JPH06504904A - エンド―１，４―β―グルカナーゼ遺伝子及び植物におけるその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エンド−１，４−β−グルカナーゼ遺伝子及び植物におけるその利用 関連出願 本出願は１９９０年４月２０日に出願された米国特許出願第０７１５１１．４１ ７号の同時係属出願であり、この開示内容全体は本明細書に参考として組入れで ある。

発明の背景 発明の分野 本発明は一般に果実の軟化を引き下げるための方法に関する。特に、これはｌも しくは複数種のエンド−１，４−β−グルカナーゼの活性を阻害することによる 、果実の軟化及び細胞壁の多ＩＩ類分解を引き下げるための方法に関する。

情報開示 果実の発育の最終段階である成熟は、果実組織における多数の劇的代謝変化を包 含している。この成熟プロセスの重要な態様は果実の軟化であり、これは主とし て細胞壁の改質に由来すると考えられている０代謝活性における多数の微妙な変 化がこの応答において含まれている。

従来の技術は成熟−損傷突然変異体、例えば旦り突然変異体であって果実の成熟 の研究に利用されているものを開示している。

ＴｉｇｃｈｅｌａａｒのＨｏｒｔｔｃ、Ｓｃｉ、　１３：５０８−５１３．１９ ７８　、　Ｌかしながら、果実の軟化を特異的にコントロールするためのこのよ うな突然変異体の利用は限られた有用性に出くわし、それはこのような突然変異 体の多面的性質による。

ペクチンの分解にとって重要な酵素であるポリガラクツロナーゼの活性の上昇は 果実の軟化に関与する。アンチセンス方向においてポリガラクツロナーゼｃＤＮ Ａと連結している植物プロモーターを含む組換構造体が作製されている。このよ うな構造体を成熟果実におけるこの酵素の活性を阻害せしめるためにトマトの中 に挿入した。

Ｓｍ１ｔｈ　らＮａｔｕｒｅ、３３４ニア２４−７２６，１９８８；５ｈｅｅｌ ｙ　らＰｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

８５：８８０５−８８０９．１９８８ｓＨｉａｔｔら、米国特許第４，８０１． ３４０号ＨＢｒｉｄｇｅｓら、ＥＰＯ公開番号第０．２７１，９８８号、このよ うな構造体はポリガラクツロナーゼ活性を阻害することが示されているが、果実 の軟化への影響は示されていない、　Ｓｍ１ｔｈら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．１４ ：３６９−３７９．１９９０゜エンド−１，４−β−グルカナーゼは果実の軟化 に関与するその他の酵素であると考えられている。これは主要半セルロース系ポ リマー、キシログルカンを分解することで知られる。　Ｈａｔｆｉｅｌｄ　ａｎ ｄＮｅｖｉｎｓ、Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏ１．．２７：５ ４１−５５２．１９８６１１　エンド−１゜４−β−グルカナーゼをコードする ｃＤＮＡ及び遺伝子はアボカド（Ｃｈｒｔｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ 　Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、、３：３８５，１９８４）及びそら豆（Ｔｕｃｋｅｒ ら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ｉｏ１．８８：１２５７，１９８８）からクローンさ れ、両者とも本明細書に参考として組入れている。

発明の概要 本発明は果実の軟化を引き下げ、且つ細胞壁ポリマーの分解を阻害する方法であ って、植物に、エンド−１，４−β−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列に由 来する少なくとも２０塩基対のＤＮＡサブ配列に作動連結している植物プロモー ター配列を有する発現カセットを導入せしめることを含んで成る方法に関し、こ こでこのＤＮＡサブ配列はこのプロモーター配列と、発現にとって反対の配向に おいて（即ち、アンチセンス方向において）連結されている。このプロモーター は誘発性又は構成的のいづれでもよい、もし誘発性であるとき、これはトマトＥ ８遺伝子に由来するのが好ましい。もし構成的なら、これはカリフラワーモザイ クウィルスの３５３プロモーターであることが好ましい。

本方法は前記の発現カセットに加えて、第２のグルカナーゼ又はポリガラクツロ ナーゼをコードする遺伝子に由来する少なくとも２０塩基対のサブ配列に作動連 結している植物プロモーター配列を有する第２の発現カセットを利用することに よって改良することができる。このその他のＤＮＡ配列もプロモーター配列と発 現にとって反対の配向において連結している。

本方法に適切な経済的に重要な収穫植物はトマト及びコシヨウを含む、この発現 カセットは植物の中にいづれの試験管内操作、好ましくはアゲロバクチリア（Ａ 　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ＋）を用いることによって導入できる。この発現カセ ットは性交配によって植物の中に導入することもできる。

本発明は更に、エンド−１，４−β−グルカナーゼの活性を阻害する方法であっ て、植物に、エンド−１，４−β−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列に由来 する少なくとも２０塩基対のＤＮＡサブ配列に作動連結している植物プロモータ ー配列を有する発現カセットを導入せしめることを含んで成る方法を提供し、こ こでこのＤＮＡサブ配列はこのプロモーター配列と、発現にとって反対の配向に おいて連結している。この酵素を阻止することにより、細胞壁の多１＊＊の分解 は阻害される。

本発明は更に、エンド−１，４−β−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列に由 来の少なくとも２０塩基対のＤＮＡサブ配列と作動連結している植物プロモータ ー配列を含んで成る発現カセットを提供し、ここでこのＤＮＡサブ配列はこのプ ロモーター配列と、発現にとって反対の配向において連結している。このプロモ ーターは誘発性、典型的にはＥ８プロモーターであっても、又は構成的、典型的 にはカリフラワーモザイクウィルスに由来していてもよい。

植物、好ましくはトマトであって、エンド−１，４−β−グルカナーゼをコード するＤＮＡ配列由来の少なくとも２０塩基対のＤＮＡサブ配列に作動連結してい る植物プロモーター配列を有し、ここでこのＤＮＡサブ配列がこのプロモーター と、発現にとって反対の配向において連結している発現カセットを含んでいるも のも提供する。

本発明は更に、介在されていな（、エンド−１，４−β−グルカナーゼをコード し、そして少なくとも一方の側に非野生型ＤＮＡが隣接するＤＮＡ配列を提供す る。このＤＮＡ配列は典型的にはトマトに由来のＤＮＡ配列である。

更に、介在されていな（且つエンド−１，４−β−グルカナーゼをコードするＤ ＮＡ配列と作動連結しているプロモーター配列を含んで成る発現カセットを提供 する。このＤＮＡ配列は典型的にはトマトに由来するｃＤＮＡ配列である。この プロモーター配列は原核及び真核生物の両者において機能する。

本発明は更にエンド−１，４−β−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列を植物 から単離する方法であって、エンド−１，４−β−グルカナーゼｃＤＮＡから保 存されている配列を含んで成るオリゴヌクレオチドプローブによって植物組織か ら作られたＤＮＡライブラリーを釣り出すことを含んで成る方法を提供する。こ のＤＮＡライブラリーはゲノム又はｃＤＮＡライブラリーのいづれでもよい。

この好ましい保存配列は 最後に、トマトエンド−１，４−β−グルカナーゼ由来のシグナルペプチドをコ ードするＤＮＡ配列と作動連結しているプロモーターを含んで成るＤＮＡ構造体 を提供し、ここでこのＤＮＡ配列は成熟トマトエンド−１，４−β−グルカナー ゼをコードする配列以外と連結している。

図面の簡単な説明 図１はｐＭＬＪｌ：Ｅ８　ａｎｔｉ　ＰＧ／ＣＬ及びｐＭＬＪｌ：ＣａｍＶａｎ ｔｉＰＧ／　ＣＬベクターの作製を図示する。

好ましい態様の説明 種々の農業的に重要な植物種において果実の軟化を引き下げる改善された方法を 提供する。この方法は、エンド−１，４−β−グルカナーゼ（グルカナーゼ）Ｄ ＮＡとその正常な発現にとって反対の配向において作動連結している植物プロモ ーターを有する発現カセットを植物細胞に形質転換せしめることを含んで成る。

アンチセンス方向においてその他のグルカナーゼＤＮＡ及び／又はポリガラクツ ロナーゼＤＮＡを含んで成る発現カセットも利用されうる。このグルカナーゼｃ ＤＮＡは植物又は細菌細胞において、この遺伝子の発現にとって適正な配向にお いて挿入することもできる。更に、同−又は異なる植物種からその他の遺伝子を 単離するために利用することができるエンド−１，４−β−グルカナーゼ遺伝子 の保存領域を含んで成る核酸プローブを提供する０本発明によって提供されるｃ ＤＮＡ配列は、任意の外来遺伝子と融合せしめたグルカナーゼシグナルペプチド を含んで成る、融合タンパク質を発現することのできるベクターを作製するのに 利用できる。このことは、植物細胞からの外来遺伝子生成物の分泌を提供する。

成熟プロセス中の果実の軟化の速度のコントロールは大いに経済的に重要である 。トマトの場合において、果実の軟化の阻止は、つるの上での成熟の間に新鮮な 商品トマトが堅くあり続けることを可能とする。つる上の成熟トマトは緑色の間 に採取されたものよりも優れた風味及び色調を存する。果実の成熟は病原耐性を 強めることによって果実の品質も向上させる。このような特性はトマトの果実の より長い貯蔵及び運送寿命を可能にする。細胞壁分解の阻止は果実の粘性及び堅 さを高めることによってトマトの果実の加工特性も向上させる。

本発明は種々の農業上重要な種における１もしくは複数種のグルカナーゼの活性 を阻害することによつて果実の軟化を引き下げる方法を提供する。典型的な例に おいて、果実の成熟中にこの遺伝子の活性をコントロールするためのアンチセン スＤＮＡを含んで成る発現カセットを作り上げるためにトマトグルカナーゼ遺伝 子由来のｃＤＮＡを利用する。

適切なベクターの中にアンチセンスｃＤＮＡ配列を導入するために組換えＤＮＡ 技術を利用し、これを次に適切な宿主細胞に形質転換せしめる。典型的なケース において、究極宿主であるトマト細胞へのｃＤＮＡの搬送のための媒体としてア ゲロバクチリア　トウメヱＬ之工Ｚ（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ　ｔｕ＋ｗｅ ｆａｃｉｅｎｓ　）を利用している。この形質転換細胞から再生した植物は、該 酵素の活性を阻害するアンチセンスＤＮＡを転写する。植物細胞において、ｃＤ ＮＡは遺伝子の発現を、ｍＲＮＡの増加を妨げることによって阻害し、これはこ の遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを引き下げる。

５ｈｅｅｈｙら、前記。

以下の説明は植物細胞において外来ＤＮＡ配列を導入及び発現するのに有用な種 々の方法を詳細する。好ましい方法の特定の例も説明する。

まとめると、アンチセンスグルカナーゼｃＤＮＡを調製するため及びそれらを植 物細胞へと導入せしめるために必要な操作は、１）成熟果実からｍＲＮＡを単離 し、２）このｍＲＮＡからｃＤＮＡを作り、３）所望の配列に関するｃＤＮＡを スクリーンし、４）この所望の配列を植物プロモーターと、このグルカナーゼ遺 伝子の発現にとって反対の配向において連結し、５）適切な宿主植物細胞を形質 転換し、そして６）この逆になっている配列を転写する細胞を選び、そして再生 せしめることを含む。

１、二股１迭 一般に、本明細書に用いている学術用語及び以下に詳細の組換ＤＮＡ技術におけ る研究室工程はよく知られ且つ当業界において一般的に利用されているものであ る。クローニング、ＤＮＡ及びＲＮＡ単離、増幅並びに精製のために標準的な技 術を利用した。ＤＮＡＩＪガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアー ゼ等を含む一般的な酵素反応はその製造者の仕様書に従って行った。このような 技術及び種々のその他の技術は５ａｓｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ ｏｎｉｎ　−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ 、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９に従って一般的に行った。このマニュアル以後 ｒ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊとして引用する。その他の一般的な文献を本明細書に わたって提供する。それらの方法は当業界においてよく知られているものと考え 、そして読み手の便宜上提供した。その中に含まれている全ての情報を本明細書 に参考として組入れている。

Ｕ、ｘン′−４−−グル力　−ゼｃＤＮＡの１種々のグルカナーゼ遺伝子からｃ ＤＮＡを調製するため、成熟果実からますｍＲＮＡを単離した。真核ｍ　ＲＮ　 Ａはその３′末端に、　。

ポリ−八尾部として知られるアデニンヌクレオチド残基の鎖を有する。

次にオリゴｄ−Ｔヌクレオチドの短い鎖をこのポリ−八尾部にハイブリダイズさ せ、そして逆転写酵素のプライマーとして働かせた。

この酵素はＲＮＡを相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）ｌ［の合成のための鋳型として利 用する０次に第２のＤＮＡ１［を、鋳型としてこの第１ｃＤＮＡ饋を利用して合 成した。　Ｅ、２ｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ）における増幅のためのプラスミド又はλフ アージベクターへの挿入のためにリンカ−をこの二本＄ｌｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに付加 した。

所望のｃＤＮＡを保育するクローンの同定は、核酸ハイブリダイゼーシヨン又は もし発現ベクターを用いたなら、コード化タンパク質の免疫学的検出のいづれか によって行った。この細菌コロニーを次にニトロセルロースフィルター上にレプ リカプレートした。この細胞を溶解せしめ、そして所望のｃＤＮＡに相補性のオ リゴヌクレオチド又は所望のタンパク質に対する抗体のいづれかとプローブせし めた。

以下に詳細の典型的なケースにおいて、アボカド及びそら豆の両者において見い 出せる高（保存された領域（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎら、前記及びＴｕｃ ｋｅｒら前記を参照のこと）を、トマト果実ｃＤＮＡライブラリーをスクリーン するための同義性（ｄｅｇｅｎｅｒａ　ｔｅ）オリゴヌクレオチドプローブを作 製するために用いた。交差−ハイブリダイゼーシゴン実験は、グルカナーゼ遺伝 子の種類（ファミリー）がトマト果実の成熟中に発現されることを示唆した。こ の種類の中の３種の遺伝子をｔｅｌｌ、　ｔｃ１２及びｔｃ１３として同定した 。

ｔｃｌｌｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列Ｎｏ、１）を以下の表１に紹介する 。このｃＤＮＡはアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｊｌｌ ｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄに１９９０年４月２０日に寄託し、その承認番号はＮｏ、 ６８３１２である０表２はｔｃ１２ｃＤＮＡの部分のヌクレオチド配列である（ 配列Ｎｏ、２）、この配列は表１に紹介したｔｃｌｌヌクレオチド配列における ヌクレオチド３１９〜４２３に相当する。この配列は多数の方法のうちのいづれ において利用できる０例えば、この配列のフラグメントはその他の植物種から作 り上げたゲノム又はｃＤＮＡライブラリーにおけるその他のグルカナーゼ遺伝子 を同定するためのプローブとして利用できる。

このｃＤＮＡは植物細胞におけるこのグルカナーゼ遺伝子の発現を阻止するため に、発現カセットにアンチセンス方向において挿入することができる。このｃＤ ＮＡ配列はそれ自体を、細菌又は植物細胞における発現のために発現カセットに 挿入することができる。

細菌へのこの発現カセットの挿入は、エタノール又はメタノールへの植物組織の バイオマス変換（ｂｉｏｍａｓｓ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）のために有用である 。

紹介する配列は、他のタンパク質に融合したグルカナーゼ酵素の一部を含んで成 る融合タンパク質の発現のために利用することもできる０時に注目されるのはこ のタンパク質の一過性ペプチド配列である。当業界によく知られている通り、細 胞膜を通って輸送されたタンパク質は約１５〜３０アミノ酸の長さの疎水性アミ ノ酸に冨んだＮ−末端配列を有する。膜の通過のプロセスの際、時折り、このシ グナル配列はシグナルペプチダーゼによって切断される。　Ｗａｔｓｏｎら、Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ一旦ｒｅ　Ｇｅｎｅユ頁７３１，１９８７ 　、従って、トマトのエンド−１，４−β−グルカナーゼ遺伝子のシグナルペプ チドコード化配列をその他の外来性の構造遺伝子に連結させて、細胞壁へ外来遺 伝子生成物を輸送せしめることができうる。この外来構造遺伝子は細菌、酵母、 動物又は植物を含む任意の起源に由来しうる。典型的には、このシグナルペプチ ドコード化配列をその３′末端で、外来構造遺伝子への連結のためのリンカ−に 、適切な解読枠において連結させるであろう。対象の外来遺伝子は、炭水化物及 び細胞壁代謝酵素、例えばインベルターゼ、デキストラスクラーゼ、レバンスク ラーゼを含む。疾患耐性に関与するタンパク質、例えばキチナーゼ、ヒドロキシ タンパク質に富む糖タンパク質及びポリガラクッロナーゼ阻害タンパク質をコー ドする遺伝子も対象となる。

表　１ トマトエンド−１，４−β−グルカナーゼの配列表２ 所望の組換えベクターは、植物におけるアンチセンスｃＤＮＡの転写を開始せし めるためにデザインされた発現カセットを含んで成りうる。細菌又はウィルス起 源のそれに付随する配列もこのベクターが細菌又はファージ宿主の中にクローン されるようにさせるために含ませる。

このベクターは好ましくは広域宿主範囲原核生物複製起点を含む。

この所望の構造体を保有する細菌細胞の選別を可能とするために選択マーカーも 含ませるべきである。適切なる原核細胞選択マーカーには、抗生物質、例えばカ ナマイシン又はテトラサイタリンに対する耐性が含まれる。

その他の機能をコードするその他のＤＮＡ配列もこのベクターに存在させてよく 、これは当業界に知られている１例えば、アゲロバクチリアの形質転換の場合、 Ｔ−ＤＮＡ配列も植物染色体へのその後の転移のために含ませることができる。

もし細菌におけるグルカナーゼｃＤＮＡの発現を所望するなら、細菌性発現ベク ターを用いることができる。細菌への発現ベクターの挿入はエタノール又はメタ ノールへの植物組織のバイオマス変換に慕いて有用である。細菌性発現ベクター の作製は典型的には強力な細菌性プロモーターの下流にｃＤＮＡを置くことによ って行われる。利用されうる細菌性プロモーターの例には、β−ラクタマーゼ、 β−ガラクトシダーゼ及びファージλｐＬプロモーターが含まれる。

細菌におけるｍＲＮＡの翻訳の効率性はリポソーム結合性部位の存在及びその転 写開始コドンからの距離に本質的に依存する。

植物における発現のため、この組換発現カセットはこの所望の配列の他に、植物 プロモーター領域、転写開始部位（もしこの転写すべき配列がそれを欠いている なら）及び転写終結配列を含むであろう、このカセットの５′及び３′末端での 固有制限酵素部位は、典型的には予め存在しているベクターへの容易な挿入を可 能とするために含まれている。

真核細胞遺伝子発現をコントロールする配列は既にかなり研究されている。プロ モーター配列因子にはＴＡＴ＾ボックス共通配列（ＴＡＴＡＡＴ）が含まれ、こ れは通常転写開始部位の２０〜３０塩基対（ｂｐ）上流にある０便宜により、こ の開始部位を＋１と称する。５′　（上流）方向に広がる配列は負の数字で示し 、そして３′　（下流）方向に広がる配列は正の数字で示す。

植物において、ＴＡＴＡボックスから更に上流の−８０〜−１００の位置にて、 典型的にはトリヌクレオチドＧ（又はＴ）ＮＧを囲む一連のアデニンを有するプ ロモーター因子が存在している。　Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｇｅｎ旦チェ」随工 崩ｊシ１ユＬユｎ　Ｐｌａｎｔｓ−頁２２１−２２７（Ｋｏｓａｇｅ、Ｍｅｒｅ ｄｉｔｈ　ａｎｄＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ　＊、　１９８３）　ａ組織特異性、環 境シグナルへの応答又は転写の最大効率性を授けるその他の配列もプロモーター 領域において見い出すことができる。このような配列は通常転写開始部位の４０ ０ｂｐ以内に見い出せるが、２０００ｂｐ以上離れていることもある。

異種間のプロモーター／構造遺伝子の組合せの作製において、このプロモーター は、その自然における転写開始部位からとおよそ同程度の変更はプロモーター機 能の損失を伴うことな（許容されうる。

この発現カセットに利用される特定のプロモーターは本発明の非本質的な観点で ある。植物細胞において転写をもたらす多数のプロモーターのうちのいづれも適 切でありうる。このプロモーターは構成的であっても誘発性であってもよい、細 菌起源のプロモーターにはオクトパインシンターゼプロモーター、ツバリンシン ターゼプロモーター及び天然Ｔｉプラスミドに由来するその他のプロモーターが 含まれる。　Ｈｅｒｒａｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ、３０３：２ ０９−２１３．１９８３　、ウィルス性プロモーターにはカリフラワーモザイク ウィルスの３５Ｓ及び１９ＳＲＮＡが含まれる。　０ｄｅ１１　ら、Ｎａｔｕｒ ｅ、３１３：８１０−８１２．１９８５　。

可能な植物プロモーターにはツブロース−１，３−ビホスフエートカルボキシラ ーゼ小サブユニットプロモーター及びフエーズオリン（ｐｈａｓｓｏｌｉｎ）プ ロモーターが含まれる。Ｅ８遺伝子及びその他の遺伝子であってその発現がエチ レンによって誘発されるもの由来のプロモーター配列も利用できる。Ｅ８プロモ ーターの単離及び配列はＤｅｉｌｖａｎ　ａｎｄ　Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＥＭＢＯＪ 、　７：３３１５−３３２７．１９８８に詳しく説明され、これは本明細書に参 考として組入れている。

プロモーター配列に加えて、この発現カセットは効率的な終結を提供するために この構造遺伝子の下流に転写終結領域も含むべきである。この終結領域はこのプ ロモーター遺伝子と同一の遺伝子から得るか、又は異なる遺伝子から得ることも できる。

もしこの構造遺伝子によってコードされるｍＲＮＡが効率的に翻訳されるなら、 ポリアデニル化配列も一般にこのベクター構造体に付加する。　Ａｌｂｅｒ　ａ ｎｄ　Ｋａｗａｓａｋｉ、　Ｍｏ１ｏ　ａｎｄ　Ａ　１．Ｇｅｎｅｔ　１：４１ ９−４３４゜１９８２、ポリアデニル化は植物細胞におけるグルカナーゼｃＤＮ Ａの発現にとって重要である。ポリアデニル化配列には１３６三Ｚ９乙至Ｊ−ヱ 　オクトパインシンターゼシグナル（Ｇｉｅｌｅｎら、ＥＭＢＯＪ、　３：８３ ５−８４６、１９８４）又はツバリンシンターゼシグナル（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら 、Ｍｏｌ。

」皿」ｕＬ堕ｎｅｔ　１：５６１−５７３．１９８２）が含まれるが、それらに 限定されない。

このベクターは典型的には選択マーカーも含み、これによって形質転換された植 物細胞は培養において同定されうる０通常、このマーカー遺伝子は抗生物質耐性 をコードするであろう、このようなマーカーには０４１８　、ヒグロマイシン、 プレオマイシン、カナマイシン及びゲンタマイシンに対する耐性が含まれる。植 物細胞を形質転換せしめた後、このベクターを有するこれらの細胞は特定の抗生 物質を含む培養中における増殖するその能力によって同定されるであろう。

■、　におけるエンド−１４−−グルカナーゼアンチセｌ入！旦凡Δ二転亙 Ａ、　による　の７− １、　直接的形質転換 上記のベクターは、この組換ＤＮＡを機械的に搬送するマイクロピペットの利用 によって植物細胞の中に直接的にマイクロインジェクトすることができる。　Ｃ ｒｏｓｓｗａｙ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　２０２：１７９ −１８５．１９８５　、この遺伝子物質はポリエチレングリコールを用いて植物 細胞に入れることもできる。　Ｋｒｅｎｓ　ら、ハ旦匹１皿紅７２−７４．１９ ８２゜核酸セグメントのその他の導入方法は、小ビーズもしくは粒子内又は表面 上のいづれかに核酸を有する小粒子による高速弾道貫入法である。　Ｋｌｅｉｎ 　ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７．７０−７３．１９８７゜更なる導入の他の方法は 、ミニ細胞、細胞、リゾソーム又は他の融合性脂質表層化体のいづれかのその他 のものとのプロブラストの融合である。　Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ＋　７９＋１８５９−１８６３＋１９８２゜ このＤＮＡはエレクトロポレーションによって植物細胞に導入することもできる 。　ｐｒｏｓｅ　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ、８２ ：５８２４（１９８５）。

この技術において、植物のプロトプラストを発現カセットを含むプラスミドの存 在下においてエレトクロボレートせしめる。高電場の強さの電気的衝撃は生体膜 を可逆的に浸透性にし、プラスミドの導入を可能にする。エレトクロボレートさ れた植物プロトプラストはその細胞壁を修復し、分裂し、そして再生する。

２　ベタ　−のノ　− カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ　）は植物細胞にアンチセンスＤＮＡ を導入するためのベクターとして利用されうる（Ｈｏｈｎら、１９８２’　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔユｕｍｏｒｓ″Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ＋ＮｅｗＹｏｒｋ、頁５４９−５６０；■ｏｗｅ１１の米国特許 第４．４０７，９５６号）、詳細されている方法に従うと、ＣａＭＶウィルス性 ＤＮＡゲノム全体を親線菌性プラスミドに挿入して組換ＤＮＡ分子を作り、これ は細菌において増幅されうる。クローニングの後、この組換えプラスミドを、所 望の配列をこのプラスミドのウィルス部分における固有制限部位に導入せしめる ことによって更に改質せしめる。この組換プラスミドの改質ウィルス部分を次に 親線菌性プラスミドから切り出し、そして植物細胞又は植物を感染せしめるのに 用いる。

植物細胞の中にＤＮＡを導入する他の方法は、この遺伝子によって予め形質転換 せしめた７　ｆ　Ｏｔ＜２ｍ　トウメツアシエン又は紅　ユｊヱヱ（Ａ、ｒｈ■ ｇ■）によって植物細胞を感染させることである。当業界に知られる適切な条件 のもとで、この形質転換植物細胞を増殖させて苗条又は根を形成し、そして更に 植物へと発育させる。

１ヱ’ｏＲ９−Ｉ　７−はグラム陰性科リゾビアシー（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａ ｅ）の代表的な属である。この種はクラウンゴール（Ａ、王立／７二之工Ｚ）及 び毛状根病（Ａ、ユスエｌ）の原因である。クラウンゴール腫瘍及び毛状根にお ける植物細胞はオパインとして知られるアミノ酸誘導体を生産するように誘発さ れ、これは細菌によってのみ異化代謝される。オパインの発現の原因である細菌 性遺伝子はキメラ発現カセットに関するコントロール因子の便利な起源である。

更に、オパインの存在のアッセイは形質転換組織の同定に利用できる。

異種遺伝子配列はＬ　ウメフ　ジエンのＴｉプラスミド又は紅ユ／ヱｌのＲｉプ ラスミドの手段によって適切な植物細胞に導入せしめることができる。このＴｉ 又はＲｉプラスミドはアゲロバクチリアによる感染に基づいて植物細胞に移され 、そしてこれは植物ゲノムの中に安定的に組込まれる。　Ｊ、５ｃｈｅ１１，５ ｃｉｅｎｃｅ、２３７：１１７６−１１８３、１９８７゜ Ｔｉ及びＲｉプラスミドは形質転換細胞の製造のために本質的な二つの領域を含 む、このうちの一方は転移ＤＮＡ　（Ｔ−ＤＮＡ）と呼ばれ、これは植物の核に 転移され、そして腫瘍又は根の形成を誘発する。他方はヴイルレンス（ｖｔｒ　 ）　ｔｄ域と呼ばれ、これはＴ−ＤＮＡの転移にとって本質的であるがそれ自身 は転移されない、このＴ−ＤＮＡは、この紅り領域が異なるプラスミド上にある ときでさえも植物細胞に転移されうる。　Ｈｏｅｋｅｍａら、Ｎａｔｕｒｅ、３ ０３：１７９−１８９゜１９８３、この転移されたＤ　Ｎ　Ａ　ｗ！域は、その 転移される能力が影響されることなく、異種ＤＮＡの挿入によってそのサイズが 増大することができる。疾患の原因となる遺伝子の欠失せしめた改質Ｔｉ又はＲ ｉプラスミドが、本発明の遺伝子構造体の適切な植物細胞への導入のためのベク ターとして利用できる。一般的な以下の方法において組換Ｔｉ及びＲｉプラスミ ドの作製は、典型的には一般的な細菌ベクター、例えばｐＢＲ３２２と一緒に利 用される。天然プラスミドに時折り見い出せる及び外来配列から時折り作製され るアセクサリー遺伝子因子が更に利用できる。これらは「シャトルベクターＪ　 （Ｒｕｖｋｕａａｎｄ　Ａｕ５ｕｂｅｌ、１９８１．Ｎａｔｕｒｅ　２９８：８ ５−８８）　％プロモーター（Ｌａｗｔｏｎら、１９８７、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ ．Ｂｉｏｌ、９：３１５−３２４）及び選別因子としての抗生物質耐性のための 構造遺伝子（Ｐｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、８０ ：４８０３−４８０７、１９８３）が含まれるがそれらに限定されない。

７　／／　Ｏｔ＜り」１丈１−によって形質転換されることができ、そして完全 植物へと再生することができる全ての植物細胞は本発明に従って形質転換されて 所望のＤＮＡを含む形質転換外植体を提供することができる。植物細胞をアゲロ バクチリアによって形質転換するには二通りの一般的な方法がある： （１）アゲロバクチリアを単離化プロトプラストと一緒に培養する、又は （２）完全細胞もしくは組織のヱｌ三バＬカ１ヱによる形質転換。

方法（１）はプロトプラストの培養及びその後の培養プロトプラストの植物再生 を可能とする樹立された培養系を必要とする。

方法（２）は、（ａ）完全植物組織、例えば子葉がアゲロバクチリアによって形 質転換されうること、及び（ｂ）形質転換細胞又は組織が誘発されて完全植物へ と再生できることを必要とする。

はとんどの双子葉植物の種はアゲロバクチリアによって形質転換されうる。アゲ ロバクチリアにとって天然の植物宿主である全ての種は試験管内で形質転換され うる。単子葉植物、特に穀類はアゲロバクチリアの天然宿主でない、ヱ２ヱを用 いるそれらの形質転換の試みは最近まで成功していなかった。　Ｈｏｏｙｋａｓ −ＶａｎＳｌｏｇｔｅｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３１１ニア６３−７６４．１９ ８４、一定の単子葉植物はヱｌ旦バ久±ユヱによつて形質転換されうる実証が出 てきている。新規なる実験手法を利用することにより、穀類の種、例えばライ麦 （ｄｅ　Ｉａ　Ｐｅｎａら、Ｎａｔｕｒｅ　３２５：２７４−２７６．１９８７ ）、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：２０４−２０７ ．１９８８）及びコメ　（Ｓｈｉｓ＋ａｍｏｔｏ　ら、口旦朋３３８：２７４− ２７６、１９８７）が現在形質転換されうる。

Ｂ、／　−の゛　１　び 形質転換の後、該アンチセンスＤＮＡを含んで成る形質転換植物細胞又は植物を 同定しなくてはならない０選択マーカー、例えば前記したものが典型的に利用さ れる。形質転換植物細胞はこの細胞を適切な抗生物質を含む増殖培地において増 殖せしめることによって選別できる。オパインの存在もこの植物がアゲロバクチ リアによって形質転換されているかどうかのために利用できうる。

形質転換された細胞を選別した後、所望の異種遺伝子の発現を確認することがで きる。挿入されたＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡの簡単な検出は当業界に よく知られた方法、例えばノーザンプロットハイブリダイゼーシジンによって行 われうる。同様に挿入された配列はサザンプロットハイプリダイゼーシッンによ っても同定できる。例えば前記したＳａ＊ｂｒｏｏｋを参照のこと。

該アンチセンスＤＮＡの存在の確認の後、完全植物の再生が所望される。プロト プラストが単離でき、且つ完全に再生した植物を得るように培養できる全ての植 物は本発明によって形質転換されうる。

いくつかの適切な植物には、例えば以下の属、イチゴ（ｋ組肛凰）、ミヤコグサ （Ｌｏｔｕｓ）　、ウマゴヤシコ姐江吐吐、イガマメ（０口ｏｂｒｃｈｉＳ）、 シャクジクソウ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕａ＋）、レイショウコラ（ｋｎ並旦釦）　、 サザケ（■［紅、ミカン（Ｃｉｔｒｕｓ）　、アマ（Ｌｉｎｕｍ）、フロラソウ （Ｇｅｒａｎｉｕｇ＋）　、イモツキ（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ニンジｙ　（Ｄａｕ ｃｕｓ）　、シロイヌナズサ（Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓ ｉｃａ）　、ダイコンｐ、シロガラシ（鉦旦紅■、オオカミナスビ（ｕ皿匹）　 、トウモロコシ（堕匹江憇）、チョウセンアサガオ（ｈ組■）、ヒヨス（ｈ競り 並用）、トマト（町並餞■江匹）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ナス（鎖凰 …畦、シクバネアサガオ（ｐ＠ｊｕｎｉａ）、ジギタリス（…紅組比ａ、ハナハ ッカ（ハ且ユ匝）　、チコリ−（７、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、アキ ノノゲシ（Ｌａｃｔｕｃａ）、スズメノチ中ヒキ（Ｂｒｏｓｕｓ）　、フサスギ ガラ（ハ註胆■紅、キンギツウソウ（紅豆ｒｒｈ　ｉ匹畦、ヘレロカリス（Ｈｅ ｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ）　、アフリカランラン（ｈ肚紅吐、テンジクアオイ（ハ 旦」並ｈ１、キビ（ｈ旦臼１、チカラシバ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）　、キンポ ウゲ（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）　、キオン（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、サルメンバナ困 虹紅れ競紅■、キエウリ剋匹胆艮）、ルリマガリバナ旦皿髭虹圏）、タイス（虹 匹旦畦、ドクムギ（ｋ旦憇）、トウモロコシ（回、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ） 　、モロコシ（トユ蝕畦、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）、オランダミツバ（並ｎ般、及 びチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕ■）由来の種が含まれる。

培養プロトプラストからの植物再生はＥｖａｎｓら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆＰ ｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ上ｔｕｒｅｓ　Ｖｏｌ、　１　：　（ＭａｃＭｉｌｌ ａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９８３）；並びにＶ ａｓｉｌ　１．Ｒ，（ｅｄ、）、Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｏｍａ ｔｉｃＣｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐ１ａｎｔｓ＋　Ａｃａｄ、　Ｐｒ ｅｓｓ＋０ｒｌａｎｄｏ、Ｖｏｌ、Ｉ＋　１９８４、及びＶｏｌ、　ＩＩｌ、１ ９８６に詳細されている。

実用的な全ての植物が培養細胞又は組織から再生されうろことが知られており、 それにはさとうきび、てんさい、ねた、果実種及びマメ類が含まれるがそれらに 限定されない。

再生の手段は植物の種間で変わるが、一般に形質転換プロトプラストの懸濁物又 は形質転換外植体を含むぺ）　ＩＪ皿をまず用意する。

カルス組織が形成され、次いで苗条がカルスより誘発され、そしてその後発根す る。一方、胚形成がカルス組織において誘発されうる。

これらの胚は天然の胚のように発芽して植物を形成する。この培養培地は一般に 種々のアミノ酸並びにホルモン、例えばオーキシン及びサイトカイニンを含みう る。この培地にグルタミン酸及びプロリンを加えることが、特にトウモロコシ及 びムラサキウマゴヤシのような種にとって有利でもある。効率的な再生は培地、 ゲノムタイプ及び培養物の履歴に依存するであろう、この３種の変異因子がコン トロールされたなら、再生は通常再現よく、且つ反復性である。

該発現カセットが遺伝子導入植物に安定的に組込まれた後、これを性交配によっ て他の植物に伝搬することができる。多数の標準的な繁殖技術のいづれもが、交 配すべき種に応じて利用できる。

■、定Ｉ 「エンド−１，４−β−グルカナーゼ」又は「グルカナーゼ」なる語は、β−１ ，４−グルカン結合を切断し且つカルボキシメチルセルロースを分解することの できる植物酵素のクラスの構成員を称する。このような酵素は結晶性セルロース を分解せず、そしてそ蜘故一定のａｒｍ性セルラーゼと区別できる。このクラス は、それぞれの構成員がアミノ酸配列ＧＧＹＹＤＡＧＤＮ又はＣＷＥＲＰＥＤＭ Ｄと実質的に相同な高く保存された領域を含むことで同定されうる。

各植物の種はグルカナーゼ異賀対立遺伝子の種類を含む、このグルカナーゼ種類 における遺伝子は例えばそのヌクレオチド配列、その発現の一過性パターン及び それらが発現される組織によって同定できる。典型的には、本発明のグルカナー ゼ遺伝子の発現は（例えばｍＲＮＡのレベルによって測定される通り）、一般に 果実の成熟の発育を追う。

ｒＤＮＡ配列」なる語は、５′から３′末端へと読まれるデオキシリボヌクレオ チド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを称する。これは自己複製プラスミド、感 染性ＤＮＡのポリマー及び非機能的ＤＮＡを含む。

「プロモーター」なる語は、構造遺伝子から上流にあり、そしてＲＮＡポリメラ ーゼ及びその他の転写を開始せしめるタンパク質を認識且つ結合するのに関与す る領域を称する。「植物プロモーター」とは植物細胞において転写を開始せしめ ることのできるプロモーターである。

「植物」なる語は完全植物、植物の器官（例えば葉、茎、根等）、種子及び植物 細胞を含んでいる。

「適切なる宿主」なる語は、組換えプラスミド、ＤＮＡ配列又は組換え発現カセ ットと調和し、そしてプラスミドが複製でき、そのゲノムに組込まれることがで き、又は発現されることができることを可能とする微生物又は細胞を称する。

「発現」なる語は、構造遺伝子が転写且つ翻訳され、これによってタンパク質が 合成されることを称する。

「構成的」プロモーターとは、はとんどの環境的条件、及び発育又は細胞分化の 状態のもとで活性であるプロモーターである。

「誘発性」プロモーターとはより厳格な環境又は発育のコントロール下にあるプ ロモーターである。誘発性プロモーターによる転写に影響を及ぼしうる環境条件 の例は、嫌気性条件又は光の存在を含む０発育コントロール下にあるプロモータ ーの例には、一定の組織においてのみ転写を開始するプロモーター、例えば成熟 果実においてエチレンによって誘発されるＥ８遺伝子由来のプロモーターが含ま れる。

「発現にとって反対の配向」なる語は、天然の配向に対して逆さまの状態におい て発現カセットに挿入された、構造遺伝子由来の二本ＭＤＮＡ配列を称する。特 に、正常では「鋳型鎖」である鎖はコード鎖となり、そしてその逆もまた同じで ある。

「介在されていない」なる語は介在する非翻訳配列を欠く解放解読枠を含むＤＮ Ａ配列を称する。

「非野生型ＤＮＡ、なる語は、天然環境において一定のＤＮＡと隣り合っていな いＤＮＡ配列を称する。

以下の実験結果を限定でなく例示を目的として提供する。

例■ 本例はグルカナーゼｃＤＮＡの単離及び植物細胞の形質転換のために適切なアン チセンス発現ベクターの作製を詳細する０例示のみの目的のため、例示のベクタ ーはｔｃｌｌアンチセンスＤＮＡを含んで成る。その他のグルカナーゼ遺伝子も この開示した方法において有意なる改質を伴うことなく利用できることが理解さ れるであろう。

ベクタｍｍｃＤＮＡライブラリーを標準の方法を用いて調製した。

このライブラリーは、本明細書に参考として組入れた、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、 組肥、３１　ニア９−８９．１９８４の方法によって、成熟トマト果実ポリ−Ａ ＲＮＡ由来のベクターｐＡＲＣ７のクローニングにおいて調製した。

２、ｃＤＮＡ−イブ−１−のスクｊ−ニングａ、コロニーの増殖 赤い成熟トマト由来のｃＤＮＡライブラリーを含む８８１０１細胞を希釈し、そ して１０１のルリア培地（ＬＢ）当り約５０００のコロニーを提供する希釈液を 作った。小分けした１０ｍ１の凍結細菌懸濁物を１０枚の１３２−腸のニトロセ ルローフイルター上で吸引濾過し、次にそのコロニー側を１００μｇ７’ｓｌの アンピシリンを含むＬＢ−寒天プレート上に置いた。コロニーが約０．５　ａｍ の直径となるまでこのプレートを３７°Ｃでインキュベートした。

ｂ、レプリカブレーティング マスターフィルターをこのプレートから取り出し、番号付けをし、そして黒イン クで配向マークを付けた。新たなフィルターを新鮮なＬＢプレート上で濡らし、 そしてこれを各マスターフィルターの上に載せ、そして配向マークをレプリケー トにコピーせしめた。このコロニー転写の工程を第２の新たなフィルターで繰り 返し、一枚のマスターフィルター当り二枚のレプリカフィルターを作った。コロ ニーが約０．５−一となるまでレプリケートをＬＢ−寒天プレート上で３７℃で 増殖させ、その後１５０μｇ／■ｌのクロラムフェニコールを有するＬＢ寒天を 含むプレートに移した。これを３７℃で１２時間増殖させた。

Ｃ３細菌性コロニー溶解 プレートからレプリカフィルターを取り、そしてコロニー側を上にして室温にて 、０．５ＭのＮａＯＨ／１．５　ＭのＮａＣ１で濡らしたーｈａｔｍａｎａＭＭ 紙のシート上に置いた。　１０分後、フィルターを乾いた３Ｍ紙上にプロットし 、そしてＩＭのトリスｐＨ７／１．５　ＭのＮａＣ１で濡らした３ＭＭ紙に２分 間転写させた。このフィルターを３ｘのＳＳＣに１５分浸し、乾いた３ＭＭ紙に 載せ、そして風乾し、真空のもとて２時間、８０℃で熱した。

ｄ、オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションこの熱したフィル ターから細菌の塊を、３ｘのＳＳＣ１０，１％のＳＤＳで６２℃で２４時間洗う ことで除去し、その間この洗浄液は新鮮な洗浄液で３回交換した。このフィルタ ーをまとめて、６ｘのＳＳＣ。

ｌｘのデンハーツ溶液、０．５％のＳＯ５、０，０５％のＮａＰＰ１及び０．１ ｗｇ／ｓ＋１の煮沸し且つ水冷したサケ精子ＤＮＡと３７℃で一夜予備ハイブリ ダイズさせた。この２０枚のフィルターを次に２グループのハイブリダイゼーシ ョンのためのレプリケートに分けた。

２種類の２６塩基オリゴヌクレオチドプローブをＤＮＡ合成装置にて合成した。

プローブ配列は、グルカナーゼの二つの領域に相当し、これはそら豆分離帯グル カナーゼ及びアボカド果実グルカナーゼにおけるアミノ酸レベルにて完全に保存 されていた。オリゴヌクレオチドを１０５Ｍのトリス−ＥＤＴＡ　（ＴＥ）　ｐ Ｈ８に溶解し、そしてＴＢ−飽和ブタノールで抽出した；これを次に酢酸アンモ ニウム中で０．３Ｍに調整し、そして４容量のエタノールによって一８０℃で沈 殿させた。ＤＮＡを遠心により集め、そして？［＋　ｐＨ８中でｌａｇ／ｍｌに した。

１μｇのそれぞれのオリゴヌクレオチドをＴ４ＤＮＡポリメラーゼラベリングシ ステム（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）によって、その製造 者によって供給されたプロトコールに従い、３！Ｐ−＾ＴＰで末端ラベルした。

各プローブの比活性は５　ｘｔｏ’ｃｐ■／μｇを超えていた。

レプリカフィルターのそれぞれのセットを、１５ｍ１のハイブリダイゼーシッン 緩衝液及び煮沸且つ氷冷せしめた放射性標識したプローブの一方を含むハイブリ ダイゼーシジンバッグの中で４２°Ｃにて一夜インキュベートした。ハイブリダ イゼーション媒体は６ｘのＳＳＣ。

ＩＸのデンハーツ溶液、０．０５％のＮａＰＰ１及び０．１　ｍｇ／ｍｌの煮沸 且つ氷冷したサケ精子ＤＮＡである。

これらのフィルターを４２°Ｃで、６ｘのＳＳＧ　、　０．０５％のＮａＰＰ１ 中で数時間、緩衝液を数回変えながら洗った。これらを次にＫｏｄａｋ　Ｘ−０ −Ｍａｔ　ＡＲフィルムに、−８０°Ｃで２４時間、増強スクリーンを用いなが ら暴露せしめた。このフィルムを現像し、そしてグルカナーゼプローブ配列を含 むクローンを、対応のマスタープレート上の配向マークとこのフィルム上のそれ とを比較することで同定した。

ｅ、推測グルカナーゼクローンの第２スクリーニンググルカナーゼオリゴヌクレ オチドプローブによって同定したコロニーを無菌のつまようじによって拾い、１ ■ｌのＬＢに分散し、そして３７℃で２．５時間振騰させながらインキュベート した。この懸濁物を次に５００．０００倍に希釈し、そして８２ｍ５のニトロセ ルロースフィルターを介して小分けした５■ｌの水冷ＬＢ中で吸引濾過した。こ れらを３７℃で、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天上で８時間増 殖させ、次いで１５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレー トに移した０次にこれらを３７℃で１２時間インキュベートした。このフィルタ ーを上記の段階３及び４の通りに、放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブ によって処理且つスクリーンした。この第２スクリーンにおいて同定した２８種 のグルカナーゼクローンそれぞれの単一コロニーを３■ｌのＬＢチアンシリンに 移し、そして３７℃で一夜増殖させた。交差ハイプリダイゼーシ四ン実験は、こ のクローンが３つの異なるクラスｔｃｌｌ、　ｔｃ１２及びｔｃｌｌ３へとまと めることができることを示した。

ｆ、グルカナーゼクローンのサザン分析ミニブレブＤＮＡをＫｒａｆｔら、Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　６　（６）　：　５４４−５４６（本明細書に参考と して組入れる）の方法によって細菌培養物から単離した０次にこのＤＮＡをＳｍ ａｌ制限酵素によって２．５時間、標準の条件のもとで消化し、それらの個々の ｐＡｒｃベクターからクローン化グルカナーゼインサートを遊離させた。消化生 成物を、アボカドグルカナーゼｃＤＮＡ及びトマトポリガラクツロナーゼｃＤＮ Ａクローンをそれぞれ陽性及び陰性コントロールとして用いて、１．２％のアガ ロースゲルでサイズ分画した。２５０ｍ１のＨＣＩ　、それに続く０．５ＭのＮ ａＯＨ／１．５　ＭのＮａＣ１及び最後に０．５Ｍのトリス／３ＭのＮａＣｌで のインキュページ町ンの後、このゲルをニトロセルロースにプロットし、そして 前記した通りに末端ラベルされた各オリゴヌクレオチドプローブとプローブさせ た。最も大きいグルカナーゼインサートは１．８キロベースと見積もられ、既に 特徴付けされている１、９ｋＢのアボカドグルカナーゼｃＤＮＡと類似していた 。　ｐＴｃＬｌと命名したこのクローンをシーケンシングのために選んだ。

３、ｔｃｌｌのジ−ケンシング ミ、サブクローニング 前記のコロニーから調製したミニプレブＤＮＡのＳ■ａＩ消化は、ｐＡｒｃベク ターから１．８ｋｂ（見積サイズ）のグルカナーゼクローンを遊離させた。消化 生成物を０．４容量の酢酸アンモニウム及び２容量のエタノールで沈殿させ、そ してｌｘのＤＮＡサンプル緩衝液に再懸濁させた。この生成物を低融点アガロー スゲル上に載せ、インサートを電気泳動によって８０■でベクターから分離させ た。このインサートをゲルから切り出し、そしてゲルスライスとして一２０℃で 必要となるまで保存した。ＤＮＡ濃度はインサートと一定の標準品間の臭化エチ ジウム染色の相対強度から推定した。

ブルースクリプトベクター（ＳＫ＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｉｎｃ、、Ｌａ 　Ｊｏｌｌａ。

ＣＡ）を標準条件のもとで３０℃でＳ■ａｌ消化によって線状にした。２．５時 間後、消化したベクターをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（ ２５：２４：１）で１回、そしてクロロホルム−イソアミルアルコール（２４： １）で１回抽出し、そして０．４容量の酢酸アンモニウム及び２．５容量のエタ ノールで沈殿させた。ペレント化したＤＮＡを５００μｌの５０ｍＭのトリス、 ０．１１のＥＤＴＡ、ｐＨ８に入れ、そしてプラント末端化ＤＮＡフラグメント のため、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍの１牛小腸アルカリ性ホスファ ターゼによりその製造者の仕様書に従って脱リン酸化せしめた。脱リン酸したベ クターを前記した酢酸アンモニウム／ＥｔＯＨ沈殿によって集め、そして水で１ ００μｇ／ｍｌにした。

脱リン酸化ベクターを１５℃で１２時間、低融点アガロースゲルからの溶融グル カナーゼインサートにリゲートさせた。リゲート条件は各４５μｌのリゲーシゴ ンに関して以下の通りである：全ＤＮＡ：ａ度に１μｇ、インサート二ベクター ＝２．Ｈモルベースに基づ＜）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ−１００ユニツト／ｍｌ、 最終ＰＥＧ濃度＝５％。

リゲーシテン混合物をＴＥ　８．０で１００！ｌｌにし、そして２００μｌの新 たに融解したＸＬＩブルーコンピテント細胞に加えた。氷上で３０分後、この細 胞を５分間４２℃で熱ショックにかけ、そして３７℃に予め温めた２ＸＬ培地４ −１に加えた。この細胞をオービタルシェーカー上で１００ｒｐ−にて１００分 間、３７℃で振騰し、次いで氷に移した。適当に小分けしたこの細胞を次に１０ ０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ 寒天プレート上にまいた。このプレートは１００μｍの（５０μｌの１００ｍＭ のｒＰＴＧ、　２０ａ　１の２０ｍｇ／ｍｌのＸ　ｇａｌ　、　３０μｌのＬＢ ）を予めまいである。

このプレートを次に３７℃で一夜インキュベートし、これによって形質転換コロ ニー（白色）は非形質転換コロニー（青色）と区別できるようになった。ミニブ レプＤＮＡを前記の通りにこの形質転換体から単離し、そして５ｅａｌで消化し てインサートを遊離させた。約１．８ｋｂの１種類のグルカナーゼ形質転換体が １．５％のアガロースゲルでの消化生成物の電気泳動分離によって同定された。

二本鎖ミニブレブＤＮＡをシーケンシングのために前記の通りに調製した。

ｂ、シーケンシング 第１鎖のシーケンシングにおいて利用するための種々の長さの二本鎖ＤＮＡ鋳型 を、製造者によって供給されたエラーゼーＡ−ペースキット（Ｅｒａｓｅ−Ａ− Ｂａｓｅ　ｋｉ　ｔ）　（Ｐｒｏｍｅｇａ）プロトコールに詳細の通りに、グル カナーゼミニブレブＤＮＡのエキソヌクレアーゼ消化によって作り上げた。シー ケンシングは製造者によって供給されたシーケナーゼキット（Ｕｎｉｔｅｄ　５ ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、）プロトコールにおいて完全に 説明されているジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＤＮＡ　７４：５４６３−５４６７）によって行った。リバ ースＭ１３プライマーはＰｈａｒｓａｃｉａより購入した。

作製したシーケンスデーターはＭｉｃｒｏｇｅｎｉｅシーケンス分析コンピュー タープログラム（Ｂｅｃｋｓ＋ａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、）を 用いて入力及び分析し、その［Ｉ２０種以上の小さな配列の重複より成った。

Ｂ、二Ｕ二見作製 ４種の異なるベクターを作製した。１つのベクター、Ｅ８ａｎｔｉＣＬはトマト Ｅ８遺伝子由来のプロモーター及びｔｃｌｌアンチセンスＤＮＡを含んでいた。

このプロモーターはトマトの果実の成熟中において誘発性である。第２のベクタ ー、ｃａｓＶａｎｔｔＣＬはカリフラワーモザイクウィルス３５３プロモーター 及びｔｃｌｌアンチセンスＤＮＡを含む。

このプロモーターは構成的である。他の２種のベクターは同様の手法で作製した が、ただしポリガラクツロナーゼアンチセンスＤＮＡ及び適切なプロモーターを 付加した。この後者の２種のベクターの構造を図１に図示する。

１、Ｅ８ａｎｔｉＣＬ ２、ＯｋｂのＥ８プロモーターフラグメントを、ｐＨ８ｓｕｔＲＮ２．０をＮｅ ｏ　１によって切断することによって単離した。このｐＨ８ｓｕｔＲＮ２．０の 調製は、本明細書に参考として組入れた、ＧｉｏｖａｎｉｎｎｏｎｉらのＴｈｅ 　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ、１　＝５３−６３．１９８９に詳細されている。　Ｎｃ ｏｌ制限部位の５′突き出しをＤＮＡポリメラーゼの大きなフラグメント（フレ ノウフラグメント）によってプラント末端とし、そしてＥｃｏＲ１制限エンドヌ クレアーゼによって消化した。得られる２、ＯｋｂのＥｃｏＲｌ　／補完Ｎｃｏ ｌフラグメントを、ＥｃｏＲｌ及び５ｅａｌ制限エンドヌクレアーゼによって切 断したｐＵｃ１１８にリゲートさせた。ここで得られる構造体、ｐ［＋８ｍｕｔ ＲＮ２．０（＋）は、本来のＮｃａｌ制限部位並びに二〇Ｎｃｏ　１制限部位の 下流にＢａｍＨｌ、Ｘｂａｌ、５ａ１１．Ｐｓｔｌ、５ｐｈｌ及びＨｉｎｄｌ［ ［部位を有する。

ブルースクリプトＭ１３ｆ　（ＳＫ＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｉｎ ｃ、。

ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）の５ｅａ１部位にクローンした１、８ｋｂのエンド −１，４−β−グルカナーゼｃＤＮＡを、Ｂａ−■及びＫｐｎｌによる消化によ って遊離させ、その後アガロースゲルで精製した。このフラグメントを次にＢａ ５ａｌ　／Ｋｐｎｌ消化ｐＵｃ１１８にリゲートし、ｐＵｃｃＬｌ、８を作った 。

ｐＵｃｃｌ、８の１．８ｋｂのＢａｍＨ１／５ｓｔｌ　ＣＤ　Ｎ　Ａインサート を制限エンドヌクレアーゼ消化によって遊離させ、そしてアガロースゲル電気泳 動によって精製した。

ここで得られた１、８ｋｂのＢａｍＨ１／５ｓｔｌフラグメントを、ｐＢＩＬ２ １（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）より精製した ０、　２５ｋｂの５ｓｔｌ／　ＥｃｏＲｌ−ヱｆａｔ＜９−１７−ツバリンシン ターゼ遺伝子転写ターミネータ−フラグメント（植物において遺伝子転写の直接 的終結が可能）との３分子リゲーションに用い、次いでＢａ５ａｌ及びＥｃｏＲ ｌによって切断したｐＵｃ１１８にリゲートさせた。ここで得られるｐＵｃａｎ ｔｉｃＬ−ｔｅｒ構造体は、グルカナーゼｃＤＮＡがその５′末端にてＳｓ　ｔ １部位リゲーシッンを介して融合したツバリンシンターゼ遺伝子転写終結フラグ メント←や−Φ尋・を含んでいる。この２．０５ｋｂのａｎｔｉＣＬ−ｔｅｒフ ラグメントを、ｐＵＣａｎｔｉＣＬ−ｔａｒよりＢａ−旧による消化、その後の ＥｃｏＲｌによる部分消化によって単離した０次にこの２．０５ｋｂの生成物を アガロースゲルで精製した。

ここで得られる２、　０５ｋｂのＥｃｏＲｌ　／　ＢａｍＨ１フラグメントをｐ Ｈ８ｓｕｔＲＮ２．０から単離した２、ＯｋｂのＥｃｏＲｌ　／　ＢａｍＨ１フ ラグメント及びＥｃｏＲｌによって切断したｐＵｃ１１８との３分子リゲーシッ ンにおいて利用した。

得られる構造体ｐＨ８ａｎｔｉＣＬは、Ｅ８プロモーターがグルカナーゼｃＤＮ Ａクローンの３′末端に融合し、その５′末端がツバリンシンターゼ遺伝子の転 写終結フラグメントに融合しているものを含む、このｃＤＮＡと転写ターミネー タ−配列との間に位置する内在ＥｃｏＲ１部位をＥｃｏＲ１制限エンドヌクレア ーゼによる部位消化によって除去し、次いでこのＥｃｏＲ１５’突き出しをフレ ノウ酵素によって補完し、次いでこの補完したＥｃｏＲ１制限エンドヌクレアー ゼ部位をリゲートせしめた。この内在ＥｃｏＲ１部位の欠失は、得られる構造体 、ｐＨ８ａｎｔｉＣＬ−Ｒ１の制限エンドヌクレアーゼ地図化によって確認した 。ｐＨ８ａｎｔｉＣＬ−Ｒ１の４．０ｋｂのインサートをＥｃｏＲ１制限エンド ヌクレアーゼによって遊離し、アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして 下記の３章に詳細のアゲロバクーｌアＴ−ＤＮＡ＃組込み（ｃｏｎ　ｉｎ　ｔｅ ｇｒａｔｉｖｅ）　シャトルベクターｐＭＬＪ１のＥｃｏＲ１部位にリゲートせ しめた。

得られた構造体をｐＭＬＪｌ　：　Ｅ８ａｎｔｉＣＬと称した。

２、ＣａＭＶａｎｔｉＣＬ カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ転写ユニツトの調節配列をｐＢ１１２１か ら、５ｐｈｌ及びＢａａ旧による消化、その後のアガロースゲル精製によって単 離した。得られた０、８ｋｂの５ｐｈＩ／Ｂａ−旧フラグメントをｐＵｃａｎｔ ｉｃＬ−ｔｅｒの２．０５ｋｂのＢａａ）ＩＩ／ＥｃｏＲＩ　フラグメント（前 記）と５ｐｈｌ及びＥｃｏＲｌによって消化したｐＵｃ１１８との３分子リゲー ションに利用した。ここで得られる構造体をＥｃｏＲｌで部分消化し、そしてフ レノウ酵素との補完反応、その後のリゲーシッンにかけ、このｃＤＮＡの５′末 端と植物転写終結配列の間に位置する内在ＥｃｏＲ１制限エンドヌクレアーゼ部 位を除去した。このｃＤＮＡと転写終結配列の間のＥｃｏＲ１部位が除かれたこ とを確認するために制限エンドヌクレアーゼ地図化を採用した。得られる構造体 をｐｃａＭＶａｎｔｉｃＬ−３と称した。　ｐＣａＭνａｎｔｉＣＬ−５を５ｐ ｈｌで消化した。　５ｐｈｌ消化により得られる３′突き出しをＴ４ＤＮＡボリ メラー＋′ヲ用いて補完し、ＥｃｏＲ１リンカ−（ＢＲＬ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ 、Ｍａｒｙｌａｎｄ）にリゲートさせた。ここで得られた構造体をｐｃａＭＶａ ｎ　ｔ　ｉＣＬと称した。　ｐｃａＭＶａａｔｉｃＬの２．８５ｋｂのインサー トをＥｃｏＲ１制限エンドヌクレアーゼによる消化、その後のアガロースゲル精 製によって単離し、そしてｐＭＬＪｌのＥｃｏＲ１部位にリゲートさせてｐＭＬ Ｊｌ：ＣａＭＶａｎｔｉＣＬを作り上げた。

３、訃主佳ぜＬ４四 ブルースクリプトＭ１３＋（Ｓに＋）ベクターの５ｅａ１部位にクローンした、 ｐＢｓＰＧｌ、９ＣＤｅｌｌａｐｅｎｎａ　ら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ｉｏｌｏ 　９０：１３７２−１３７７゜１９８９、本明細書に参考として組入れた）の１ ．７ｋｂの全長トマト果実ポリガラクツロナーゼｃＤＮＡインサートを５ａｌｌ 及び５ｓｔｌ制限エンドヌクレアーゼによる消化によって遊離させ、次いでアガ ロースゲル精製にかけた。得られる１、７ｋｂのフラグメントを０．２５ｋｂの ５ｓｔｌ／ＥｃｏＲ１ヱ久旦バ久之工ヱノバリンシンターゼ遺伝子転写終結配列 （前記）及び５ａ１１／ＥｃｏＲ１消化ｐＵｃ１１８との３分子リゲーションに おいて利用した。ここで得られる構造体をｐＵｃａｎｔｉＰＧ−ｔｅｒと称し、 そしてこれはポリガラクッロナーゼｃＤＮＡの５′末端がツバリンシンターゼ転 写終結配列とその５ａｌ１部位にて融合しているものより成る。

ｐＵｃａｎｔｉＰＧ−ｔｅｒの１．９５ｋｂのインサートを５ａｉｌ及びＥｃｏ Ｒ１制限エンドヌクレアーゼによる消化によって遊離し、次いでアガロース精製 にかけた。得られる１、９５ｋｂの５ａｌｌ／ＥｃｏＲ１フラグメントを、ｐＨ ８ｓｕｔＲＮ２．０（＋）（前記）由来の２．ＯｋｂのＥｃｏＲｌ　／５ａｉｌ 　Ｅ８プロモーターフラグメント及びｐＬｌｃＥ８ａｎｔｉＰＧとの３分子リゲ ーシ町ンに用いた。

ｐｌｌｃＥａｎｔｉＰＧの３．９５ｋｂのインサートをＥｃｏＲ１制限エンドヌ クレアーゼによる消化の後のアガロースゲル精製によって単離し、次いでこの３ ．９５ｋｂのアンチセンス遺伝子の両側に相接する５　’　ＥｃｏＲｌ突き出し のＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ）補完を行った。この弁組込み植物形質転換ベ クター、ｐＭＬＪｌの固有５ａｉｌ制限部位を５ａｌｌによって切断し、そして フレノウ酵素で補完した。このプラント末端化した３、９５ｋｂのＥ８ａｎｔｉ ＰＧフラグメントをｐｌ’１ＬＪ１のプラント末端化５ａ１１部位にリゲートし 、ｐＭＬＪｌ：Ｅ８ａｎｔｉＰＧを作った。　ｐＭＬＪｌ：Ｅ８ａｎｔｉＰＧを このｐＭＬＪ１配列の固有ＥｃｏＲ１部位において切断した。　ｐＥ８ａｎｔｉ ＣＬ−Ｒ１（前記）の４．０５ｋｂのインサートをＥｃｏＲｌによって遊離させ 、そしてアガロースゲル電気泳動によって精製した。ここで得られる４、０５に のＥ８ａａｔｉＣＬ−Ｒ１フラグメントをこのｐＭＬＪｌ　：　Ｅ８ａｎｔｉＰ ＧのＥｃｏＲ１部位にリゲートさせ、ｐＭＬＪｌ：Ｅ８ａｎｔｉＰＧ／（：Ｌを 作った（図２参照）。

４、勉■朋旦と７県 カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ転写ユニツトの調節配列を前記の通りにｐ Ｂ１１２１から単離した。　ｐＵＣａｎｔｉＰＧ−ｔｅｒ（前記）の１．９５ｋ ｂのインサートをＥｃｏＲｌによる消化及びＢａ５ａｌによる部分消化、その後 の得られる１、９５ｋｂのフラグメントのアガロースゲル精製によって単離した 。　ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター由来の０．８ｋｂの５ｐｈｌ／Ｂａｗ［１１フ ラグメントを、ｐＵＣａｎｔｉＰＧ−ｔｅｒの１．９５ｋｂのＢａｍ１ｌｌ／Ｅ ｃｏＲ１インサートと、５ｐｈｌ及びＥｃｏＲ１制限エンドヌクレアーゼによっ て消化したｐＵｃｌｌＢとの３分子リゲーシッンにおいて利用し、ｐＵＣＣａＭ ＶａｎｔｉＰＧ−３と称する構造体を作った。ｐｌＪｃｃａＭＶａｎｔｉＰＧ− ３をｓｐｈ　Ｉで消化した。　５ｐｈＩ消化に由来する３′突き出しを７４ＤＮ Ａポリメラーゼを用いて補完し、そしてＥｃｏＲ１リンカ−（ＢＲＬ、　Ｂｅｔ ｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）にリゲートさせた。

得られる構造体をｐＬＩｃｃａＭＶａｎｔｔＰＧと称し、そしてこれはｐＵｃｌ ｌＢのＥｃｏＲｌの部位にクローンされた２、　７５ｋｂのＣａＭＶａｎｔｉＰ Ｇ遺伝子を含む。

ｐＣａＭＶａｎｔｉＣＬの２．８５ｋｂのインサートを、ＥｃｏＲ１制限エンド ヌクレアーゼによる消化及びフレノウ酵素による５　’　ＥｃｏＲｌ突き出しの 補完の後にアガロースゲル電気泳動によって単離した。　Ｉ）ＭＬＪＩの固有５ ａ１１部位を５ａｌｌによって切断し、そしてフレノウ酵素によって補完した。

　２．８５ｋｂのプラント末端ＣａＭＶａｎｔｉＣＬフラグメントをｐＭＬＪｌ ：ＣａＭＶａｎＬｉＣＬのＥｃｏＲ１部位にリゲートし、ｐＭＬＪｌ：ＣａＭＶ ａｎｔｉＰＧ／ＣＬを作った（図２参照）。

５、　アンチセンス゛　−龜　の此　′人工親株交配をＶａｎ　Ｈａｕｔｅら、 Ｅ？ｌＢＯＪ、　２　：　４１１−４１７．１９８３　（本明細書に参考として 組入れる）に詳細の当業界によく知られる方法に従って行った。二親株交配に用 いたシャトルベクターは本発明にとって本質的でない、ここで用いた特定なるシ ャトルベクターｐＭＬＪ１は、ＤｅＢｌｏｃｈらＥＭＢＯＪ、３：１６８１−１ ６８９．１９８４に詳細のものに由来する。

ｐＧＶ３８５０．　ＰＧＶ３８５０：Ｅ８ａｎｔｉＣＬ及びｐＧＶ３８５０：Ｃ ａＭＶａｎｔｉＣＬへのアンチセンス遺伝子構造体の弁組込みをもたらす、ｐＭ ＬＪｌ：Ｅ８ａｎｔｉＣＬ、　ｐＭＬＪｌ：ＣａＭＶａｎｔｉＣＬ、　ｐＭＬＪ ｌ：Ｅ８ａｎｔｉＰＧ／ＣＬ又はｐＭＬＪｌ：Ｃａｓ＋ＶａｎｔｉＰＧ／ＣＬを 有するＬ　ユニ（株ＪＭ１０９）と、弁組込み植物形質転換ベクターｐＧＶ３８ ５０　（このベクターはＺａｍｂｒｙｓｋｉ　らのＥ？ｌＢＯＪ。

２：２１４３，１９８３（本明細書に参考として組入れた）に詳しく記載されて いる）を含む１３（ジとｌ」漏失１−　王立ＬスＬ之エヱ、及びヘルパーＬ　ユ ニ株ｐＧＪ２３との三親株交配を、アンチセンスエンド−１，４−β−グルカナ ーゼ配列のトマトゲノムへの挿入のために利用した。

Ｃ，アンチセンスエンド−１４−−グルカナーゼ　°１　によるトマ　の　一 方１ぴｍ 簡単に述べると、無菌の子葉断片を、Ｔ−ＤＮＡ内に遺伝子導入植物においてカ ナマイシン耐性を授けることのできるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺 伝子（ＮＴＰＩＩ）を含むＴｉプラスミドを含んでいるアゲロバクチリアで感染 する。この弁組込みアゲロバク元見二　上？／７　ｙｚ７’ｒｔ””ター、ｐＧ Ｖ３８０テあッテ、ｐＭＬＪｌ　：Ｅ８ａｎｔｉＣＬ、　ｐＭＬＪｌ：ＣａＭＶ ａｎｔｉＣＬ、　ｐＭＬＪｌ：Ｅ８ａｎｔｉＰＧ／ＣＬ又はｐＭＬＪｌ　：Ｃａ ＭＶａｎｔｉｉＰＧ　／ＣＬが個々にそれに組込まれているものを、個々のトマ トゲノムの中に２種のアンチセンス遺伝子構造体を移すために用いた。トマト（ ユユバニ之ユヱ　エ２ヱ」≦仁しムＣｖアイルサクレイクＣＩ、）−匹匹■旦郊 」匹虹並且ｍ　ｃｖ　Ａ１１ｓａ　Ｃｒａｉｇ）子葉断片のこの細菌との培養を タバコフィーダープレート上で４８時間行った。苗条の再生は再生培地において 誘発せしめた。この段階より、アゲロバクチリアの増殖を阻止するため（セフォ タキシム）及び形質転換植物細胞を選別するため（カナマイシン）抗生物質を用 いた。最後に、苗条を発根培地に移し、その後、土壌に植え、そして温室の中で 成育させた。

１、フィー　−の タバコキサンチ（ｔｏｂａｃｃｏ　Ｘａｎｔｈｉ）懸濁培養物を維持するため、 細胞を週に一回４０メツシュフィルターで濾過した。　１０ｍ１の濾液を５００ ■ｌのフラスコの中の１０抛ｌの新鮮なキサンチン培地に加えた。

λ　上ヱ上Ｉ王夏見！ ５０■ｌのビーカーの中で約５０個の種子を７０％のＥｔＯＨ２０ｍｌ中で２分 間撹拌し、そして無菌水ですすいだ、これらを次に５分間、２滴のツイーン８０ を含む２０％の漂白剤中で撹拌し、そして無菌蒸留Ｈ，Ｏで４回すすいだ。

無菌のビンセットを用い、１２〜１５個の種子を各プレートに入れた。

このペトリ皿をパラフィルム及びアルミホイルで包み、２５°Ｃで成育させた。

５日後（このとき種子は約６０％の発芽率に達していた）、これらをアルミホイ ルから取り出し、そして２５００１ｕｘのもとで、１６時間の光射時間によって 成育させた。実生は全部で８日間かけて成８ｇ／ｌの寒天を有する約４０１のキ サンチン培養培地の厚みのあるペトリ皿を利用した。１−１の厚みのあるキサン チン培養物（７日目）を各フィーダープレートにピペットした。このプレートを パラフィルムでシールし、そして成育チャンバー（２５℃）の中で、光の照らし た棚の上で１２時間インキュベートした。

４、　フィーダープレートへの　の 無菌のＷｈａｔｍａｎ　＃　１フイルターを各フィーダー細胞プレート上に置い た。子葉を外科用メスによってペトリ皿の中の一滴の無菌水の中で切断した。こ の外科用メスはやさしく揺らして切断を行い、これによって組織の破れ及び傷っ けを最小にした。子葉の末端のみを切除した。切断した子葉を逆さまにして（切 断部位を下に）フィーダープレート上のフィルター上に載せた。約５０個の子葉 断片を各プレートに置いた。このプレートをパラフィルムでシールし、そして成 育チャンバーの中に１６時時間−た。

５、　５　−　アゲロバクー１７によるｐＭＬＪｌ：Ｅ８ａｎｔｉＣＬ及びｐＭ ＬＪｌ：ＣａＭＶａｎｔｉＣＬを含む１ヱシエハノ」Ｌ火１−の１０■ｌの一夜 培養物を２５μｇ／■１のスペクチノマイシンを有するＹＥ８培地に増殖させた ＊７ｆｏｔ＜ノＵヱーー夜培養物を種子発芽培地の中で５９０の０．０．へと、 ４倍希釈した。　０．５　ｍｌの希釈細菌をペトリ皿に小分けし、次いであらか じめタバコフィーダー細胞と一緒に培養した３０個の子葉断片を加えた。このア ゲロバクチリア／子葉混合物を濡れるまで膨潤させた。子葉は細菌中で５分間濡 らした。この子葉を一度無菌ペーパータオルでぬぐった。この子葉を同じフィー ダープレートに逆さまにして戻し、そして更に４８時間−緒に培養した。

６、再生 細菌と一緒に培養した後、子葉を正しい面を上にして再生培地に置いた。この子 葉の先端はこの寒天の中に巻き下がり、傷ついた表面がこの薬剤と直接接触する ことを確実にするようになるであろう。

１５個の子葉断片を各プレートに置いた。

１０日以内にカルスはこの感染化子葉の先端にて見られるようになった。子葉断 片を２週間ごとに新鮮なプレートに移し換えた。苗条及び濃緑色のカルスを苗条 用培地（再生培地と同じであるが、ただしゼアチンの濃度は０．１−ｇ／■ｌに 下げている）に移し換えた。６週間後（３回の移し換え）、全てのカルス及び苗 条を苗条用培地に移し換えた。

苗条成形のため、ＴＭ５苗条用培地を利用した（Ｓｈａｓｈｔｎ、　Ｔｈｅｏｒ 。

Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、６９：２３５−２４０．１９８５）　、カナマイシン及びセ フアトキシムのレベルはそれぞれ２５ｍ１／　ｌ及び１２５■ｇ／ｌに下げてい る。

苗条が満足たる根へと発育した後、これを土壌に移し換えた。植物を土壌に移し 換えるには、スパチュラを用いてほとんどの寒天をかき払ってていねいに寒天か ら取り出した。この根を温水中ですすいでできる限り寒天を取り除いた。それら をＧＡ−７ボツクスの中に入れた粘土ポットの中に植えた。このボックスのカバ ーを徐々に数日かけて開け、そしてそれらを１回の給水置きに１／２強度のＨｏ ａｇｌａｎｄ溶液で給水した。２週間後、この植物を成育チャンバーの中で完全 に解放し、そして大きなポットの中に移植し、そして温室に移した。

１本のＫＣＭＳ塩（ＭＭｌｏｏ）　４．３　ｇｉ−イソシトール　１００　ｅｇ ｇ スクロース　３０　ｇ ＫＨｚＰＯａ　２　ｍｌ　１００　ｓａｇ／醜ｌチアミン　１．３ｍｌ　１　ｒ ａｇ／１ａ１２．４−Ｄ　２■１　１００　ｍｇ／ｍｌカイネチン　０．４ｍｌ 　０．２５ｍｇ／＠ｌＭｏ１でｐＨ５，５ ＨｚＯで１１ １００ｍｌのアリコートを５００ｍ１のフラスコに入れるフラスコに栓をし、そ してアルミホイルでキャップするオートクレーブで２０分 す、　のためのプレート Ｈ３培地　１　ｐｋｇ、　ＫＣＭＭ−１００３％のスクロース　３０ｇのスクロ ース８００鴎ｌのＨｔＯ ＫＯＨ’ｔ”ｐＨ５，７ 容量は１１ ８ｇのバタトアガーを添加（０，８％の寒天）２０分のオートクレーブ 厚みのあるベトリ皿に注ぐ（１皿当り約３０ｍ１　）Ｃ６ｉ１隻並 １リットル用： ４．３ｇの？ｌＳ塩（ＫＣＭｌ’ｌ−１００）３０　ｇのグルコース ０．５９　ｇのＭＥＳ ２ｍｌの５００ｘのガンボルグ（Ｇａａｂｏｒｇｓ）ビタミン（以下参照）ＩＮ のＫＯＨでｐＨ５，８ 容量は１リツトル ８ｇの組織培養縁寒天 オートクレーブで２０分 ５０℃に冷却 １ｍｇの無菌ゼアチン（トランス、異性体）３００　ｍｇ／ｍｌのセフオドキシ ム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃａｔ＃２１９３８０）５０■ｇ／ｍｌのカナマイ シン：を添加５００ｘのガンボルグビタミン： ５ｇのミオーイソシトール ０．５ｇのチアミンＨＣＬ ５０ｍｇのニコチン酸 ５０−ｇのピリドキシンＭＣ１ １００１の無菌水 セフオドキシムは光感受性である。これは光に長いｌ５ると黄色に変色する。従 ってセフオドキシムを含むプレートは利用の前日に作成する。

ｄ１発ｍ誘発のための升 成分　量／リットル ＭＳ塩　４．３ｇ ポテトビタミン（２００ｘ）　５　ｍｌスクロース　３０ｇ ＩＢ＾（インドール−３−ｉ！Ｉ！酸、Ｓｉｇａ＊ａ）　０．１ｍｇ　（オート クレーブの直前に添加） 精製寒天　７ｇ ＫＯ［ｌでｐＨ５，８に調整 オートクレーブ１５分 ５０℃に冷やしたら、２５℃１ｇのカナマイシン及び１２５■ｇのセフアトキシ ムを添加。

ポテトビタミン（２００ｘ） 成分　量／リットル ミオーイノシトール　２０　ｇ ゲアミ７−ＨＣｌ　１００　ｍｇ ピリドキシン−ＨＣｌ　１００　ｍｇ ニコチンＭＩ　１ｇ グリシン　５００　ｍｇ ビオチン　１０　ｆｉｇ 葉酸　１００　ｍｇ 溶液を透明化するためにｐＨ５，８〜６．０に調整。

−２０℃で保存。

国際調査報告 フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５ｍ別記号庁内整ｆｌｉ番号ＣＩ　２　Ｎ　９／２４　 ９３５９−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　Ｆ＊、　ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＭ、ＧＡ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、Ａ Ｔ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ 、　ＧＢ。

ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＣ，ＭＧ、ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　 Ｒ○、ＳＤ、ＳＥ、ＳＵＩ （７２）発明者　ラシュブルック、コラリアメリカ合衆国、カリフォルニア　９ ５６２０゜ディクソン、ドイル　レーン　７９７５（７２）発明者　ジョバンニ 、ジェームズアメリカ合衆国、カリフォルニア　９４１２３゜サンフランシスコ 、ピアース　ストリート

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．果実の軟化を引き下げるための方法であって、エンド−１，４−β−グルカ ナーゼをコードするＤＮＡ配列に由来する少なくとも２０塩基対のＤＮＡサブ配 列に作動連結している植物プロモーターを有する発現カセット（ここでこのＤＮ Ａサブ配列は発現にとって反対の配向においてこのプロモーター配列と連結して いる）を植物に導入せしめることを含んで成る方法。 ２．前記プロモーター配列が誘発性である請求項１に記載の方法。 ３．前記プロモーターがトマトＥ８遺伝子に由来する請求項１に記載の方法。 ４．前記プロモーターが構成的である請求項１に記載の方法。 ５．ポリガラクツロナーゼをコードするＤＮＡ配列に由来する少なくとも２０塩 基対のＤＮＡサブ配列に作動連結している植物プロモーターを有する発現カセッ ト（ここでこのＤＮＡサブ配列は発現にとって反対の配向においてこのプロモー ター配列に連結している）を植物に導入することを更に含んで成る、請求項１に 記載の方法。 ６．前記植物がトマトである請求項１に記載の方法。 ７．アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いて前記発現カセット を植物に導入する請求項１に記載の方法。 ８．性交配によって前記発現カセットを植物に導入する請求項１に記載の方法。 ９．エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性を阻害する方法であって、エンド− １，４−β−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列に由来する少なくとも２０塩 基対のＤＮＡサブ配列に作動連結している植物プロモーターを有する発現カセッ ト（ここでこのＤＮＡサブ配列は発現にとって反対の配向においてこのプロモー ター配列と連結している）を植物に導入せしめることを含んで成る方法。 １０．前記プロモーター配列が誘発性である請求項９に記載の方法。 １１．前記プロモーターがトマトＥ８遺伝子に由来する請求項９に記載の方法。 １２．前記プロモーターが構成的である請求項９に記載の方法。 １３．前記植物がトマトである請求項９に記載の方法。 １４アグロバクテリアを用いて前記発現カセットを植物に導入する請求項９に記 載の方法。 １５．性交配によって前記発現カセットを植物に導入する請求項９に記載の方法 。 １６．エンド−１，４−β−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列に由来する少 なくとも２０塩基対のＤＮＡサブ配列に作動連結している植物プロモーター配列 を含んで成り、このＤＮＡサブ配列が発現にとって反対の配向においてこのプロ モーター配列と連結している、発現カセット。 １７．前記プロモーターが誘発性である請求項１６に記載の発現カセット。 １８．前記プロモーターがトマトＥ８遺伝子に由来する、請求項１６に記載の発 現カセット。 １９．前記プロモーターが構成的である、請求項１６に記載の発現カセット。 ２０．前記プロモーターがカリフラワーモザイクウイルスに由来する、請求項１ ６に記載の発現カセット。 ２１．エンド−１，４−β−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列に由来する少 なくとも２０塩基対のＤＮＡサブ配列に作動連結している植物プロモーターを有 し、このＤＮＡサブ配列が発現にとって反対の配向においてこのプロモーター配 列と連結している発現カセットを含む植物。 ２２．前記植物がトマトである請求項２１に記載の植物。 ２３．トマト植物におけるエンド−１，４−β−グルカナーゼ活性を阻害する方 法であって、トマトエンド−１，４−β−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列 に由来する少なくとも２０塩基対のＤＮＡサブ配列に作動連結している植物プロ モーターを有する発現カセット（ここでこのＤＮＡサブ配列は発現にとって反対 の配向においてこのプロモーター配列と連結している）を植物に導入せしめるこ とを含んで成る方法。 ２４．介在されていなく、エンド−１，４−β−グルカナーゼをコードし、そし て少なくとも一方の側にて非野生型ＤＮＡが隣り合っているＤＮＡ配列。 ２５．前記の配列がｃＤＮＡ配列である請求項２４に記載のＤＮＡ配列。 ２６．前記の配列がトマトに由来する請求項２４に記載のＤＮＡ配列。 ２７．介在されていなく且つエンド−１，４−β−グルカナーゼをコードするＤ ＮＡ配列に作動連結しているプロモーター配列を含んで成る発現カセット。 ２８．前記ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列である請求項２７に記載の発現カセット。 ２９．前記ＤＮＡ配列がトマトに由来する請求項２７に記載の発現カセット。 ３０．前記プロモーター配列が原核生物において転写を開始させることのできる 請求項２７に記載の発現カセット。 ３１．前記プロモーター配列が真核生物において転写を開始させることのできる 請求項２７に記載の発現カセット。 ３２．エンド−１，４−β−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列を植物から単 離する方法であって、エンド−１，４−β−グルカナーゼｃＤＮＡからの保存配 列を含んで成るオリゴヌクレオチドプローブによって植物組織から作られたＤＮ Ａライブラリーを釣り出すことを含んで成る方法。 ３３．前記ＤＮＡライブラリーがｃＤＮＡを含んで成る、請求項３２に記載の方 法。 ３４．前記ライブラリーがゲノムＤＮＡを含んで成る、請求項３２に記載の方法 。 ３５．前記の保存配列が、 【配列があります】及び 【配列があります】 より成る群から選ばれる、請求項３２に記載の方法。 ３６．トマトエンド−１，４−β−グルカナーゼ由来のシグナルペプチドをコー ドするＤＮＡ配列に作動連結しているプロモーター配列を含んで成り、このＤＮ Ａ配列が成熟トマトエンド−１，４−β−グルカナーゼをコードする配列以外の ものに連結しているＤＮＡ構造体。 ３７．請求項３６に記載ＤＮＡ構造体を含んで成る植物細胞。