KR102125714B1 - 식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 demeter 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 DEMETER 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 애기장대 유래 DEMETER 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 비형질전환체에 비해 식물체의 재분화 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 DEMETER 유전자 및 이의 용도{DEMETER gene from Arabidopsis thaliana for regulating regeneration efficiency of plant and uses thereof}

본 발명은 식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 DEMETER 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물은 분화된 체세포로부터 탈분화(reprogramming)를 유도할 수 있는 현저한 능력을 가지고 있으며, 탈분화 후의 재분화(regeneration) 과정은 만능(pluripotent) 캘러스로부터 새로운 식물을 유도한다. 옥신 및 시토키닌(cytokinin)의 적절한 비율은 캘러스 형성뿐만 아니라 기관(organ) 재분화에도 필수적이다. 이와 마찬가지로, 호르몬 생합성 유전자 및 시그널 등의 유전적 요소는 다양한 조직 이식편으로부터의 식물 재분화와 연관되어 있다.

조직 정체성의 전환은 효율적인 세포 탈분화 및 기관 재분화를 촉진하는 데에 필수적인 과정이다. 캘러스 조직은 뿌리 분열 조직의 특성들과 유사하고, 분자 특성들은 또한 유도된 캘러스가 뿌리 분열 유전자를 전위적으로(ectopically) 발현한다는 면에서 유사성을 가진다. 그러나, 캘러스는 인 비트로 조직 배양 방법에 의해 모든 조직 이식편으로부터, 심지어 지상부에서도, 효율적으로 유도될 수 있다. 이어서 유도된 만능 캘러스는 성공적인 전식물(whole plant)로의 재분화를 위해 신초 형성(shoot formation)이 우선적으로 시도된다. 따라서, 잎에서 캘러스(leaf-to-callus; 뿌리-유사 조직) 탈분화 및 캘러스에서 잎(callus-to-leaf) 재분화로 구성되는 2-단계 조직 정체성 변화는, 잎 이식편으로부터 유래되는 인 비트로 조직 배양 중에 일어난다.

식물 형질전환에 있어서 낮은 재분화 효율은 큰 장애물이다. 고부가가치의 작물을 농생명공학적으로 육종하기 위해서는 형질전환 과정이 필요한데, 조직의 탈분화(캘러스 형성) 후에 일어나는 재분화 과정의 효율이 매우 낮아 작물의 형질전환이 매우 제한적으로 이루어지고 있는 상황이다.

DEMETER 유전자는 글리코실라제(glycosylase) 도메인을 가지고 있는 유전자로, 이 유전자에 이상이 생기면 배(embryo)는 하트단계(heart stage)에서 성장을 멈추고, 배에 영양을 공급하는 역할을 하는 배젖(endosperm)은 마치 암세포와 마찬가지로 비정상적인 세포분열을 거듭하다가 배젖이 과대생산(endosperm over-production)되어 결국 정상적인 씨를 형성하지 못하고 발달이 정지되는 것으로 알려져 있다.

한편, 한국등록특허 제1898392호에는 '애기장대 유래 ATX4 유전자를 이용한 식물체의 재분화 효율 증가 방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 DEMETER 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 식물체의 재분화 효율을 조절 또는 개선할 수 있는 유전자를 제공하기 위해, 야생형 애기장대와 DEMETER 유전자 돌연변이체(dme-2)의 잎 이식편으로부터 캘러스 유도 및 신초 형성능을 분석하였다. 그 결과, dme-2 돌연변이체로부터 유래한 캘러스가 야생형 유래 캘러스보다 60% 높은 생체중을 보였으며, 각각의 캘러스로부터 형성된 신초의 수 또한 dme-2 돌연변이체에서 야생형에 비해 약 3배 많은 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 애기장대 유래 DEMETER 유전자가 식물체의 재분화를 음성적으로(negatively) 조절가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래의 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화(regeneration) 효율을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물체의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 재분화 효율 조절용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어, 재분화 효율이 증가된 돌연변이 식물체를 제공한다.

본 발명의 애기장대 유래 DEMETER 유전자는 식물 형질전환 과정의 낮은 재분화 효율을 개선할 수 있으므로, 농생명공학적 작물 형질전환이 보다 광범위하게 일어날 수 있도록 기여할 수 있으며, 육종연한을 단축시키고 육종과정의 효율화를 가능하게 할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 야생형(Ler) 및 dme-2 돌연변이체의 잎 절편으로부터 캘러스 형성능(탈분화, A) 및 신초 형성능(재분화, B)을 분석한 결과이다.
도 2는 애기장대 유래 DEMETER 유전자의 각 splicing variant에서 dme-2 돌연변이의 위치를 보여주는 모식도이다. DEMETER 유전자 Model 1, 2, 3(위에서부터 순서대로), 녹색 막대: UTR(untranslated region), 노란 막대: CDS(coding sequence), 실선: intron.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화(regeneration) 효율을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 재분화 효율 조절 방법에 있어서, 상기 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 비형질전환체에 비해 식물체의 재분화 효율을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 증가된 재분화 효율은 캘러스에서 신초 형성능이 증가된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시키면 식물체의 이식편으로부터 캘러스로의 탈분화능이 증가될 수 있다.

상기 유전자 발현의 저해 (또는 억제)는 통상의 기술자가 재조합 벡터에 삽입되는 프로모터의 종류를 선택 및 제어하여 달성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 애기장대 유래 DEMETER 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 재분화 효율을 조절하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 암호화하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 본 발명의 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

애기장대의 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자(DME)는 현재까지 총 3개의 splicing variant가 알려져 있다. 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 9,194개의 염기로 이루어진 variant 1 DME 유전자(도 2의 Model 1)이다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자 외에, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 variant 2 DME 유전자(도 2의 Model 2) 및 variant 3 DME 유전자(도 2의 Model 3)도 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(Phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한,

애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는, 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 상기 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 비형질전환체에 비해 식물체의 재분화 효율을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 형질전환 식물체의 제조 방법에 있어서, 상기 애기장대 유래 DEMETER 단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 그 범위는 전술한 것과 같다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(A. tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 형질전환 식물체 및 이의 종자는 비형질전환체에 비해 재분화율이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자이다.

상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 재분화 효율 조절용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어, 재분화 효율이 증가된 돌연변이 식물체를 제공한다. 상기 유전자의 발현 저해는 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 유도하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

식물 재료 및 생장 조건

본 발명에서는 Landsberg ecotype 애기장대(이하 Ler)를 야생형으로 사용하였다. 애기장대 종자의 표면을 멸균한 후, 1/2 MS(Murashige and Skoog)를 포함하는 0.7% 아가 플레이트에 심었다. 식물은 22-23℃에서 백색 형광등(120 μmol photons·m^-2·s^-1)을 사용하여 장일조건(16 시간 광/8 시간 암주기)에서 재배되었다. dme-2 돌연변이 식물체는 본 발명자의 이전 연구(YH Choi., et al. Cell (2002) 110:33-42 및 JS Park,. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2017) 114(8):2078-2083)에 개시된 돌연변이체로, 본 발명에서는 현재까지 알려진 애기장대 유래 DEMETER 유전자의 3개의 splicing variant 중 cDNA 길이는 6,963 bp이고, CDS의 길이는 5,190 bp이며 1,729개의 아미노산(서열번호 2)으로 변역되는 9,194 bp로 이루어진 DEMETER 유전자(서열번호 1)의 4,049-4,096번째 염기가 결실된 Ler 유전배경의 homozygous mutant를 사용하였다.

캘러스 유도(callus induction) 및 신초 형성(shoot formation)

캘러스 유도를 위해서, 2주령 식물체의 첫 번째 및 두 번째 잎의 이식편을 캘러스 유도 배지(callus-inducing medium, CIM)(0.5 ㎍/㎖ 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D) 및 0.05 ㎍/㎖ 키네틴이 보충된 MS 배지)에서 22℃의 조건으로 2주 동안 암배양하였다. 각 유전자형에서 30개의 캘러스를 수집하여 생체중 측정에 사용하였다. 생체중은 3반복으로 수행하였다. 통계적 유의성은 Student's t-test로 결정하였다.

지상부(shoot) 재분화를 위해, 유도된 캘러스를 CIM에서 6일 동안 전배양한 후, 신초 유도 배지(shoot-inducing medium, SIM)(0.9 μmol/L 3-인돌아세트산, 2.5 μmol/L 2-이소펜테닐아데닌이 보충된 MS 배지)에서 25℃, 연속 조명 조건 하에서 2주 동안 배양하였다.

실시예 1. 야생형과 dme-2 돌연변이체의 캘러스 및 신초 형성능 분석

식물체의 재분화는 캘러스 유도와 de novo 지상부 기관형성(organogenesis)을 포함하는 두 단계 과정을 포함한다. 먼저 조직 이식편은 옥신이 풍부한 캘러스 유도 배지에 배양하여 분화된 체세포로부터 캘러스 형성을 자극시킨다. 다능성(pluripotent)의 캘러스는 그 후 신초 유도 배지로 옮겨 식물체의 재분화를 유도하게 된다. 일반적으로, 높은 수준의 세포 주기 재진입(reentry) 특성을 가진 형질전환 또는 돌연변이 식물체는 증진된 캘러스 형성과 신초 재분화 특성을 보여준다. 상기 두 생물학적 사건은 활발한 세포 증식을 필수적으로 요구한다. 본 발명자들은 dme-2 돌연변이체 또한 식물체의 재분화에 있어서 변형된 표현형을 보일 것으로 예측하였다.

캘러스에서의 세포 증식성을 확인하기 위해 2주령 식물체의 잎 외식편으로부터 캘러스를 유도한 결과, 야생형 애기장대(Ler) 유래 캘러스에 비해 dme-2 돌연변이체 유래 캘러스에서 60% 증가된 생체중을 보여주었다(도 1A). 또한, dme-2 돌연변이체 유래 캘러스로부터 생성된 신초의 수가 야생형 애기장대 유래 캘러스로부터 생선된 신초의 수보다 3배 이상 많음을 확인할 수 있었다(도 1B). 상기 결과를 통해, DEMETER 유전자가 세포 증식을 감소시켜 식물체의 재분화를 음성적으로 조절함을 유추할 수 있었다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> DEMETER gene from Arabidopsis thaliana for regulating regeneration efficiency of plant and uses thereof <130> PN19164 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9194 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 gttctccggc attgactcgc ctgagaatca gaaagcttag atcggtgagc ttttagctcc 60 attttctgtt tatttacata ttatttcctt tttttctctc tccctttttt atctggaatt 120 tgttctgcta aattttccag ctgttacatt ttccgatcac gagaagaatc actgggtttt 180 tatgttaatc aatacatgtt cctgttttct gatcataaat ctcagctatt aacacctgat 240 tttgattctg cgtaataaaa acctctgatt tgcttttatc ttcactttcc ccataaacat 300 tgcttacttt attcgctctt cttttaccgt ttccagctaa aaaattcttc gctattcaat 360 gtgtttctcg ttttgttgat gagaaaaata tctgacaaaa aatcatttat tgcattttat 420 ggtgcagatt cttagttaat gtcgccttct ctaaccaagt cagattaaaa aggagtgttc 480 gtccatgttg ctttgttttg gtgtttggag agagttttcg gagagttagg tgagtgttat 540 ttggggtgag gtagtgataa ggtttgaagg gggagtgatt catcaagtgt gttatgaatt 600 cgagggctga tccgggggat agatattttc 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gcagagcatt atggactcgt 1500 ctgctgttaa tgcgacggaa gctactgaac aaaatgatgg cagcagacaa gatgttctgg 1560 agttcgacct taacaaaact cctcagcaga aaccctccaa aaggaaaagg aagttcatgc 1620 ccaaggtggt cgtggaaggc aaacctaaaa gaaagccacg caaacctgca gaacttccca 1680 aagtggtcgt ggaaggcaaa cctaaaagga agccacgcaa agctgcaact caggaaaaag 1740 tgaaatctaa agaaaccggg agtgccaaaa agaaaaattt gaaagaatca gcaactaaaa 1800 agccagccaa tgttggagat atgagcaaca aaagccctga agtcacactc aaaagttgca 1860 gaaaagcttt gaattttgac ttggagaatc ctggagatgc gaggcaaggt gactctgagt 1920 ctgaaattgt ccagaacagt agtggcgcaa actcgttttc tgagatcaga gatgccattg 1980 gtggaactaa tggtagtttc ctggattcag tgtcacaaat agacaagacc aatggattgg 2040 gggctatgaa ccagccactt gaagtgtcaa tgggaaacca gccagataaa ctatctacag 2100 gagcgaaact ggccagagac caacaacctg atttattgac tagaaaccag caatgccagt 2160 tcccagtggc aacccagaac acccagttcc caatggaaaa ccaacaagct tggcttcaga 2220 tgaaaaacca acttattggc tttccatttg gtaaccagca acctcgcatg accataagaa 2280 accagcagcc ttgcttggcc atgggtaatc aacaacctat gtatctgata ggaactccac 2340 ggcctgcatt agtaagtgga aaccagcaac taggaggtcc ccaaggaaac aagcggccta 2400 tatttttgaa tcaccagact tgtttacctg ctggaaatca gctatatgga tcacctacag 2460 acatgcatca acttgttatg tcaaccggag ggcaacaaca tggactactg ataaaaaacc 2520 agcaacctgg atcattaata agaggccagc agccttgcgt acctttgatt gaccagcaac 2580 ctgcaactcc aaaaggtttt actcacttga atcagatggt agctaccagc atgtcatcgc 2640 ctgggcttcg acctcattct cagtcacaag ttcctacaac atatctacat gtggaatctg 2700 tttccaggat tttgaatggg actacaggta catgccagag aagcagggct cctgcatacg 2760 attctttaca gcaagatatc catcaaggaa ataagtacat actttctcat gagatatcca 2820 atggtaatgg gtgcaagaaa gcgttacctc aaaactcttc tctgccaact ccaattatgg 2880 ctaaacttga ggaagccagg ggctcgaaga gacagtatca tcgtgcaatg ggacagacgg 2940 aaaagcatga tctaaactta gctcaacaga ttgctcaatc acaagatgtg gagagacata 3000 acagcagcac gtgtgtggaa tatttagatg ctgcaaagaa aacgaaaatc cagaaagtag 3060 tccaagaaaa tttgcatggc atgccacctg aggttataga aatcgaggat gatccaactg 3120 atggggcaag aaaaggtaaa aatactgcca gcatcagtaa 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ccttgtcgga ctgccatgag 8220 aggaagtttt ccgctcaacg ggacatattt ccaagtcaac gaggttagat gaaataaaac 8280 tcaaacagac agacgaaaca ttatttctgt ttagtgttgg ttctttatcc tccttgccat 8340 tttttatctt gcagttattt gcagaccacg agtccagtct caaacccatc gatgttccta 8400 gagattggat atgggatctc ccaagaagga ctgtttactt cggaacatca gtaacatcaa 8460 tattcagagg taaaaacatt cgtaatagag ttagttaatc aaatgtccaa aacacaagaa 8520 agcttcaccg tccaatacac aagaaagctt caccttctct ttgccaaaaa agatcttaga 8580 atgttttgct gaatttgtgc aggtctttca acggagcaga tacagttctg cttttggaaa 8640 ggtaaacgtt aactttcgac ccagagaaat ccggaaaatc tattgctttg ttctgatcaa 8700 tacgttaaac atatacacac acactttaca cttaggacca atactgttct gatctgtgat 8760 agaaactggt aaacatctaa caattatgat tgcaggattc gtatgtgtcc gtggattcga 8820 acagaagaca agagcaccgc gtccattaat ggcaaggttg cattttcctg cgagcaaatt 8880 gaagaacaac aaaacctaaa gatgactgga agaaagcaaa cgcattgctt ctctgctctc 8940 ctctatttaa agccaggaaa agtcccattt agacataata acaggaatcc aaataggcta 9000 ttttctcttt ctttcttatt tcattcatag agcagaagcg 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atccagcttt ggcaacctac tcctccaaag 3420 acacctttat caagaagcaa gcctaaagga aaagggagaa agtccataca agattcagga 3480 aaagcaagag gtaactaatg tattctacaa tctctgtgat ataattttga gattttagta 3540 actgatgtgt ccaaaccagc tccttatcac tgttggtgcg ttgtataggt ccatcaggag 3600 aacttctgtg tcaggattct attgcggaaa taatttacag gatgcaaaat ctgtatctag 3660 gagacaaaga aagagaacaa gagcaaaatg caatggtctt gtacaaagga gatggtgcac 3720 ttgttcccta tgagagcaag aagcgaaaac caagacccaa agttgacatt gacgatgaaa 3780 caactcgcat atggaactta ctgatgggga aaggagatga aaaagaaggg gatgaagaga 3840 aggataaaaa gaaagagaag tggtgggaag aagaaagaag agtcttccga ggaagggctg 3900 attccttcat cgctcgcatg cacctggtac aaggtgaaga tccacttctc ttctcaactc 3960 catttttatt cacacaaatt agtagaatac tcaaaaatga tgttttgttt gcaaaatttt 4020 aaaattcact agttaaccat gtcaaataat attcataatg catcttgtga agaacaggtg 4080 tgcatttatg gtgacagctg aatggtttat gtgcctatta tttcttttac tgctatagat 4140 gaccaattga acttaaacgt ttacaggaga tagacgtttt tcgccatgga agggatcggt 4200 ggttgattcg gtcattggag ttttccttac 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gagtaaagaa caaaaatgta ccacgcaggt 5100 ttttcagaca aggtggaagt gttccaagag aattcacagg tcagatcata ccatcaacgc 5160 ctcatgaatt accaggaatg ggattgtccg gttcctcaag cgccgtccaa gaacaccagg 5220 acgataccca acataatcaa caagatgaga tgaataaagc atcccattta caaaaaacat 5280 ttttggatct gctcaactcc tctgaagaat gccttacaag acagtccagt accaaacaga 5340 acatcacgga tggctgtcta ccgagagata gaactgctga agacgtggtt gatccgctca 5400 gtaacaattc aagcttacag aacatattgg tcgaatcaaa ttccagcaat aaagagcaga 5460 cggcagttga atacaaggag acaaatgcca ctattttacg agagatgaaa gggacgcttg 5520 ctgatgggaa aaagcctaca agccagtggg atagtctcag aaaagatgtg gaggggaatg 5580 aagggagaca ggaacgaaac aaaaacaata tggattccat agactatgaa gcaataagac 5640 gtgctagtat cagcgagatt tctgaggcta tcaaggaaag agggatgaat aacatgttgg 5700 ccgtacgaat taaggtaaat ctactaattt cagttgagac cctcatcaaa tctgtcagaa 5760 ggcttgaaca tcagtaaatt atgtaaccat atttacaaca ttgcaggatt tcctagaacg 5820 gatagttaaa gatcatggtg gtatcgacct tgaatggttg agagaatctc ctcctgataa 5880 agccaagtgg gtaaatcaca tttttagtga ctgcaacact agcacgatcg atttactcaa 5940 caattacgtc aaactgagta ttaacaagtt gctcatgaac atttcacagg gactatctct 6000 tgagcataag aggtctgggt ttgaaaagtg ttgaatgcgt gcgactctta acactccaca 6060 atcttgcttt ccctgtgagt cagactattc cattatctac taaaaactta gaataactcc 6120 ggctaactaa gctggaactt gtattgatga tatgaaggtt gacacgaatg ttggaaggat 6180 agcagttagg atgggatggg tgcctctaca acccctacct gaatcacttc agttacacct 6240 cctggagctg taagtttctt tttgtttgtc atctaaacaa cgaaattttt atgcaagtca 6300 taaccatgct gtgttttcac agatacccag tgctcgagtc catccaaaaa tttctttggc 6360 caagactttg caaactcgat caacgaacac tgtatgctca taaactctaa caaatcatct 6420 gtctgaaaaa ccaatatttc tttggtagaa ttctattgtc attactcatt actaacagcg 6480 aaattaatta acgttctttt tcttactcag gtatgaatta cactaccaac tgattacgtt 6540 tggaaaggta ttattgctct aagctttgaa tttatcatat ggtaatttca agcattgtag 6600 gcacctgatc aattatgtgt ctaaatcatg tgaattcatg tcaggtattt tgcacaaaga 6660 gtagaccaaa ttgtaatgca tgtccaatga gaggagagtg cagacacttt gccagtgctt 6720 atgctaggta agcaagcttt catgtactta 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tgaacaaacc agtaggagac aagcaagcaa 7620 aacgttttaa gataaggtct atggtaaaat gacaaggtaa ctgataaatg tgtcgtctat 7680 ttgcaggtac gagctcccag attcacatcg tctccttgat ggtgtaagtc aatttttaac 7740 tctctctata ctcgagttgt ttcacttgag caacactgtt taaaagtcct catttgataa 7800 aataacagat ggataaaaga gaaccagatg atccaagtcc ttatctctta gctatatgga 7860 caccaggtga gaataaaact gcaatgtttc attcatgtgt ctacagtatc aaagaaagta 7920 cagctagagc taaaaagcat ttgaaataga gtcggttaaa tatgaaagtt tgaatctgta 7980 aatgaaagcc ggaacgtagc attggtggat gttatatgta aattagtttt tgagattggt 8040 ctaatgtagt tgtttgactg ccaggtgaaa cagcgaattc ggcacaaccg cctgaacaga 8100 agtgtggagg gaaagcgtct ggcaaaatgt gctttgacga gacttgttct gagtgtaaca 8160 gtctgaggga agcaaactca cagacagttc gaggaactct tctggtgaga ttatcttgat 8220 cttttgtgtt gctcatgaaa aggagaagtg agaatacaag tttgctaata tcattttttc 8280 gtcattcaca gataccttgt cggactgcca tgagaggaag ttttccgctc aacgggacat 8340 atttccaagt caacgaggtt agatgaaata aaactcaaac agacagacga aacattattt 8400 ctgtttagtg ttggttcttt atcctccttg ccatttttta tcttgcagtt atttgcagac 8460 cacgagtcca gtctcaaacc catcgatgtt cctagagatt ggatatggga tctcccaaga 8520 aggactgttt acttcggaac atcagtaaca tcaatattca gaggtaaaaa cattcgtaat 8580 agagttagtt aatcaaatgt ccaaaacaca agaaagcttc accgtccaat acacaagaaa 8640 gcttcacctt ctctttgcca aaaaagatct tagaatgttt tgctgaattt gtgcaggtct 8700 ttcaacggag cagatacagt tctgcttttg gaaaggtaaa cgttaacttt cgacccagag 8760 aaatccggaa aatctattgc tttgttctga tcaatacgtt aaacatatac acacacactt 8820 tacacttagg accaatactg ttctgatctg tgatagaaac tggtaaacat ctaacaatta 8880 tgattgcagg attcgtatgt gtccgtggat tcgaacagaa gacaagagca ccgcgtccat 8940 taatggcaag gttgcatttt cctgcgagca aattgaagaa caacaaaacc taaagatgac 9000 tggaagaaag caaacgcatt gcttctctgc tctcctctat ttaaagccag gaaaagtccc 9060 atttagacat aataacagga atccaaatag gctattttct ctttctttct tatttcattc 9120 atagagcaga agcgacacaa aaaagttttt tgggttattt attttctctc taacaaattt 9180 gtagcgtttt gggtcttttt ctggctgtca ctagcgtggc aaatccaatg tctgcgcaca 9240 cttaggcgca ttgtcaataa aatttctccg gccaccggag tgtttagcat cttttaaccg 9300 gcggctaatg cgaatatttc cggtaacaca tattccttat tctatgttgg gttttgtgat 9360 aacggcagtg ggccttacta gacaatgatc atcaataaaa ctaacacaaa gttgaatgct 9420 ac 9422

Claims (10)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래의 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 재분화(regeneration) 효율을 증가시키는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 DEMETER 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어, 재분화 효율이 증가된 돌연변이 식물체.

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