BRPI1105206B1 - Método para produção de plantas geneticamente modificadas com capacidade de controle da produção do hormônio etileno, plantas geneticamente modificadas assim obtidas, vetor de dna recombinante e seus usos - Google Patents

Abstract

método para produção de plantas geneticamente modificadas com capacidade de controle da produção do hormônio etileno, plantas geneticamente modificadas assim obtidas, vetor de dna recombinante e seus usos o uso de promotores constitutivos para controle da expressão gênica tem sido uma ferramenta importante em biologia molecular de plantas. entretanto, em alguns casos, a regulação temporal precisa é desejada para caracterizar a função de um gene em um específico tempo durante o crescimento e desenvolvimento da planta. adicionalmente, para muitos genes, a constante indução leva a planta a fenótipos deletérios e indesejáveis. nesse cenário, o sistema de expressão induzido ao etanol, o sistema de expansão alc, tem sido usado com sucesso em tomate, batata, arabidopsis e tabaco. uma aplicação valiosa desse tipo de sistema é o uso em plantas de cana-de-açúcar para controle da maturação utilizando o etanol como indutor, em substituição á aplicação de reguladores vegetais. a presente invenção descreve um método para produção de plantas transgênicas utilizando um vetor de dna que compreende o sistema alc na regulação do gene scacs1 e, consequentemente, no controle da biossíntese do etileno. adicionalmente, são descritos também os usos do método e do vetor.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve um método para produção de plantas transgênicas que permitem o uso do etanol como indutor químico da síntese controlada do hôrmonio etileno, um maturador natural da cana. Adicionalmente, também é descrito o vetor que é inserido nas plantas para modificação gênica, o qual compreende o gene que codifica a enzima ACC sintase de cana-de-açúcar, enzima limitante na biossíntese do hormônio etileno e seus usos.

A maturação é influenciada por uma variedade de fatores incluindo umidade, quantidade disponível de nitrogênio, incidência da luz solar, altitude, latitude, temperatura, idade do cultivo e genótipo. Além disso, é uma das últimas fases dos processos fisiológicos da planta e está diretamente relacionada ao acúmulo de açúcares. A fase de maturação no desenvolvimento da cana-de-açúcar é especialmente interessante, pois está diretamente relacionada com o tempo na colheita da safra e conseqüentemente, no teor de sacarose. Desse modo, a criação de plantas geneticamente modificadas expressando genes relacionados ao amadurecimento é uma alternativa viável para a obtenção de cultivares melhorados. O estabelecimento de um sistema de amadurecimento em plantas controlado quimicamente, que apresente facilidade na aplicação, baixo custo de produção, propriedade atóxica em níveis requeridos para a indução tem grande interesse industrial.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Dentre as tecnologias para produção de plantas transgênicas, a transformação por Agrobacterium (Hooykaas PJ, Schilperoort RA (1992) Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Mol Biol 19: 15-38; Barton KA, Chilton MD (1983) Agrobacterium Ti plasmids as vectors for plant genetic engineering. Methods Enzymol 101: 527-539), a transferência direta de genes em protoplastos (Gharti-Chhetri GB, Cherdshewasart W, Dewulf J, Paszkowski J, Jacobs M, et al. (1990) Hybrid genes in the analysis of transformation conditions. 3. Temporal/spatial fate of NPTII gene integration, its inheritance and factors affecting these processes in Nicotiana plumbaginifolia. Plant Mol Biol 14: 687-696; Lyznik LA, Peng JY, Hodges TK (1991) Simplified procedure for transient transformation of plant protoplasts using polyethylene glycol treatment. Biotechniques 10: 294-300; Rodenburg KW, de Groot MJ, Schilperoort RA, Hooykaas PJ (1989) Single-stranded DNA used as an efficient new vehicle for transformation of plant protoplasts. Plant Mol Biol 13: 711-719 e Ballas N, Zakai N, Loyter A (1987) Transient expression of the plasmid pCaMVCAT in plant protoplasts following transformation with polyethyTeneglycoi. Exp Ceil Res 170: 228-234) e o bombardeamento de partículas (Klein TM, Wolf ED, Sanford JC (1987) High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327: 70-73) são as mais utilizadas.

Nos últimos anos tem-se obtido grande avanço nas tecnologias para a transformação de plantas e as pesquisas têm se voltado para a necessidade de desenvolver métodos eficazes de transformação genética das principais espécies de interesse experimental e econômico. A agrotransformação tem ganhado grande aceitação pela facilidade do método de transformação e a alta taxa de plantas transgênicas geradas a partir desse método. Por outro lado, o tabaco tem sido utilizado amplamente como ferramenta de transformação gênica pela facilidade de transformação e rápida obtenção de gerações transformadas. Desta forma, genes de diferentes espécies podem ser avaliados inicialmente em tabaco, pela facilidade e rapidez na produção e análise das plantas transgênicas. Isso tem ocorrido com genes de cereais, produtos hortícolas, plantas ornamentais, medicinais, árvores frutíferas, pastagens, dentre outros. Assim, embora o tabaco seja uma planta dicotiledônea, ele oferece evidência clara que genes de monocotiledôneas, como cana-de-açúcar, milho, trigo e arroz, possam conferir função e regulação biológica conservadas.

Nos últimos anos, com a chegada de novas tecnologias como o seqüenciamento genômico, microarrays e outras tecnologias (Mardis ER (2008) Nextgeneration DNA sequencing methods. Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387-402) têm aumentado as informações sobre os genes, até o ponto do patenteamento de genomas completos (Stix G (2006) Owning the stuff of life. Sci Am 294: 76-83 e Stott M, Valentine J (2003) Impact of gene patenting on R&D and commerce. Nat Biotechnol 21: 729-731; author reply 731). A partir dessas novas abordagens, um grande número de genes vem sendo identificado, e, dessa forma, tem-se buscado cada vez mais o patententeamento de sistema de controle gênico quantitativo, espacial e temporal em plantas.

O controle da expressão de transgenes em plantas é um ponto importante para a caracterização da função do gene e da sua manipulação durante o crescimento e desenvolvimento da planta (Rosian H, Salter MG, Wood CD, et al . 2001. Characterization of the ethanol-inducible ale gene-expression system in Arabidopsis thaliana . The Plant Journal 28, 225-235). A expressão controlada de genes de interesse utilizando promotores induzíveis apresenta importantes vantagens: permite que a atividade gênica seja induzida em determinadas fases do desenvolvimento da planta; pode ser possível modular a expressão e então determinar a resposta da planta para diferentes níveis do produto gênico; a expressão pode ser usada para determinar se o efeito fenotípico é reversível ou permanece estável em estágios específicos do desenvolvimento (Garoosi GA, Salter MG, Caddick MX, Tomsett AB (2005) Characterization of the ethanol-inducible ale gene expression system in tomato. J Exp Bot 56:1635-164). Deste modo, sistemas de expressão gênica que dependem de indução química têm sido desenvolvidos para o uso em plantas (Gatz, C. and Lenk, I., 1998. Promoters that respond to chemical inducers. Trends Plant Sci., 3: 352-358; Jepson MA, Clark MA. Studying M cells and their role in infection. Trends Microbiol 1998;6:359-65; Zuo J, Niu’Q-W, Chua N-H. 2000. An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants. The Plant Journal 24, 265-273).

Um sistema de expressão controlado por etanol foi desenvolvido por

Salter et al (Salter MG, Paine JA, Riddell KV, Jepson I, Greenland AJ, Caddick MX, Tomsett AB. 1998. Characterization of the ethanol-inducible ale gene expression system for transgenic plants. The Plant Journal 16, 127-132.). Esse sistema está baseado no gene ale, do fungo Aspergillus nidulans, que usa o etanol como indutor (Pateman, J. A., Doy, C. H., Olsen, J. E., Norris, U, Creaser, E. H. & Hynes, M. (1983) Proc. R. Soc. London Ser. B 217, 243-264; Sealy-Lewis,H.M. and Lockington,R.A. (1984) Curr. Genet., 8, 253-259; Felenbok B, Sequeval D, Mathieu M, Sibley S, Gwynne DI, Davies RW (1988) The ethanol regulon in Aspergillus nidulans: characterisation and sequence of the positive regulatory gene alcR. Gene 73:385-396). A indução por etanol ocorre pela ação do gene alcR,cuja proteína ativa a expressão dos genes estruturais alcA e aldA, que codificam a álcool desidrogenase I e aldeído desidrogenase respectivamente (Pateman et al, 1983). O gene alcR é positivamente auto-regulado, necessitando da proteína AlcR funcional mesmo para a expressão em níveis basais (Fillinger S, Panozzo C, Mathieu M, Felenbok B (1995) The basal level of transcription of the ALC genes in the ethanol regulon in Aspergillus nidulans is controlled both by the specific transactivator ALCR and the general carbon catabolite repressor CREA. FEBS Lett 368:547-550). Da mesma forma, para a ativação dos genes alcA e aldAé preciso a presença do etanol para que a proteína AlcR seja capaz de se ligar às regiões promotoras desses genes e permitir ã transcrição.

O sistema alc é muito sensível ao etanol, com rápida indução em baixa concentração, sendo que 0,01% (1,7 mM) de etanol em meio de cultura inicia a expressão do gene CAT (chloranphenicol acetyl transferase) nas primeiras 4 horas de exposição (Salter et al,1998). A indução de expressão gênica usando o sistema alc tem sido estudada através da absorção do etanol pelas raízes ou pulverização das folhas. Esses métodos têm sido utilizados com sucesso em tabaco, no qual a expressão de um gene repórter foi observada depois de 2 horas de aplicação atingindo um pico após 96 horas por absorção radicular e 24 horas depois da pulverização das folhas. De acordo com Sweetman et al (Sweetman JP, Chu C, Qu N, Greenland AJ, Sonnewald U, Jepson I. 2002. Ethanol vapour is an efficient inducer of the alc gene expression system in model and crop plant species. Plant Physiology 129, 943-948.), baixas concentrações de vapor de etanol induzem eficientemente o sistema de expressão do gene alc em plantas transgênicas de tabaco, batata e canola. Tratamentos de tubérculos de batata com vapor de etanol resultam em uma expressão uniforme do gene uidA,que codifica a enzima beta-glucoronidase (GUS). 0 uso de vapor de etanol como um indutor químico também tem sido relatado em estudos com Arabidopsis (Rosian H, Salter MG, Wood CD, et al. 2001. Characterization of the ethanol-inducible alc gene-expression system in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 28, 225-235). A eficácia desse sistema de expressão de transgene foi demostrada recentemente também em tomate (Garoosi, 2005). Adicionalmente, o sistema alc tem sido usado para promover a expressão em tecidos específicos, através da fusão do gene alcR a promotores apropriados,, cuja atividade só exista no tecido alvo (Deveaux Y, Peaucelle A, Roberts GR, Coen E, Simon R, Mizukami Y, Traas J, Murray JAH, Doonan JH, Laufs P. 2003. The ethanol switch: a tool for tissue-specific gene induction during plant development. The Plant Journal 36, 918-930.; Maizel A, Weigel D. 2004. Temporally and spatially controlled induction of gene expression in Arabidopsis thaliana . The Plant Journal 38,164-171.).

O etanol é um indutor químico e não tóxico nos níveis requeridos para a indução. Além disso, é de fácil utilização, podendo ser aplicado nas plantas por pulverização, submersão das raízes e adicionado ao meio de cultura (Salter et al,1998).

Por esses motivos, o promotor alc destaca-se como um excelente candidato para a estratégia de amadurecimento controlado da cana-de-açúcar e será usado como modelo para validar a estratégia.

Apesar do crescimento em pesquisas com cana-de-açúcar, são poucos os exemplos de invenções que utilizam genes de cana para controle e/ou aumento da maturação fisiológica da planta. O uso de genes de cana que controlam sua maturação, em contraponto a genes de outras espécies, permite a produção de plantas transgênicas da cana contendo genes da própria cana, os quais têm maior aceitação pelos consumidores. De fato, 70% dos consumidores dão suporte a modificações genéticas envolvendo genes da própria espécie, em contraste com o suporte de 26% quando se tratam de genes de outras espécies (Rommens CM, 2010, Barriers and paths to market for genetically engineered crops. Plant Biotechnology Journal 8:101- 111).

Esta invenção relaciona-se com-o processo de manipulação de uma seqüência de DNA que codifica uma proteína de cana-de-açúcar e da produção de plantas geneticamente modificadas de cana contendo essa sequência. O conhecimento prévio no estado da arte não permite associar qualquer estratégia de controle da maturação, através do hormônio etileno, desta invenção. Esta invenção descreve também a construção de vetores que contém a seqüência da proteína de cana-de-açúcar, bem como um processo de controle químico da maturação fisiológica de plantas transgênicas.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

O uso de promotores constitutivos para controle da expressão gênica tem sido uma ferramenta importante em biologia molecular de plantas. Entretanto, em alguns casos, a regulação temporal precisa é desejada para caracterizar a função de um gene em um específico tempo durante o crescimento e desenvolvimento da planta. Adicionalmente, para muitos genes, a constante indução leva a planta a fenótipos deletérios e indesejáveis. Nesse cenário, o sistema de expressão induzido ao etanol, o sistema de expressão alc, tem sido usado com sucesso em tomate, batata, arabidopsis e tabaco. Uma aplicação valiosa desse tipo de sistema é o uso em plantas de cana-de-açúcar para controle da maturação utilizando o etanol como indutor, em substituição à aplicação de reguladores vegetais.

Dessa forma, a presente invenção descreve um método para produção de plantas geneticamente modificadas que contém em suas células uma seqüência de nucleotídeos de cana-de-açúcar e a expressão controlada quimicamente desse gene leva à maior produção do hormoriiõ etileno pela planta em questão.

Em uma forma mais ampla, o polinucleotídeo que codifica a proteína de cana-de-açúcar é expresso por um promotor e um terminador que funcionam em plantas. Mais especificamente, a presente invenção descreve um polinucleotídeo de DNA recombinante no sentido 5' para 3', que compreende um promotor que funciona em plantas, operacionalmente ligado a um segundo 3polinucleotídeo que codifica uma proteína de cana, operacionalmente ligado ao terminador, o qual finaliza a transcrição do polinucleotídeo de DNA fornecendo um sítio de poliadenilação. De acordo com o presente método, é utilizada uma seqüência de DNA recombinante em que o promotor é selecionado do grupo constituído por promotores induzíveis.

Mais especificamente, o método da presente invenção descreve a produção de um vetor que contém seqüência de DNA recombinante em que o promotor induzível corresponde ao promotor do gene AlcA, operacionalmente ligado a um segundo polinucleotídeo que codifica uma proteína AlcR do fungo Aspergilus nidulans, que, por sua vez, é operacionalmente ligado ao terminador, o qual finaliza a transcrição do polinucleotídeo de DNA fornecendo um sítio de poliadenilação.

Portanto, o método descrito possibilita a produção de plantas que tem como característica a biossíntese do hormônio etileno controlada quimicamente pelo indutor etanol através da inserção nas células vegetais de um vetor de DNA recombinante compreendendo um gene cana-de-açúcar capaz de se inserir no genoma de uma célula vegetal.

Na presente invenção, além do método para produção de plantas transgênicas,-é descrito-seu uso-para produção, aíém das plantas genéticamente modificadas, possíveis partes de plantas que venham a ser modificadas, células vegetais e propágulos formados, que contenham em seu genoma moléculas de DNA recombinante, tal como descrito. Adicionalmente, são descritos tambémdescrevem-se também o vetor de DNA usado no método

As plantas incluem, mas não estão limitadas a plantas de cultivo, monocotiledôneas ou dicotiledôneas e dentre elas podem-se incluir cana-de-açúcar, soja, milho, canola, arroz, algodão, cevada, aveia, grama, trigo, pinhão manso, mangueira, goiabeira, limoeiro, abacateiro, laranjeira, ameixeira, pitagueira, jabuticabeira, macieira, pessegueira, batateira, ervilheira, tomateiro, roseira, girassol, feijão, eucalipto, abacate, morango, pêra, maçã, goiaba, cacau, limão, maracujá, palma forrageira, mamona, mandioca, seringueira, mate, jacarandá, café, abóbora, melancia, pêssego, pitanga e caju.

Mais especificamente, esta invenção fornece um método para produzir uma planta que tem como uma das características, a biossíntese do hormônio etileno controlada quimicamente pelo indutor etanol. A invenção compreende as etapas de inserir no genoma de uma célula de planta, a construção de uma molécula de DNA recombinante compreendendo um gene cana-de-açúcar, a obtenção de uma célula de planta transformada ou células transformadas, a regeneração de plantas transformadas de células vegetais e a seleção de plantas que apresentam melhores características agronômicas. Uma das características da invenção é o fato das plantas . selecionadas-apresentarem um còhtrõle"induzido quimicamente da biossíntese do hormônio etileno.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Sequência de polinucleotídeo correspondente à SEQ ID NO: 1 e sequência de polipetídeo correspondente à SEQ ID NO: 2. A) SEQ ID NO: 1, correspondente à sequência de DNA do fragmento de DNA obtido a partir do gene ScACSl de cana-de-açúcar; B) SEQ ID NO: 2, correspondente à sequência da proteína deduzida da SEQ ID NO: 1.

Figura 2: PCR quantitativo do gene ScACSl em folhas maduras e internos 1, 5 e 9 de cana-de-açúcar. As amostras foram testadas em triplicada experimental a normalizadas para o gene da poliubiquitina de cana-de-açúcar. As barras representam a media de duas réplicas biológicas.

Figura 3: Construções utilizando o sistema de expressão alc. (A) Construções contendo o sistema completo alc. As construções incluem o promotor CaMV35S (CaMV35S-pro) que dirige o cDNA do gene alcR, posicionado rio acima do terminador CaMV35S (35S-ter). O promotor quimérico (35S:alcA-pro) é composto do promotor CaMV35S mínimo (-23 ate +1) fusionado com o promotor alc (Caddick et al., 1998) que dirige o gene repórter GUS na construção (Al) ou o cDNA do gene ScACSl (JF274985) na construção (AH), nos dois casos utilizando o terminador NOS (NOS-ter). (B) Controles negativos do sistema alc. O cassete de expressão com o fator de transcrição alcR não foi incluído nas construções (BI) e (Bll). O vetor de transformação para plantas pCAMBlA2300 tem o gene de"resistência nptll para a seleção em plantas do neomicina-fosfotransferase II, e o gene lacZ para a seleção por colonias brancas/azuis. Borda esquerda, LB; Borda direita: RB; Sítio múltiplo de clonagem, MCS.

Figura 4: Expressão transiente do gene GUS em alface utilizando o sistema induzível do gene alc. Folhas de alface foram coradas para atividade GUS dois dias após a infiltração com A. tumefaciens cepa GV3101, carregando a construção alcR- alcA-GUS (I), a construção alcA-GUS (II), o vetor controle pCAMBIA2301 (III) ou alface não transformada, utilizada como controle negativo do ensaio (IV). Concentrações de etanol de 0,5%, 1%, 5%, 10% (v/v) e água ultrapura correspondem á figures AB, CD, EF, GH e IJ, respectivamente. Os asteriscos (*) indicam a presença da coloração de GUS como descrito na figura IIJ. Os cortes nas folhas foram feitos para permitir a penetração do substrato do GUS.

Figura 5: Análise de RT-PCR da expressão do gene alcR em plantas transgênicas. Na esquerda, 1, 2.1, 31.2, 68 e 71 são linhagens independentes da construção alcR alcA::GUS; na direita, 11, 16, 28 e 32 são linhagens independentes da construção alcR alcA::Scacsl; wt, selvagem; ct-, sem cDNA; O controle da β-actina é mostrado na parte inferior do painel.

Figura 6: Produção de etileno induzida por etanol nas plantas de tabaco transgênicas. A quantificação de etileno foi feita em plantas tratadas com água ou etanol 5% (v/v). Wt, plantas selvagens; 10, linhagem da construção alcA::Scacsl; 16 e 32, linhagens independentes da construção alcR alcA::Scacsl

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve um método para produção de plantas geneticamente modificadas que compreende a produção de um vetor de DNA, no qual é inserido um gene de cana-de-açúcar cuja sequencia é descrita em SEQ ID:1 ou, uma sequencia que apresente pelo menos 60% de identidade com a descrita em SEQ ID:l.

O vetor descrito na presente invenção permite o controle químico da expressão do gene ACC sintase em plantas transgênicas através da atuação do gene descrito em SEQ ID: 1, que codifica uma nova proteína de cana-de-açúcar, de função até então desconhecida. A SEQ ID:1 contida no vetor deve ser operacionalmente ligada a um promotor funcional em plantas capaz de ser controlado pela proteína alcR, a qual interage com o promotor na presença do indutor etanol.

A SEQ ID: 1 é nomeada Sugarcane ACC Sintase (ScACSl) e a proteína SEQ ID NO: 2, deduzida a partir dessa seqüência de DNA estão indicados na Figura 1.

O sistema de expressão genético controlado quimicamente através do indutor etanol é composto de duas sequências de polinucleotídeos. A primeira sequência é composta pelo gene que codifica a proteína alcR. Na presente invenção o gene alcR está sob controle de um promotor constitutivo, como, por exemplo, o CaMV35S. A segunda sequência é composta do gene de cana-de-açúcar, ScACSl, indicado na SEQ ID NO: 1 sob o controle do promotor quimérico alcA:35S, cuja atividade é dependente da proteína alcR. Desta forma, o cassete contendo o gene ScACSl só será expresso na presença de etanol (Figura 3).

A sequência de DNA" descrita èrri SEQ ID NÓ: 1 compreende a região codificante do gene ScACSl que é usada como parte de um DNA quimérico capaz de aumentar a expressão da região codificante em células vegetais.

O vetor de transformação de plantas usado para introduzir o ácido nucléico na célula vegetal pode ser um plasmídeo, em que o DNA SEQ ID NO:1 é inserido em sítios de divagem de endonucleases de restrição ou por recombinação mediada por outros tipos de proteína. O DNA é inserido no vetor de clonagem utilizando procedimentos padrão facilmente conhecidos. Isso geralmente envolve o uso de enzimas de restrição e ligases do DNA, conforme descrito, por exemplo, por Sambrook et al (Wood EJ, Molecular-Cloning - a Laboratory Manual - Maniatis,T, Fritsch,Ef, Sambrook,J. Biochemical Education 11: 82-82; 1983). O plasmídio resultante, que inclui a SEQ ID NO:1 pode então ser usado para transformar uma célula vegetal, plantas ou partes de plantas por métodos convencionais de transformação.

Para a transformação de plantas, o plasmídeo de preferência também inclui um gene marcador de seleção na transformação de plantas, embora existam métodos que prescindam do uso desse tipo de gene marcador. Marcadores seleção de vegetais comumente usados incluem o gene da neomicina fosfotransferase II (nptll), que confere resistência a canamicina, o gene da higromicina fosfotransferase (hpt), que confere resistência a higromicina, o gene de fosfinotricina acetil transferase (bar), que confere resistência à fosfinotricina, o gene 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), que confere resistência ao glifosato, ou gene da acetolactato sintase - (ALS), que confere resistência’a herbicidas como o herbicidas IMI e SUL. Na presente invenção, o marcador de seleção utilizado é o gene Nptll, que permite a seleção dos transformantes com canamicina.

O plasmídeo também pode incluir um gene repórter que fornece uma indicação clara de que a transformação genética foi efetuada, através da detecção da atividade da proteína codificada pelo gene repórter. Os genes repórteres mais comumente utilizados são os que codificam a beta-glucuronidase (GUS),a luciferase e a proteína verde fluorescente (GFP). Genes repórter são muitas vezes colocados in frameda região promotora e nas proximidades do gene de interesse para assegurar que elas são expressas em conjunto e não separadas por eventos de recombinação cromossômica.

O plasmídeo de preferência também inclui os promotores adequados para a expressão do ácido nucléico indicado na SEQ ID NO: 1 e também para a expressão do gene marcador de seleção, assim como o gene repórter. O promotor do vírus do mosaico couve-flor 35S (CaMV 35S) é comumente utilizado para a transformação de plantas, bem como o do gene da actina 1 de arroz (Actl), da ubiquitina 1 (Ubil), o promotor do gene da alfa-amilase, e promotores de genes induzidos por estresse. Na presente invenção, o promotor utilizado para expressão do gene alcR é o promotor CaMV35S, mas outros promotores também podem ser utilizados. O promotor utilizado para a expressão do gene ScACSl é o promotor induzível alcA:35S. - - No plasmídeo, o DNA descrito em SEQ ID NO:1 está sob o controle de um promotor induzível. Para a transformação de plantas, o plasmídeo de preferência inclui também uma molécula de ácido nucléico codificando o terminador, como a região 3' não codificante dos genes que codificam um inibidor de protease de actina, do vírus do mosaico da couve-flor, ou da nopalina (NOS). Na presente invenção, o plasmídeo inclui o terminador da nopalina sintase (NOS) (Figura 3).

O plasmídeo é preferencialmente um vetor de transformação de plantas binário em que os genes de interesse são inseridos dentro das bordas do T- DNA. Exemplos de tais vetores de transformação de plantas que podem ser usados na presente invenção são vetores obtidos a partir de fontes comerciais, tais como a serie pCambia, pBH21 ou pGreenll que contém uma origem RK2 de baixa replicação, o gene marcador da neomicina-fosfotransferase (nptll), e o terminador da nopalina sintase (NOS), promotor constitutivo e um sinal de 3' NOS de poliadenilação.

Para a transformação das plantas, qualquer método adequado para a transformação de monocotiledôneas ou dicotiledôneas pode ser usado, como, por exemplo, a transformação mediada por Agrobacterium ou bombardeamento de partículas (também conhecida como transformação de biobalística). Na transformação mediada por Agrobacterium, as células vegetais são colocadas em contato com um inóculo de bactérias transformadas com o plasmídeo contendo o DNA indicado na SEQ ID NO: 1 da invenção, por exemplo, através da inoculação de células de plantas com uma suspensão de bactérias transformadas. Bactérias do gênero Agrobacterium que podem ser utilizados para transformar células vegetais incluem espécies de - Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tümefaciens de preferência cepas de A. tumefaciensLBA4404, EHA105 ou GV301. Agrobacterium spp. são transformadas com o plasmídeo por métodos convencionais conhecidos.

Por sua vez, utilizando-se um protocolo de transformação de discos foliares, bactérias de A. tumefacienscom o DNA indicado na SEQ ID NO:1 clonado no vetor binário são cultivadas em um meio de crescimento na presença de antibióticos, como por exemplo, canamicina, para selecionar as células bacterianas que possuem o plasmídeo binário. Em seguida, folhas de tabaco selvagem são esterilizadas superficialmente, cortadas em pequenos discos e incubadas numa suspensão de A. tumefaciens por um tempo adequado. Diferentes tecidos podem ser utilizados para a transformação, tais como folhas, talo, flor, dentre outros. Após a incubação com A. tumefaciens as folhas infetadas são transferidas ao meio de cultura in vitropor determinado período de tempo. A seleção das plantas transgênicas é iniciada colocando-se as plantas infetadas no meio de seleção in vitrocom antibiótico. Após o desenvolvimento de plantulas com raízes ocorre a transferência para solo e o crescimento em câmara de crescimento.

Dessa forma, o método descrito na presente invenção refere-se ao método de produção de plantas, partes de plantas, células vegetais ou progénie de plantas geneticamente transformadas com um vetor de DNA contendo a seqüência indicada em SEQ ID NO:1, gene quimérico com capacidade de expressão em células vegetais, sob o controle químico do sistema alc indicado na figura 3, aumentando a produção do hormônio ètilènõ em plantas induzidas com etanol.

A concentração de etanol que deve ser aplicada às plantas geneticamente modificadas para que se obtenha o efeito esperado de indução e modulação da produção de etileno, deve variar entre 0,5% e 10%, sendo 5% a concentração preferencial, porém sem limitar-se a ela, como demonstrado na figura 4.

Plantas transgênicas, de acordo com esta invenção, incluem, sem limitação, os cereais, como trigo, cevada, milho, arroz, aveia, gramíneas forrageiras, turfa, outras monocotiledôneas como cana-de-açúcar, miscanthus, ou qualquer espécie de cultura de outros alimentos como o feijão, a soja, ervilha, tomate, colza, bem como outras espécies de interesse econômico, como o tabaco, a laranja, etc.

EXEMPLOS Exemplo 1: AVALIAÇÃO DO NÍVEL DE EXPRESSÃO DO GENE SCACS1 DE CANA-DE-AÇÚCAR

Para avaliar o padrão de expressão do gene ScACSl em cana-de-açúcar foi feito um PCR em tempo real conforme descrito por Rocha et al (Rocha FR, Papini- Terzi FS, Nishiyama MY, Vencio RZN, Vicentini R, et al. (2007) Signal transduction- related responses to phytohormones and environmental challenges in sugarcane. Bmc Genomics 8) utilizando folhas e entrenós 1, 5 e 9 da variedade de cana (RB935744). Como gene de referência foi utilizado o gene da poliubiquitina de cana.

A expressão do gene ScACSlfoi determinada a partir do método 2- ΔΔCT (Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using - real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25: 402- 408). A região 3'UTR do gene ScACSlfoi usado como molde para desenho dos primers utilizado na técnica. Os valores do PCR quantitativo são relativos a amostra do entrenó 1 da variedade RB935744.

O resultado da análise mostrou a expressão do gene ScACSl em folha madura e durante o desenvolvimento dos entrenós 1, 5 e 9. O gene ScACSl foi expresso em todos os tecidos analisados e altos níveis de transcritos foram detectados no entrenó 9 quando comparados com entrenós 1 e 5. Esse alto nível de transcritos no entrenó 9 pode estar relacionado com altos níveis de sacarose, já que o processo de maturação em cana-de-açúcar é caracterizado por um aumento gradual do conteúdo de sacarose do topo para a base da planta. Esses dados sugeriram que o gene ScACSl poderia estar envolvido na maturação fisiológica em cana.

Exemplo2: CLONAGEM DA SEQ ID NO: 1 DE CANA-DE-AÇÚCAR E PRODUÇÃO DE UM CASSETE RECOMBINANTE.

Um clone com seqüência do gene ScACSl de cana-de-açúcar foi obtido do Brazilian Clone Collection Center (BCCCENTER, Jaboticabal, Brasil). A partir desse DNA a seqüência codificante completa, indicada na SEQ ID NO: 1 (Figura 1), foi amplificada por PCR utilizando oligonucleotideos específicos 5'- CTGCAGGGAAAAAACCGACGTCAA -3'e 5' - GAGCTCTGTCTTACCGAATGCATGC -3', e clonada no vetor pGEMT-Easy (Promega, EUA).

Um dos cassetes de expressão foi formado pela região codificante do gene ScACSl sob controle do promotor alcA e região terminadora NOS, seguidos pelo promotor CaMV35S nõ còhtrólé do géne que codifica o fator de transcrição (alcR) e pelo terminador 35S. Para tal foram desenhados primers específicos para ScACSl, contendo sítios de restrição para facilitar as clonagens. O produto de PCR foi subclonado em pGEM-Teasy (Promega, EUA) e então retirado via digestão enzimática para clonagem no vetor contendo o promotor alcA. Um segundo cassete foi construído da mesma forma usando a região codificante do gene GUS em substituição à do gene ScACSl. A confirmação da identidade das construções em todos os casos foi feita através de digestões enzimáticas e eletroforeses em gel de agarose. As construções recombinantes finais (contendo o gene ScACSl ou GUS) resultantes foram introduzidas separadamente em Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 (CLONTECH, EUA).

Exemplo 3: EXPRESSÃO TRANSIENTE DO GENE REPÓRTER GUS PELO SISTEMA ALC EM ALFACE

A construção do sistema alc com gene repórter GUS (Figura 3.A I) foram inoculadas em meio YEB (6 g/L Extrato de Levedura, 5 g/L Peptona, 5 g/L Sacarose, 2 mM MgSO4) suplementado com 100 μg/ml Kanamicina, 15 μg/ml Rifampicina e 25 μg/ml Gentamicina. Após incubação no escuro por 2 dias à 289C e agitação a 250 rpm foi realizada uma diluição 1:100 do inóculo primário para um volume final de 1,2 litros do mesmo meio YEB com os antibióticos já citados. Após adição de 50 mM de tampão Fosfato de Potássio pH 5,6 e 20 μM de Acetoseringona o inóculo foi incubado no escuro à 289C e agitação a 250 rpm durante a noite. Após adição de 55 g/L de Sacarose, 100 μM de Acetoseringona e incubação por 1 hora no escuro à 229C e agitação a 250 rpm foram adicionados 0,0005% de Tween20 .

A infiltráção à vácuo foi feita em 4 recipientes de 2 L em um dissecador. Foi colocada a alface lisa e hidroponada dentro de cada recipiente contendo 1,2 litros de inóculo. Após aplicação de vácuo de 700 mmHg por 30 minutos, a alface foi lavada com água destilada e colocada por 2 dias em câmara de crescimento (BOD) a 22^C e fotoperíodo de 16 horas. Em paralelo foi feita infiltração apenas com meio YEB como controle negativo do teste de agro-infiltração. Todos os procedimentos foram realizados em um fluxo laminar. Após dois dias de incubação as alfaces foram cortadas em pedaço irregulares e colocadas dentro de placas de Petri com diferentes concentrações de etanol (0,5%, 1%, 5% e 10% de etanol) por 24 horas em BOD à 22^C e fotoperíodo de 16 horas. Como controle foi usada incubação com água milliQ. Cada tratamento foi realizado com 8 repetições.

O ensaio histoquímico de X-Gluc foi realizado como descrito em (Jefferson, R.A., Kavanagh, T,A., Bevan, M.W. (1987). GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO Journal 6:3901- 3907) e observação e documentação dos resultados foram realizadas através da lupa Leica MZ10F.

Exemplo 4: PRODUÇÃO DE PLANTAS GENETICAMENTE MODIFICADAS

Sementes selvagens de tabaco (Nicotiana tabacum, var. SR1) foram germinadas em placas de Petri contendo meio IX Murashige-Skoog (MS) com 5g/L de Phyto agar. As plântulas foram transplantadas para solo composto de Baccto (Michigan Peat Co., EUA) e areia (4:1, v/v), em potes de 325 mL. Quando as plantas desenvolveram entre 10 e 12 folhas, foram transplantadas para potes de 1 L contendo a mesma- mistura antes mencionada.

As plantas foram crescidas em câmara de crescimento com fotoperíodo de 16/8h luz/escuro (300-400 μmol fótons m’2 s'1) a 25°C e umidade relativa de 75- 80%. Para a produção de sementes, as plantas foram induzidas à floração por extensão do tempo de exposição à luz. Folhas de tabaco selvagem foram esterilizadas em sua superfície, cortadas em pequenos discos e incubadas numa suspensão de A. tumefacienspor 5 a 20 min. Após isto, as folhas infetadas foram transferidas ao meio MS (suplementado com 2 mg L1 benzil-adenina e 0,1 mg L1 ácido naftilacético) por 3 dias.

A seleção das plantas transgênicas foi iniciada colocando as plantas infetadas no meio de seleção (MS, 2 mg L1 benziladenina, 0,1 mg L1 ácido naftilacético e 100 mg L'1 canamicina, ou 30 mg L1 higromicina e 500 mg L1 carbenicilina). Os explantes que então se desenvolveram foram transferidas para o meio MS com 0,1 mg L I ácido 3-indol acético, 100 mg L1 canamicina, ou 30 mg L1 higromicina, e 500 mg L1 carbenicillina enquanto as plantas enraizadas foram transferidas para solo e crescidas em câmara de crescimento com fotoperíodo de 16/8h luz/escuro (300-400 μmol fótons m-2s-1) à 25°C e umidade relativa de 75-80%.

Exemplo 5: ANÁLISES DA PRESENÇA DO T-DNA EM PLANTAS GENETICAMENTE MODIFICADAS

A caracterização inicial das plantas enraizadas e transferidas para solo foi feita primeiramente extraindo DNA total de amostras de folha de plantas selvagens - e plantas transgênicas. Para "tal,"colètaram-se cerca de 50-150 mg de folha, que foram transferidos rapidamente para um almofariz contendo nitrogênio líquido. Após evaporação no nitrogênio, o material foi pulverizado até obter um pó bastante fino, ao qual foi acrescentado 3 mL de tampão de extração. Imediatamente a solução foi transferida para tubos plásticos estéreis de 1,5 mL, os quais foram mantidos em banho-maria a 65°C, por 30 minutos, com agitação suave a cada 10 minutos. Logo depois, foram adicionados aos tubos 10 μL de Proteinase K e os mesmos foram incubados novamente em banho-maria a 65°C por 30 minutos, com agitação suave a cada 10 mim. Em seguida, os tubos foram centrifugados numa microcentrífuga a 10.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi então transferido para um novo tubo plástico de 1,5 mL e, após atingir a temperatura ambiente, foi feita a primeira extração de DNA utilizando-se fenol-clorofórmio (1:1), na proporção de 1:1 (1 parte do sobrenadante: 1 parte de fenol-clorofórmio).

Em seqüência, o tubo foi invertido suavemente por várias vezes para conseguir uma emulsão homogênea e as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos. Imediatamente após os tubos serem retirados cuidadosamente da microcentrífuga, a fase superior (aquosa) foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL, evitando-se os contaminantes da fase inferior. Logo em seguida foi adicionada RNAse 100 mg/mL (1:100) e a mistura foi incubada a 37°C por 30 minutos.

Na última fase da extração foi adicionado o mesmo volume da solução de clorofil (24 partes de clorofórmio: 1 parte de álcool isoamílico) e a mistura foi colocada sob agitação suave por 5 minutos. Os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm durante 10 minutos e ã fase superior foi transferida para um novo recipiente.

Finalmente, adicionou-se o mesmo volume da solução de clorofil e a mistura foi agitada suavemente. Em seguida, centrifugaram-se os tubos a 10.000 rpm durante 10 minutos e a fase superior foi transferida para um novo tubo. A essa fase aquosa superior, adicionou-se 1 volume de álcool isopropílico e a solução foi, então, homogeneizada até a formação de um precipitado de DNA. O DNA precipitado foi lavado no próprio tubo em álcool 70%, por três vezes e foram adicionados 100 μL de água ultra pura. O DNA genômico foi armazenado a -20°C.

A presença do gene alcR no DNA genômico extraído de plantas transgênicas de tabaco foi confirmada pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Inicialmente foram utilizados 1 μL de DNA, 1,5 μL 4 dNTP (10 mM), 1,4 μL MgCI2 (25 mM), 1 μL de Primer sense (10 μM), 1 μL Primer antisense (10 μM), 2,5 μL Tampão Taq lOx, 0,3 μL Taq Polimerase (Fermentas), 16,3 μL de água MilliQ e essa reação foi submetida ao seguinte programa de amplificação: 3 minutos à 94°C mais 30 ciclos de 30 segundos à 94°C, 30 segundos a uma temperatura de 55°C, 2 minutos a 72°C e 7 minutos a 72°C.

O produto dessa reação foi visualizado em gel de agarose 0,8% em TAE contendo brometo de etídeo, sob iluminação de luz ultra-violeta. Essas plantas foram utilizadas nos ensaios posteriores para observar a expressão induzida do gene indicado na SEQ ID NO:1 na presença do indutor etanol em plantas de tabaco.

Exemplo 6: ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO ALCR NAS PLANTAS TRANSGÊNICAS.

Para verificar a expressão constitutiva do gene alcR nas plantas transgênicas, RNA total foi isolado usando Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A primeira fita de cDNA foi sintetizada usando 2 μg RNA tratado com DNAse I, primer oligo-dT (500ng/μL) e dNTP lOMm. Todas as amostras de RNA foram denaturadas à 65° C por 10 minutos, colocadas no gelo 2 minutos e adicionado 5X Tampão First Strand, 0,1 M DTT, RNAse out (40 U/μL) and Superscript III RT enzyme (200 U/μL) (Life Technologies, EUA). A reação foi realizada à 42°C por 50 minutos. A síntese da primeira fita de cDNA foi finalizada por aquecimento à 70°C for 15 minutes para inativação da enzima RT. O cDNA de cada amostra das plantas transgênicas e da planta selvagem foram utilizadas para o PCR utlizando primers que permitem amplificar o gene alcR.

Exemplo 7: INDUÇÃO DA ENZIMA ACC SINTASE EM PLANTAS TRANSGÊNICAS (Nicotiana tabacum)E QUANTIFICAÇÃO DO HORMÔNIO ETILENO LIBERADO.

Dois eventos transgênicos T2, (numerados como 16 e 32), carregando a construção com ambos os cassetes de expressão alcR e ScACSl (ver figura 3.AII) e um evento transgênico T2, (numerado como 10), carregando a construção somente com o cassete de expressão ScACSl (ver figura 3.BII) foram propagados in vitrosob condições de crescimento (25°C; 16 h luz/8 h escuro) em frascos bem vedados. Essas plantas com 4 meses de idade foram induzidas com 5% (v/v) etanol por 24h através de spray foliar.

Amostras de gases do espaço interno do frasco foram retiradas através de seringas de gás e analizadas por cromatografia gasosa (Shimadzu, Japão). Gás etileno padrão foi usado na análise é triplicate experimental foi realizada para cada planta.

Anteriormente, essas mesmas plantas foram induzidas com água ultra- pura nas mesmas condições acima como controle experimental negativo. Planta controle, selvagem, e triplicatas biológicas de casa linhagem transgênica foram usadas no experimento.

Claims (4)

1. Método para produção de plantas geneticamente modificadas caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) Produção de um vetor que compreenda a sequência descrita em SEQ ID NO:1 obtida de cana-de-açúcar; um promotor funcional em plantas; um terminador funcional em plantas; o promotor induzível alcA sob indução do fator de transcrição alcR; b) Inserção do dito vetor no genoma de célula vegetal, planta ou partes de plantas de tabaco; e c) Modulação da produção do hormônio etileno por indução com etanol em concentração entre 0,5% e 10%.

2. Vetor de DNA recombinante caracterizado por compreender a sequência gênica descrita em SEQ ID NO:1, um promotor operacionalmente ligado à sequência gênica de interesse e ser o promotor CaMV 35 S do vírus do mosaico do couve-flor, um terminador operacionalmente ligado à sequência gênica de interesse e o ácido nucléico que codifica o terminador ser o da nopalina sintase (NOS), um gene marcador NptII e um gene repórter.

3. Uso do método conforme descrito na reivindicação 1 caracterizado por ser aplicado para produção de célula vegetal, planta, sementes, partes de planta ou progênie com a finalidade de reprodução assexuada.

4. Uso do vetor conforme descrito na reivindicação 2 caracterizado por ser aplicado para produção de célula vegetal, planta, sementes, partes de planta ou progênie com a finalidade de reprodução assexuada.

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