de Açúcar (SCBV), o qual inclui um elemento de núcleo mínimo Min-Ubi1P clonado a montante de um promotor do SCBV.

[0036] A FIG. 6 mostra um mapa de plasmídeo representativo de pDAB105806.

[0037] A FIG. 7 mostra um exemplo de desenho esquemático dos cassetes de expressão genética YFP e GUS, os quais são cada um ligado operavelmente a um promotor bidirecional do SCBV sintético.

[0038] A FIG. 8 mostra exemplos de apresentações esquemáticas de constructos de multi-genes proporcionados aqui, neste pedido de patente. Trocas de translação são mostradas usando um símbolo especial (haltere vertical).

[0039] A FIG. 9 mostra mapas de plasmídeo representativos de pDAB108708 e pDAB101556.

[0040] A FIG. 10A mostra a SEQ ID NO: 1, a qual compreende uma região de 215 bp de um promotor de núcleo mínimo de Ubiquitina 1 de Zea mays (minUbi1P). A FIG. 10B mostra a SEQ ID NO: 2, a qual compreende o complemento reverso de um polinucleotídeo compreendendo um promotor de núcleo mínimo minUbi1P de Z. mays (sublinhado); um líder de Ubi1 de Z. mays(éxon ZmUbi1; fonte em negrito); e um íntron de Ubi1 de Z. mays (letra minúscula).

[0041] A FIG. 11 mostra a SEQ ID NO: 3, a qual compreende um exemplo de promotor bidirecional de Ubi1 sintético, em que o complemento reverso de um primeiro minUbi1P, e um segundo minUbi1P, estão sublinhados.

[0042] A FIG. 12 mostra a SEQ ID NO: 4, a qual compreende um exemplo de ácido nucléico compreendendo os cassetes de expressão genética YFP e GUS dirigidos por um promotor bidirecional de Ubi1 sintético.

[0043] A FIG. 13 mostra a SEQ ID NO: 5, a qual compreende um exemplo de promotor bidirecional do SCBV sintético compreendendo um promotor de núcleo mínimo minUbi1P, em que o complemento reverso do minUbi1P está sublinhado.

[0044] A FIG. 14 mostra a SEQ ID NO: 6, a qual compreende um promotor do SCBV contendo o éxon 6 de ADH1 (sublinhado), o íntron 6 (fonte em letra minúscula), e o éxon 7 (fonte em negrito).

[0045] A FIG. 15 mostra a SEQ ID NO: 7, a qual compreende um ácido nucléico compreendendo os cassetes de expressão genética YFP e GUS dirigidos por um exemplo de promotor bidirecional do SCBV sintético.

[0046] A SEQ ID NO: 8 mostra o Iniciador Dianteiro de YFP: 5‘-GATGCCTCAG TGGGAAAGG-3’. A SEQ ID NO: 9 compreende um Iniciador Reverso de YFP: 5‘-CCATAGGTGA GAGTGGTGAC AA-3‘. A SEQ ID NO: 10 compreende um Iniciador Dianteiro de Invertase: 5‘-TGGCGGACGA CGACTTGT-3’. A SEQ ID NO: 11 compreende um Iniciador Reverso de Invertase: 5‘-AAAGTTTGGA GGCTGCCGT-3’. A SEQ ID NO: 12 compreende uma Sonda de Invertase: 5-CGAGCAGACC GCCGTGTACT TCTACC-3'. A SEQ ID NO: 13 compreende um Iniciador Dianteiro de AAD1: 5-TGTTCGGTTC CCTCTACCAA-3'. A SEQ ID NO: 14 compreende um Iniciador Reverso de AAD1: 5'-CAACATCCAT CACCTTGACT GA-3'. A SEQ ID NO: 15 compreende uma Sonda de AAD1: 5-CACAGAACCG TCGCTTCAGC AACA-3' (vide também a Tabela 7).

[0047] A FIG. 16 mostra uma análise por Western blot para expressão de YFP estável dirigida por um constructo do Promotor do SCBV bidirecional (pDAB108708) em plantas T0 de milho. Plantas típicas apresentaram expressão de YFP estável em folha dirigida pelo elemento promotor de núcleo mínimo Min-Ubi1P. A quantidade de proteína a qual é produzida é indicada como partes por milhão (ppm).

[0048] A FIG. 17 mostra uma análise por Western blot para expressão de YFP estável a partir do constructo de controle contendo um promotor ZmUbi1 que somente dirige a expressão de YFP (pDAB101556); uma sequência codificante de GUSnão está contida neste constructo. A quantidade de proteína a qual é produzida é indicada como partes por milhão (ppm).

[0049] A FIG. 18 mostra exemplos de constructos de pilhas de cassetes de quatro genes pDAB105849 (AAD1-2A-YFP mais Cry34-2A-Cry35) e pDAB105865 (YFP-2A-AAD1 mais Cry34-2A-Cry35). Setas sombreadas indicam a direção de transcrição a partir do promotor bidirecional. Ubi1-mimP compreende sequência de 200 nt a montante do sítio de iniciação transcricional do promotor de Ubi1 do milho. SCBV-URS compreende sequência reguladora a montante do promotor do SCBV excluindo o promotor de núcleo (mostrado como seta). Ubi1-Int compreende um íntron do promotor de Ubi1 do milho. A FIG. 19 mostra dois exemplos adicionais de constructos de pilhas de cassetes de quatro genes.

[0050] A FIG. 20 mostra mapas representativos para os plasmídeos pDAB105818 e pDAB105748.

[0051] As FIGURAS 21A a 21E mostra promotores de núcleo mínimo adicionais (min-Ubi1P ou Ubi1-minP) de SEQ ID NOs: 16 a 40.

[0052] A FIG. 22 mostra mapas representativos para os plasmídeos pDAB105841 e pDAB105847.

[0053] A FIG. 23 mostra mapas representativos para os plasmídeos pDAB105840 e pDAB105849.

[0054] A FIG. 24 mostra mapas representativos para os plasmídeos pDAB101917 e pDAB108719.

[0055] A FIG. 25 mostra mapas representativos para os plasmídeos pDAB105844 e pDAB105848.

[0056] A FIG. 26 mostra mapas representativos para os plasmídeos pDAB105865 e pDAB108720.

[0057] A FIG. 27 mostra sequência de ácido nucléico para cassetes de expressão genética de pDAB108719, onde é ilustrado cada gene e elemento.

[0058] A FIG. 28 mostra exemplos de dados de expressão de proteína entre vários constructos testados para Cry34 (FIG. 28A), AAD-1 (FIG. 28B), e Cry35 (FIG. 28C).

[0059] A FIG. 29 mostra dois exemplos de sequências para proteínas fluorescentes amarelas de Phialidium sp. SL-2003 (PhiYFP, SEQ ID NO: 51; e PhiYFPv3, SEQ ID NO: 52).

[0060] A FIG. 30 mostra exemplos de modalidades do promotor bidirecional de Ubi1 sintético e constructos proporcionados, incluindo pDAB108706 (ZMUbi bidirecional (-200)), pDAB108707 (ZMUbi bidirecional (-90)), pDAB108708 (SCBV bidirecional (-200)), e pDAB108709 (SCBV bidirecional (-90)). pDAB101556 (ZmUbi1-YFP controle), pDAB108715 (SCBV sem promotor mínimo), e pDAB108716 (ZMUbi1 sem promotor mínimo) servem como constructos de controle com promotores uni-direcionais.

[0061] A FIG. 31A mostra exemplos dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para proteína YFP (LCMS) em ng/cm2. A FIG. 31B mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para RNA de YFP.

[0062] A FIG. 32A mostra exemplos dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para proteína GUS (LCMS) em ng/cm2. A FIG. 32B mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para RNA de GUS.

[0063] A FIG. 33A mostra exemplos dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para proteína AAD1 (LCMS) em ng/cm2. A FIG. 33B mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para RNA de AAD1.

[0064] A FIG. 34A mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para proteína YFP (LCMS) em ng/cm2. A FIG. 34B mostra uma análise estatística dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para RNA de YFP. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0065] A FIG. 35A mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para proteína GUS (LCMS) em ng/cm2. A FIG. 35B mostra uma análise estatística dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para RNA de GUS. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0066] A FIG. 36A mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para proteína AAD1 (LCMS) em ng/cm2. A FIG. 36B mostra uma análise estatística dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para RNA de AAD1. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0067] As FIGURAS 37A, 37B, e 37C mostram exemplos dos resultados da expressão (V10) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para proteína YFP, AAD1, e GUS (LCMS) em ng/cm2 respectivamente.

[0068] As FIGURAS 38A, 38B, e 38C mostram a análise estatística dos resultados da expressão (V10) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para proteína YFP, GUS, e AAD1 (LCMS) em ng/cm2respectivamente. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0069] As FIGURAS 39A, 39B, e 39C mostram exemplos dos resultados da expressão (R3) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para proteína YFP, GUS, e AAD1 (LCMS) em ng/cm2, respectivamente.

[0070] As FIGURAS 40A, 40B, e 40C mostram a análise estatística dos resultados da expressão (R3) dos sete constructos mostrados na FIG. 30 para proteína YFP, GUS, e AAD1 (LCMS) em ng/cm2, respectivamente. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0071] A FIG. 41 mostra constructos de multi-transgenes adicionais usando promotor de Ubi1, incluindo pDAB108717 e

[0072] A FIG. 42A mostra exemplos dos resultados da expressão constructos pDAB105748 (ZMUbi1-Cry34/ZMUbi1 (YFP/AAD-1-ZMUbi1 (AAD1/YFP-ZMUbi1 (YFP/AAD1-SCBV (AAD1/YFP - SCBV bidirecional-Cry34-Cry35). A FIG. 42B mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) da proteína Cry34 (LCMS) dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720.

[0073] A FIG. 43A mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) de RNA de AAD1 dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. A FIG. 43B mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) da proteína AAD1 (LCMS) dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720.

[0074] A FIG. 44A mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) de RNA de YFP dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. A FIG. 44B mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) da proteína YFP (LCMS) dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720.

[0075] A FIG. 45A mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) de RNA de Cry35 dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. A FIG. 45B mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) da proteína Cry35 (ELISA) dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720.

[0076] A FIG. 46 mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) de RNA de PAT dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720.

[0077] A FIG. 47A mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) de RNA de Cry34 dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. A FIG. 47B mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) da proteína Cry34 dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0078] A FIG. 48A mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) de RNA de AAD1 dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. A FIG. 48B mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) da proteína AAD1 dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0079] A FIG. 49A mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) de RNA de YFP dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. A FIG. 49B mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) da proteína YFP dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0080] A FIG. 50A mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) de RNA de Cry35 dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. A FIG. 50B mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) da proteína Cry35 dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0081] A FIG. 51 mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) de RNA de PAT dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0082] As FIGURAS 52A, 52B, 52C, e 52D mostram exemplos dos resultados da expressão de proteína (V10) de YFP, AAD1, Cry34, e Cry35 respectivamente dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720.

[0083] As FIGURAS 53A, 53B, 53C, e 53D mostram a análise estatística dos resultados da expressão de proteína (V10) de YFP, AAD1, Cry34, e Cry35 respectivamente dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0084] As FIGURAS 54A, 54B, 54C, e 54D mostram exemplos dos resultados da expressão de proteína (R3) de YFP, AAD1, Cry34, e Cry35 respectivamente dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720.

[0085] As FIGURAS 55A, 55B, 55C, e 55D mostram a análise estatística dos resultados da expressão de proteína (R3) de YFP, AAD1, Cry34, e Cry35 respectivamente dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[0086] A FIG. 56 mostra exemplos dos resultados de Western blot para expressão de proteína de Cry34, Cry35, e AAD1 de pDAB108718, pDAB108717, pDAB108719, e pDAB108720.

MODO(S) PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[0087] O desenvolvimento de produtos transgênicos está se tornando cada vez mais complexo, o que requer a piramidização de múltiplos transgenes em um único lócus. Tradicionalmente cada transgene geralmente necessita de um único promotor para expressão, de modo que múltiplos promotores são necessários para expressar diferentes transgenes dentro de uma pilha de genes. Além de aumentar o tamanho da pilha de genes, isto frequentemente leva à utilização repetida do mesmo promotor de modo a obter níveis similares de padrões de expressão de diferentes transgenes que controlam o mesmo traço. São conhecidos constructos de multi-genes dirigidos pelo mesmo promotor para causar silenciamento genético, deste modo produzindo produtos transgênicos menos eficazes na área. O excesso de sítios de ligação de fator de transcrição (TF) devido à repetição de promotor pode provocar a depleção de fatores de transcrição endógenos levando a inativação transcricional. O silenciamento de transgenes provavelmente vai afetar de modo indesejável a performance de uma planta transgênica produzida para expressar os transgenes. Sequências repetitivas dentro de um transgene podem levar a recombinação homóloga intra-lócus genético resultando em reorganizações de polinucleotídeos.

[0088] São proporcionado métodos e constructos combinando o sistema de promotor bidirecional com organização bicistrônica de genes sobre qualquer uma ou sobre ambas as extremidades do promotor, por exemplo com a utilização de uma sequência 2A do vírus Thosea asigna. A proteína2A, a qual tem somente 16 a 20 aminoácidos de extensão, cliva a poliproteína em seu próprio término carboxila. Esta propriedade de "auto-clivagem" ou "skip de ribossoma" do peptídeo 2A ou 2A-like pode ser usada para processar poliproteínas artificiais produzidas em plantas transgênicas. Em uma modalidade, os genes Cry34 e Cry35 são fundidos em um cassete de expressão genética, ao passo que os genes YFP (ou PhiYFP) e AAD1 são fundidos em outro cassete de expressão genética (com um único frame de leitura aberta (ORF) com uma cópia do gene da proteína 2A colocada entre os dois genes em cada combinação). Por exemplo, cada um destes cassetes de expressão genética (ou pares de genes) pode ser colocado sobre qualquer uma das extremidades do promotor bidirecional para acionar 4 transgenes usando um único promotor. Deste modo, os constructos e os métodos proporcionados aqui, neste pedido de patente, são úteis para evitar a utilização repetida do mesmo promotor e reduzem significativamente o tamanho dos constructos comerciais. Além disso, o acionamento de quatro ou mais genes com um promotor também proporciona capacidade para coexpressar genes que controlam um único traço.

[0089] Promotores de plantas usados para pesquisa básica ou para aplicação biotecnológica são geralmente unidirecionais, direcionando somente um gene que tenha sido fundido em sua extremidade 3‘ (a jusante). Frequentemente é necessário introduzir múltiplos genes em plantas para engenharia metabólica e empilhamento de traços e portanto, múltiplos promotores são tipicamente necessários em culturas transgênicas futuras para acionar a expressão de múltiplos genes. É desejável desenhar estratégias que possam economizar o número de promotores implantados e permitir expressão coregulada simultânea para piramidização genética. Em algumas modalidades, os promotores bidirecionais proporcionados podem acionar a transcrição de múltiplas unidades de transcrição, incluindo sequências de RNAi, de miRNA artificial, ou de RNA de loop de haipin.

[0090] Modalidades aqui, neste pedido de patente, utilizam um processo em que um promotor unidirecional de um gene de ubiquitina- 1 de milho (por exemplo, ZmUbi1) e um promotor do SCBV para projetar um promotor bidirecional sintético, de tal modo que um promotor pode direcionar a expressão de dois genes, um sobre cada extremidade do promotor. Promotores bidirecionais sintéticos podem permitir que estes na técnica empilhem transgenes em células de plantas e plantas ao mesmo tempo que diminuindo a utilização repetida do mesmo promotor e reduzindo o tamanho dos constructos transgênicos. Além disso, a regulação da expressão de dois genes com um único promotor bidirecional sintético também pode proporcionar a capacidade de coexpressar os dois genes sob as mesmas condições, tal como pode ser útil, por exemplo, quando os dois genes contribuem cada um para um único traço no hospedeiro. A utilização de função bidirecional dos promotores em plantas tem sido reportada em alguns casos, incluindo os promotores CaMV 35 (Barfield e Pua (1991) Plant Cell Rep. 10(6-7):308-14; Xie et al. (2001)), e os promotores do promotor de manopina sintase (mas) (Velten et al. (1984) EMBO J. 3(12):2723-30; Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23).

[0091] A iniciação de transcrição e a modulação da expressão genética em genes de plantas é direcionada por uma variedade de elementos de sequências de DNA que são dispostos coletivamente dentro do promotor. Promotores eucarióticos consistem em elemento promotor de núcleo mínimo (minP), e adicionalmente de sequências reguladoras a montante (URSs). O elemento promotor de núcleo é um trecho mínimo de sequência de DNA contígua que é suficiente para direcionar iniciação de transcrição precisa. Promotores de núcleo em plantas também compreendem regiões canônicas associadas com a iniciação de transcrição, tais como boxes CAAT e TATA. O elemento TATA box está geralmente localizado aproximadamente 20 a 35 nucleotídeos a montante do sítio de iniciação de transcrição.

[0092] A ativação do minP é dependente da sequência reguladora a montante, à qual várias proteínas ligam e subsequentemente interagem com o complexo de iniciação de transcrição. As sequências reguladoras a montante consistem em sequências de DNA, as quais determinam o padrão de expressão espaço-temporal de um promotor compreendendo a URS. A polaridade de um promotor é frequentemente determinada pela orientação do minP, ao passo que a sequência reguladora a montante é bipolar (isto é, funciona independente de sua orientação). Por exemplo, o promotor polar unidirecional sintético do CaMV 35S pode ser convertido para um promotor bidirecional fundindo um minP na extremidade 5‘ do promotor na orientação oposta. Vide, por exemplo, Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9.

[0093] Em exemplos específicos de algumas modalidades, um elemento promotor de núcleo mínimo (minUbi1P) de um promotor de Ubi1 do milho modificado (ZmUbi1) originalmente derivado a partir da linhagem consanguínea de Z. mays, B73, é usado para produzir um promotor do SCBV bidirecional sintético que pode funcionar em plantas de modo a proporcionar características de controle de expressão que são únicas com respeito ao promotores bidirecionais previamente disponíveis. Modalidades incluem um promotor do SCBV bidirecional sintético que inclui adicionalmente sequência de nucleotídeos derivada de um promotor do SCBV nativo. Modalidades particulares podem incluir adicionalmente um promotor do SCBV bidirecional sintético compreendendo um íntron (por exemplo, um íntron de ADH) em íntima proximidade com elementos de sequência do SCBV e do minUbi1P no promotor do SCBV bidirecional sintético.

[0094] O promotor ZmUbi1 originalmente derivado de B73 compreende sequências localizadas no genoma do milho dentro de cerca de 899 bases 5‘ do sítio de iniciação de transcrição, e adicionalmente dentro de cerca de 1093 bases 3‘ do sítio de iniciação de transcrição. Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18(4):675-89 (descrevendo um gene B73 ZmUbi1). Um promotor ZmUbi1 modificado derivado de B73 que é usado alguns exemplos é um promotor de aproximadamente 2 kb que contém uma TATA box; dois elementos de consenso de choque térmico em sobreposição; uma sequência líder de 82 ou 83 nucleotídeos (dependendo do filamento de referência) imediatamente adjacente ao sítio de iniciação de transcrição, a qual é referida aqui, neste pedido de patente, como éxon ZmUbi1; e um íntron de 1015 a 1016 nucleotídeos (vide a FIG. 1 por exemplo). Outras variantes de promotor de ubiquitina do milho derivadas dos genótipos de Zea species e de Zea mays podem apresentar alta conservação de sequência em torno do elemento minP que consiste no elemento TATA e dos elementos de consenso de choque térmico a montante. Portanto, modalidades da invenção são exemplificadas pela utilização desta região curta (~200 nt) altamente conservada (por exemplo, SEQ ID NO: 1) de um promotor ZmUbi1 como um elemento promotor de núcleo mínimo para construção de promotores de planta bidirecionais sintéticos.

[0095] Algumas abreviações descritas estão listadas na Tabela 1. Tabela 1. Abreviações usadas na descrição

[0096] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, os artigos, "um,""uma," e "o", "a" incluem referências plurais a menos que o contexto claramente e inequivocamente dite de modo diverso.

[0097] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "retrocruzamento" se refere a um processo no qual um criador cruza a progênie híbrida de volta com uma das plantas de origem, por exemplo, um híbrido da primeira geração F1 com um dos genótipos parentais do híbrido F1.

[0098] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "íntron"se refere a qualquer sequência de ácido nucléico compreendida em um gene (ou sequência de nucleotídeos de interesse expressada) que é transcrita mas não traduzida. Íntrons incluem sequência de ácido nucléico não traduzida dentro de uma sequência de DNA expressada, bem como a sequência correspondente em moléculas de RNA transcritas a partir da mesma.

[0099] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "isolado" se refere a componente biológico (incluindo um ácido nucléico ou proteína) que tenha sido substancialmente separado, produzido além de, ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente ocorre naturalmente (isto é, DNA e RNA cromossômicos e extra-cromossômicos diversos, e proteínas), enquanto efetuando uma alteração química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucléico pode ser isolado de um cromossoma rompendo ligações químicas que conectam o ácido nucléico ao DNA remanescente no cromossoma). Moléculas de ácido nucléico e proteínas que tenham sido "isoladas" incluem moléculas de ácido nucléico e proteínas purificadas por métodos de purificação de rotina. A expressão "isolado"também engloba ácidos nucléicos e proteínas preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como moléculas de ácido nucléico, proteínas, e peptídeos sintetizados quimicamente.

[00100] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "expressão genética"se refere a um processo por meio do qual a informação codificada de uma unidade transcricional de ácido nucléico (incluindo, por exemplo, DNA genômico) é convertida em uma parte operacional, não operacional, ou estrutural de uma célula, frequentemente incluindo a síntese de uma proteína. A expressão genética pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, de um tecido, ou de um organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão genética. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer parte no caminho de DNA a RNA a proteína. A regulação da expressão genética ocorre, por exemplo, através de controles agindo sobre a transcrição, a translação, o transporte e o processamento de RNA, a degradação de moléculas intermediárias tais como mRNA, ou através de ativação, inativação, compartimentalização, ou degradação de moléculas de proteínas específica depois destas terem sido produzidas, ou por combinações dos mesmos. A expressão genética pode ser medida no nível do RNA ou no nível da proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ou um ou mais testes de atividade de proteína in vitro, in situ, ou in vivo.

[00101] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "silenciamento genético à base de homologia" (HBGS) se refere a um termo genérico que inclui tanto silenciamento genético transcricional quanto silenciamento genético pós-transcricional. O silenciamento de um lócus alvo por um lócus de silenciamento não ligado pode resultar de inibição de transcrição (silenciamento genético transcricional; TGS) ou de degradação de mRNA (silenciamento genético pós-transcricional; PTGS), devido à produção de RNA de filamento duplo (dsRNA) correspondente a sequências de promotor ou transcritas, respectivamente. O envolvimento de componentes celulares distintos em cada processo sugere que TGS e PTGS induzidos por dsRNA provavelmente resultam da diversificação de um mecanismo comum antigo. No entanto, foi difícil de realizar uma rigorosa comparação de TGS e PTGS porque geralmente se baseia na análise de loci de silenciamento distintos. Um único lócus transgênico pode ser descrito para acionar tanto TGS quanto PTGS, devido à produção de dsRNA correspondente a sequências de promotor e transcritas de diferentes genes-alvo. Vide, por exemplo, Mourrain et al. (2007) Planta 225:365-79. É provável que siRNAs sejam as moléculas reais que acionam TGS e PTGS sobre sequências homólogas: os siRNAs neste modelo iriam acionar o silenciamento e a metilação de sequências homólogas em cis e em transatravés da disseminação de metilação de sequências transgênicas no promotor endógeno.

[00102] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "molécula de ácido nucléico"(ou "ácido nucléico"ou "polinucleotídeo") se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos, a qual pode incluir tanto filamentos sentido quanto antissentido de RNA, de cDNA, de DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros mistos das acima. Um nucleotídeo pode se referir a um ribonucleotídeo, a um desoxirribonucleotídeo, ou a uma forma modificada de um ou outro tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucléico"conforme usado aqui, neste pedido de patente, é sinônima com "ácido nucléico"e "polinucleotídeo."Uma molécula de ácido nucléico tem geralmente no mínimo 10 bases de extensão, a menos que especificado de modo diverso. O termo pode se referir a uma molécula de RNA ou de DNA de comprimento indeterminado. O termo inclui formas de DNA de filamento único e de filamento duplo. Uma molécula de ácido nucléico pode incluir um ou outro ou ambos os nucleotídeos que ocorrem naturalmente e modificados ligados juntos por ligações de nucleotídeo que ocorrem naturalmente e/ou que não ocorrem naturalmente.

[00103] As moléculas de ácido nucléico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivadas, conforme será prontamente reconhecido pelas pessoas versadas na técnica. As modificações referidas incluem, por exemplo, etiquetas, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, modificações internucleotídeos (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; queeladores; alquiladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucléico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de filamento único, de filamento duplo, parcialmente duplexado, triplexado, hairpinned, circulares, e padlocked.

[00104] A transcrição prossegue em uma maneira 5‘ a 3‘ ao longo de um filamento de DNA. Isto significa que RNA é produzido pela adição sequencial de ribonucleotídeo-5-trifosfatos ao término 3‘ da cadeia em crescimento (com uma eliminação requerida do pirofosfato). Em uma molécula de ácido nucléico ou linear ou circular, elementos distintos (por exemplo, sequências de nucleotídeos particulares) podem ser referidos como estando "a montante" em relação a um elemento adicional caso eles sejam ligados ou venham a ser ligados ao mesmo ácido nucléico na direção 5‘ daquele elemento. De modo similar, elementos distintos podem ser "a jusante" em relação a um elemento adicional caso eles sejam ou venham a ser ligados ao mesmo ácido nucléico na direção 3‘ daquele elemento.

[00105] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "posição de base," se refere à localização de uma dada base ou de um dado resíduo nucleotídeo dentor de um ácido nucléico designado. O ácido nucléico designado pode ser definido por alinhamento (vide abaixo) com um ácido nucléico de referência.

[00106] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "hibridização"se refere a um processo em que oligonucleotídeos e seus análogos hibridizam por ligação de hidrogênio, o qual inclui ligação de hidrogênio de Watson-Crick, de Hoogsteen ou de Hoogsteen reversa, entre bases complementares. Geralmente, moléculas de ácido nucléico consistem em bases nitrogenadas que são ou pirimidinas (citosina (C), uracila (U), e timina (T)) ou purinas (adenine (A) e guanina (G)). Estas bases nitrogenadas formam ligações de hidrogênio entre uma pirimidina e uma purina, e a ligação da pirimidina à purina é referida como "pareamento de bases." Mais especificamente, A vail ligar hidrogênio a T ou U, e G vail ligar a C. "Complementar" se refere ao pareamento de bases que ocorre entre duas sequências de ácido nucléico distintas ou duas regiões distintas da mesma sequência de ácido nucléico.

[00107] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, as expressões "especificamente hibridizáveis"e "especificamente complementares" se refere a um grau suficiente de complementaridade de tal modo que ocorre ligação estável e específica entre o oligonucleotídeo e o DNA ou o RNA alvo. O oligonucleotídeo não precisa ser 100% complementar a sua sequência-alvo de modo a ser especificamente hibridizável. Um oligonucleotídeo é especificamente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo à molécula de DNA ou de RNA alvo interfere com a função normal do DNA ou do RNA alvo, e existe grau suficiente de complementaridade para evitar ligação inespecífica do oligonucleotídeo a sequências não alvo sob condições onde se deseja ligação específica, por exemplo sob condições fisiológica no caso de testes ou sistemas in vivo. Semelhante ligação é referida como hibridização específica.

[00108] As condições de hibridização resultando em graus particulares de estringência vão variar dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e da composição e da extensão das sequências de ácido nucléico hibridizantes. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou de Mg2+) do tampão de hibridização vão contribuir para a estringência de hibridização, embora os tempos de lavagem também influenciem a estringência. Cálculos relativos às condições de hibridização requeridas para obter graus particulares de estringência são discutidos em Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 e 11.

[00109] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "condições estringentes" engloba condições sob as quais somente ocorrerá hibridização se houver menos de 50% de incompatibilidades entre a molécula hibridizante e o DNA alvo. "Condições estringentes" incluem níveis particulares adicionais de estringência. Deste modo, conforme usado aqui, neste pedido de patente, condições de "moderada estringência" são aquelas sob as quais moléculas com mais de 50% de incompatibilidades de sequência não vão hibridizar; condições de "alta estringência" são aquelas sob as quais sequências com mais de 20% de incompatibilidades não vão hibridizar; e condições de "estringência muito alta"são aquelas sob as quais sequências com mais de 10% de incompatibilidades não vão hibridizar.

[00110] Em modalidades particulares, condições estringentes podem incluir hibridização a 65°C, seguida por lavagens a 65°C com 0,1x SSC/0,1% de SDS por 40 minutos.

[00111] As seguintes são condições hibridização típicas e não limitantes:

[00112] Estringência Muito Alta: Hibridização em 5x tampão SSC a 65°C por 16 horas; lavagem duas vezes em 2x tampão SSC em temperatura ambiente por 15 minutos cada; e lavagem duas vezes em 0,5x tampão SSC a 65°C por 20 minutos cada.

[00113] Alta Estringência: Hibridização em 5x-6x tampão SSC a 65 a 70°C por 16 a 20 horas; lavagem duas vezes em 2x tampão SSC em temperatura ambiente por 5 a 20 minutos cada; e lavagem duas vezes em 1x tampão SSC a 55 a 70°C por 30 minutos cada.

[00114] Moderada Estringência: Hibridização em 6x tampão SSC em temperatura ambiente a 55°C por 16 a 20 horas; lavagem no mínimo duas vezes em 2x-3x tampão SSC em temperatura ambiente a 55°C por 20 a 30 minutos cada.

[00115] Em modalidades particulares, moléculas de ácido nucléico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de estringência muito alta. Nestas e em modalidades adicionais, moléculas de ácido nucléico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de alta estringência. Nestas e em modalidades adicionais, moléculas de ácido nucléico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de moderada estringência.

[00116] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "oligonucleotídeo" se refere a um polímero de ácidos nucléicos curtos. Os oligonucleotídeos podem ser formados por clivagem de segmentos de ácido nucléico mais longos, ou por polimerização de precursores de nucleotídeos individuais. Os sintetizadores automatizados possibilitam a síntese de oligonucleotídeos até vários centenas de pares de bases de extensão. Como os oligonucleotídeos podem ligar a uma sequência de nucleotídeos complementar, podem ser usados como sondas para a detecção de DNA ou de RNA. Oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de pequenas sequências de DNA. Em PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um "iniciador," o qual permite que uma DNA polimerase estenda o oligonucleotídeo e replique o filamento complementar.

[00117] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "identidade de sequência"ou "identidade," se refere a um contexto em que duas sequências de ácido nucléico ou polipeptídeo, pode se referir aos resíduos nas duas sequências que são as mesmas quando alinhadas para máxima correspondência sobre uma janela de comparação especificada.

[00118] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "percentagem de identidade de sequência"se refere ao valor determinado comparando duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucléico, e sequências de aminoácidos) sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos (gaps)) em comparação com a sequência de referência (a qual não compreende adições ou deleções) para ótimo alinhamento das duas sequências. A percentagem é calculada determinando o número de posições nas quais o resíduo aminoácido ou nucleotídeo idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequência.

[00119] Métodos para alinhamento de sequências para comparação são conhecidos de modo geral na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia de sequência podem ser encontrados em, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

[00120] A ferramenta BLAST™ (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1990)) do NCBI (National Center for Biotechnology Information) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para utilização em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar identidade de sequência usando este programa está disponível na internet sob a seção de ajuda "help" para BLAST™. Para comparações de sequências de ácido nucléico, pode ser empregada a função "Blast 2 sequences" do programa BLAST™ (Blastn) usando os parâmetros de default. Sequências de ácido nucléico com ainda maior similaridade com as sequências de referência vão apresentar percentagem de identidade crescente quando avaliadas por este método.

[00121] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "ligada operavelmente" se refere a um contexto no qual a primeira sequência de ácido nucléico é ligada operavelmente com uma segunda sequência de ácido nucléico quando a primeira sequência de ácido nucléico está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor é ligado operavelmente com uma sequência codificante quando o promotor afeta a transcrição ou a expressão da sequência codificante. Quando produzidas de modo recombinante, sequências de ácido nucléico ligadas operavelmente são geralmente contíguas e, onde necessário para unir duas regiões codificantes de proteína, on mesmo frame de leitura. No entanto, elementos não precisam ser contiguous para serem ligados operavelmente.

[00122] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "promotor" se refere a uma região de DNA que geralmente está localizada a montante (em direção à região 5‘ de um gene) que é necessária para transcrição. Promotores podem permitir a ativação ou repressão apropriada do gene o qual controlam. Um promotor pode conter sequências específicas que são reconhecidas por fatores de transcrição. Estes fatores podem ligar aos promotores de sequências de DNA e resultam no recrutamento de RNA polimerase, uma enzima que sintetiza RNA a partir da região codificante do gene.

[00123] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "transforma" ou "transduz" se refere a um processo onde um vírus ou um vetor transfere moléculas de ácido nucléico para uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucléico "transduzida" na célula quando a molécula de ácido nucléico se torna replicada de modo estável pela célula, quer por incorporação da molécula de ácido nucléico no genoma celular ou por replicação epissômica. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "transformação" engloba todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucléico pode ser introduzido em uma célula semelhantes. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmídeo; eletroporação (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); lipofecção (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); microinjeção (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); captação de DNA direta; transformação mediada por whiskers; e bombardeamento de microprojéteis (Klein et al. (1987) Nature 327:70).

[00124] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "transgene" se refere a uma sequência de ácido nucléico exógena. Em um exemplo, um transgene é uma sequência genética (por exemplo, um gene resistente a herbicida), um gene codificando um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil, ou um gene codificando um traço agrícola desejável. Em ainda outro exemplo, o transgene é uma sequência de ácido nucléico antissentido, em que a expressão da sequência de ácido nucléico antissentido inibe a expressão de uma sequência de ácido nucléico alvo. Um transgene pode conter sequências reguladoras ligadas operavelmente ao transgene (por exemplo, um promotor). Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucléico de interesse é um transgene. No entanto, em outras modalidades, uma sequência de ácido nucléico de interesse é uma sequência de ácido nucléico endógena, em que são desejadas cópias genômicas adicionais da sequência de ácido nucléico endógena, ou uma sequência de ácido nucléico que está na orientação antissentido com respeito à sequência de uma molécula de ácido nucléico alvo no organismo hospedeiro.

[00125] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucléico conforme introduzido em uma célula, deste modo produzindo uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucléico que permitem que este replique na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, um plasmídeo, um cosmídeo, um bacteriófago, ou um vírus que carrega DNA exógena para dentro de uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, moléculas antissentido, e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar, ou infectar uma célula, deste modo fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácido nucléico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor pode opcionalmente incluir materiais para ajudar a realizar a entrada da molécula de ácido nucléico dentro da célula (por exemplo, um lipossoma).

[00126] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "planta" inclui plantas e partes de plantas incluindo, mas não limitadas a células de plantas e tecidos de plantas tais como folhas, caules, raízes, flores, pólen, e sementes. A classe de plantas que podem ser usadas na presente invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas superiores e inferiores suscetíveis a mutagênese incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samanbaias e algas multicelulares. Deste modo, "planta" inclui plantas dicotiledôneas e plantas monocotiledôneas. Exemplos de plantas dicotiledôneas incluem tabaco, Arabidopsis, soja, tomate, papaya, canola, girassol, algodão, alfalfa, batata, videira, feijão guandu, ervilha, brássicas, grão de bico, beterraba sacarina, colza, melancia, melão, pimentão, amendoim, abóbora, rabanete, espinafre, abóbora, brócolis, repolho, cenoura, couve flor, salsão, repolho chinês, pepino, berinjela, e alface. Exemplos de plantas monocotiledôneas incluem milho, arroz, trigo, cana de açúcar, cevada, centeio, sorgo, orquídeas, bambu, banana, cattails, lírios, aveia, cebola, milheto, e triticale.

[00127] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "material de planta" se refere a folhas, caules, raízes, flores ou partes das flores, frutos, pólen, células somáticas, zigotos, sementes, mudas, culturas de células ou tecidos, ou qualquer outra parte ou produto de uma planta. Em alguma modalidade, material de planta inclui cotilédone e folha.

[00128] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "troca de translação"se refere a um mecanismo na extremidade de um gene que permite a translação de um gene imediatamente a jusante. O mecanismo de troca de translação pode funcionar no nível do ácido nucléico (por exemplo, sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) viral ou eucariótico, um sítio de emenda alternativo, ou um sítio de clivagem de ribozima) ou no nível do peptídeo/da proteína (por exemplo, um peptídeo 2A, um peptídeo 2A- like, um inteína peptídeo, ou um sítio de clivagem de protease).

[00129] Estes mecanismos de troca de translação no nível do ácido nucléico ou no nível do peptídeo/da proteína são conhecidos de modo geral na técnica. Vide, por exemplo, Z. Li, H.M. Schumacher, et al. (2010) J. Biotechnol. 145(1): 9-16; Y. Chen, K. Perumal, et al. (2000) Gene Expr. 9(3):133-143; T.D. Dinkova, H. Zepeda, et al. (2005) Plant J. 41(5): 722-731; Y.L. Dorokhov, M.V. Skulachev, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99(8): 5301-5306; O. Fernandez-Miragall e C. Hernandez (2011) PLoS One 6(7): e22617; E. Groppelli, G.J. Belsham, et al. (2007) J. Gen. Virol. 88(Pt 5): 1583-1588; S.H. Ha, Y.S. Liang, et al. (2010) Plant Biotechnol J. 8(8): 928-938; A. Karetnikov e K. Lehto (2007) J. Gen. Virol. 88(Pt 1): 286-297; A. Karetnikov e K. Lehto (2008) Virology 371(2): 292-308; M.A. Khan, H. Yumak, et al. (2009) J. Biol. Chem. 284(51): 35461-35470; e D.C. Koh, S.M. Wong, et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(23): 20565-20573, cujos conteúdos são por este incorporados por meio de referência em suas totalidades. Constructos de expressão de multi-genes contendo inteínas modificadas foram revelados nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 7.026.526 e 7.741.530, bem como no Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2008/0115243.

[00130] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão "marcador selecionável"ou "gene marcador selecionável"se refere a um gene que é opcionalmente usado na transformação de planta de modo a, por exemplo, proteger as células das plantas contra um agente seletivo ou de modo a proporcionar resistência/tolerância para um agente seletivo. Somente as células ou plantas que recebem um marcador selecionável funcional são capazes de dividir ou crescer sob condições tendo um agente seletivo. Exemplos de agentes seletivos podem incluir, por exemplo, antibióticos, incluindo espectinomicina, neomicina, canamicina, paromomicina, gentamicina, e higromicina. Estes marcadores selecionáveis incluem gene para neomicina fosfotransferase (npt II), o qual expressa uma enzima que confere resistência para o antibiótico canamicina, e genes para os antibióticos relacionados neomicina, paromomicina, gentamicina, e G418, ou o gene para higromicina fosfotransferase (hpt), o qual expressa uma enzima que confere resistência para higromicina. Outros genes marcadores selecionáveis podem incluir genes codificando resistência para herbicida incluindo Bar (resistência contra BASTA® (amônio glufosinato), ou fosfinotricina (PPT)), acetolactato sintase (ALS, resistência contra inibidores tais como sulfonilureias (SUs), imidazolinonas (IMIs), triazolopirimidinas (TPs), pirimidinil oxibenzoatos (POBs), e sulfonilamino carbonil triazolinonas que previnem a primeira etapa na síntese dos aminoácidos de cadeia ramificada), glifosato, 2,4-D, e resistência ou sensibilidade para metal. A expressão "marcador-positivas" se refere a plantas que tenham sido transformadas de modo a incluir o gene marcador selecionável.

[00131] Vários marcadores selecionáveis ou marcadores detectáveis podem ser incorporados no vetor de expressão escolhido de modo a permitir a identificação e a seleção de plantas transformadas, ou transformantes. Muitos métodos estão disponíveis para confirmar a expressão de marcadores de seleção em plantas transformadas, incluindo por exemplo sequenciamento de DNA e PCR (reação de cadeia polimerase), Southern blotting, RNA blotting, métodos imunológicos para detecção de uma proteína expressada a partir do vetor, por exemplo, proteína precipitada que media resistência para fosfinotricina, ou outras proteínas tais como genes reporter β-glucuronidase (GUS), luciferase, proteína fluorescente verde (GFP), DsRed, β-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), fosfatase alcalina, e semelhantes (vide Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001).

[00132] Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Genes marcadores selecionáveis incluem genes codificando resistência a antibióticos, tais como os genes codificando neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT) bem como genes que conferem resistência para compostos herbicidas. Genes de resistência para herbicida geralmente codificam para uma proteína alvo modificada insensível ao herbicida ou para uma enzima que degrada ou detoxifica o herbicida na planta antes de poder agir. Por exemplo, resistência ao glifosato ou foi obtida usando genes codificando para as enzimas alvo mutantes, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS). Genes e mutantes para a EPSPS foram revelados nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.940.835, 5.188.642, 5.310.667, 5.633.435, 5.633.448, e 6.566.587. Resistência para o amônio glufosinato, para o bromoxinila, e para o 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) foi obtida usando genes bacterianos codificando fosfinotricina acetiltransferase, uma nitrilase, ou uma 2,4-diclorofenoxiacetato monooxigenase, a qual detoxifica os respectivos herbicidas. Enzimas/genes para resistência/tolerância para o glufosinato foram descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.273.894, 5.276.268, 5.550.318, e 5.561.236. Enzimas/genes para resistência para o 2,4-D foram revelados previamente nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.100.446 e 6.153.401, bem como no pedido de patente dos Estados Unidos No. US 2009/0093366 e no pedido de patente internacional No. WO 2007/053482. Enzimas/genes para nitrilase foram descritos previamente nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.810.648.

[00133] Outros herbicidas podem inibir o ponto de crescimento ou meristema, incluindo imidazolinona ou sulfonilureia, e genes para resistência/tolerância de acetohidroxiácido sintase (AHAS) e acetolactato sintase (ALS) para estes herbicidas foram descritos. Genes e mutantes para AHAS e mutantes foram descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.761.373, 5.304.732, 5.331.107, 5.853.973, e 5.928.937. Genes e mutantes para ALS foram descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.013.659 e 5.141.870.

[00134] Genes de resistência para o glifosato incluem genes de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPs) mutante (através da introdução de ácidos nucléicos recombinantes e/ou várias formas de mutagênese in vivo de genes de EPSPs nativos), genes aroA e genes de glifosato acetil transferase (GAT), respectivamente). Genes de resistência para outros compostos fosfono incluem glufosinato (genes de fosfinotricina acetil transferase (PAT) de espécies de Streptomyces, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes), e ácidos piridinóxi ou fenóxi propriônicos e ciclo- hexonas (genes codificando inibidores de ACCase). Genes de resistência/tolerância para herbicida de acetil coemzima A carboxilase (ACCase) foram descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.162.602 e 5.498.544.

[00135] Uma molécula de DNA codificando um gene aroA mutante pode ser obtoda sob o número de acesso da ATCC 39256, e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é descrita na Patente dos Estados Unidos No. 4.769.061 para Comai, no pedido de patente Europeia No. 0 333 033 para Kumada et al., e na Patente dos Estados Unidos No. 4.975.374 para Goodman et al., descrevendo sequências de nucleotídeos de genes de glutamina sintetase os quais conferem resistência a herbicidas tais como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene PAT é proporcionada no pedido de patente Europeia No. 0 242 246 para Leemans et al. Além disso DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989), descreve a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos codificando para atividade de PAT. Exemplos de genes que conferem resistência a ácidos fenóxi propriônicos e ciclo-hexonas, incluindo setoxidim e haloxifop, são os genes Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3 descritos por Marshall et al., Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992). Genes GAT capazes de conferir resistência ao glifosato são descritos no pedido de patente internacional No. WO 2005012515 para Castle et al. Genes que conferem resistência aos herbicidas 2,4-D, fop e piridilóxi auxina são descritos no pedido de patente internacional No. WO 2005107437 e no pedido de patente dos Estados Unidos Ser. No. 11/587.893.

[00136] Outros herbicidas podem inibir a fotossíntese, incluindo triazina (genes psbA e 1s+) ou benzonitrila (gene de nitrilase). Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991), descreve a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos codificando genes psbA mutantes. Sequências de nucleotídeos para genes de nitrilase são reveladas na Patente dos Estados Unidos No. 4.810.648 para Stalker, e moléculas de DNA contendo estes genes estão disponíveis sob os Nos. de Acesso da ATCC 53435, 67441, e 67442. A clonagem e a expressão de DNA codificando para uma glutationa S-transferase são descritas por Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992).

[00137] Para os fins da presente invenção, genes marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a genes codificando: neomicina fosfotransferase II (Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1-25); cianamida hidratase (Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4250-4264); aspartato quinase; di-hidrodipicolinato sintase (Perl et al. (1993) Bio/Technology 11:715-718); triptofano descarboxilase (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Bio. 22:907-912); di-hidrodipicolinato sintase e aspartato quinase dessensibilizada (Perl et al. (1993) Bio/Technology 11:715-718); gene bar (Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100:1503-1507; e Meagher et al. (1996), Crop Sci. 36:1367); triptofano descarboxilase (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:907-912); neomicina fosfotransferase (NEO) (Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327; higromicina fosfotransferase (HPT ou HYG) (Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol. 6:1074); di-hidrofolato redutase (DHFR) (Kwok et al. (1986) PNAS USA 4552); fosfinotricina acetiltransferase (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513); ácido 2,2-dicloropropiônico dehalogenase (Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); acetohidroxiácido sintase (Anderson et al., Patente dos Estados Unidos No. 4.761.373; Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-enolpiruvil-shikimato-fosfato sintase (aroA) (Comai et al. (1985) Nature 317:741); haloarilnitrilase (Stalker et al., publicação do pedido de patente internacional No. WO87/04181); acetil-coenzima A carboxilase (Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220); di- hidropteroato sintase (sul I) (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127); e polipeptídeo fotossistema II de 32 kD (psbA) (Hirschberg et al. (1983) Science 222:1346).

[00138] Também são incluídos genes codificando resistência a: cloranfenicol (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol Bio. 16:807-820 (1991); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219-227; e Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807-820); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio. 15:127-136); bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); 2,4-D (Streber et al. (1989) Bio/Technology 7:811-816); glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481); e fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518).

[00139] A lista acima de genes reporter e marcadores selecionáveis não tem a intenção de ser limitante. Quaisquer genes reporter ou marcadores selecionáveis são englobados pela presente invenção. Caso necessário, os genes referidos podem ser sequenciados por métodos conhecidos na técnica.

[00140] Os genes reporter e marcadores selecionáveis são sintetizados para ótima expressão na planta. Isto é, a sequência codificante do gene foi modificada para aumentar a expressão em plantas. O gene marcador sintético é projetado para ser expressado em plantas em um maior nível resultando em maior eficiência da transformação. Métodos para otimização sintético de genes estão disponíveis na técnica. De fato, vários genes têm sido otimizados para aumentar a expressão do produto genético em plantas.

[00141] A sequência de gene marcador pode ser otimizada para expressão em uma espécie de planta em particular ou alternativamente pode ser modificada para ótima expressão em famílias de plantas. Os códons preferenciais da planta podem ser determinados a partir dos códons de frequência mais alta nas proteínas expressadas na maior quantidade nas espécies de planta em particular de interesse. Vide, por exemplo, o pedido de patente europeia No. EPA 0359472; o pedido de patente europeia No. EPA 0385962; o pedido de patente internacional No. WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research 17: 477-498; a Patente dos Estados Unidos No. 5.380.831; e a Patente dos Estados Unidos No. 5.436.391. Desta maneira, as sequências de nucleotídeos podem ser otimizadas para expressão em qualquer planta. É reconhecido que toda ou qualquer parte da sequência genética pode ser otimizada ou sintética. Isto é, também podem ser usadas sequências totalmente otimizadas ou parcialmente otimizadas.

[00142] Genes que Conferem Resistência a um Herbicida:

[00143] Resistência/tolerância da acetohidroxiácido sintase (AHAS) e da acetolactate sintase (ALS) contra os herbicidas imidazolinona ou sulfonilureia. Genes e mutantes para AHAS e mutantes foram revelados nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.761.373, 5.304.732, 5.331.107, 5.853.973, e 5.928.937. Genes e mutantes para ALS foram descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.013.659 e 5.141. 870.

[00144] Genes para resistência/tolerância para acetil coenzima A carboxilase (ACCase) contra os herbicidas ciclo-hexanodionas e/ou ácido ariloxifenoxipropanoico (incluindo Haloxyfop, Diclofop, Fenoxyprop, Fluazifop, Quizalofop) foram descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.162.602 e 5.498.544.

[00145] Genes para resistência/tolerância para glifosato. Gene de 5-enolpiruvil -3-fosfoshikimato sintase (ES3P sintase) foi descrito na Patente dos Estados Unidos No. 4.769.601. Genes de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) e mutantes foram descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.940.835. 5.188.642. 5.310.667. 5.633.435. 5.633.448. e 6.566.587.

[00146] Genes para resistência/tolerância para o glufosinato (bialafos, fosfinotricina (PPT)). Gene para fosfinotricina acetiltransferase (Pat) foi descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.273.894. 5.276.268. e 5.550.318; e gene para resistência para o bialafos (Bar) foi descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.561.236 e 5.646.024. 5.648.477. e 7.112.665. Gene para glutamina sintetase (GS) foi descrito na Patente dos Estados Unidos No. 4.975.372 e no pedido de patente Europeia No. EP 0333033 A1.

[00147] Genes de resistência/tolerância de hidróxi fenil piruvato dioxigenase (HPPD) contra os herbicidas isoxazol, dicetonitrilos, e/ou tricetonas incluindo sulcotriona e mesotriona foram descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.268.549 e 6.069.115.

[00148] Genes para resistência/tolerância para 2,4-D. Gene de 2,4-D-monooxigenase foi descrito na Patente dos Estados Unidos No. 6.100.446 e na Patente dos Estados Unidos No. 6.153.401. Genes adicionais para resistência/tolerância para 2,4-D são descritos no pedido de patente dos Estados Unidos No. US 2009/0093366 e no pedido de patente internacional No. WO 2007/053482.

[00149] Gene de imidazolglicerol fosfato desidratase (IGPD) contra os herbicidas imidazol e/ou triazol foi descrito na Patente dos Estados Unidos No. 5.541.310. Genes de enzimas de degradação de Dicamba (oxigenase, ferredoxina, e redutase) contra o herbicida Dicamba foram descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 7.022.896 e 7.105.724.

[00150] Genes para herbicidas que inibem a fotossíntese, incluindo triazina (genes psbA e 1s+) ou um benzonitrila (gene de nitrilase). Vide, por exemplo, Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991) descrevendo a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos codificando genes psbA mutantes. Sequências de nucleotídeos para genes de nitrilase são descritas na Patente dos Estados Unidos No. 4.810.648 e moléculas de DNA contendo estes genes estão disponíveis sob os Nos. de Acesso na ATCC 53435, 67441, e 67442. Clonagem e expressão de DNA codificante para uma glutationa S-transferase é descrita por Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992).

[00151] A menos que especificamente explicado de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, neste pedido de patente, têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles com conhecimento regular na técnica à qual esta descrição pertence. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo: Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[00152] Esta descrição proporciona moléculas de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos sintética que pode funcionar como um promotor bidirecional. Em algumas modalidades, um promotor bidirecional sintético pode ser ligado operavelmente a uma ou duas sequências de nucleotídeos de interesse. Por exemplo, um promotor bidirecional sintético pode ser ligado operavelmente a uma ou duas sequências de nucleotídeos de interesse (por exemplo, dois genes, um sobre cada extremidade do promotor), de modo a regular a transcrição de no mínimo uma (por exemplo, uma ou ambas) das sequências de nucleotídeos de interesse. Por incorporação de uma URS a partir de um promotor do SCBV no promotor bidirecional sintético, podem ser obtidos padrões particulares de expressão e reguladores (por exemplo, tais como são apresentados por genes sob o controle do promotor do SCBV) com respeito a uma sequência de nucleotídeos de interesse que é ligada operavelmente ao promotor bidirecional sintético.

[00153] Algumas modalidades da invenção são exemplificadas aqui, neste pedido de patente, por incorporação de um elemento promotor de núcleo mínimo de um promotor genético de ubiquitina-1 de milho unidirecional (ZmUbi1) em um contexto molecular diferente daquele do promotor nativo para manipular um promotor bidirecional sintético. Este elemento promotor de núcleo mínimo é referido aqui, neste pedido de patente, como "minUbi1P," e tem aproximadamente 200 nt de comprimento. O sequenciamento e a análise de elementos minUbi1P de múltiplos genótipos de espécies Zea e de Z. mays revelou que elementos minUbi1P funcionais são altamente conservados, de tal modo que um elemento minUbi1P pode preservar sua função como um iniciador de transcrição se compartilhar, por exemplo, no mínimo cerca de 75%; no mínimo cerca de 80%; no mínimo cerca de 85%; no mínimo cerca de 90%; no mínimo cerca de 91%; no mínimo cerca de 92%; no mínimo cerca de 93%; no mínimo cerca de 94%; no mínimo cerca de 95%; no mínimo cerca de 96%; no mínimo cerca de 97%; no mínimo cerca de 98%; no mínimo cerca de 99%; e/ou no mínimo cerca de 100% de identidade de sequência com o elemento minUbi1P de SEQ ID NO:1. Características de elementos minUbi1P que podem ser úteis em algumas modalidades da invenção podem incluir, por exemplo e sem limitação, a alta conservação de sequência de nucleotídeos mencionada acima; a presença de no mínimo uma TATA box; e/ou a presença de no mínimo um (por exemplo, dois) elemento(s) de consenso de choque térmico. Em particular elementos minUbi1P, mais de um elementos de consenso de choque térmico podem estar em sobreposição dentro da sequência do minUbi1P.

[00154] Em algumas modalidades, o processo de incorporação de um elemento minUbi1P em um contexto molecular diferente do contexto de um promotor nativo para manipular um promotor bidirecional sintético pode compreender a incorporação do elemento minUbi1P em um promotor do SCBV ácido nucléico, enquanto revertendo a orientação do elemento minUbi1P com respeito à sequência remanescente do promotor do SCBV. Deste modo, um promotor bidirecional do SCBV sintético pode compreender um elemento minUbilP de promotor de núcleo mínimo localizado 3‘ de, e em orientação reversa com respeito a, uma sequência de nucleotídeos de promotor do SCBV, de tal modo que pode ser ligado operavelmente a uma sequência de nucleotídeos de interesse localizada 3‘ da sequência de nucleotídeos do promotor do SCBV. Por exemplo, o elemento minUbilP pode ser incorporado na extremidade 3‘ de um promotor do SCBV em orientação reversa.

[00155] Um promotor do SCBV bidirecional sintético também pode compreender um ou mais elementos adicionais de sequência além de um elemento minUbi1P e elementos de um promotor do SCBV nativo. Em algumas modalidades, um promotor do SCBV bidirecional sintético pode compreender um promotor URS; um éxon (por exemplo, um peptídeo lider ou de sinal); um íntron; uma sequência de espaçador; e ou combinações de um ou mais de qualquer um dos precedentes. Por exemplo e sem limitação, um promotor do SCBV bidirecional sintético pode compreender uma sequência de URS de um promotor do SCBV; um íntron de um gene de ADH; um éxon codificando um peptídeo lider de um gene Ubi1; um íntron de um gene Ubi1; e combinações destes.

[00156] Em alguns dos exemplos compreendendo um promotor do SCBV bidirecional sintético compreendendo um promotor URS, o URS pode ser selecionado de modo a conferir propriedades reguladoras particulares sobre o promotor sintético. Os promotores conhecidos variam amplamente no tipo de controle que exercem sobre genes operavelmente ligados (por exemplo, respostas ambientais, sinais de desenvolvimento, e informação espacial), e um URS incorporado em um promotor heterólogo tipicamente mantém o tipo de controle que o URS apresenta com respeito a seu promotor nativo e um ou mais genes ligados operavelmente. Langridge et al. (1989), supra. Exemplos de promotores eucarióticos que foram caracterizados e podem conter um URS compreendido dentro de um promotor de Ubi1 bidirecional sintético de acordo com algumas modalidades incluem, por exemplo e sem limitação: os promotores descritos nas Patentes dos Estados Unidos No. 6.437.217 (promotor RS81 do milho); No. 5.641.876 (promotor de actina do arroz); No. 6.426.446 (promotor RS324 do milho); No. 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); No. 6.232.526 (promotor A3 do milho); No. 6.177.611 (promotores do milho constitutivos); No. 6.433.252 (promotor de L3 oleosina do milho); No. 6.429.357 (promotor de actina 2 do arroz. e íntron de actina 2 do arroz); No. 5.837.848 (root-específica promotor); No. 6.294.714 (promotores indutíveis por luz); No. 6.140.078 (promotores indutíveis por sal); No. 6.252.138 (promotores indutíveis por patógeno); No. 6.175.060 (promotores indutíveis por deficiência de fósforo); No. 6.388.170 (promotores bidirecionais); No. 6.635.806 (promotor de gama-coixina); e no Pedido de Patente dos Estados Unidos Serial No. 09/757.089 (promotor de aldolase de cloroplasto do milho).

[00157] Exemplos adicionais de promotores procarióticos incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); o promotor da octopina sintase (OCS) (o qual é carregado sobre plasmídeos indutores de tumor do Agrobacterium tumefaciens); os promotores do caulimovirus tais como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve flor (CaMV) (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2; o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); o promotor da sacarose sintase (Yang e Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); o promotor do complexo genético R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); CaMV35S (Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.322.938. 5.352.605. 5.359.142. e 5.530.196); FMV35S (Patente dos Estados Unidos No. 6.051.753. e 5.378.619); um promotor do PC1SV (Patente dos Estados Unidos No. 5.850.019); o promotor do SCP1 (Patente dos Estados Unidos No. 6.677.503); e promotores AGRtu.nos (GenBank Acesso No. V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7), e semelhantes.

[00158] Em algumas modalidades, um promotor do SCBV bidirecional sintético pode compreender adicionalmente um éxon. Por exemplo, em exemplos pode ser desejável ter por alvo ou tráfego um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos de interesse ligada operavelmente ao promotor em uma localização e/ou em um compartimento subcelular em particular. Nestas e em outras modalidades, uma sequência codificante (íxon) pode ser incorporada em uma molécula de ácido nucléico entre a sequência do promotor do SCBV bidirecional sintético remanescente e uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo. Estes elementos podem ser dispostos de acordo com o critério do clínico versado de tal modo que o promotor do SCBV bidirecional sintético estimule a expressão de um polipeptídeo (ou uma ou ambas de duas sequências codificantes de polipeptídeo que são ligadas operavelmente ao promotor) compreendendo o peptídeo codificado pela sequência codificante incorporada em uma relação funcional com o restante do polipeptídeo. Em exemplos particulares, pode ser incorporado um éxon codificando um peptídeo líder, de trânsito, ou de sinal (por exemplo, um peptídeo líder Ubi1).

[00159] Peptídeos que podem ser codificados por um éxon incorporado em um promotor de Ubi1 bidirecional sintético incluem, por exemplo e sem limitação: um peptídeo líder de Ubiquitina (por exemplo, Ubi1); um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP) (por exemplo, o CTP de EPSPS da A. thaliana (Klee et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:437-42), e o CTP de EPSPS da Petunia hybrida (della-Cioppa et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-7)), conforme exemplificado pelo cloroplasto tendo por alvo a dicamba monooxigenase (DMO) na Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2008/105890.

[00160] Íntrons também podem ser incorporados em um promotor do SCBV bidirecional sintético em algumas modalidades da invenção, por exemplo, entre a sequência do promotor do SCBV bidirecional sintético remanescente e uma sequência de nucleotídeos de interesse que é ligada operavelmente ao promotor. Em alguns exemplos, um íntron incorporado em um promotor do SCBV bidirecional sintético pode ser, sem limitação, uma 5‘ UTR que funciona como uma sequência líder de translação que está presente em um mRNA totalmente processado a montante da sequência de iniciação de translação (uma sequência líder de translação semelhante pode afetar o processamento de um transcripto primário para mRNA, estabilidade de mRNA, e/ou eficiência de translação). Exemplos de sequências líder de translação incluem líderes de proteína do choque térmico do milho e da petúnia (Patente dos Estados Unidos No. 5.362.865), líderes de proteínas da capa viral de plantas, líderes da planta rubisco, e outras. Vide, por exemplo, Turner e Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitantes de 5‘ UTRs incluem GmHsp (Patente dos Estados Unidos No. 5.659.122); PhDnaK (Patente dos Estados Unidos No. 5.362.865); AtAnt1; TEV (Carrington e Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (GenBank Acesso No. V00087; e Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7). Em exemplos particulares, um ou mais íntrons de Ubi1 e/ou de ADH podem ser incorporados em um promotor do SCBV bidirecional sintético.

[00161] Sequências adicionais que podem ser opcionalmente incorporadas em um promotor do SCBV bidirecional sintético incluem, por exemplo e sem limitação: sequências não traduzidas 3'; regiões de terminação de transcrição 3\ e regiões de poliadenilação. Estas são elementos genéticos localizados a jusante de uma sequência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, uma sequência de interesse que é ligada operavelmente a um promotor do SCBV bidirecional sintético), e incluem polinucleotídeos que proporcionam sinal de poliadenilação, e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição, o processamento de mRNA, ou a expressão genética. Um sinal de poliadenilação pdoe funcionar em plantas provocando a adição de nucleotídeos poliadenilato à extremidade 3‘ de um precursor do mRNA. A sequência de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de genes de plantas, ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitante de uma região de terminação de transcrição 3‘ é a região 3‘ da nopalina sintase (nos 3\ Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7). Um exemplo da utilização de diferentes regiões não traduzidas 3‘ é proporcionado em Ingelbrecht et al. (1989), Plant Cell 1:671-80. Exemplos não limitantes de sinais de poliadenilação incluem um de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (GenBank Acesso No. E01312).

[00162] Em algumas modalidades, um promotor do SCBV bidirecional sintético compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos que facilitam o direcionamento de um ácido nucléico compreendendo o promotor para um lócus em particular no genoma de um organismo-alvo. Por exemplo, podem ser incluídas uma ou mais sequências que são homólogas a segmentos da sequência de DNA genômico no hospedeiro (por exemplo, sequências de DNA genômico raras ou únicas\). Em alguns exemplos, estas sequências homólogas podeom guiar a recombinação e a integração de um ácido nucléico compreendendo um promotor do SCBV bidirecional sintético no sítio do DNA homólogo no genoma do hospedeiro. Em exemplos particulares, um promotor do SCBV bidirecional sintético compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos que facilitam o direcionamento de um ácido nucléico compreendendo o promotor para uma localização rara ou única em um genoma do hospedeiro utilizando enzimas nuclease manipuladas que reconhecem, sequenciam na localização rara ou única e facilitam a integração nesta localização rara ou única. Um sistema de integração direcionado semelhante empregando endonucleases de dedo de zinco como a enzima nuclease é descrito no Pedido de patente dos Estados Unidos No. 13/011.735.

[00163] Ácidos nucléicos compreendendo um promotor do SCBV bidirecional sintético podem ser produzidos usando qualquer técnica conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, e sem limitação: RCA; amplificação por PCR; amplificação por RT-PCR; OLA; e SNuPE. Estas e outras técnicas equivalentes são conhecidas de modo geral das pessoas versadas na técnica, e são adicionalmente descritas em detalhes em, por exemplo e sem limitação: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdEd., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001; e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1998.

[00164] Liberação e/ou transformação: A presente descrição também proporciona métodos para transformar uma célula com uma molécula de ácido nucléico compreendendo um promotor do SCBV bidirecional sintético. Qualquer um do grande número de técnicas conhecidas na técnica para introdução de moléculas de ácido nucléico em plantas pode ser usado para transformar uma planta com uma molécula de ácido nucléico compreendendo um promotor do SCBV bidirecional sintético de acordo com algumas modalidades, por exemplo, para introduzir um ou mais promotores de SCBV bidirecionais sintéticos no genoma da planta hospedeira, e/ou para introduzir adicionalmente uma ou mais moléculas de ácido nucléico de interesse ligadas operavelmente ao promotor.

[00165] Métodos adequados para a transformação de plantas incluem qualquer método pelo qual DNA pode ser introduzido em uma célula, por exemplo e sem limitação: eletroporação (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 5.384.253); bombardeamento de microprojéteis (vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861, e 6.403.865); transformação mediada por Agrobacterium (vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.635.055, 5.824.877, 5.591.616; 5,981.840, e 6.384.301); e transformação de protoplasts (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 5,508,184). Através da aplicação de técnicas tais como as precedentes, as células de virtualmente quaisquer espécies de plantas podem ser transformadas de modo estável, e estas células podem ser desenvolvidas em plantas transgênicas por meio de técnicas conhecidas das pessoas versadas na técnica. Por exemplo, técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto da transformação do algodão são descritas nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.846.797, 5.159.135, 5.004.863, e 6.624.344; técnicas para a transformação de plantas brássicas em particular são descritas, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. 5.750.871; técnicas para a transformação de soja são descritas, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. 6.384.301; e técnicas para a transformação do milho são descritas, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 7.060.876 e 5.591.616, e na Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 95/06722.

[00166] Depois de efetura a liberação de um ácido nucléico exógeno para uma célula receptora, a célula transformada é geralmente identificada para posterior cultura e regeneração da planta. De modo a aprimorar a capacidade de identificar transformantes, pode-se desejar empregar um gene marcador selecionável ou triável com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. Neste caso, a população celular potencialmente transformada pode ser avaliada expondo as células a um agente ou agentes seletivos, ou as células podem ser triadas para o traço do gene marcador desejado.

[00167] Células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que tenham sido classificadas positivas em um teste de triagem, podem ser cultivadas em meio que suporta a regeneração de plantas. Em algumas modalidades, quaisquer meios de cultura de tecidos de plantas adequado (por exemplo, meios MS e N6) podem ser modificados incluindo substâncias adicionais, tais como reguladores do crescimento. O tecido pode ser mantido sobre um meio básico com reguladores do crescimento até estar disponível tecido suficiente para iniciar os esforços de regeneração da planta, ou depois de repetidas rodadas de seleção manual, até a morfologia do tecido ser adequada para regeneração (por exemplo, no mínimo 2 semanas), em seguida transferido para meios favoráveis para a formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até ter ocorrido formação de brotos suficiente. Uma vez que os brotos são formados, são transferidos para meios favoráveis para a formação de raízes. Uma vez que brotos suficientes são formados, as plantas podem ser transferidas para o solo para posterior crescimento e maturidade.

[00168] De modo a confirmar a presença da molécula de ácido nucléico desejada compreendendo um promotor do SCBV bidirecional sintético nas plantas em regeneração, podem ser realizados uma variedade de testes. Os testes referidos incluem, por exemplo: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e Northern blotting e PCR; ensaios bioquímicos, tais como detecção da presença de um produto protéico, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e/ou Western blots) ou por função enzimática; testes de partes das plantas, tais como testes de folhas ou raízes; e análise do fenótipo da planta regenerada inteira.

[00169] Eventos de integração direcionados podem ser triados, por exemplo, por amplificação por PCR usando, por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeos específicos para moléculas de ácido nucléico de interesse. Entende-se que genotipagem por PCR inclui, mas não está limitada a, amplificação, por reação de cadeia polimerase (PCR), de DNA genômico derivado de tecido de calo da planta hospedeira isolada previsto para conter uma molécula de ácido nucléico de interesse integrada no genoma, seguida por clonagem de rotina e análise de sequência dos produtos de amplificação por PCR. Métodos de genotipagem por PCR foram descritos de modo geral (vide, por exemplo, Rios et al. (2002), Plant J. 32:243-53), e podem ser aplicados a DNA genômico derivado de qualquer espécie de planta ou tipo de tecido, incluindo culturas celulares. Combinações de iniciadores de oligonucleotídeos que ligam tanto à sequência-alvo quanto à sequência introduzida podem ser usados sequencialmente ou multiplexados em reações de amplificação por PCR. Podem ser produzidos iniciadores de oligonucleotídeos designados para anelar ao sítio-alvo, sequências de ácido nucléico introduzidas, e/ou combinações dos dois. Deste modo, estratégias de genotipagem por PCR podem incluir, por exemplo e sem limitação: a amplificação de sequências específicas no genoma da planta; a amplificação de múltiplas sequências específicas no genoma da planta; a amplificação de sequências inespecíficas no genoma da planta; e combinações de quaisquer dos precedentes. Uma pessoa versada na técnica pode conceber combinações adicionais de iniciadores e reações de amplificação para interrogar o genoma. Por exemplo, uma série de iniciadores de oligonucleotídeos dianteiro e reverso podem ser projetados para anelar a uma ou mais sequências de ácido nucléico específicas para o alvo fora dos limites da sequência de ácido nucléico introduzida.

[00170] Iniciadores de oligonucleotídeos dianteiros e reverso podem ser projetados para anelar especificamente a uma molécula de ácido nucléico introduzida, por exemplo, em uma sequência correspondente a uma região codificante dentro de uma sequência de nucleotídeos de interesse compreendida na mesma, ou outras partes da molécula de ácido nucléico. Estes iniciadores podem ser usados em combinação com os iniciadores descritos acima. Iniciadores de oligonucleotídeos podem ser sintetizados de acordo com uma sequência desejada, e estão disponíveis comercialmente (por exemplo, na Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA). A amplificação pode ser seguida por clonagem e sequenciamento, ou por análise de sequência direta dos produtos de amplificação. Uma pessoa versada na técnica pode conceber métodos alternativos para análise dos produtos de amplificação gerados durante a genotipagem por PCR. Em uma modalidade, iniciadores de oligonucleotídeos específicos para o gene- alvo são empregados em amplificações por PCR.

[00171] Algumas modalidades da presente invenção também proporcionam células compreendendo um promotor do SCBV bidirecional sintético, por exemplo, conforme pode estar presente em um constructo de ácido nucléico. Em exemplos particulares, um promotor do SCBV bidirecional sintético de acordo com algumas modalidades pode ser utilizado como uma sequência reguladora para regular a expressão de transgenes em células de plantas e em plantas. Em alguns exemplos semelhantes, a utilização de um promotor do SCBV bidirecional sintético ligado operavelmente a uma sequência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, um transgene) pode reduzir um número de promotores homólogos necessários para regular a expressão de um dado número de sequências de nucleotídeos de interesse, e/ou para reduzir o tamanho do um ou mais constructos de ácido nucléico requeridos para introduzir um dado número de sequências de nucleotídeos de interesse. Além disso, a utilização de um promotor do SCBV bidirecional sintético pode permitir a coexpressão de duas sequências de nucleotídeos ligadas operavelmente de interesse sob as mesmas condições (isto é, as condições sob as quais o promotor do SCBV é ativo). Os exemplos referidos podem ser particularmente úteis, por exemplo, quando as duas sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente contribuem cada uma para um único traço em um hospedeiro transgênico compreendendo as sequências de nucleotídeos de interesse, e a coexpressão das sequências de nucleotídeos de interesse impacta vantajosamente a expressão do traço no hospedeiro transgênico.

[00172] Em algumas modalidades, uma planta transgênica compreendendo um ou mais promotores de SCBV bidirecionais sintéticos e/ou uma ou mais sequências de nucleotídeos de interesse pode ter um ou mais traços desejáveis conferidos (por exemplo, introduzidos, reforçados, ou contribuídos) por expressão da uma ou mais sequências de nucleotídeos de interesse na planta. Os traços referidos podem incluir, por exemplo e sem limitação: resistência a insetos, pragas diversas, e agentes causadores de doença; tolerâncias a herbicidas; aumentada estabilidade, produção, ou vida útil; tolerâncias ambientais; produção farmacêutica; produção de produto industrial; e reforços nutricionais. Em alguns exemplos, um traço desejável pode ser conferido por transformação de uma planta com uma molécula de ácido nucléico compreendendo um promotor do SCBV bidirecional sintético ligado operavelmente a uma sequência de nucleotídeos de interesse. Em alguns exemplos, um traço desejável pode ser conferido a uma planta produzida como uma planta da progênie através de reprodução, cujo traço pode ser conferido por uma ou mais sequências de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente a um promotor do SCBV bidirecional sintético que é/são passadas para a planta a partir de uma planta mãe compreendendo uma sequência de nucleotídeos de interesse ligada operavelmente a um promotor do SCBV bidirecional sintético.

[00173] Uma planta transgênica de acordo com algumas modalidades pode ser qualquer planta capaz de ser transformada com uma molécula de ácido nucléico da invenção, ou de ser produzida com uma planta transformada com uma molécula de ácido nucléico da invenção. Por conseguinte, a planta pode ser uma dicotiledônea ou uma monocotiledônea. Exemplos não limitantes de plantas dicotiledôneas para utilização em alguns exemplos incluem: alfalfa; feijões; brócolis; repolho; canola, cenoura; couve flor; salsão; repolho chinês; algodão; pepino; berinjela; alface; melão; ervilha; pimentão; amendoim; batata; abóbora; rabanete; colza; espinafre; soja; abóbora; beterraba sacarina; girassol; tabaco; tomate; e melancia. Exemplos não limitantes de plantas monocotiledôneas para utilização em alguns exemplos incluem: milho; cebola; arroz; sorgo; trigo; centeio; milheto; cana de açúcar; aveia; triticale; switchgrass; e turfgrass.

[00174] Em algumas modalidades, uma planta transgênica pode ser usada ou cultivada de qualquer maneira, em que é desejável a presença de um promotor do SCBV bidirecional sintético e/ou uma sequência de nucleotídeos ligada operavelmente de interesse. Por conseguinte, as plantas transgênicas referidas podem ser manipuladas para, entre outros, ter um ou mais traços desejados, sendo transformadas com moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção, e podem ser semeadas e/ou cultivadas por qualquer método conhecido pelas pessoas versadas na técnica.

[00175] Apesar da invenção ter sido descrita com referência a métodos e modalidades específicos, será reconhecido que várias modificações e alterações podem ser feitas sem se afastar da invenção.

[00176] Os exemplos que se seguem são proporcionados para ilustrar algumas características particulares e/ou modalidades. Os exemplos não devem ser considerados como limitando a descrição das características particulares ou modalidades exemplificadas.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Transformação e Expressão

[00177] Transformação de Agrobacterium tumefaciens: O vetor binário pDAB108706 é transformado em Agrobacterium tumefaciens cepa DAt13192 ternária (Patente Provisória dos Estados Unidos. No. 61/368965). Colônias bacterianas são isoladas e DNA de plasmídeo binário é isolado e confirmado através de digestão por enzima de restrição.

[00178] Transformação de Milho: Espiga Esterilização e Embrião Isolamento. De modo a obter embriões imaturos de milho, plantas de Zea mays (c.v. B104) são cultivadas na estura e auto ou sib-polinizadas para produzir espigas. As espigas são colhidas aproximadamente 9 a 12 dias pós-polinização. No dia do experimento, as espigas são esterilizadas superficialmente por imersão em uma solução a 20% de alvejante doméstico, a qual contém 5% de hipoclorito de sódio, e agitadas por 20 a 30 minutos, seguida por três enxágues em água estéril. Depois de esterilização, embriões zigóticos imaturos (1,5 a 2,2 mm) são dissecados asseticamente de cada espiga e distribuídos aleatoriamente em tubos de micro-centrífuga contendo meios de infecção líquidos (meio basal LS (LS Basal Medium), 4,43 gm/L; Solução de Vitamina N6 [1000X], 1,00 mL/L; L-prolina, 700,0 mg/L; sacarose, 68,5 gm/L; glicose, 36,0 gm/L; 2,4-D, 1,50 mg/L. Para uma dada série de experimentos, embriões reunidos de 2 a 3 espigas são usados para cada tratamento.

[00179] Iniciação da Cultura de Agrobacterium: Estoques de glicerol de Agrobacterium contendo os vetores binários descritos acima são riscados sobre placas de meio mínimo AB contendo antibióticos apropriados e são cultivados a 20°C por 3 a 4 dias. Uma única colônia é selecioanda e riscada sobre placas de YEP contendo os mesmos antibióticos e foi incubada a 28°C por 1 a 2 dias.

[00180] Cultura e Cocultura de Agrobacterium: No dia do experimento, as colônias de Agrobacteriumsão retiradas da placa de YEP, suspendidas em 10 mL de meio de infecção em um tubo descartável de 50 mL, e a densidade celular é ajustada para OD600 = 0,2 a 0,4 nm usando um espectrofotômetro. As culturas de Agrobacteriumsão colocadas sobre um shaker giratório a 100 rpm, em temperatura ambiente, enquanto é realizada a dissecção dos embriões. Embriões zigóticos imaturos entre 1,5 a 2,2 mm de tamanho são isolados dos grãos de milho esterilizados e colocados em 1 mL do meio de infecção e lavados uma vez no mesmo meio. A suspensão de Agrobacterium (2 mL) é adicionada a cada tubo e os tubos são invertidos por cerca de 20 vezes e em seguida agitados por 10 a 15 minutos. Os embriões são transferidos para meio de cocultura (Sais de MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba- 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan™, 3,00 gm/L; MS-Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L, AgNθ3, 15,0 mg/L; Acetoseringona, 100 μM), orientados com o escutelo virado para cima, e incubados por 3 a 4 dias na luz a 25°C.

[00181] Expressão Transitória de GUS e de YFP/PhiYFP: Pode ser observada expressão transitória de YFP/PhiYFP e de GUS em embriões transformados e depois de 3 dias de cocultura com Agrobacterium. Os embriões são observados sob um estereomicroscópio (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) usando filtro de YFP e fonte de luz de 500 nm. Embriões apresentando expressão de YFP/PhiYFP são selecionados para teste histoquímico de GUS. Solução de coloração de GUS é preparada conforme descrito em Maniatis et al. (1989) e os embriões são incubados em 1 mL de solução por 24 horas a 37°C. Os embriões são observados para expressão transitória de GUS sob o microscópio.

[00182] Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Putativos: Depois do período de cocultura, os embriões são transferidos para meio de repouso (sais de MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 500,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan 2.30 gm/L; MS-Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250.0 mg/L) sem agente seletivo e incubados na luz por 7 dias a 28°C. Os embriões são transferidos para meio de Seleção 1 (sais de MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 500,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan™ 2,30 gm/L; MS-Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) contendo 100 nM de haloxifop e incubados em 24 horas de luz com intensidade da luz de 50 μmol m-2s-1por 7 dias a 28°C.

[00183] Embriões com calos embriogênicos proliferantes são transferidos para meio de Seleção 2 (sais de MS, 4,33 gm/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; L-prolina, 700,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 500,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan™ 2,30 gm/L; MS-Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) contendo 500 nM de haloxyfop e são incubados em 24 horas de luz com intensidade da luz de 50 μmol m-2s-1por outros 14 dias a 28°C. Esta etapa de seleção permite que o calo transgênico prolifere e diferencie mais. O período de seleção dos calos dura três semanas. Calos embriogênicos proliferantes são transferidos para meio de Regeneração 1 (sais de MS, 4,33 gm/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; L-prolina, 350,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 250,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 50,0 mg/L; NAA 0,500 mg/L; ABA 2,50 mg/L; BA 1,00 mg/L; sacarose, 45,0 gm/L; Gelzan™ 2,50 gm/L; MS-Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNo3, 1,00 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) contendo 500 nM de haloxyfop e cultivados em 24 horas de luz com intensidade da luz de 50 μmol m-2s-1por 7 dias a 28°C. Calos embriogênicos com botões semelhantes a brotos são transferidos para meio de Regeneração 2 (sais de MS, 4,33 gm/L; MS-Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; sacarose, 60,0 gm/L; Goma Gelana G434™ 3,00 gm/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) contendo 500 nM de haloxyfop. As culturas são incubadas sob 24 horas de luz com intensidade da luz de 50 μmol m-2s-1por 7 a 10 dias a 28°C. Brotos pequenos com raízes primárias são transferidos para meio de alongamento de brotos e enraizamento (sais de MS, 4,33 gm/L; MS-Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; sacarose, 60,0 gm/L; Goma Gelana G434™ 3,00 gm/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) em MAGENTA™ boxes (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e são incubados sob 16/8 horas de luz/escuridão por 7 dias a 28°C. Plântulas transgênicas putativas são analisadas para número de cópias de transgenes e transferidas para a estufa.

EXEMPLO 2: Construção de um Promotor do SCBV Bidirecional Sintético e Vetor pDAB108708

[00184] Um desenho esquemático exemplar do promotor de Ubiquitina-1 do milho (Ubi1) é mostrado na FIG. 1. Um promotor Ubi1 é clonado a partir do milho. Um plasmídeo o qual continha o promotor é amplificado por PCR usando um sistema de amplificação por PCR de alta fidelidade. Uma região de aproximadamente 200 nt do promotor Ubi1 do milho é identificada como um promotor de núcleo mínimo de Ubi1 de Zea mays (minUbi1P) (SEQ ID NO: 1). O minUbi1P de SEQ ID NO: 1 é em seguida adicionado a um polinucleotídeo compreendendo um éxon de Ubiquitina-1 de Zea mays (éxon ZmUbi1) e um íntron de Ubiquitina-1 de Zea mays (íntron ZmUbi1) usando métodos de clonagem conhecidos comumente na técnica para produzir o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2. O polinucleotídeo resultante foi em seguida clonado a montante em orientação reversa de um ácido nucléico compreendendo o promotor de Ubi1 do milho (incluindo a URS Ubi1) para produzir o promotor de Ubi1 bidirecional sintético de SEQ ID NO: 3.

[00185] Sequências codificantes de gene reporter são clonadas a jusante de cada extremidae do promotor de Ubi1 bidirecional sintético. Uma sequência codificante de proteína de fluorescência amarela (YFP) é inserida a jusante do fragmento de polinucleotídeo o qual continha os elementos promotores minUbi1P, éxon ZmUbi1, e íntron ZmUbi1. Além disso, uma sequência líder a jusante contendo uma sequência de polinucleotídeos de stop de 3-frame e a sequência de polinucleotídeos de consenso do milho é adicionada ao fragmento dos elementos promotores minUbi1P, éxon ZmUbi1, e íntron ZmUbi1. Uma sequência codificante uidA (GUS) também foi inserida a jusante do promotor de Ubi1 bidirecional sintético em orientação reversa com respeito à sequência YFP para produzir o ácido nucléico de SEQ ID NO: 4. O polinucleotídeo resultante compreendendo o promotor de Ubi1 bidirecional sintético ligado operavelmente aos genes YFP e GUS foi clonado no plasmídeo pDAB105801. A FIG. 4 mostra a orientação do cassete de expressão YFP e GUS em relação ao promotor de Ubi1 bidirecional sintético no plasmídeo pDAB105801.

[00186] A sequência de promotor de Ubi1 nativa é removida do promotor de Ubi1 bidirecional do plasmídeo pDAB105801 e substituída com um fragmento amplificado por PCR contendo o promotor do SCBV e íntron de ADH (SEQ ID NO: 6). O exemplo de promotor do SCBV bidirecional sintético resultante é definido como SEQ ID NO: 5 (vide também a FIG. 5). A adição deste promotor do SCBV resultou no completamento do vetor pDAB105806 (FIG. 6). Este vetor continha os cassetes de expressão genética YFP e GUS os quais foram dirigidos pelo promotor bidirecional do SCBV (SEQ ID NO: 7; vide também a FIG. 7).

[00187] Um vetor binário o qual continha os cassetes de expressão genética GUS e YFP do plasmídeo pDAB105806 é completado através de uma reação GATEWAY L-R CLONASE (Invitrogen, Carlsbad, CA). O vetor resultante, pDAB108708, continha os cassetes de expressão genética GUS, YFP, e AAD-1 dentro da região de filamento T (vide a FIG. 9).

EXEMPLO 3: Expressão de Genes ligados Operavelmente a um Promotor do SCBV Bidirecional Sintético

[00188] Exemplos típicos de expressão transitória de YFP e GUS em embriões de Zea mays transformados com pDAB108708 podem ser estudados por imagens. Ambos os lados do promotor do SCBV bidirecional podem acionar robusta expressão das sequências codificantes YFP e GUS ligadas operavelmente. Os níveis de expressão de YFP são comparáveis com os níveis de expressão de GUS. Estas observações confirmam que ambos os lados do promotor do SCBV bidirecional são biologicamente funcionais. Além disso, o elemento minUbi1P do promotor do SCBV bidirecional sintético pode expressar YFP em níveis de expressão similares em comparação com calo de Zea mays transformado com um plasmídeo binário (pDAB101556) que continha somente um promotor ZmUbi1 unidirecional dirigindo a sequência codificante de YFP. A expressão de YFP ou GUS não é detectada em embriões imaturos de controle negativo os quais não são transformados com um constructo binário, e não continham as sequências codificantes YFP ou GUS.

EXEMPLO 4: Expressão Estável de Genes ligados Operavelmente a um Promotor do SCBV Bidirecional Sintético

[00189] Podem ser observadas imagens de células de calo de Zea mays que são transformadas de modo estável com o vetor binário pDAB108708, o qual contém uma sequência codificante de YFP. Estas células são obtidas a partir de embriões de Z. mays que estavam propagando sobre o meio de Seleção 2. As condições de microscopia e o protocolo que são usados para gerar as imagens dos embriões. O promotor do SCBV bidirecional pode acionar robusta expressão das sequências codificantes de YFP. Estes resultados confirmam que o elemento promotor mínimo Min-Ubi1P do promotor do SCBV bidirecional é capaz de expressar um gene reporter em células de calo de Zea mays transformadas de modo estável. O níveis de expressão da proteína YFP são similares em comparação com a expressão de YFP em calo de Z. mays transformado com um vetor binário de controle que continha o promotor ZmUbi1 unidirecional dirigindo a sequência codificante de YFP (pDAB101556). Não é detectada expressão de YFP no calo de controle negativo que não foi transformado com um constructo binário e não continha uma sequência codificante de YFP ou GUS.

EXEMPLO 5: Estimativa do Número de Cópias de Transgenes Usando PCR TaqMan™ em Tempo Real

[00190] Embriões de Zea mays são transformados com um vetor binário contendo um promotor do SCBV bidirecional, pDAB108708, e outras plantas são transformadas com um vetor binário de controle, pDAB101556. A presença de transgenes YFP dentro do genoma de ambos os grupos de plantas de Z. mays é confirmada através de um teste de sonda de hidrólise. Plântulas de Z. mays transgênicas transformadas de modo estável que se desenvolveram a partir do calo são obtidas e analisadas para identificar eventos que contêm um baixo número de cópias (1 a 2 cópias) de insertos de filamento T de extensão total do vetor binário pDAB108708 e do vetor binário de controle pDAB101556. Plântulas identificadas são encaminhadas para a estufa e cultivadas.

[00191] O sistema Roche Light Cycler480™ é usado para determinar o número de cópias de transgene para eventos que são transformados com o vetor binário pDAB108708. O método utiliza uma reação TAQMAN®biplex que emprega oligonucleotídeos específicos para o gene YFP e para o gene de referência de Z. mays endógeno, invertase (Genbank No. de Acesso: U16123.1), em um único teste. O número de cópias e a zigosidade são determinados medindo a intensidade da fluorescência específica para YFP, em relação à fluorescência específica para invertase, em comparação com padrões de número de cópias conhecidos.

[00192] Em Z. mays transformada com o vetor binário pDAB108708, um fragmento de DNA específico do gene YFP é amplificado com um conjunto de iniciador/sonda TAQMAN®contendo uma sonda marcada com corante fluorescente de FAM, e invertase é amplified com um segundo conjunto de iniciador/sonda TAQMAN® contendo uma sonda marcada com fluorescência de HEX (Tabela 2). A mistura da reação de PCR é preparada conforme estipulado na Tabela 3, e os fragmentos de DNA gene-específicos são amplificados de acordo com as condições estipuladas na Tabela 4. O número de cópias e a zigosidade das amostras são determinados medindo a intensidade relativa da fluorescência específica para o gene reporter, YFP, para a fluorescência específica para o gene de referência, invertase, em comparação com padrões de número de cópias conhecidos. Tabela 2. Iniciador de nucleotídeo dianteiro e reverso e sondas fluorescentes (sintetizadas pela Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)

[00193] Padrões são criados diluindo o vetor, pDAB108708, em DNA genômico (gDNA) de Z. mays B104 de modo a obter padrões com uma relação conhecida de pDAB108706:gDNA. Por exemplo, são preparadas amostras tendo uma; duas; e quatro cópias de DNA de vetor por uma cópia do gDNA de Z. mays B104. Diluições de uma e duas cópias do pDAB108706 misturado com o padrão de gDNA de Z. mays B104 são validadas contra um evento de Z. mays de controle que se sabe que é hemizigoto, e um evento de Z. mays de controle que se sabe que é homozigoto (Z. mays evento 278; vide a Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT No. WO 2011/022469 A2). Um teste biplex TAQMAN®o qual utiliza oligonucleotídeos específicos para o gene AAD1 e oligonucleotídeos específicos para o gene de referência de Z. maysendógeno, invertase, é realizado por amplificação e detecção de um fragmento de DNA gene-específico para AAD1 com um conjunto de iniciador/sonda TAQMAN®contendo uma sonda marcada com corante fluorescente de FAM, e por amplificação e detecção de um fragmento de DNA gene-específico para invertase com um segundo conjunto de iniciador/sonda TAQMAN®contendo uma sonda marcada com fluorescência de HEX (Tabela 2). A mistura da reação TAQMAN®de AAD1é preparada conforme estipulado na Tabela 3 e os fragmentos específicos são amplificados de acordo com as condições estipuladas na Tabela 4. Tabela 3. Mistura da reação de PCR TAQMAN®.

[00194] O nível de fluorescência que foi gerado para cada reação foi analisado usando o termociclador Thermocycler da Roche LightCycler 480™ de acordo com as instruções do fabricante. A porção fluorescente de FAM foi excitada em uma densidade ótica de 465/510 nm, e a porção fluorescente de HEX foi excitada em uma densidade ótica de 533/580 nm. O número de cópias foi determinado por comparação dos valores de Alvo/de Referência para amostras desconhecidas (produção pelo LightCycler 480™) com valores de Alvo/de Referência de quatro padrões de números de cópias conhecidos (Nulo, Cópia 1 (hemi), Cópia 2 (homo) e Cópia 4). Tabela 4. Condições do Termociclador para amplificação por PCR.

[00195] Resultados da análise do número de cópias de transgene de plantas transgênicas obtidas através de transformação com um constructo do promotor ZmUbi1 bidirecional (pDAB108706), e de plantas transgênicas obtidas através de transformação com um constructo YFP de promotor ZmUbi1 unidirecional de controle (pDAB101556) são mostrados na Tabela 5. Somente plantas com 1 a 2 cópias do transgene yfpsão transferidas para a estufa para análises de expressão posteriores. Tabela 5. Estimativa do número de cópias de transgene das plantas transgênicas obtidas a partir de constructos de controle e promotor bidirecional.

EXEMPLO 6: Expressão Estável em Plantas Inteiras de Genes ligados Operavelmente a um Promotor do SCBV Bidirecional Sintético.

[00196] Plantas inteiras que contêm um baixo número de cópias do plasmídeo binário pDAB108708, e plantas que contêm um baixo número de cópias do plasmídeo binário de controle pDAB101556, são cultivadas em uma estufa. Estas plantas são analisadas usando microscopia, onde podem ser observadas imagens apresentando expressão de YFP em plantas de Z. mays T0 que são transformadas de modo estável com um exemplo de constructo de ácido nucléico compreendendo um cassete de expressão de YFP ligado operavelmente a um promotor bidirecional do SCBV sintético (pDAB108708). Exemplos típicos de expressão estável de YFP no tecido das folhas e das raízes de plantas de milho T0 transgênicas obtidas a partir de embriões de Z. mays transformados com pDAB108708 mostram boa expressão de YFP. O promotor do SCBV bidirecional pode acionar robusta expressão das sequências codificantes de YFP tanto nos tecidos das folhas quanto nos tecidos das raízes. A análise por microscopia também confirma que o elemento promotor mínimo Min-UbiP1 no promotor do SCBV bidirecional pode acionar a expressão de YFP em níveis de expressão similares em comparação com plantas de Z. mays transformadas com um plasmídeo binário de controle (pDAB101556) que contém um promotor ZmUbi1 unidirecional dirigindo a expressão da sequência codificante de YFP. As plantas de control apresentam expressão de YFP estável nos tecidos das folhas e nos tecidos das raízes.

EXEMPLO 7: Análise Western Blot de Genes ligados Operavelmente a um Promotor do SCBV Bidirecional Sintético

[00197] Proteína Solúvel Total: Plantas de milho T0 transformadas são amostradas no estágio de desenvolvimento V6. Um total de quatro punches de folhas da folha desdobrada mais jovem são amostrados em um tubo de matriz e colocados em uma caixa de matriz. Como um controle negativo, quatro punches de folhas de duas plantas de milho B104 não transformadas no estágio de desenvolvimento V6 são amostradas em um tubo de matriz. Uma conta de aço é colocada dentro dos tubos de matrizes com as amostras, e em seguigda 400 μL de PBST é adicionado a cada tubo. Os tubos são tampados, e a proteína é extraída através de batedura de conta (beat beating) a 1500 rpm por 5 minutos em um triturador de tecido Kleco™. Os detritos são peletizados através de centrifugação.

[00198] Uma amostra de 5 μL de cada tubo foi diluída para 25 μL com PBST em uma placa de microtítulo de 96 cavidades. Estas amostras foram analisadas para proteína solúvel total usando um kit de teste de proteína BCA (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) de acordo com as instruções do fabricante. Os padrões de albumina sérica bovine (BSA) proporcionados no kit foram analisados em duplicata, e a média dos valores foi usada para gerar uma curva padrão que foi em seguida usada para calcular a proteína solúvel total para cada amostra. A proteína solúvel total para cada amostra foi em seguida normalizada para mg/μL. Tabela 6. Protocolo da Western blot.

[00199] Análise Western Blot de YFP/PhiYFP: Na placa de microtítulo de 96 cavidades, cada amostra de 5 μL de proteína extraída é diluída com 5 μL de 2x tampão Laemmli Buffer + 2-β-mercaptoetanol. Amostras de controle de YFP/PhiYFP purificada em tampão HEPES (50 mM de HEPES, 200 mM de KCl, 10% de glicerol) são adquiridas da Axxora (San Diego, CA). As amostras são preparadas na mesma placa por diluição a 1:1 com tampão Laemmli de modo a produzir uma curva padrão das seguintes concentrações: 0,5 ng/μL, 0,25 ng/μL, e 0,125 ng/μL. As amostrras são aquecidas em um termociclador Thermocycler a 95°C por 30 minutos, e em seguida resfriadas para 4°C. Um gel Bio-Rad Criterion gel™ é em seguida montado usando tampão MES/SDS. As amostras são deixadas para aquecer até a temperatura ambiente, e 10 μL de amostra são carregados para dentro de cada cavidade de dois géis. Além disso, amostras de YFP/PhiYFP purificada usada para uma curva padrão, e marcador de escala de proteína, são carregados para dentro das cavidades do gel. Os géis são passados eletroforeticamente a 150 V e 150 mA por 90 min. Depois da passagem, os invólucros dos gel são abertos e as proteínas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando o sistema iBlot System™ (Invitrogen). A proteína é transferida do gel para a membrana passando uma corrente de 20 V por 10 minutos. A membrana de nitrocelulose é removida e colocada em tampão de bloqueio StartingBlock T20™ de um dia para o outro a 4°C. O tampão de bloqueio é em seguida descartado, e a membrana é processada usando o protocolo estipulado na Tabela 6.

[00200] Foi detectada ligação de anticorpos usando o sistema de detecção quimiluminescente Amersham ECL™ plus seguindo as instruções do fabricante. O filme foi exposto a 10 minutos e a 30 minutos. O filme exposto a 10 minutos foi usado para quantificar a proteína, e o filme de superexposição por 30 minutos foi usado para confirmar a ausência de proteína em B104 e outras amostras de controle. A membrana foi fixada à parte posterior do filme exposto, e a proteína foi quantificada através de análise da densidade de pixels. A densidade de pixels dos padrões de proteína purificada foi usada primeiro para gerar uma curva padrão que foi usada para quantificar a proteína nas amostras. Embora a membrana apresentasse bandas para um monômero e dímero de PhiYFP mesmo no padrão purificado, somente o monômero de PhiYFP foi usado para quantificar a expressão de proteína. Os valores para a proteína foram em seguida normalizados para ng/μL. A proporção de proteína solúvel total normalizada (TSP) para PhiYFP foi calculada para as unidades de ng de YFP/mg de TSP, ou alternativamente, partes por milhão (ppm).

[00201] Análise por Western Blot de GUS: A expressão da proteína GUS é quantificada em uma maneira similar à PhiYFP, com a seguinte exceção: uma amostra de 10 μL de extrato é diluída a 1:1 com 2x Laemmli + 2-β-mercaptoetanol, desnaturada a 95°C por 30 minutos, e em seguida 15 μL é carregado no gel. Membranas processadas com filme (1 minuto de exposição) são sobrepostas com a membrana para análise da densidade dos pixels.

[00202] Resultados de uma análise por Western blot de 12 plantas de milho T0 transgênicas obtidas a partir de embriões de Z. mays transformados com o vetor binário, pDAB108708, são mostrados na FIG. 16. O promotor do SCBV bidirecional mostra robusta expressão das sequências codificantes de YFP e GUS a partir de tecido das folhas. Estas observações confirmam que o elemento promotor mínimo Min-UbiP1 isolado a partir de um Promotor de Ubiquitina1 de Zea mays e fundido ao promotor do SCBV pode expressar YFP em níveis de expressão similares em comparação com calo de Z. mays transformado com um plasmídeo binário contendo um promotor ZmUbi1 unidirecional dirigindo a sequência codificante de YFP (pDAB101556; vide a FIG. 17).

EXEMPLO 8: Constructo de uma Pilha de Cassetes de Quatro Genes

[00203] Um constructo do plasmídeo pDAB105806 é usado como o plasmídeo de partida para gerar uma pilha de cassetes de quatro genes (AAD1-2A-PhiYFP e Cry34(8V6)-2A-Cry35) acionada por um único promotor bidirecional do SCBV. Um mapa representativo do plasmídeo pDAB105806 é mostrado na FIG. 6, o qual contém um promotor bidirecional do SCBV.

[00204] O fragmento AAD1-2A-PhiYFP derivado a partir do plasmídeo pDAB105841 (FIG. 22) é clonado na espinha dorsal do vetor de corte PstI e SacI do plasmídeo pDAB105806 usando métodos de clonagem conhecidos comumente na técnica. Isto resultou no plasmídeo intermediário pDAB105847 (FIG. 22). Um fragmento Cry34(8V6)-2A-Cry35 digerido por NotI/XbaI obtido a partir do plasmídeo pDAB105840 é clonado entre os sítios NotI/SpeI do plasmídeo pDAB105847 para o plasmídeo do constructo pDAB105849 (FIG. 23). O plasmídeo pDAB105849 contém os cassetes genéticos Cry34(8V6)-2A-Cry35 e AAD1-2A-PhiYFP sobre cada lado do promotor bidirecional do SCBV sintético.

[00205] Um vetor binário contendo o promotor bidirecional do SCBV sintético, e os cassetes de expressão genética Cry34(8V6)-2A-Cry35 e AAD1-2A-PhiYFP do plasmídeo pDAB105849 é gerado através de uma reação GATEWAY L-R CLONASE (Invitrogen, Carlsbad, CA) em um plasmídeo de destinação pDAB101917 (FIG. 24). O vetor resultante, pDAB108719, contém os cassetes de expressão genética Cry34(8V6)-2A-Cry35, AAD1-2A-PhiYFP, e PAT dentro das bordas de T-DNA (FIG.24).

EXEMPLO 9: Constructo de uma Segunda Pilha de Cassetes de Quatro Genes

[00206] Um fragmento PhiYFP-2A-AAD1 derivado a partir do plasmídeo pDAB105844 (FIG. 25) é clonado na espinha dorsal do vetor de corte PstI e SacI do plasmídeo pDAB105806 usando métodos de clonagem conhecidos comumente na técnica. Isto resultou no plasmídeo intermediário pDAB105848 (FIG. 25). Um fragmento Cry34(8V6)-2A-Cry35 digerido por NotI/XbaI obtido a partir do plasmídeo pDAB105840 é clonado entre os sítios NotI/SpeI do plasmídeo pDAB105848 para o plasmídeo do constructo pDAB105865 (FIG. 26). O plasmídeo pDAB105865 contém os cassetes genéticos Cry34(8V6)-2A-Cry35 e PhiYFP-2A-AAD1 sobre cada lado do promotor bidirecional do SCBV sintético.

[00207] Um vetor binário contendo o promotor bidirecional do SCBV sintético, e os cassetes de genes Cry34(8V6)-2A-Cry35 e PhiYFP-2A-AAD1 do plasmídeo pDAB105865 é gerado através de uma reação GATEWAY L-R CLONASE (Invitrogen, Carlsbad, CA) em um plasmídeo de destinação pDAB101917 (FIG. 24). O vetor resultante, pDAB108720, contém os cassetes de expressão genética Cry34(8V6)-2A-Cry35, PhiYFP-2A-AAD1, e PAT dentro das bordas de T-DNA (FIG. 26).

EXEMPLO 10: Transformação de Agrobacterium tumefaciens Cepa DAt13192

[00208] Os vetores binários pDAB108719 e pDAB108720 são transformados em Agrobacterium tumefaciens cepa ternária DAt13192 (vide o Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos No. 61/368965). Colônias bacterianas são isoladas e DNA de plasmídeo binário é extraído e verificado através de digestões por enzimas de restrição.

EXEMPLO 11: Transformação em Milho

[00209] Esterilização de Espigas e Isolamento de Embriões: De modo a obter embriões imaturos de milho, plantas de Zea mays (c.v. B104) são cultivadas na estufa e auto ou sib-polinizadas para produzir espigas. As espigas são colhidas aproximadamente 9 a 12 dias depois de polinização. No dia do experimento, as espigas são esterilizadas superficialmente por imersão em uma solução a 20% de alvejante doméstico, o qual contém 5% de hipoclorito de sódio, e agitadas por 20 a 30 minutos, seguidos por três enxagues em água estéril. Depois de esterilização, embriões zigóticos imaturos (1,5 a 2,2 mm) são dissecados asseticamente de cada espiga e distribuídos aleatoriamente dentro de tubos de micro-centrífuga contendo meio de infecção líquido (LS Basal Medium, 4,43 g/L; Solução de Vitamina N6 [1000X], 1,00 mL/L; L-prolina, 700,0 mg/L; sacarose, 68,5 g/L; glicose, 36,0 g/L; 2,4-D, 1,50 mg/L. Para um dado conjunto de experimentos, são usados embriões agrupados de 2 a 3 espigas para cada tratamento.

[00210] Iniciação da Cultura de Agrobacterium: Estoques de glicerol de cepas de Agrobacterium contendo os vetores binários descritos acima são riscados sobre placas de meio mínimo AB contendo antibióticos apropriados e são cultivados a 20°C por 3 a 4 dias. Uma única colônia é selecioanda e riscada sobre placas de YEP contendo os mesmos antibióticos e é incubada a 28°C por 1 a 2 dias.

[00211] Cultura e Cocultura de Agrobacterium: No dia do experimento, as colônias de Agrobacteriumsão retiradas da placa de YEP, suspendidas em 10 mL de meio de infecção em um tubo descartável de 50 mL, e a densidade celular é ajustada para OD600 = 0,2 a 0,4 nm usando um espectrofotômetro. As culturas de Agrobacteriumsão colocadas sobre um shaker giratório a 115 rpm, em temperatura ambiente, enquanto é realizada a dissecção dos embriões. Embriões zigóticos imaturos entre 1,5 a 2,2 mm de tamanho são isolados dos grãos de milho esterilizados e colocados em 1 mL do meio de infecção e lavados uma vez no mesmo meio. A suspensão de Agrobacterium (2 mL) é adicionada a cada tubo e os tubos são invertidos por cerca de 20 vezes e em seguida agitados por 10 a 15 minutos. Os embriões são transferidos para meio de cocultura (Sais de MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba- 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan™, 3,00 gm/L; MS-Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L, AgNθ3, 15,0 mg/L; Acetoseringona, 100 μM), orientados com o escutelo virado para cima, e incubados por 3 a 4 dias na luz a 25°C.

[00212] Expressão Transitória de YFP/PhiYFP: Pode ser observada expressão transitória de YFP/PhiYFP em embriões transformados e depois de 3 dias de cocultura com Agrobacterium. Os embriões são observados sob um estereomicroscópio (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) usando filtro de YFP e fonte de luz de 500 nm.

[00213] Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Putativos: Depois do período de cocultura, os embriões são transferidos para meio de repouso (sais de MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 500,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan™, 2,30 g/L; MS- Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) sem agente seletivo e incubados em 24 horas de luz com intensidade da luz de 50 μmol m-2s-1por 7 dius a 28°C. Os embriões são transferidos para meio de Seleção 1 (sais de MS, 4,33 g/L; L-prolina, 700,0 mg/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre], 500,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína, 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 g/L; Gelzan™, 2,30 g/L; MS-Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L), contendo 3 mg/L de Bialaphos e incubados em 24 horas de luz com intensidade da luz de 50 μmol m-2s-1por 7 dias a 28°C.

[00214] Embriões com calos embriogênicos proliferantes são transferidos para meio de Seleção 2 (sais de MS, 4,33 g/L; mio- inositol, 100,0 mg/L; L-prolina, 700,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre], 500,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína, 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 g/L; Gelzan™ 2,30 g/L; MS-Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L), contendo 5 mg/L de Bialaphos e são incubados em 24 horas de luz com intensidade da luz de 50 μmol m-2s-1por outros 14 dias a 28°C. Esta etapa de seleção permite que o calo transgênico prolifere e diferencie mais. O período de seleção dos calos pode durar por três semanas. Calos embriogênicos proliferantes são transferidos para meio de Regeneração 1 (sais de MS, 4,33 g/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; L-prolina, 350,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre], 250,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína, 50,0 mg/L; NAA, 0,500 mg/L; ABA, 2,50 mg/L; BA, 1,00 mg/L; sacarose, 45,0 g/L; Gelzan™ 2,50 g/L; MS-Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 1,00 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L), contendo 3 mg/L de Bialaphos e cultivados em 24 horas de luz com intensidade da luz de 50 μmol m-2s-1por 7 dias a 28°C.

[00215] Calos embriogênicos com com brotos/botões são transferidos para meio de Regeneração 2 (sais de MS, 4,33 g/L; MS- Vitamin modificada [1000X], 1,00 ml/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; sacarose, 60,0 g/L; Goma Gelana G434™, 3,00 g/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L), contendo 3 mg/L de Bialaphos. As culturas são incubadas sob 24 horas de luz com intensidade da luz de 50 μmol m-2s-1por 7 a 10 dias a 28°C. Brotos pequenos com raízes primárias são transferidos para meio de alongamento de brotos e enraizamento (sais de MS, 4,33 g/L; Solução de Vitamina N6 [1000X], 1,00 mL/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; sacarose, 30,0 g/L; agar 5,50 g/L; em phytatray e são incubados sob 16/8 horas de luz/escuridão a 90 μmol m-2s-1por 7 dias a 28°C. Plântulas transgênicas putativas saudáveis são selecionadas e em seguida incubadas em 16/8 horas de luz/escuridão a 200 μmol m-2s-1por outros 2 a 5 dias a 25°C e são analisadas para número de cópias de transgenes e transferidas para a estufa.

EXEMPLO 12: Expressão de PhiYFP Transitória

[00216] É realizada expressão transitória de PhiYFP a partir de embriões de Zea mays transformados com pDAB108719. O promotor do SCBV bidirecional pode expressar PhiYFP a partir do cassete de expressão genética AAD1-2A-PhiYFP, onde embrião não transformado não apresenta qualquer fluorescência de PhiYFP. Pode ser observado nível similar de expressão de PhiYFP a partir de embriões de Zea mays transformados com um plasmídeo binário pDAB105748 (FIG. 20) contendo um promotor de Ubi1 de Zea mays (Zm) uni-direcional acionando sequência codificante PhiYFP única apresentou o nível esperado de expressão de YFP/PhiYFP. Pode ser observada expressão transitória de PhiYFP a partir de embriões de Zea mays transformados com pDAB108720, onde promotor de Zm Ubi1 bidirecional pode expressar PhiYFP a partir do cassete de expressão genética PhiYFP-2A-AAD1.

EXEMPLO 13: Expressão de PhiYFP em Milho Transformado de modo estável

[00217] Expressão de PhiYFP em Calo de Zea mays Transformado de modo estável Acionada por um Promotor de Zm Ubi1 BiDirecional: Embriões de Zea mays transformados com o vetor binário pDAB108719 contendo o cassete de expressão genética AAD1-2A-PhiYFP apresentam boa expressão de PhiYFP. O promotor do SCBV bidirecional pode acionar robustar expressão de PhiYFP. Estes resultados confirmam que o elemento promotor mínimo Min-UbiP1 do promotor do SCBV bidirecional é capaz de expressar um gene reporter, por exemplo PhiYFP ou YFP. Os níveis de expressão da proteína PhiYFP são similares em comparação com calo de Zea mays transformado com um vetor binário de controle o qual continha o promotor de Zm Ubi1 uni-direcional acionando a sequência codificante PhiYFP (pDAB105748). Não é detectada expressão de PhiYFP no calo de controle negativo o qual não é transformado com um binário constructo e não continha as sequências codificantes PhiYFP.

[00218] Embriões de Zea mays transformados com o vetor binário pDAB108720 o qual contém o cassete de expressão genética PhiYFP-2A-AAD1 apresentam boa expressão de PhiYFP. O promotor do SCBV bidirecional pode acionar robustar expressão de PhiYFP. Estes resultados confirmam que o elemento promotor mínimo Min-UbiP1 do promotor do SCBV bidirecional é capaz de expressar um gene reporter, por exemplo PhiYFP ou YFP.

EXEMPLO 14: Estimativa do Número de Cópias de Transgene

[00219] Estimativa do Número de Cópias de Transgene Usando PCR TaqMan™ em Tempo Real: Plantas de Zea mays foram transformadas com vetores binários contendo um promotor do SCBV bidirecional, pDAB108719 e pDAB108720, e outras plantas são transformadas com um vetor binário de controle, pDAB105748. A presença de sequência codificante (PhiYFP, AAD1, Cry34, Cry35, Pat) dentro do genoma de plants transgênicas de Z. mays para pDAB108719 e pDAB108720 é confirmada através de um teste de sonda de hidrólise TaqMan. As plantas transgênicas para vetor de controle pDAB105748 são analisadas para a presença da sequência de PhiYFP. Plântulas de Z. mays transgênicas transformadas de modo estável que se desenvolveram a partir do calo são obtidas e analisadas para identificar eventos que contêm um baixo número de cópias (1 a 2 cópias) de insertos de filamento T de extensão total dos vetores binários pDAB108719 e pDAB108720, e o vetor binário de controle pDAB105748. Plântulas confirmadas são encaminhadas para a estufa e cultivadas.

[00220] O sistema Roche Light Cycler480™ é usado para determinar o número de cópias do transgene para eventos que são transformadas com o vetor binário pDAB108719 e pDAB108720. O método utilizou uma reação TAQMAN®biplex que emprega oligonucleotídeos específicos para a sequência codificante e para o gene de referência de Z. maysendógeno, invertase (Genbank Acesso No: U16123.1), em um único teste. O número de cópias e a zigosidade são determinados medindo a intensidade da fluorescência específica de sequências codificantes, em relação à fluorescência específica para invertase, em comparação com padrões de números de cópias conhecidos. Tabela 7. Iniciador de nucleotídeo dianteiro e reverso e sondas fluorescentes (sintesizadas pela Integrated DNA Technologies, Coralville, IA).

[00221] Para amostras de Z. mays transformadas com os vetores binários pDAB108719 e pDAB108720, um fragmento de DNA específico de sequência codificante é amplificado com um conjunto de iniciador/sonda TAQMAN®contendo uma sonda marcada com corante fluorescente de FAM, e a invertase é amplificada com um segundo conjunto de iniciador/TAQMAN®contendo uma sonda marcada com fluorescência de HEX (Tabela 7). A mistura da reação de PCR é preparada conforme estipulado na Tabela 8, e os fragmentos de DNA gene-específicos são amplificados de acordo com as condições estipuladas na Tabela 9. O número de cópias e a zigosidade das amostras são determinados medindo a intensidade relativa de fluorescência específica para a sequência codificante para fluorescência específica para o gene de referência, invertase, em comparação com padrões de número de cópias conhecidos.

[00222] São criados padrões diluindo o vetor (pDAB108719 ou pDAB108720) em DNA genômico (gDNA) de Z. mays B104 para obter padrões com uma relação conhecida de vector:gDNA. Por exemplo, são preparadas amostras tendo uma, duas, e quatro cópias de DNA de vetor por uma cópia do gDNA de Z. mays B104. Diluições de uma e duas cópias do vetor misturado com o padrão de gDNA de Z. mays B104 são validadas contra um evento de Z. mays de controle que se sabe que é hemizigoto, e um evento de Z. mays de controle que se sabe que é homozigoto (Z. mays evento 278; Vide a Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT No. WO 2011/022469 A2). Um teste biplex TAQMAN®o qual utiliza oligonucleotídeos específicos para o gene de sequência codificante e oligonucleotídeos específicos para o gene de referência de Z. maysendógeno, invertase, é realizado por amplificação e detecção de um fragmento de DNA gene-específico para sequência codificante com um conjunto de iniciador/sonda TAQMAN®contendo uma sonda marcada com corante fluorescente de FAM, e por amplificação e detecção de um fragmento de DNA gene-específico para invertase com um segundo conjunto de iniciador/sonda TAQMAN®contendo uma sonda marcada com fluorescência de HEX. De acordo com Tabela 7, a mistura da reação TAQMAN®de sequência codificante é preparada conforme estipulado na Tabela 8 e os fragmentos específicos são amplificados de acordo com as condições estipuladas na Tabela 9. Tabela 8. Mistura da reação de PCR TAQMAN®.

[00223] O nível de fluorescência gerado para cada reação é analisado usando o termociclador Thermocycler da Roche LightCycler 480™ de acordo com as instruções do fabricante. A porção fluorescente de FAM é excitada em uma densidade ótica de 465/510 nm, e a porção fluorescente de HEX é excitada em uma densidade ótica de 533/580 nm. O número de cópías pode ser determinado por comparação dos valores de Alvo/de Referência para amostras desconhecidas (output by the LightCycler 480™) com valores de Alvo/de Referência de quatro padrões de número de cópias conhecidos (por exemplo, (Nulo, Cópia 1 (hemi), Cópia 2 (homo) e Cópia 4). Tabela 9. Condições do Termociclador para amplificação por PCR.

[00224] Resultados da análise do número de cópias de transgene de plantas transgênicas obtidas através de transformação com alguns constructos do promotor do SCBV bidirecional (pDAB108719 e pDAB108720), e de plantas transgênicas obtidas através de transformação com um constructo PhiYFP de promotor ZmUbi1 unidirecional de controle (pDAB105748) estão resumidos na Tabela 10. Somente plantas com 1 a 2 cópias de todos os transgenes são transferidas para a estufa para análises de expressão posteriores. Tabela 10. Estimativa do número de cópias de transgene das plantas transgênicas obtidas a partir de constructos de controle e promotor bidirecional.

EXEMPLO 15: Expressão Estável de PhiYFP em Plantas T0 de Milho

[00225] Pode ser observada Expressão estável de PhiYFP em Plantas T0 de Zea mays Acionada por Promotor do SCBV bidirecional: embriões de Zea mays transformados com o vetor binário pDAB108719 contendo o cassete de expressão genética AAD1-2A-PhiYFP. O promotor do SCBV bidirecional pode acionar robusta expressão da PhiYFP tanto nos tecidos dos brotos quanto das raízes. Os resultados confirmam que o elemento promotor mínimo Min-UbiP1 do promotor do SCBV bidirecional é capaz de expressar um gene reporter, por exemplo PhiYFP ou YFP que é fundido bicistronicamente com aad1 usando uma sequência 2A. Os níveis de expressão da proteína PhiYFP é similar a embriões de Z. mays transformados com um vetor binário de controle o qual contém o promotor Zm Ubi1 uni-direcional acinando a sequência codificante de PhiYFP (pDAB105748). Não é detectada expressão de PhiYFP nas plantas de controle negativo as quais não são transformadas com um constructo binário e não contêm as sequências codificantes de PhiYFP.

[00226] Pode ser observada expressão de PhiYFP nos tecidos das folhas e das raízes de plantas T0 de Zea maystransgênicas para o vetor binário pDAB108720 o qual contém o cassete de expressão genética PhiYFP-2A-AAD1. O promotor do SCBV bidirecional pode acionar robusta expressão de PhiYFP. Os resultados confirmam que o elemento promotor mínimo Min-UbiP1 do promotor do SCBV bidirecional é capaz de expressar um gene reporter, por exemplo PhiYFP ou YFP fundido a aad1 com uma sequência 2A ou com uma sequência 2A-like.

EXEMPLO 16: Análise de Proteína Cry34, Cry35, e AAD1

[00227] As plantas são amostradas em colunas 1 a 10 de uma caixa de matriz em tubos cônicos de 1,5 mL aos quais 1 conta de aço é adicionada seguida por PBST + 0,5% de BSA (0,6 mL). A caixa é em seguida batida por contas para trituração das amostras em um Geno Grinder por 5 minutos a 1500 rpm e em seguida centrifugada a 3700 rpm por 7 minutos a 4°C.

[00228] Teste ELISA de Cry34/35: Em uma placa separada de 96 cavidades profundas, uma amostra do extrato é diluída a 1:200 em PBST + 1% de blotto. Dois volumes de 25 μL da amostra diluída são em seguida transferidos para placas separadas de 96 cavidades que foram ordenadas (arrayed) com anti-Cry34 e anti-Cry35 (Meso Scale Discovery). Nas colunas 11 e 12 de cada placa, concentrações padrões de Cry34 e de Cry35 em PBST + 1% de blotto são adicionadas (25 μL). As placas são então incubadas enquanto agitando em temperatura ambiente por uma hora. As placas são em seguida lavadas com PBST (3x300 μL). Em seguida 25 μL de uma solução de SulfoTAG conjugado anti-Cry34 e anti-Cry35 é adicionado a cada cavidade e incubado com agitação em temperatura ambiente por uma hora. As placas são em seguida lavadas com PBST (3x300 μL). Um volume de 150 μL de Read Buffer T (Meso Scale Discovery) é em seguida adicionado e a placa é imediatamente lida em uma leitora SECTOR®6000. As concentrações de proteínas na amostra podem ser calculadas usando a curva padrão para a respectiva proteína gerada da mesma lâmina.

[00229] Teste ELISA de AAD-1 ELISA: Em uma placa separada de 96 cavidades profundas, uma amostra do extrato é diluída a 1:20 em PBST + 0,5% de BSA. Dois volumes de 200 μL da amostra diluída são em seguida transferidos para placas separadas de 96 cavidades que foram revestidas com anti-AAD1 (proporcionado pela Acadia Bioscience LLC). Nas colunas 11 e 12 de cada placa, concentrações padrões de AAD1 em PBST + 0,5% de BSA são adicionadas (200 μL). Um volume de 50 μL de anti-AAD1 biotinilado é em seguida adicionado a cada cavidade e as placas são incubadas enquanto agitando em temperatura ambiente por uma hora. As placas são então lavadas com PBST (5x300 μL). Em seguida 100 μL de uma solução conjugada de estreptavidina e fosfato alcalino é adicionado a cada cavidade e incubado com agitação em temperatura ambiente por 30 minutos. As placas são em seguida lavadas com PBST (5x300 μL). Um volume de 100 μL de substrato (p-nitrofenilfosfato, PNPP) é em seguida adicionado e incubado com agitação em temperatura ambiente por 45 minutos. As placas são em seguida lidas a A405 em uma leitora de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices). As concentrações de proteínas na amostra podem ser calculadas usando a curva padrão gerada da mesma lâmina.

EXEMPLO 17: Análise de Proteína de Plantas T0 de Milho

[00230] Neste exemplo é realizada análise de proteína de plantas T0 de milho acionadas pelo constructo do Promotor do SCBV de Zea mays bidirecional (pDAB108719). Tabela 11. Expressão de Cry34/Cry35/AAD1 em plantas transgênicas pDAB108719 de milho T0

[00231] Análise ELISA representativa de 12 plantas de milho T0 transgênicas obtidas a partir de embriões de Zea mays transformados com pDAB108719 que contém o cassete de expressão genética Cry34-2A-Cry35 é resumida na Tabela 11. Promotor do SCBV bidirecional pode acionar robusta expressão de ambas as sequências codificantes Cry34 e Cry35 em folha. Estas observações mostram que o promotor bidirecional do SCBV sintético único em constructo pDAB108719 pode expressar múltiplos genes (por exemplo, Cry34, Cry35, e AAD1).

[00232] Análise de proteína de plantas T0 de milho dirigidas pelo constructo do Promotor de Ubiquitina1de Zea mays bidirecional (pDAB108720): Análise ELISA representativa de 9 plantas de milho T0 transgênicas obtidas a partir de embriões de Zea mays transformados com pDAB108720 que contém o cassete de expressão genética Cry34-2A-Cry35 é resumida na Tabela 12. O promotor do SCBV bidirecional pode acionar robusta expressão de ambas as sequências codificantes Cry34 e Cry35 em folha. Tabela 12. Expressão de Cry34/Cry35/AAD1 em plantas transgênicas pDAB108720 de milho T0

EXEMPLO 18: Empilhamento de Transgenes: Promotores Bidirecionais Sintéticos (dados de T1)

[00233] Expressão genética de plantas T1 acionada pelos constructos de promotor bidirecional: dez a doze eventos de cópia única por constructo são selecionados para análise com a exceção de que o constructo de controle pDAB108716 tem somente um evento. São testadas cinco plantas/eventos para o estágio V6 e são testadas três plantas/eventos para os estágios V10-12 e /R3. São realizados testes de proteína usando LCMS ou ELISA.

[00234] Os constructos usados neste exemplo são mostrados na FIG. 30. pDAB108708 (SCBV bidirecional (-200)) e pDAB108709 (SCBV bidirecional (-90)) são constructos com promotor bidirecional típico da presente invenção além de constructos com promotor bidirecional de Ubi1 do milho (pDAB108706 [ZMUbi bidirecional (-200)) e pDAB108707 (ZMUbi bidirecional (-90))]; pDAB101556 (ZmUbi1-YFP controle), pDAB108715 (SCBV sem promotor mínimo), e pDAB108716 (ZMUbi1 sem promotor mínimo) servem como constructos de controle com promotores uni-direcionais.

[00235] Exemplos dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos para proteína YFP (LCMS) em ng/cm2são mostrados na FIG. 31A. Exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos para RNA de YFP são mostrados na FIG. 31B.

[00236] Exemplos dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos para proteína GUS (LCMS) em ng/cm2são mostrados na FIG. 32A. Exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos para RNA de GUS são mostrados na FIG. 32B.

[00237] Exemplos dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos para proteína AAD1 (LCMS) em ng/cm2são mostrados na FIG. 33A. Exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos para RNA de AAD1 são mostrados na FIG. 33B.

[00238] Uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos para proteína YFP (LCMS) em ng/cm2é mostrada na FIG. 34A. Uma análise estatística dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos para RNA de YFP é mostrada na FIG. 34B. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00239] Uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos para proteína GUS (LCMS) em ng/cm2é mostrada na FIG. 35A. Uma análise estatística dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos para RNA de GUS é mostrada na FIG. 35B. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00240] Uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) dos sete constructos para proteína AAD1 (LCMS) em ng/cm2é mostrada na FIG. 36A. Uma análise estatística dos resultados da expressão relativa (V6) dos sete constructos para RNA de AAD1 é mostrada na FIG. 36B. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00241] As FIGURAS 37A, 37B, e 37C mostram exemplos dos resultados da expressão (V10) dos sete constructos para proteína YFP, AAD1, e GUS (LCMS) em ng/cm2, respectivamente.

[00242] As FIGURAS 38A, 38B, e 38C mostram a análise estatística dos resultados da expressão (V10) dos sete constructos para proteína YFP, GUS, e AAD1 (LCMS) em ng/cm2, respectivamente. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00243] As FIGURAS 39A, 39B, e 39C mostram exemplos dos resultados da expressão (R3) dos sete constructos para proteína YFP, GUS, e AAD1 (LCMS) em ng/cm2, respectivamente.

[00244] As FIGURAS 40A, 40B, e 40C mostram a análise estatística dos resultados da expressão (R3) dos sete constructos para proteína YFP, GUS, e AAD1 (LCMS) em ng/cm2, respectivamente. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00245] Os resultados mostram que tanto os promotores bidirecionais do SCBV sintéticos da presente invenção quanto os promotores bidirecionais de Ubi1 do milho podem acionar robusta expressão de GUS e YFP. A expressão de YFP do promotor bidirecional de Ubi1 do milho é similar à expressão de YFP acionada por Ubi1 do milho unidirecional. A expressão de YFP do promotor bidirecional do SCBV sintético é significativamente maior do que a expressão de YFP acionada por Ubi1 do milho unidirecional ou promotor bidirecional de Ubi1 do milho. No entanto, esta diferença se torna menos significativa no estágio V10. Os resultados também sugerem que transcrição bidirecional tem efeito não significativo sobre a expressão de GUS (expressão de GUS comparada com os constructos carecendo de promotor mínimo sem expressão de YFP). Promotores bidirecionais do SCBV sintéticos também proporcionam expressão de GUS significativamente maior comparados com promotores bidirecionais de Ubi1 do milho.

EXEMPLO 19: Uma Combinação de Promotor Bidirecional e Sequência Bicistrônica 2A para Acionar Quatro Transgenes de Um Único Promotor (dados de T1)

[00246] Expressão genética de plantas T1 dirigida pelos constructos de promotor bidirecional: dez a doze eventos de cópia única por constructo são selecionados para análise com a exceção de que os constructos de controle têm quatro ou cinco eventos por constructo. São testadas cinco plantas/eventos para o estágio V6 e são testadas três plantas/eventos para os estágios V10-12 e /R3. São realizados testes de proteína usando LCMS ou ELISA.

[00247] pDAB108719 e pDAB108720 são mostrados na FIG. 19. pDAB105748 e pDAB105818 são mostrados na FIG. 20. Constructos de multi-transgenes adicionais usando promotor de Ubi1, incluindo pDAB108717 e pDAB108718 são mostrados na FIG. 41.

[00248] Exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) de RNA de Cry34 de seis constructos pDAB105748 (ZMUbi1-YFP), pDAB105818 (ZMUbi1-Cry34/ZMUbi1-Cry35/ ZMUbi1-AAD1), pDAB108717 (YFP/AAD-1-ZMUbi1 bidirecional-Cry34-Cry35), pDAB108718 (AAD1/YFP-ZMUbi1 bidirecional-Cry34-Cry35), pDAB108719 (YFP/AAD1-SCBV bidirecional-Cry34-Cry35), e pDAB108720 (AAD1/YFP – SCBV bidirecional-Cry34-Cry35) são mostrados na FIG. 42A. Exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) da proteína Cry34 (LCMS) dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 são mostrados na FIG. 42B.

[00249] Exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) de RNA de AAD1 dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 são mostrados na FIG. 43A. Exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) da proteína AAD1 (LCMS) dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 são mostrados na FIG. 43B.

[00250] Exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) de RNA de YFP dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 são mostrados na FIG. 44A. Exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) da proteína YFP (LCMS) dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 são mostrados na FIG. 44B.

[00251] Exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) de RNA de Cry35 dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 são mostrados na FIG. 45A. Exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) da proteína Cry35 (ELISA) dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 são mostrados na FIG. 45B.

[00252] A FIG. 46 mostra exemplos dos resultados da expressão relativa (V6) de RNA de PAT dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720.

[00253] Uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) de RNA de Cry34 dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 é mostrada na FIG. 47A. Uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) da proteína Cry34 dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 é mostrada na FIG. 47B. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00254] Uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) de RNA de AAD1 dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 é mostrada na FIG. 48A. Uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) da proteína AAD1 dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 é mostrada na FIG. 48B. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00255] Uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) de RNA de YFP dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 é mostrada na FIG. 49A. Uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) da proteína YFP dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 é mostrada na FIG. 49B. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00256] Uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) de RNA de Cry35 dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 na FIG. 50A. Uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) da proteína Cry35 dos mesmos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720 é mostrada na FIG. 50B. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00257] A FIG. 51 mostra uma análise estatística dos resultados da expressão (V6) de RNA de PAT dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00258] As FIGURAS 52A, 52B, 52C, e 52D mostram exemplos dos resultados da expressão de proteína (V10) de YFP, AAD1, Cry34, e Cry35 respectivamente dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720.

[00259] As FIGURAS 53A, 53B, 53C, e 53D mostram a análise estatística dos resultados da expressão de proteína (V10) de YFP, AAD1, Cry34, e Cry35 respectivamente dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00260] As FIGURAS 54A, 54B, 54C, e 54D mostram exemplos dos resultados da expressão de proteína (R3) de YFP, AAD1, Cry34, e Cry35 respectivamente dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720.

[00261] As FIGURAS 55A, 55B, 55C, e 55D mostram a análise estatística dos resultados da expressão de proteína (R3) de YFP, AAD1, Cry34, e Cry35 respectivamente dos seis constructos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, pDAB108718, pDAB108719, e pDAB108720. Os valores médios e os resultados estatísticos estão listados.

[00262] A FIG. 56 mostra exemplos dos resultados de Western blot para expressão de proteína de Cry34, Cry35, e AAD1 de pDAB108718, pDAB108717, pDAB108719, e pDAB108720.

[00263] Os resultados mostram que todos os quatro transgenes nos constructos acionados por promotor único são funcionais com bons níveis de expressão. Três genes (Cry34/Cry35/AAD1) na pilha bidirecional de Ubi1 apresentam robustos níveis de expressão similares aos níveis de expressão proporcionados pela pilha de genes acionada por Ubi1 único (DExT).

[00264] Apesar de uma série de aspectos e modalidades exemplares terem sido discutidos acima, as pessoas versadas na técnica vão reconhecer determinadas modificações, permutações, adições e subcombinações dos mesmos. Portanto se pretende que as reivindicações anexadas que se seguem e que as reivindicações futuramente introduzidas sejam interpretadas de modo a incluir todas as referidas modificações, permutações, adições e subcombinações como estando dentro de seu verdadeiro espírito e âmbito.

Claims

1. Polinucleotídeo sintético, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor bidirecional compreendendo: um elemento de núcleo mínimo de promotor de um gene Ubiquitina 1 de Zea mays ou Zea luxurians, e um segundo elemento de núcleo mínimo de promotor de um gene Ubiquitina 1 de Zea mays ou Zea luxurians, em que os dois elementos de núcleo mínimo de promotores estão cada um em orientação complementar reversa em relação ao outro no polinucleotídeo sintético; e uma sequência de nucleotídeo heteróloga de interesse operacionalmente ligada ao promotor bidirecional, em que o promotor bidirecional consiste no polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5.