KR101269656B1

KR101269656B1 - Ｍａｒ 서열의 복합 트랜스펙션 방법에 의한 포유동물 세포에서의 고효율 유전자 전달 및 발현

Info

Publication number: KR101269656B1
Application number: KR1020117023134A
Authority: KR
Inventors: 니콜라스 메르모드; 삐에르 알랭 기로드; 필립 뷔체르; 두크-쾅 뉴옌; 다비드 칼라브레세; 다미엥 소기; 스테파니아 푸티니
Original assignee: 셀렉시스 에스. 에이.
Priority date: 2003-10-24
Filing date: 2004-10-22
Publication date: 2013-05-30
Also published as: KR20110112883A; KR101222025B1; HK1149777A1; AU2010236072A1; JP5396653B2; WO2005040377A2; IL198863A; US9879297B2; EP2287302B1; CA2535836C; EP2292754B1; AU2010236072B2; KR101229989B1; RU2006117757A; CN1863913B; EP1959011B1; HK1151825A1; EP2298898B1; ATE551420T1; HK1120549A1

Abstract

본 발명은 단백질 생산 증가 활성을 갖는 분리 및 정제된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키기 위한 매트릭스 부착 부위(MARs)의 용도에 관한 것이다. 또한, 상기 활성 부위, 특히 MAR 뉴클레오티드 서열의 동정 방법 및 신규한 복합 형질전환 방법에서 특성화된 활성 MAR 서열의 용도가 개시되어 있다.

Description

ＭＡＲ 서열의 복합 트랜스펙션 방법에 의한 포유동물 세포에서의 고효율 유전자 전달 및 발현{High efficiency gene transfer and expression in mammalian cells by a multiple transfection procedure of MAR sequences}

본 발명은 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 진핵 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키기 위한 매트릭스 부착 부위(MARs)의 용도에 관한 것이다. 또한, 상기 활성 부위, 구체적으로는 MAR 뉴클레오티드 서열의 동정 방법 및 신규 복합 형질전환 방법에서의 이러한 활성 MAR 서열의 용도가 개시되어 있다.

현재는, 진핵 염색체의 루프 도메인 조직화 모델이 잘 받아들여지고 있다 (Boulikas T, “Nature of DNA sequences at the attachment regions of genes to the nuclear matrix”, J. Cell Biochem., 52:14-22, 1993). 이 모델에 따르면, 염색질이, RNP 및 다른 비히스톤 단백질로 구성된 단백질성 네트워크인 핵 매트릭스(nuclear matrix)에 부착하여 50-100 kb로 펼쳐져 있는 루프 내에 조직화되어 있다(Bode J, Stengert-Iber M, Kay V, Schalke T and Dietz-Pfeilstetter A, Crit . Rev. Euk . Gene Exp., 6:115-138, 1996).

핵 매트리스에 부착된 DNA 부위는 스캐폴드 (scaffold, 중기 동안) 부착 부위 또는 매트릭스(간기) 부착 부위로 각각 불리는 SAR 또는 MAR로 정의된다(Hart C and Laemmli U (1998), “Facilitation of chromatin dynamics by SARs”Curr Opin Genet Dev 8, 519-525).

이와 같이, 이러한 부위들은 개별적인 염색질 도메인의 경계를 한정할 수 있으며, 이로 인해 도메인 내에서 유전자 발현을 조절하는 시스-조절성(cis-regulatory) 엘리먼트 만을 포함한다.

그러나, 근처의 염색질 엘리먼트로부터 염색체 위치를 완전히 보호하고, 이로 인해 위치(position)-독립적으로 유전자를 발현하게 하는 능력은, 안정하게 형질전환된 세포에서는 발견되지 않았다(Poljak L, Seum C, Mattioni T and Laemmli U. (1994) “SARs stimulate but do not confer position independent gene expression”, Nucleic Acids Res 22, 4386-4394). 한편, MAR (또는 S/MAR) 서열은 국소적 염색질 접근성을 증가시키기 위해 인핸서와 작용하는 것으로 보고되었다(Jenuwein T, Forrester W, Fernandez-Herrero L, Laible G, Dull M, and Grosschedl R. (1997) Extension of chromatin accessibility by nuclear matrix attachment regions Nature 385, 269-272). 특히, MAR 엘리먼트는 배양 세포주(Kalos M and Fournier R (1995) “Position-independent transgene expression mediated by boundary elements from the apolipoprotein B chromatin domain” Mol Cell Biol 15,198-207), 형질전환 생쥐(Castilla J, Pintado B, Sola, I, Sanchez-Morgado J, and Enjuanes L (1998) “Engineering passive immunity in transgenic mice secreting virus-neutralizing antibodies in milk”Nat Biotechnol 16, 349-354) 및 식물(Allen G, Hall GJ, Michalowski S, Newman W, Spiker S, Weissinger A, and Thompson W (1996), “High-level transgene expression in plant cells: effects of a strong scaffold attachment region from tobacco” Plant Cell 8, 899-913)에서 이종(heterologous) 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 유전자 치료용의 기능이 향상된 벡터를 개발하기 위한 MAR 서열의 유용성도 인정된다(Agarwal M, Austin T, Morel F, Chen J, Bohnlein E, and Plavec I (1998), “Scaffold attachment region-mediated enhancement of retroviral vector expression in primary T cells” J Virol 72, 3720-3728).

최근에는, MARs를 포함하는 염색질-구조 변형 서열, 예컨대 닭 라이소자임 5' MAR이, 안정한 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포의 군집에서 리포터 발현을 유의적으로 증가시킬 수 있다는 사실이 보고되었다(Zahn-Zabal M, et al., Development of stable cell lines for production or regulated expression using matrix attachment regions, J Biotechnol, 2001, 87(1): p. 29-42). 이러한 특성은 고-생산 클론의 비율을 증가시키는데 사용됨으로써, 스크리닝될 필요가 있는 클론의 수를 감소시켰다. 이러한 이점은, 형질전환 유전자(transgene) 발현 카세트를 플랭킹(flanking)하는 MARs을 가진 컨스트럭트(constructs) 뿐만 아니라, 컨스트럭트가 MAR 서열을 이용해 분리된 플라스미드 상에 형질전환될 때 확인되었다. 그러나, MARs을 이용한 동시-형질전환 동안의 발현 레벨은, 2개의 MARs이 형질전환 유전자 발현 단위를 한정하는(delimitate) 컨스트럭트에서 발견되는 것만큼 높지 않았다. 3번째 바람직한 방법은, 형질전환 유전자 및 개별 플라스미드 상에 모두 연결되는 MARs을 이용해 형질전환 유전자를 형질전환시키는 방법인 것으로 확인되었다(Girod et al., 공개용으로 제출됨). 그러나, 이러한 기술에서 지속적으로 나타나는 한계 중의 하나는, 세포 당 형질전환될 수 있는 DNA의 양이다. 소망하는 유전자의 기능을 특성화하는 형질전환 효율을 높게 유지하기 위해, 많은 복합 형질전환 프로토콜이 개발되었다. 야마모토 등에 의해 적용된 프로토콜(Yamamoto et al, 1999, “High efficiency gene transfer by multiple transfection protocol” Histochem . J. 31(4), 241-243)은 5회의 형질전환이 일어나고 난 뒤에 형질전환 효율을 약 80%로 유도되었으나, 통상적인 형질전환 프로토콜은 단지 ＜40%의 효율에 도달하는 정도였다. 이러한 기술은 발현 세포의 비율을 증가시키고자 할 때에는 유용할 수 있으나, 높은 내재적 생산성을 가진 세포로 유도하지는 않는다. 따라서, 이 방법은 높은 생산성의 모노클로날 세포주를 생산하는데에는 유용하지 않다. 그러므로, 상술한 기술은 다음과 같은 2개의 주요한 결점을 갖는다:

i) 이 기술은, 유전자 카피의 추가 삽입에 유리하지 않거나, 형질전환 유전자를 유리한 염색체 위치(loci)에 삽입하지 않기 때문에, 형질전환된 세포의 동종 집단을 생성하지 않음,

ii) 복합 형질전환 이벤트에서의 동일한 선별가능 마커의 용도는 이중 또는 삼중으로 형질전환된 세포의 선별을 허용하지 않음.

특허 출원 WO 02/074969호에는, 안정한 진핵 세포주를 개발하기 위한 MARs의 용도가 기술되었다. 그러나, 상기 출원특허에서는 MAR DNA 엘리먼트에 대한 모든 보존된 상동성 또는 MAR 서열이 되고자 하는 DNA 서열의 능력을 예측하기 위한 어떠한 기술도 기술되어 있지 않다.

사실, 어떠한 명백한(clear-cut) MAR 일치 서열(consensus sequence)도 발견되지 않았으나(Boulikas T, “Nature of DNA sequences at the attachment regions of genes to the nuclear matrix” J. Cell Biochem., 52:14-22, 1993), 동물 MARs이 식물의 핵 스캐폴드에 결합할 수 있으며 이의 반대도 가능하기 때문에, 진화학적으로는, 이러한 서열의 구조가 진핵 게놈에서 기능적으로 보존되어 있는 것으로 여겨진다(Mielke C, Kohwi Y, Kohwi-Shigematsu T and Bode J, “Hierarchical binding of DNA fragments derived from scaffold-attached regions: correlation of properties in vitro and function in vivo” Biochemistry, 29:7475-7485, 1990).

생화학적 연구에 의한 MARs의 동정은, 장시간이 소요되고 예측불가능한 방법이다; 분석법에 따라 여러가지 결과가 얻어질 수 있다(Razin SV, “Functional architecture of chromosomal DNA domains” Crit Rev Eukaryot Gene Expr., 6:247-269, 1996). 진핵 게놈에 있는 엄청난 수의 예측된 MARs 및 게놈 프로젝트로부터 발행된 서열의 양을 고려한다면, 목표로 하는 실험을 수행하기 위해 포텐셜(potential) MARS를 필터할 수 있는 기술이 매우 유용할 수 있다.

최근에는, MARs에 대한 2개의 다른 예측 기술이 인터넷을 통해 이용가능하다. 첫번째 기술은, 수개의 MARs 내에서 동정된 패턴의 설정 및 이러한 패턴의 동시-유발의 통계 분석을 기초로 하는 MAR-Finder이다(http://futuresoft.org/MarFinder; Singh GB, Kramer JA and Krawetz SA, “Mathematical model to predict regions of chromatin attachment to the nuclear matrix” Nucleic Acid Research, 25:1419-1425, 1997). MAR-Finder 예측은 서열 컨텍스트(context)에 의존하는데, 이는 예측된 MARs가 등록된 서열의 컨텍스트에 의존함을 의미한다. 다른 예측 소프트웨어인, SMARTest(http://www. genomatix.de; Frisch M, Frech K, Klingenhoff A, Cartharius K, Liebich I and Werner T, In silico prediction of scaffold/matrix attachment regions in large genomic sequences, Genome Research, 12:349-354, 2001)는 실험적으로 확인된 MARs로부터 유도되는 웨이트-매트릭스(weight-matrices)를 이용한다. SMARTest는 스케일이 큰 분석을 수행하는데 적합한 것으로 알려져 있다. 그러나, 실제 이의 상대적으로 낮은 특이성을 제쳐놓더라도, 이를 이용하여 스케일이 큰 분석을 수행할 때 이론적 MARs의 양이 급속하게 많아지며, 이론적 MARs의 수를 억제하기 위한 그의 특이성을 증가시킬 방법이 없으므로, SMARTest는 사이즈가 큰 DNA서열로부터 잠재(potent) MARS를 스크리닝하는데 거의 쓸모없어지고 있다.

인터넷을 통해 이용가능하지 않은 다른 소프트웨어들도 있는데; 이들은 MAR 모티프의 빈도(MRS 판정법;Van Drunen CM et al., “A bipartite sequence element associated with matrix/scaffold attachment regions” Nucleic Acids Res, 27:2924-2930, 1999), (ChrClass; Glazko GV et al., “Comparative study and prediction of DNA fragments associated with various elements of the nuclear matrix” Biochim . Biophys . Acta, 1517:351-356, 2001) 뿐만 아니라 스트레스-유도된 DNA 듀플렉스 위치의 동정(SIDD; Benham C and al., Stress-induced duplex DNA destabilization in scaffold/matrix attachment regions, J. Mol . Biol., 274:181-196, 1997)에 기초한다. 그러나, 게놈 서열을 완전하게 분석하기 위한 이들의 적합성이 여전히 알려져 있지 않은 상태이며, 이러한 기술들이 단백질 생산-증가 서열의 동정을 가능하게 하는지에 대해서도 보고되어 있지 않다.

게다가, 이러한 소프트웨어의 상대적으로 낮은 특이성으로 인해(Frisch M, Frech K, Klingenhoff A, Cartharius K, Liebich I and Werner T, “In silico prediction of scaffold/matrix attachment regions in large genomic sequences” Genome Research, 12:349-354, 2001), 게놈에서 동정된 이론적 MARs의 양은 라지 스케일 분석을 수행할 때 다루기 힘들 정도로 급속히 증가하며, 특히 이들의 대부분은 실제 활성이 없거나 낮은 활성을 나타낸다. 따라서, 이론적 MARs의 수를 억제하기 위한 예측 특이성을 증가시킬 방법이 없으므로, 이용가능한 많은 프로그램들은 재조합 단백질 생산성을 효율적으로 증가시키는 관점에서 잠재 유전자 엘리먼트를 동정하는데 거의 쓸모가 없게 된다.

상기 이용가능한 예측 방법들 모두가, 신규 및 잠재 MARs를 확실히 동정하기 위한 게놈의 라지-스케일 분석법을 방해하는 몇가지 문제점을 가지고 있기 때문에, 본 발명의 목적은 1) 재조합 단백질 발현을 향상시키게 하는 MARs의 기능적 특성을 이해하고, 2) 기능의 예측으로서 MAR 구조적 특성을 컴파일하는 신규한 바이오인포매틱스 기술을 가짐으로서, 3) 게놈의 라지 스케일 분석을 수행하여 신규하고 더욱 잠재적인 MARs를 동정하고, 최종적으로는 4) 새롭게 동정된 MAR 서열을 이용할 때 진핵 세포 또는 생물체로부터 재조합 단백질의 생산을 향상시키는 향상된 효율성을 보여주는 것이다.

본 발명은 단백질 생산 증가 활성을 가지고 있으며, 1 이상의 벤트 DNA 엘리먼트 및 DNA 결합 단백질에 대한 1 이상의 결합 자리(binding site)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리 및 정제된 DNA서열에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 단백질 생산 증가 활성을 가진 DNA 서열, 구체적으로는 MAR 뉴클레오티드 서열을 동정하기 위한 향상되고 신뢰성이 있는 방법 및 진핵 세포에서 재조합 단백질의 생산을 증가시키기 위한 신규한 복합 형질전환 방법에서의 활성 MAR 서열의 용도를 제공함으로써 실현된다.

도 1은 MARs 및 비-MARs 서열의 분포도(distribution plot)를 나타낸다. 히스토그램은 관찰된 파라미터의 값에 대한 농도 도표(빈(bin) 너비로 나눈 상대 빈도)이다. SMARt DB 데이터베이스에서의 인간 MARs에 대한 농도 히스토그램은 검은색으로 표시되어 있으며, 인간 염색체 22에 대한 농도 히스토그램은 회색으로 표시되어 있다.
도 2는 SMAR Scan

의 사용에 의한 4개의 다른 기준의 분산도 및 SMARt DB로부터의 인간 MARs을 이용한 AT-함량(content)을 나타낸다.
도 3은 생물체에 따른 MAR 서열의 분포도를 나타낸다. SMARt DB로부터 다른 생물체의 MAR 서열을 검색하여 분석하였다. 마우스, 닭, 수수(sorghum bicolor) 및 인간에 대한 MAR 서열 농도 분포가 함께 플로팅되어 있다.
도 4는 인간 염색체 22 및 셔플된(shuffled) 염색체 22 상에서의 SMAR Scan

의 예측을 나타낸다. 상단 도표: 하기 5개를 이용해 SMAR Scan

에 의해 얻어진 평균 히트(hits) 수: 10 bp의 비중복 윈도우 내에서 조각나고(rubble), 스크램블되고(scrambled) 셔플된(shuffled) 것, 오더 1 마르코브 체인(Markov chain) 모델 및 천연(native) 염색체 22. 하단 도표: 하기 5개에서 SMAR Scan

에 의해 예측된 MARs의 평균 갯수: 10 bp의 비중복 윈도우 내에서 조각나고, 스크램블되고, 셔플된 것, 오더 1 마르코브 체인(Markov chain) 모델 및 천연 염색체 22.
도 5는 CHO-DG44 세포에서 형질전환 유전자 발현을 자극하기 위한 닭 라이소자임 유전자 5'-MAR의 활성의 조사(dissection)를 나타낸다. 단편 B, K 및 F는 형질전환 유전자 발현을 촉진시키는 능력이 높은 것으로 나타낸다. 엘리먼트의 표시된 상대 강도는 고-발현 세포의 수를 기준으로 하였다.
도 6은 형질전환 유전자 발현을 촉진시키는 능력의 소실에 대한 5'-MAR의 5'-말단 (상부) 및 3'-말단(하부)의 순차적-결실의 영향을 나타낸다. 증가된 활성으로부터 감소된 활성으로의 전이는 B-, K- 및 F-단편과 일치한다.
도 7은 형질전환 유전자 발현을 유의적으로 촉진시키는 F 단편의 부분(portion)을 나타낸다. 밝은 회색 화살표로 표시된 F 단편 부위를 다중화시키고(multimerize), pGEGFP control에 삽입하였으며 CHO 세포에 형질전환시켰다. 높은 활성을 나타내는 엘리먼트는 엘리먼트의 중앙 부분에 위치하며 단편 FIII(검은색 막대로 표시된 최소 MAR)와 일치한다. 또한, 인핸서 활성도를 나타내는 엘리먼트는 FIII 단편의 3'-플랭킹 부분(짙은 회색 막대로 표시된 MAR 인핸서)에 위치한다.
도 8은 cLysMAR 내의 다양한 DNA 서열 모티프의 위치의 맵(map)을 나타낸다. 도 8(B)는 cLysMAR 내의 다양한 DNA 서열 모티프의 위치 맵을 표시한다. 수직선은 컴퓨터-예측한 위치(site) 또는 cLysMAR 및 도 5에 표시된 바와 같은 이의 활성 부위의 3034개 염기쌍을 통한 서열 모티프의 위치(position)를 나타낸다. MatInspector(Genomatix)를 이용해, 활성화 인자에 대한 추정되는 전사 인자 위치 (MEF2 05, Oct-1, USF-02, GATA, NFAT) 및 전사 억제 인자에 대한 (CDP, SATB1, CTCF, ARBP/MeCP2)를 동정하였으며, CPGPLOT를 이용해 CpG 섬(island)을 동정하였다. MAR 엘리먼트와 이전에 결합한 모티프는 검은색으로 표시되어 있고, CpG 디뉴클레오티드 및 CpG 섬, 풀린(unwinding) 모티프(AATATATT 및 AATATT), poly As 및 Ts, poly Gs 및 Cs, 6 bp 코어에 대해 동일성을 가진 초파리 토포이소머라제 II 결합 자리 (GTNWAYATTNATTNATNNR) 및 고 이동성 그룹 I(high mobility group I, HMG-I/Y) 단백질 결합 자리를 포함한다. 다른 구조적 모티프는 뉴클레오좀-결합 자리 및 뉴클레오좀 디스페이버(disfavouring) 위치 및 고차 나선형(superhelical) DNA 가닥인 것으로 생각되는 모티프를 포함한다. 도 8(A)는 MarFinder를 이용하는 MAR 예측 점수 프로파일을 이용하여, 전사를 활성화시키는 cLysMAR의 부분의 활성의 비교를 나타낸다. 상단 도표는 도 5에 표시된 바와 같은 MAR 단편의 활성을 나타내는 반면, 중단 및 하단 커브는 MAR 활성 및 벤트 DNA 구조 각각에 대한 MARFinder-예측된 잠재성을 나타낸다.
도 9는 MAR 활성도와 DNA 물리-화학적 특성의 관계를 나타낸다. 도 9(A)는 5'-MAR의 DNA 녹는점, 이중 나선 벤딩(bending), 메이저 그루브 깊이 및 마이너 그루브 너비 프로파일을 나타내며, 이들은 레비츠키 등의 알고리즘(Levitsky VG, Ponomarenko MP, Ponomarenko JV, Frolov AS, Kolchanov NA “Nucleosomal DNA property database” Bioinformatics, 15; 582592, 1999)을 이용하여 검정하였다. 상단에 표시된 가장 활성을 띄는 B, K 및 F 단편은 도 1에 표시된 바와 같다. 도 9(B)는 패널 A에 표시된 데이터를 확장하여 표시해주며, 녹는점(상단 커브) 및 DNA 벤딩(하단 커브)에 대응하여 따라가면서 정렬한 F 단편 맵을 나타낸다. 가장 활성을 띄는 FIB 단편의 위치 및 특정 전사 인자에 대한 단백질 결합 자리는 표시된 바와 같다.
도 10은 5'-cLysMAR 내의 추정되는 전사 인자 결합 자리의 분포를 나타낸다. 큰 화살표는 SMAR Scan

로 동정한 바와 같은 CUE 엘리먼트의 위치를 표시한다.
도 11은 다양한 MAR 부분의 조립에 대한 계획도(scheme)를 나타낸다. cLysMAR의 표시된 부분을 PCR로 증폭하고, 각 말단에 BglII-BanHI 링커 엘리먼트를 삽입한 뒤, 조립함으로써 표시된 복합 엘리먼트를 제조하였다. 예를 들어, 상단의 컨스트럭트는 모든 CUE 및 플랭킹 서열이, 각 엘리먼트를 분리하는 BglII-BanHI 링커 서열을 제외한 그의 원래 위치에 조립된 것으로 구성된다.
도 12는 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 13은 GFP 발현에 대한 1차 형질전환체의 재-형질전환의 효과를 나타낸다. 세포(CHO-DG44)를 pSV40EGFP(왼쪽 튜브) 또는 pMAR-SV40EGFP(중간 튜브) 및 내성 플라스미드로서 pSVneo로 동시 형질전환시켰다. pMAR-SV40EGFP로 형질전환된 세포들을 동일한 플라스미드 및 다른 선별 플라스미드인 pSVpuro(오른쪽 튜브)로 24시간 후에 재-형질전환시켰다. 2주 동안의 선별 후에, 안정하게 형질전환된 세포 군집의 표현형을 FACS로 분석하였다.
도 14는 MAR-포함 플라스미드의 복합 로드(load)의 영향을 나타낸다. pMAR-pSV40EGFP/pMAR-SV40EGFP 2차 형질전환체를 선별 단계의 마지막에 형질전환의 3번째 사이클에서 사용하였다. pMAR 또는 pMAR-SV40EGFP을 이용하여 3차 형질전환을 수행함으로써 3차 형질전환체를 제조하였다. 24시간 후에, 세포를 플라스미드로 다시 형질전환시킴으로써, 4차 형질전환체를 제조하였다(참조, 표 4).
도 15는 WP18A10A7 부위로 실시한 SMAR 예측 알고리즘의 비교 수행(performance)을 나타낸다. (A) SMAR Scan

분석을 초기 설정으로 수행하였다. (B) SIDD 분석(상단 커브, 왼쪽 면의 스케일) 및 수개의 DNA 단편의 핵 매트릭스에 대한 인 비트로에서의 부착도(막대-그래프, 오른쪽 면의 스케일)는 고에츠 등의 방법(Goetze S, Gluch A, Benham C, Bode J, “Computational and in vitro analysis of destabilized DNA regions in the interferon gene cluster: potential of predicting functional gene domains.” Biochemistry, 42:154-166, 2003)으로 얻었다.
도 16은 MARs를 이용한 유전자 치료법-유사 프로토콜의 결과를 나타낸다. 실험의 시작 단계에 유도된, MAR-네트워크를 주입한 마우스 그룹은 MAR을 제외한 원래의 네트워크를 주입한 마우스와 비교하여 적혈구 용적율(hematocrit)이 훨씬 더 유도되는 것으로 나타났다. 2달 후에, “MAR-포함 그룹”에서의 적혈구 용적율은 정상 적혈구 용적율 레벨(45-55%)에 비해 여전히 높은 값(65%)을 나타내었다.
도 17은 SMAR can

로 계산한 예측된 DNA 벤딩에 대한 1757개 S/MAR 서열의 AT(상단) 및 TA(하단) 디뉴클레오티드의 백분율의 분산도를 나타낸다.
도 18은 1757개의 비-S/MARs 서열에 대한 디뉴클레오티드 백분율 분포도를 나타낸다.
도 19는 재조합 녹색 형광 단백질(GFP)의 생산에 대한 다양한 S/MAR 엘리먼트의 효과를 나타낸다. 표시된 바와 같이 MAR 엘리먼트를 포함하거나 포함하지 않는 GFP 발현 벡터로 형질전환된 CHO 세포의 군집을 형광-활성화된 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorter, FACS

)로 분석하였으며, 전형적인 프로파일들이 표시되어 있다. 프로파일은 GFP 형광 레벨의 기능으로서 세포 수 계수(count)를 나타낸다.
도 20은 MAR-네트워크를 주입한 마우스에서의 적혈구 용적율의 유도 효과를 표시한다.

어떤 DNA 서열은 상대적으로 “안정한 곡선”을 형성하는 것으로 알려져 있으며, 여기서 상기 DNA는 각각 3차원적 경로(path)를 따른다. 따라서, 보통의 B-DNA 형(“곧은 모양”) 이외에, 일부 DNA는 벤트 DNA(Marini, et al ., 1982 “Bent helical structure in kinetoplast DNA”, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 79: 7664-7664)로 정의된 것과 같이 평편하고, 평면의 곡선을 형성할 수 있다.

놀랍게도, 본 출원인은 본 발명의 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열의 벤트 DNA 엘리먼트가 통상적으로 100개의 인접 염기쌍 스트레치(stretch) 상에 10% 이상의 디뉴클레오티드 TA 및/또는 12% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 포함함을 확인하였다. 바람직하게는, 상기 벤트 DNA 엘리먼트는 100개의 인접 염기쌍 스트레치 상에 33% 이상의 디뉴클레오티드 TA 및/또는 33% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 포함하였다. 이러한 데이터는 이후에 기술되는 방법에 의해 얻어졌다.

본 발명에 따르면, 분리 및 정제된 DNA 서열은 일반적으로 서열번호 1 내지 27의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 cLysMAR 엘리먼트 또는 이의 단편을 포함한다. 바람직하게는, 상기 분리 및 정제된 DNA 서열은 서열번호 1 내지 27의 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 24 내지 27의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 MAR 뉴클레오티드 서열이다.

본 발명에 포함되는 것은 PCR 또는 다른 수단에 의해 생산될 수 있는, 상기-언급한 서열번호 1 내지 27의 서열 및 cLysMAR 엘리먼트의 상보적 서열이다.

“엘리먼트”는 공통의 작용 특성(즉, 전사인자에 대한 결합 자리) 또는 구조적(즉, 벤트 DNA 서열) 특성을 갖는 보존된 뉴클레오티드 서열이다.

서열번호 1 내지 27의 서열의 일부 및 cLysMAR 엘리먼트 또는 이의 단편은 서열번호 1 내지 27의 서열 각각의 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 지칭한다. 이러한 서열들은 이들이 유래된 천연 서열과 동일한 특성을 갖는 동안 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 서열들은 서열번호 1 내지 27의 서열 각각의 길이에서 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 뉴클레오티드를 갖는다.

또한, 본 발명은 상기에 언급한 서열번호 1 내지 27의 서열 및 cLysMAR 엘리먼트 또는 이의 단편의 변이체(variant), 즉 보존적 뉴클레오티드 치환에 의해 참조 서열과는 차이나는 뉴클레오티드를 포함하며, 이에 의해 1 이상의 뉴클레오티드가 동일한 특성을 가진 다른 것에 의해 치환된다.

서열번호 1 내지 23의 서열은 SMAR Scan

을 이용해 인간 염색체 1 및 2를 스캐닝함으로써 동정하였으며, 여기서 신규한 MAR 서열의 동정은 그 후 공지된 기술을 이용해 가능하지만, 서열번호 24 내지 27의 서열은 혼합 SMAR Scan

방법을 이용해 인간 게놈을 완전하게 스캐닝함으로써 동정 가능함을 보여준다.

첫번째 단계에서, 도 3에 표시된 바와 같은 가장 높은 벤트, 메이저 그루브 깊이, 마이너 그루브 너비 및 가장 낮은 녹는점과 일치하는 부위로서, 벤트 DNA 엘리먼트를 동정하기 위해, 염색체 1 및 2 모두를 스크리닝하였다. 두번째 단계에서, 도 8B)에 표시된 바와 같은 서열번호 1 내지 23의 서열을 산출하는 SATB1, GATA 등과 같은 조절 단백질의 결합 자리에 대해, 이러한 서열의 집단을 스캐닝하였다. 게다가, 서열번호 21 내지 23의 서열이 인간 게놈 데이터베이스의 공지된 유전자의 다음에 위치하는 것으로 추가로 확인되었다.

서열번호 24 내지 27에 있어서, 이러한 서열들은 혼합 방법에 따라 인간 게놈을 스캐닝함으로써 산출되었으며, 1757개 MAR 엘리먼트 중 일례로서 선별되어 검출되었다.

또한, MAR 서열의 분자 키메라도 본 발명에서 검토되었다. 분자 키메라가, MAR 엘리먼트의 기능적 부분을 포함할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 간주됨으로서, 당업계에 공지된 분자 생물학적 방법에 의해 수득될 수 있다.

또한, MAR 엘리먼트 또는 단편 또는 이의 일부분의 구체적인 조합도 본 발명에서 검토되었다. 이러한 단편들은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 제한 효소를 이용한 절단 및 단편의 회복, 화학 합성 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 서열번호 1 내지 27의 서열의 엘리먼트 또는 단편 및 cLysMAR 엘리먼트 또는 단편의 구체적인 조합도, 얻어지는 작용의 결과에 따라 본 발명에서 간주된다. cLysMAR의 엘리먼트는, 참조 문헌으로서 명세서 전체가 본원에 포함되어 있는 특허공개공보 WO 02/074969호에 개시된 바와 같은 B, K 및 F 부위이다. 본 발명에 사용된 cLysMAR의 바람직한 엘리먼트는 B, K 및 F 부위이다. 단지 1개의 엘리먼트가 사용될 수 있거나, 동일하거나 다른 엘리먼트의 복합 카피(멀티머화된 엘리먼트)가 사용될 수도 있다(참조, 도 8A)).

단편은 각 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주된다. MAR 뉴클레오티드 서열의 단편은 생물학적 활성을 보유할 수 있으며, 이로 인해 정제된 핵 매트릭스에 결합하고 및/또는 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현 패턴을 변화시킨다. MAR 뉴클레오티드 서열의 단편은 약 100 내지 1000 bp 이상, 바람직하게는 약 200 내지 700 bp, 더욱 바람직하게는 300 내지 500 bp 뉴클레오티드가 될 수 있다. 또한, 천연 MAR 엘리먼트 및/또는 단편으로 구성된 합성 MAR 서열에 존재하는 동일한 갯수의 뉴클레오티드를 포함하는, 모든 조합의 단편도 고려된다. 상기 단편은 바람직하게는 링커 서열에 의해 조립된다. 바람직한 링커는 BglII-BamHI 링커이다.

“단백질 생산 증가 활성”은 하기와 같이 정의된 분리 및 정제된 DNA 서열의 활성을 지칭한다: 적합한 조건하에서 진핵 숙주 세포에 도입되고 난 뒤에, 상기 서열은 상기 DNA 서열의 부재하에서 형질전환된 세포의 배양에 비교하여 세포 배양에서의 단백질 생산 레벨을 증가시킬 수 있다. 통상적으로, 상기 증가는 1,5 내지 10배, 바람직하게는 4 내지 10배이다. 이는 매일 세포 당 10 pg 이상의 생산 속도 또는 특이 세포 생산도와 일치한다(참조, 실시예 11 및 도 13).

본원에 사용된, 다음의 정의들이 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다.

“염색질(chromatin)”은 진핵 세포의 염색체를 구성하는 단백질 및 핵산 물질이며, DNA, RNA 및 관련(associated) 단백질로 지칭된다.

“염색질 엘리먼트(chromatin element)”는 염색체로 삽입될 때 염색질 구조를 변형하는 특성을 가진, 염색체 상의 핵산 서열을 의미한다.

“시스(Cis)”는 동일 핵산 분자(동일 벡터, 플라스미드 또는 염색체와 같은) 상의 2개 이상의 엘리먼트(염색질 엘리먼트와 같은)의 배치(placement)를 지칭한다.

“트랜스(Trans)”는 2개 이상의 다른 핵산 분자(2개의 벡터 또는 2개의 염색체와 같은) 상의 2개 이상의 엘리먼트(염색질 엘리먼트와 같은)의 배치를 지칭한다.

염색질 변형 엘리먼트는, 잠재적으로 위치 효과를 극복하는 것이 가능하고, 안정한 세포주를 개발하기 위한 소망하는 유전자가 되며, 경계 엘리먼트(boundary elements, BEs), 매트릭스 부착 부위(matrix attachment regions, MARs), 위치 조절 부위(locus control regions, LCRs) 및 범용 오프닝 엘리먼트(universal opening elements, UCOEs)를 포함한다.

경계 엘리먼트(“BEs”) 또는 인슐레이터(insulator) 엘리먼트는, 많은 경우에 있어서 염색질 내에서 경계를 정의하며(Bell A and Felsenfeld G. 1999; “Stopped at the border: boundaries and insulators”, Curr Opin Genet Dev 9, 191-198), 인 비보에서 전사적 도메인을 한정하는 역할을 할 수 있다. BEs는 내인성 프로모터/인핸서 활성이 부족하지만, 둘러싸는 염색질에 있는 조절 엘리먼트의 전사적 영향으로부터 유전자를 보호하는 것으로 생각된다. 인핸서-방어(block) 분석은 인슐레이터 엘리먼트를 동정하는데 통상적으로 사용된다. 이 분석에서, 염색질 엘리먼트는 인핸서 및 프로모터의 사이에 위치하며, 인핸서-활성화된 전사가 측정된다. 경계 엘리먼트는 초파리, 효모 및 포유동물 세포에서 포지션(position) 효과에 대항하여 안정하게 형질전환된 리포터 유전자를 방어할 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 이들은 유도성 형질전환 유전자 발현과 함께 형질전환 생쥐의 비율을 증가시키는 것으로 확인되었다.

위치 조절 부위(locus control regions, “LCRs”)는 최초의 위치 염색질 활성 및 그 이후의 그의 본래 위치에서의 유전자 전사에 필요한 시스-조절 엘리먼트이다(Grosveld, F. 1999, Activation by locus control regions Curr Opin Genet Dev 9, 152-157). 또한, LCRs의 활성 작용은, 숙주 게놈에 있는 삽입의 위치와는 상관없이, 형질전환 생쥐에 있는 적당한 조직에서 결합된(coupled) 형질전환 유전자의 발현을 가능하게 한다. 일반적으로, LCRs은, 연결된 유전자에서 조직-특이적 발현 레벨을 부여하는 반면, 절단된 인간 T-세포 수용체 LCR 및 쥐 LAP LCR에 대해서는 형질전환 생쥐에 있는 거의 모든 조직에서 효율적으로 발현함이 보고되었다. 가장 광범위하게 특성화된 LCR은 글로빈 위치의 것이다. 겸형 적혈구 병 및 (3-지중해빈혈증의 유전자 치료용 벡터에서의 이의 용도가 최근에 검증되었다.

잘 수용된(well-accepted) 모델에 따르면, “MARs”는 핵 매트릭스에 대한 특정 DNA 서열의 고정을 유도하고, 이종염색질 코어로부터 바깥쪽으로 확장하는 염색질 루프 도메인을 생성할 수 있다. MARs는 어떠한 명백한 일치 서열 또는 인식가능 서열도 포함하지 않지만, 이들의 가장 일치하는 특징은 1개 가닥 상에서 A/T 함량이 전체적으로 높고 C 염기가 우세한 경향이 있다는 것이다(Bode J, Schlake T, Rios-Ramirez M, Mielke C, Stengart M, Kay V and Klehr-Wirth D, “Scaffold/matrix-attached regions: structural propreties creating transcriptionally active loci” Structural and Functional Organization of the Nuclear Matrix : International Review of Citology, 162A:389-453, 1995). 이러한 부위들은 가닥 분리될 수 있는 성향이 있는 벤트 2차 구조를 형성하려는 경향이 있다. 이들은 염기 짝없는 부위(base unpairing regions, BURs)로 종종 일컫어지며, 가닥 분리의 핵 형성 포인트를 나타낼 수 있는 코어-풀림 엘리먼트(core-unwinding element, CUE)를 포함한다(Benham C and al., Stress-induced duplex DNA destabilization in scaffold/matrix attachment regions, J. Mol . Biol ., 274:181-196, 1997). 수개의 간단한 AT-풍부 서열 모티프가 MAR 서열 내에서 종종 발견되나, 대부분의 경우, 이들의 기능적 중요성 및 활성의 포텐셜 모드가 여전히 불명확하다. 이들은 A-박스(AATAAAYAAA), T-박스(TTWTWTTWTT), DNA 풀림 모티프(AATATATT, AATATT), SATB1 결합 자리(H-박스, A/T/C25) 및 척추동물(RNYNNCNNGYNGKTNYNY) 또는 초파리(GTNWAYATTNATNNR)에 대한 일치 토포아이소머라제 II 위치를 포함한다.

유비퀴터스 염색질 개방 엘리먼트(“광범위하게 작용하는 염색질 개방 부위”로 알려진, “UCOEs”)가 국제공개공보 WO 00/05393호에 보고되었다.

“인핸서(enhancer)”는 유전자의 상동성, 유전자와 관련한 서열의 위치 또는 서열의 방향과는 독립적으로 유전자의 전사를 가능하게 하는 작용을 하는 뉴클레오티드 서열이다. 본 발명의 벡터는 선택적으로 인핸서를 포함한다.

“유전자”는 주어진 성숙 단백질을 인코딩하는 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 서열이다. 본원에 사용된, 용어 “유전자”는 RNA 전사 개시 신호와 같은 비전사된 플랭킹 부위, 폴리아데닐화 첨가 위치, 프로모터 또는 인핸서를 포함하지 않을 것이다.

“생성물 유전자(product gene)”는 진단 또는 치료적 용도와 같은 요구되는 특성을 가지는 단백질 생성물을 인코딩하는 유전자이다. 생성물 유전자는 예를 들어 구조 유전자 및 조절 유전자를 포함한다.

“구조 유전자”는 구조 단백질을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 구조 유전자의 예는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 세포골격 단백질, 세포외 매트릭스 단백질, 효소, 핵공(nuclear pore) 단백질 및 핵 스캐폴드 단백질, 이온 채널 및 트랜스포터, 수축 단백질 및 샤페론(chaperone)을 포함한다. 바람직한 구조 유전자는 항체 또는 항체 단편을 인코딩한다.

“조절 유전자”는 조절 단백질을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 조절 유전자의 예는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 전사 인자, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 신호 전달 분자, 종양유전자, 원형-종양유전자(proto-oncogenes), 막투과 수용체 및 단백질 키나아제를 포함한다.

“방향성(orientation)”은 주어진 DNA 서열에서의 뉴클레오티드의 순서를 지칭한다. 예를 들어, DNA 서열의 역전된 방향성은, 다른 서열과 관련하는 서열에서의 5'쪽에서 3'쪽으로의 순서가, 서열이 수득되는 DNA에 있는 참조 포인트에 비교했을때 역전되어 있는 것이다. 이러한 참조 포인트는 원천(source) DNA에 있는 다른 특성화된 DNA 서열의 전사의 방향 및/또는 서열을 포함하는 복제가능 벡터의 복제 기원(origin)을 포함할 수 있다.

“진핵 세포”는 진핵 생물체로부터의 모든 포유동물 세포 또는 비-포유동물 세포를 지칭한다. 비-제한적인 실시예에 의하면, 세포 배양 조건하에서 유지가 가능하고 그 후에 형질전환된 모든 진핵 세포가, 본 발명에 포함될 수 있다. 특히 바람직한 세포 타입은 예를 들어 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cells, CHO), COS, BHK21, NIH3T3, HeLa, C2C12, 암 세포 및 1차 분화된 세포 또는 미분화된 세포를 포함한다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.

용어 “숙주 세포” 및 “재조합 숙주 세포”는 본원에서 상호교환하여 사용가능하며, 1개 이상의 본 발명의 벡터가 도입된 진핵 세포를 나타낸다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 왜냐하면, 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 계속되는 세대에서 특정한 변형이 유발될 수 있기 때문이며, 사실, 이러한 자손은 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.

용어 “진핵 숙주 세포로의 정제된 DNA의 도입” 또는 “형질전환”은 수반되는 물질을 포함하거나 포함하지 않는 세포외 DNA가 숙주 세포로 들어가는 모든 과정을 지칭한다. 용어 “형질전환된 세포(cell transfected)” 또는 “형질전환 세포(transfected cell)”는 세포외 DNA가 도입되어 세포외 DNA를 포함하는 세포를 의미한다. DNA가 세포내로 도입될 수 있으며, 이에 의해 핵산은 염색체 삽입물 또는 외부 염색체 엘리먼트로서 복제가능하다.

본원에서 사용된 “프로모터(promoter)”는 유전자의 발현을 조절하는 핵산 서열을 지칭한다.

“동시-형질전환”은 1개 이상의 외인성 유전자, 또는 벡터, 또는 플라스미드, 세포에 대한 외래유전자-이들 중의 하나는 세포에서 선택적 표현형을 부여할 수 있음-를 이용해 진핵 세포를 형질전환시키는 과정을 의미한다.

또한, 단백질 생산 증가 활성을 갖는 분리 및 정제된 DNA 서열은, 1 이상의 벤트 DNA 엘리먼트와는 관계없이, DNA 결합 단백질에 대한 1 이상의 결합 자리를 포함한다.

통상적으로, DNA 결합 단백질은 전사 인자이다. 전사 인자의 예는 polyQpolyP 도메인 단백질을 포함하는 그룹이다. 전사 인자의 다른 예는 SATB1, NMP4, MEF2, S8, DLX1, FREAC7, BRN2, GATA 1/3, TATA, Bright, MSX, AP1, C/EBP, CREBP1, FOX, Freac7, HFH1, HNF3alpha, Nkx25, POU3F2, Pit1, TTF1, XFD1, AR, C/EBPgamma, Cdc5, FOXD3, HFH3, HNF3 beta, MRF2, Oct1, POU6F1, SRF, V$MTATA_B, XFD2, Bach2, CDP CR3, Cdx2, FOXJ2, HFL, HP1, Myc, PBX, Pax3, TEF, VBP, XFD3, Brn2, COMP1, Evil, FOXP3, GATA4, HFN1, Lhx3, NKX3A, POU1F1, Pax6 및 TFIIA를 포함하는 군으로부터 선택되는 전사 인자 또는 이러한 전사 인자 2개 이상의 혼합인 것이 바람직하다. 가장 바람직한 것은 SATB1, NMP4, MEF2 및 polyQpolyP 도메인 단백질이다.

예를 들어, SATB1, NMP4 및 MEF2는 포유동물에서 발생 및/또는 조직-특이적 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 이러한 전사 인자들은 DNA 기하구조를 변화시키고, 상호적으로는 그의 구조를 변형하는 알로스테릭(allosteric) 리간드로서 DNA에 결합하는 능력을 갖는다. 최근에, SATB1이 헤테로염색질을 둘러싸는 케이지-유사(cage-like) 구조를 형성하는 것으로 확인되었다(Cai S, Han HJ , and Kohwi-Shigematsu T, “Tissue-specific nuclear architecture and gene expression regulated by SATB1” Nat Genet, 2003. 34(1): p. 42-51).

또한, 본 발명의 다른 목적은 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편, 이의 상보적 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 제공하는 것이다.

더욱 바람직하게는, 상기 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편은 B, K 및 F 부위로부터 선택되는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 링커 서열들 사이에서 조립된 천연 MAR 엘리먼트 및/또는 단편을 포함하는 합성 MAR 서열을 제공하는 것이다.

바람직하게는, 합성 MAR 서열은 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편, 이의 상보적 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 포함한다. 또한 바람직하게는, 링커 서열은 BglII-BamHI 링커이다.

본 발명의 또 다른 목적은, DNA 벤딩, 메이저(major) 그루브(groove) 깊이 및 마이너(minor) 그루브 너비 포텐셜 및 녹는점에 상응하는 1 이상의 DNA 서열 특성의 값을 계산하는 단계를 포함하는, 바이오인포매틱스 기술을 이용한 MAR 서열의 동정 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 1 이상의 DNA 서열 특성의 확인 방법은 DNA 결합 단백질에 대한 결합 자리와 일치하는 DNA 서열 특성을 추가로 확인하는 것을 포함하며, 이는 본 발명의 방법을 이용하여 계산한다.

바람직하게는, 상기 바이오인포매틱스 기술의 프로파일 또는 웨이트-매트릭스는 디뉴클레오티드 인식에 기초한다.

본 발명에 유용한 바이오인포매틱스 기술은 바람직하게는, Gene Express(http://srs6.bionet.nsc.ru/srs6bin/cgi-bin/wgetz-e+[FEATURES-SiteID:'nR'])에 의해 개발된 알고리즘을 포함하고 레비스키 등의 문헌(Levitsky et al., 1999)를 기초로 하는 SMAR Scan

이다. 이러한 알고리즘은 디뉴클레오티드 웨이트-매트릭스를 기준으로 하는 프로파일을 인식하며, 이로 인해 DNA의 형태학적 및 물리화학적 특성에 대한 이론적 값을 계산한다.

바람직하게는, SMAR Scan

은 DNA 벤딩, 메이저 그루브 깊이 및 마이너 그루브 너비 포텐셜 및 녹는점에 상응하는 DNA 서열 특성으로도 표시될 수 있는 4개의 이론적 기준-가능하다면 이들의 모든 조합-을 사용하며, 다양한 크기의 스캐닝 윈도우를 이용한다(참조, 도 3). 사용된 각 기능에 대해, 컷-오프(cut-off) 값이 설정된다. 상기 프로그램은 주어진 부위의 계산된 값이, 선택된 모든 기준에 대해 설정진 컷-오프 값 이상일 때마다 히트(hit)를 반환(return)한다. 2개의 데이터 출력 모드는 히트를 다루기에 유용하며, 첫번째 모드(“프로파일-유사”로 일컫어짐)는 간단하게 쿼리(query) 서열상의 모든 히트 포지션 및 선택된 다른 기준에 대해 일치하는 값을 리턴한다. 두번째 모드(“일치 히트”로 일컫어짐)는 단순히 수개의 일치 히트의 위치 및 이의 일치하는 서열을 리턴한다. 이 모드에 있어서, 일치 히트의 최소 갯수는 가변 윈도우 사이즈로 다시 세팅될 수 있는 다른 컷-오프 값이다. 이 두번째 모드는 SMAR Scan

의 초기설정 모드이다. 대신에, 의미론적 관점에서, 히트는 코어-풀림 엘리먼트(CUE)로 간주되며, 관련 단백질에 대한 결합 자리의 클러스터를 동반하는 CUEs의 클러스터는 MAR로 간주된다. 따라서, SMAR Scan

은 잠재적 MAR로서 단지 수개의 일치 히트로 간주된다.

4개의 이론적 구조적 기준에 대한 초기설정 컷-오프 값을 조정하기 위해, SMARt DB(http://transfac.gbf.de/- SMARt DB)의 실험적으로 확인된 MARs이 사용되었다. 데이터베이스로부터 모든 인간 MAR 서열을 검색한 뒤 4개의 기준 및 컷-오프 값 설정을 가지지 않는 “프로파일-유사” 모드를 이용하는 SMAR Scan

로 분석하였다. 이는 서열의 각 위치에 대한 각 기능을 설정할 수 있게 하였다. 그리고 난 뒤, 각 기준에 대한 분포를 이러한 데이타에 따라 계산하였다(참조, 도 1 및 3).

벤드, 메이저 그루브 깊이 및 마이너 그루브 너비에 대한 SMAR Scan

의 초기설정 컷-오프 값을 75번째 변위치(quantile) 및 중위수(median)의 평균에 맞추었다. 녹는점에 대해, 초기설정 컷-오프 값은 75th 변위치에 맞추어야 한다. “일치-히트” 모드에 대한 최소 길이는 300에 설정하여야 하는데, 왜냐하면 이것이 MAR의 최소 길이로 예측되기 때문이다(참조, 도 8 및 9). 그러나, 당업자라면, 최소의 실험으로 주어진 생물체에 대한 상기-언급한 기준에 대한 컷-오프 값을 결정할 수 있을 것이다.

바람직하게는, DNA 벤딩 값은 3 내지 5°(각도, radial degree)이다. 가장 바람직하게는, 이들은 도 1의 가장 작은 피크와 일치하는, 3.8 내지 4.4°에 위치한다.

바람직하게는, 메이저 그루브 깊이 값은 8.9 내지 9.3 Å(옹스트롱)이고, 마이너 그루브 너비 값은 5.2 내지 5.8 Å이다. 가장 바람직하게는, 메이저 그루브 깊이 값은 9.0 내지 9.2 Å이고, 마이너 그루브 너비 값은 5.4 내지 5.7 Å이다.

바람직하게는, 녹는점은 55 내지 75℃(섭씨 온도)이다. 가장 바람직하게는, 상기 녹는점은 55 내지 62℃이다.

그 값이 상기 방법에 의해 계산될 수 있는 DNA 결합 단백질은 통상적으로 전사 인자이고, 바람직하게는 polyQpolyP 도메인 또는 SATB1, NMP4, MEF2, S8, DLX1, FREAC7, BRN2, GATA 1/3, TATA, Bright, MSX, AP1, C/EBP, CREBP1, FOX, Freac7, HFH1, HNF3alpha, Nkx25, POU3F2, Pit1, TTF1, XFD1, AR, C/EBPgamma, Cdc5, FOXD3, HFH3, HNF3 beta, MRF2, Oct1, POU6F1, SRF, V$MTATA_B, XFD2, Bach2, CDP CR3, Cdx2, FOXJ2, HFL, HP1, Myc, PBX, Pax3, TEF, VBP, XFD3, Brn2, COMP1, Evil, FOXP3, GATA4, HFN1, Lhx3, NKX3A, POU1F1, Pax6 및 TFIIA를 포함하는 군으로부터 선택되는 전사 인자 또는 이 전사 인자들의 2개 이상의 조합이다.

그러나, 당업자라면 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해 다른 종류의 전사 인자를 결정할 수 있다.

예를 들어, SMAR Scan

이 큰 스케일의 분석을 수행하기 위해 사용되는 경우는, 바람직하게는 상기-언급한 방법은 계산을 줄이기 위해 DNA 전사 인자에 대한 DNA 결합 자리를 예측하는 1 이상의 필터를 추가로 포함한다.

본 발명의 방법의 원리는 상술한 바와 같은 구조적 특성을 계산하기 위한 SMAR Scan

및 예를 들어 pfsearch(Bucher P, Karplus K, Moeri N, and Hofmann K, “A flexible search technique based on gen-eralized profiles” Computers and Chemistry , 20:3-24, 1996에 개시된 바와 같은 pftools 패키지로부터의)와 같은 필터를 결합함으로써, 일부 전사 인자의 결합을 예측하는 것이다.

필터의 예는, 이에 한정되는 것은 아니지만 pfsearch, MatInspector, RMatch Professional 및 TRANSFAC Professional을 포함한다.

이 혼합 방법은 SMAR Scan

의 구조적 특성 및 MARs를 선별하기 위해 순서대로 적용될 수 있어 이로 인해 필터상의 의존성이 상기 방법의 시작 또는 끝에 적용될 수 있는 특정 전사 인자에 대한 필터의 예측된 결합력을 이용한다.

상기 첫번째 레벨은 1차 입력 서열을 제외한 서열을 선별하며, 필터에 구성되어 있는 상기 두번째 레벨은 필터에 의해 사용된 기준을 만족하는 서열로부터 선별된 것 중에서 억제하기 위해 사용될 수 있다.

이러한 혼합 방법에서, 필터는 프로파일 또는 예컨대 MatInspector(Quandt K, Frech K, Karas H, Wingender E, Werner T, “MatInd and MatInspector -New fast and versatile tools for detection of consensus matches in nucleotide sequence data”, Nucleic Acids Research , 23, 4878-4884, 1995.)의 웨이트 매트릭스를 이용해 DNA 결합 자리의 클러스터를 검출한다. 또한, 상기 필터는 DNA 결합 자리의 클러스터의 밀도도 검출할 수 있다.

상기 혼합 방법은 실제적으로 SMAR Scan

에 대해 Perl에 기재된 “래퍼(wrapper)”이며, 이 경우 pfsearch는 pftools의 필터로서 사용된다. 상기 혼합 방법은 잠재적인 “필터”로서 이러한 기술들(SMAR Scan

또는 필터) 중의 하나를 각 레벨에서 이용하는 2 레벨의 과정을 수행하며, 각 필터는 무작위로 선택할 수 있고 어떠한 필터링을 수행하지 않고도 예측된 특성을 계산하는데 사용가능하다.

만약, SMAR Scan

이 연속으로 필터하기 위해 첫번째 레벨에서 사용되면, 이는 서열을 반환하기 위해 “모든 일치 히트” 모드와 함께 사용되어야 한다. 만약 pfsearch가 첫번째 필터로서 첫번째 레벨에서 사용되면, 이는 오직 한개의 프로파일과 함께 사용되어야 하고, 뉴클레오티드에서의 거리가 제공될 필요가 있다. 이 거리는 서열을 반환하기 위해 제공된 거리보다 하위(inferior)의 거리에 위치하는 pfsearch 히트와 함께 사용될 수 있다; 상기 혼합 방법은 pfsearch를 착수하고, 이의 출력을 분석하며, 제공된 거리에 따라 함께 사용되는 pfsearch에 대응되는 서열을 반환한다. 그 후, 첫번째 레벨에서 사용되는 기술이 어느 것이든지 간에, 선별되는 부분(sub)-서열의 길이는 “히트 연장(hit extension)”이라 일컫어지는 파라미터에 따라 양쪽 말단으로 체계적으로 연장될 수 있다.

두번째 레벨 및 무작위 선택적인 레벨은 서열(이미 필터된 서열 또는 필터되지 않은 입력 서열)을 필터하거나, 이러한 서열 상에서 어떠한 필터도 수행하지 않는 SMAR Scan

및/또는 pfsearch의 결과를 얻는데 사용될 수 있다. 만약 혼합 방법의 두번째 레벨이 필터하는데 사용되면, 고려된 각 기준에 대해, 컷오프 값(뉴클레오티드 당 히트)은 이러한 서열들을 필터하기 위해 제공될 필요가 있다(참조, 도 20).

또한, 본 발명의 다른 목적은 프로파일 또는 웨이트 매트릭스를 이용하여 DNA 결합 자리의 클러스터를 검출하는 1 이상의 필터를 포함하는, MAR 서열의 동정방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 상기 방법은 2 레벨의 필터를 포함하며, 이 경우 SMAR Scan

은 상기 방법에서 완전히 제외된다. 통상적으로, 2 레벨은 pfsearch에 포함된다.

또한, 본 발명에 포함되는 것은, 기술된 바이오인포매틱스 기술을 이용해 MAR 서열을 동정하는 방법, 혼합 방법 또는 1 이상의 필터를 포함하는 방법에 따라 동정가능한 분리 및 정제된 MAR DNA 서열이다.

혼합 방법에 의한 전체 인간 게놈의 분석은, 전체 1 065 305개의 염기쌍으로 표시되는 1757개의 추정 MARs를 모두 도출하였다. 결과의 갯수를 감소시키기 위해, 이러한 1757개의 MARs 상에서 디뉴클레오티드 분석을 수행하였으며, 5'에서 3'쪽으로의 방향에 있는 양 가닥으로 여겨지는 각 서열에 대한 16개의 가능한 디뉴클레오티드 백분율을 각각 계산하였다.

놀랍게도, 본 출원인은 혼합 방법에 의해 검출되는 모든 “슈퍼(super)” MARs가 100개의 일치 염기쌍의 스트레치 상에 10% 이상의 디뉴클레오티드 TA를 포함하고 있음을 확인하였다. 바람직하게는, 이러한 서열들은 100개의 일치 염기쌍의 스트레치 상에 33% 이상의 디뉴클레오티드 TA를 포함한다.

또한, 본 출원인은 이러한 동일 서열들이 100개의 일치 염기쌍의 스트레치 상에 12% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 추가로 포함함을 확인하였다. 바람직하게는, 이 서열들은 100개의 일치 염기쌍의 스트레치 상에 33% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 27의 서열로부터 선택되는 서열, 이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 포함하는, 전술한 모든 MARs의 분리 및 정제된 MAR DNA 서열을 제공하는 것이다.

바람직하게는, 상기 분리 및 정제된 MAR DNA 서열은 서열번호 24 내지 27의 서열로부터 선택되는 서열, 이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 포함한다. 이러한 서열번호 24 내지 27의 서열은 혼합 방법에 의해 검출되는 것에 대응되며, 서열번호 1 내지 23의 서열보다 더 높은 단백질 생산 증가 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명은 제1 분리된 매트릭스 부착 부위(matrix attachment region, MAR) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA 서열, 여기서 MAR 뉴클레오티드 서열은 하기를 포함하는 군으로부터 선택됨:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 기재된 바이오인포매틱스 기술을 이용하는 MAR 서열을 동정하기 위한 방법, 혼합 방법 또는 1 이상의 필터를 포함하는 방법에 따라 동정가능한 분리 및 정제된 MAR DNA서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

- 링커 서열들 사이에서 조립된 천연 MAR 엘리먼트 및/또는 단편을 포함하는 합성 MAR 서열,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체

또는 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편의 MAR 뉴클레오티드 서열, 이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체의, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키기 위한 용도를 포함한다.

상기 분리 및 정제된 DNA 서열은 통상적으로 당업계에 공지된 바와 같은 1 이상의 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및/또는 인핸서, 폴리아데닐화 위치 및 단백질을 발현시키기 위해 통상적으로 이용되거나 선택적으로 선별 마커를 인코딩할 수 있는 스플라이스 정션(splice junction)을 추가로 포함한다. 바람직하게는 상기 분리 및 정제된 DNA 서열은 소망하는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.

본 발명의 DNA 서열은 표준 PCR 프로토콜 및 당업계에 공지된 방법에 따라 분리될 수 있다.

숙주 세포와 호환할 수 있게 제공되는 프로모터, 예를들어 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스(아데노바이러스 2와 같은), 파필로마 바이러스(소 파필로마 바이러스와 같은), 조류 사코마 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)[생쥐 또는 인간 사이토메갈로바이러스 이미디어트 얼리 프로모터(immediate early promoter)와 같은], 레트로바이러스, 헤파티티스-B 바이러스 및 시미안 바이러스(Simian Virus) 40 (SV 40 얼리 및 레이트 프로모터와 같은)와 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻어진 프로모터 또는 액틴(actin) 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터와 같은 이종 포유동물 프로모터 또는 열충격 프로모터(heat shock promoters)로부터 얻어진 프로모터가 사용될 수 있다. 이러한 조절 서열들은 직접 구조적(constitutive) 발현을 한다.

더불어, 분리 및 정제된 DNA 서열은 바람직하게는 각 세포 타입에서 핵산을 직접 발현할 수 있는 조절 서열을 추가로 포함한다(예, 조직-특이적 조절 엘리먼트는 핵산을 발현하는데 사용된다). 조직-특이적 조절 엘리먼트는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비-제한적인 예는 알부민 프로모터(간-특이적; Pinkert,et al., 1987. Genes Dev.1: 268-277), 림프-특이적 프로모터(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터(Winoto and Baltimore, 1989. EMBOJ. 8: 729-733) 및 면역글로불린(Banerji, etal., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33:741-748), 뉴런-특이적 프로모터(예, 뉴로필라멘트 프로모터;Byrne and Ruddle, 1989. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), 췌장-특이적 프로모터(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916) 및 포유동물 샘(gland)-특이적 프로모터(예, 유장(milk whey) 프로모터; 미합중국 특허 제4,873,316호 및 유럽특허출원 제264,166호)를 포함한다.

또한, 발생학적으로 조절된 프로모터도 포함된다. 이러한 프로모터의 예는 예를 들어, 생쥐 혹스(hox) 프로모터(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379) 및 티아-태아단백질(thea-fetoprotein) 프로모터(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)를 포함한다.

조절가능성 유전자 발현 프로모터는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 비-제한적인 예로서 CRE/LOX 시스템, TET 시스템, 독시사이클린(doxycycline) 시스템, NFkappaB/UV 광(light) 시스템, Leu3p/이소프로필말테이트 시스템 및 GLVPc/GAL4 시스템과 같은 외인성 분자를 결합시킴으로써 요구되는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 모든 프로모터를 포함한다(참조, 예, Sauer, 1998, Methods 14 (4): 381-92 ; Lewandoski, 2001, Nat. Rev. Genet 2 (10): 743-55; Legrand-Poels et al., 1998, J. Photochem. Photobiol. B. 45: 18; Guo et al., 1996, FEBS Lett. 390 (2): 191-5; Wang et al., PNAS USA, 1999,96 (15): 84838).

그러나, 당업자라면 다른 종류의 프로모터도 본 발명을 수행하는데 적합함을 판단할 수 있다.

인핸서는 본 발명의 정제된 DNA 서열에 선택적으로 포함되어, 조절 서열, 예를 들어 프로모터에 포함될 수 있다.

“소망하는 유전자(gene of interest)” 또는 “형질전환 유전자(transgene)”는 바람직하게는 단백질(구조적 또는 조절 단백질)을 인코딩한다. 본원에 사용된 “단백질”은 일반적으로 약 10개 이상의 아미노산을 갖는 펩타이드 및 폴리펩타이드를 일컫는다. 단백질은 숙주에 대해 “동형(homologous)”(즉, 숙주 세포에 대한 내인성이 이용됨)이거나, 효모에 의해 생산되는 인간 단백질과 같이 “이형(heterologous)”(즉, 숙주 세포에 대한 이종이 이용됨)이다. 단백질은 세포의 원형질막 주위공간(periplasmic space) 또는 세포질, 또는 세포외 배지에서 불용성 응집물(aggregate) 또는 가용성 단백질로서 생산될 수 있다. 단백질의 예는 성장 호르몬 또는 에리스로포이에틴(EPO)와 같은 호르몬, 표피 성장 인자와 같은 성장 인자, 엔케팔린(enkephalin)과 같은 진통(analgesic) 물질, 키모트립신(chymotrypsin)과 같은 효소, 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체 및 항체를 포함하며, 가시화 마커, 예를 들어 녹색 형광 단백질과 같이 통상적으로 사용되는 단백질도 포함한다.

바람직하게는, 정제된 DNA 서열은 최소한 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 제2 분리된 매트릭스 부착 부위(MAR) 뉴클레오티드 서열:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 추가로 포함한다. 분리된 매트릭스 부착 부위(MAR) 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 선택적으로, 1차 및 2차 동일 MAR 뉴클레오티드 서열이 사용된다.

바람직하게는, MAR 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 소망하는 유전자를 포함하는 서열의 5' 및 3' 말단 모두에 위치한다. 그러나, 본 발명은 상기 1차 및/또는 2차 MAR 뉴클레오티드 서열이 프로모터 및 소망하는 유전자를 포함하는 것과는 다른 서열상에 위치한다는 사실도 포함한다.

또한, 본 발명의 목적에 의해 받아들여지는 것은, 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 제1 분리된 매트릭스 부착 부위(MAR) 뉴클레오티드 서열:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 포함하는 분리 및 정제된 DNA 서열이며, 이들은 공지된 프로토콜에 따라 분리 및 정제된 DNA 서열을 진핵 숙주 세포에 삽입시킴으로써 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는데 사용할 수 있다. 이용되는 진핵 숙주 세포에 DNA를 삽입하는데 통상적으로 적용되는 방법은, 예를 들어 미세주입(microinjection) 또는 미세입자 봄바드먼트(bombardment); 일렉트로트랜스퍼(electrotransfer); 바이러스 벡터의 사용; 전달 시스템내에서의 인캡슐화(encapsulation); 및 칼슘 포스페이트, 디에틸아미노에틸(DEAE)-덱스트란과 같은 형질전환 시약 또는 Lipofect-AMINE 2000(Invitrogen)과 같은 통상적인 형질전환 시스템이다. 바람직하게는, 정제된 DNA 서열을 진핵 숙주 세포에 삽입하는 형질전환 방법은 하기에 기술한 바와 같은 진핵 세포의 형질전환 방법이다.

분리 및 정제된 DNA 서열은 환상(circular) 벡터의 형태에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 분리 및 정제된 DNA 서열은 벡터로서 선형(linear) DNA 서열의 형태에서 사용될 수 있다.

본원에 사용된, “플라스미드” 및 “벡터”는 상호 호환하여 사용되며, 플라스미드는 가장 통상적으로 사용되는 벡터 형태이다. 그러나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니지만, 등가의(equivalent) 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 경향이 있다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법을 추가로 포함한다:

a) 1 이상의 소망하는 DNA 서열을 포함하는 1 이상의 정제된 DNA 서열 및/또는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트를 포함하는 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열을 진핵 숙주 세포에 도입(introducing)하는 단계,

b) 1 이상의 소망하는 DNA 서열을 포함하는 1 이상의 정제된 DNA 서열 및/또는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트를 포함하는 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열을 이용하여, 정해진 시간내에 상기 형질전환된 진핵 숙주 세포에 추가로 1회 이상 형질도입하는 것을 수행하는 단계,

c) 상기 형질전환된 진핵 숙주 세포를 선별하는 단계.

바람직하게는, 최소한 2회 내지 4회의 형질전환 단계가 단계 b)에 적용된다.

성공적으로 형질전환된 세포를 선별하기 위해, 일반적으로 선별가능 마커(예, 항생제에 대한 저항성)를 인코딩하는 유전자가 소망하는 유전자와 함께 숙주 세포에 도입된다. 선별가능 마커를 인코딩하는 유전자는 1 이상의 소망하는 DNA 서열을 포함하는 정제된 DNA 서열 및/또는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트를 포함하는 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열 상에 위치할 수 있으며, 또는 선택적으로는 분리 형태로 예를 들어 플라스미드로 동시-도입될 수 있다. 다양한 선별가능 마커는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 약물에 대해 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 약물의 양은 생산성을 증가시키기 위해 요구되는 만큼 사용될 수 있다.

일반적으로 1 이상의 선별가능 마커가 사용된다. 바람직하게는 다른 형질전환 단계 각각에 사용되는 선별가능 마커는 다르다. 이는 2개의 다른 항생제 마커를 사용함으로써 “복합-형질전환된” 형질전환 세포를 선별가능하게 한다.

단백질 생산 가능하고 세포 벽이 결여된 모든 진핵 숙주 세포가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 인간 배아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양에서 성장한 서브클론된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol 36, 59 (1977)), 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2), 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065)와 같은 인간세포; 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77, 4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol . Reprod 23, 243-251 (1980)), 마우스 유방 세포(MMT 060562, ATCC CCL51)와 같은 설치류 세포; 및 SV4O에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 개(canine) 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 물소 래트(rat) 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442)와 같은 다른 포유동물의 세포; 마이엘로마(예. NS0)/하이브리도마 세포를 포함한다.

바람직하게는, 선별된 형질전환된 진핵 숙주 세포는 매일 세포당 10 pg 이상의 생산 속도를 가진 단백질 고생산 세포이다.

본원에서 사용하기에 가장 바람직한 것은 포유동물 세포이며, 더욱 바람직한 것은 CHO 세포이다.

분리 및 정제된 DNA 서열의 소망하는 DNA 서열은 통상적으로는 소망하는 유전자, 바람직하게는 상술한 바와 같이 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질을 인코딩하는 소망하는 유전자이다. 1 이상의 소망하는 DNA서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA 서열은 소망하는 MAR 뉴클레오티드 서열의 DNA 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트를 추가로 포함할 수 있다.

MAR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA 서열은, 예를 들어 서열번호 1 내지 27의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 서열 및/또는 cLysMAR의 각 엘리먼트, 예를 들어 B, K 및 F 부위 뿐만 아니라 상술한 바와 같은 단편 및 엘리먼트 및 이의 조합이다. 다른 염색질 변형 엘리먼트는 예를 들어 경계 엘리먼트(boundary elements, BEs), 위치 조절 부위(locus control regions, LCRs) 및 범용 오프닝 엘리먼트(universal opening elements, UCOEs)이다(참조, Zanh-Zabal et al. 이미 인용됨). 숙주 세포의 복합 형질전환의 예가 실시예 12에 개시되어 있다(표 3). 1차 형질전환 단계(1차 형질전환)는 소망하는 유전자(SV40EGFP) 단독, MAR 뉴클레오티드 서열(MAR) 단독 또는 소망하는 유전자와 MAR 뉴클레오티드 서열(MAR-SV40EGFP)을 이용하여 수행된다. 2차 형질전환 단계(2차 형질전환)는 소망하는 유전자(SV40EGFP) 단독, MAR 뉴클레오티드 서열(MAR) 단독 또는 소망하는 유전자와 MAR 뉴클레오티드 서열(MAR-SV40EGFP)을 이용하여, 가능하다면 상기 1차 형질전환 단계로부터 얻어지는 조합을 이용하여 수행된다.

바람직하게는, 진핵 숙주 세포는 다음의 단계에 의해 형질전환된다:

a) 1개의 소망하는 DNA 서열 및 추가로 MAR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정제된 DNA 서열을 도입하는 단계,

b) 상기 형질전환된 진핵 숙주 세포에, 1개의 소망하는 DNA 서열 및 추가로 MAR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 단계 a)와 동일한 정제된 DNA 서열을 정해진 시간내에 삽입하는 형질전환 단계를 추가로 1회 이상 수행하는 단계.

또한, 바람직하게는, 본 발명의 MAR 뉴클레오티드 서열은 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 분리 및 정제된 DNA 서열:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 기재된 바이오인포매틱스 기술을 이용한 MAR 서열을 동정하기 위한 방법, 혼합 방법 또는 1 이상의 필터를 포함하는 방법에 따라 동정가능한 분리 및 정제된 MAR DNA서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

- 링커 서열들 사이에들 조립된 천연 MAR 엘리먼트 및/또는 단편을 포함하는 합성 MAR 서열,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체이다.

놀랍게도, 1차 및 2차 형질전환 사이에서 상승작용이 관찰되었다. 각 상승작용은, 형질전환 단계 1개 또는 모두에 MAR 엘리먼트가 존재할 때 관찰되었다. 상기에 기술한 방법을 이용하여 pMAR 단독으로 또는 다양한 발현 플라스미드와 혼합한 것을 이용해 세포의 복합 형질전환을 수행하였다. 예를 들어, 표 3에서는 pMAR-SV40EGFP 플라스미드를 이용해 세포를 2회 형질전환하는 경우, 매우 높은 GFP 발현 및 모든 조건에서의 증가가 가장 높은 정도(4.3배)를 나타냄을 보여준다. 대조적으로, MAR이 없는 벡터로 2회 형질전환하는 경우, 예측된 2배의 증가 대신에, 매우 낮거나 거의 증가가 없었다(2.8배). 이는 각 형질전환 단계에서의 MAR 엘리먼트의 존재가 최대 단백질 합성을 수행하는데 있어서 특히 중요함을 증명해준다.

형질전환 방법의 구체적인 예로서, 1 이상의 소망하는 DNA 서열을 포함하는 상기 정제된 DNA 서열은, 프로모터에 작동가능하게 연결된 소망하는 유전자, 선별가능 마커 유전자, 및/또는 MAR 서열과 같은 단백질 생산 증가 엘리먼트를 포함하는 복합 연결되지 않은 플라스미드의 형태로 전달될 수 있다.

1차 및 그 다음 DNA 서열의 비율은 특정 세포 타입의 사용에 요구되는 것으로서 적용될 수 있으며, 이는 당업자에게 있어서는 통상적인 실험이 된다.

1차 형질전환된 세포에 추가로 형질전환하기 위한 정해진 시간은, 세포 주기 및 이의 지속시간(duration)에 밀접하게 의존한다. 통상적으로, 정해진 시간은 세포 분열 사이클에 관계된 간격(interval)과 일치한다.

따라서, 이 정확한 타이밍은 특정 세포 타입의 사용에 대해 요구되는 것으로서 적용될 수 있으며, 이는 당업자에게 있어서는 통상적인 실험이 된다.

바람직하게는, 상기 정해진 시간은 숙주 세포의 2차 세포분열 사이클 또는 추가의 세포분열 사이클, 바람직하게는 2차 사이클의 동일한 기간에 진입하는 순간이다.

이 시간은 통상적으로 이전의 형질전환이 일어나고 난 후 6시간 내지 8시간, 바람직하게는 20시간 내지 24시간이 적합하다.

또한, 본 발명에 포함되는 것은 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법이며, 상기 방법은 1 이상의 소망하는 DNA 서열을 포함하는 1 이상의 1차 분리 및 정제된 DNA 서열 및 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 1 이상의 MAR 뉴클레오티드를 포함하는 2차 정제된 DNA:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를, 상기 진핵 숙주 세포에 동시-형질전환하는 단계를 포함한다.

상기 1차 분리 및 정제된 DNA 서열은 상기에 기재한 바와 같은 1 이상의 MAR 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.

또한 고려되는 것은 단백질 생산 방법이며, 여기서 진핵 숙주 세포는 본 발명에 제시된 바와 같은 형질전환 방법에 따라 형질전환되고, 단백질의 발현에 적합한 환경하에서 배양 배지에서 배양된다. 상기 단백질은 당업계에 공지된 모든 회수(recover) 과정에 따라 최종적으로 회수된다.

실시예로서 제시된 바와 같이, 다음과 같은 단백질 생산 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 형질전환 방법으로 형질전환된 진핵 숙주 세포는, 상기 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 상기 세포를 배양하고 상기 단백질을 회수함으로써 단백질을 생산하는 방법에 사용된다. 적합한 배양 조건은 예를 들어 국제특허공개공보 WO 96/39488에 개시된 바와 같은 진핵 세포의 인 비트로 배양에서 통상적으로 사용된 조건이다. 상기 단백질은 예를 들어 면역친화(immunoaffinity) 또는 이온-교환 컬럼 상에서의 분획(fractionation); 침전; 역상 HPLC; 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 젤 여과와 같은 통상적인 분리 기술을 이용하여 배양 세포로부터 분리될 수 있다. 당업자라면 소망하는 폴리펩타이드에 적합한 정제 방법이, 재조합 배양 세포에서 발현되는 동안 폴리펩티드의 특성에 있어서의 변화를 계산하기 위해 변형이 필요함을 잘 알 수 있을 것이다.

본 발명에 따라 생산된 단백질들은 다양한 방법에 의해 기능적으로 테스트될 수 있다. 예를 들어, 항원성 에피토프의 존재 및 리간드에 결합하는 단백질의 능력은 웨스턴 블랏 분석, 형광 세포 선별 분석, 면역침전법, 면역화학 분석 및/또는 경쟁적 결합 분석뿐만 아니라 특이 결합 활성을 측정하는 다른 모든 분석법에 의해 확인될 수 있다.

본 발명의 방법은 이에 한정되는 것은 아니지만 하기를 포함하는 수개의 실제적 적용에 사용될 수 있다:

1. 바이러스/병원체 안타고니스트로서 재조합 숙주 단백질 항원을 이용한 면역화(immunization).

2. 진단 또는 스크리닝 분석용 막 단백질의 생산.

3. 생화학적 연구용 막 단백질의 생산.

4. 구조적 연구용 막 단백질의 생산.

5. 오르판(orphan) 수용체 및 이온 채널의 매핑을 포함하는 면역-조직화학적 매핑을 하기 위한 항체를 생산하기 위한 항원 생산.

또한, 본 발명에 의해 제공되는 것은 모든 선행하는 형질전환 방법에 따라 형질전환된 진핵 숙주 세포이다. 바람직하게는, 진핵 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포주이다.

이미 기재한 바와 같이, 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 인간 배아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양에서 성장한 서브클론된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol 36, 59 (1977)), 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2), 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065)와 같은 인간세포; 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77, 4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol . Reprod 23, 243-251 (1980)), 마우스 유방 세포(MMT 060562, ATCC CCL51)와 같은 설치류 세포; 및 SV4O에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 물소 래트(rat) 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442)와 같은 다른 포유동물의 세포; 마이엘로마(예. NS0)/하이브리도마 세포를 포함한다.

본원에서 사용하기에 가장 바람직한 것은 CHO 세포이다.

본 발명은 본 발명에 따른 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열을 포함하는 세포 형질전환 혼합물(mixture) 또는 킷트(kit)도 제공한다.

본 발명은 형질전환 생물체를 추가로 포함하며, 여기서 상기 생물체 세포의 최소한 일부에는, 하기로부터 선택되는 1 이상의 DNA 서열:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체가 안정하게 삽입되어 있다.

바람직하게는, 형질전환 생물체의 세포의 일부는 본원에 개시된 방법에 따라 형질전환되어 있다.

또한, 본 발명에 포함되는 것은 형질전환 생물체이며, 이 생물체의 게놈에는 하기로부터 선택되는 1 이상의 DNA 서열:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

본 발명에 유용할 수 있는 형질전환 진핵 생물체는 예를 들어 포유동물(마우스, 인간, 원숭이 등)을 포함하며, 구체적으로는 일반적으로 설치류, 곤충(초파리 등), 어류(제브라 피쉬 등), 파충류(개구리, 도룡뇽 등...) 및 c.엘레강스(c. elegans), 효모 등과 같은 다른 단순 생물체와 같은 실험 동물을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 개시된 바와 같은 MAR 서열의 동정 방법을 수행하기 위한 컴퓨터-수행가능 수단(instruction)을 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공하는 것이다.

전술한 기재는 하기 실시예를 참조로 함으로써 더 완전하게 이해될 수 있을 것이다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명을 실시하는 방법의 일례이며 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

[실시예]

실시예 1: SMAR Sc an

및 MAR 서열

실험적으로 확인된 인간 MARs 및 비-MAR 서열을 분석함으로써 SMAR Scan

의 대략적인 1차 평가를 수행하였다. MAR 서열로서, SMARt Db로부터 인간 MARs를 분서함으로써 얻어진 이전의 결과물을, 도 1에 표시된 바와 같은 각 기준에 대한 밀도 히스토그램을 도표화하는데 사용하였다. 유사하게, 비-MAR 서열도 분석하고 도표화하였다. 비-MAR 서열로서, 염색체 22로부터의 모든 Ref-Seq-contig를 사용하였으며, 이 후자는 비-MAR 서열의 일부로 간주되는 MAR 서열의 무시할 수 있는 부분을 포함하기에 아주 충분한 것으로 고려하였다.

도 1에 표시된 밀도 분포도는 모두 긴 꼬리의 비대칭이었다. 가장 높은 벤드(bend), 가장 높은 메이저 그루브 깊이 및 가장 높은 마이너 그루브 너비에 대한 분포도는 오른쪽으로 비대칭이었다. 가장 낮은 녹는점에 대한 분포도는, 다른 3개와 관련된 기준에 대해 역으로 대응되는 자연적으로 제시된 왼쪽-비대칭이었다. MAR 서열에 대해서는, 실제적으로는 2번째 약한 피크를 가진 2형상(biphasic)의 분포도가 바람직하다. 그리고, MAR 및 비-MAR 서열 분포도 사이에는, 명백한 이동(shift)도 각 도표에서 보인다.

사용된 모든 인간 MAR 서열 중에서, 평균적으로는 이들 중의 약 70%만이 4개의 다른 기준에 대해 인간 MARs 분포의 75th 분위(quantile)보다 큰 값을 가졌다. 유사하게 인간 MARs 분포 각각의 두번째로 약한 피크에 대해서는, 인간 MAR 서열의 15% 만이 이러한 범위밖(outlying) 값을 가졌다. 이러한 인간 MAR 서열의 15% 중에서, 대부분은 인터페론 위치 MAR, 베타-글로빈 위치 MAR(Ramezani A, Hawley TS, Hawley RG, “Performance- and safety-enhanced lentiviral vectors containing the human interferon-beta scaffold attachment region and the chicken beta-globin insulator” Blood, 101:4717-4724, 2003) 또는 아포지방단백질 MAR(Namciu, S, Blochinger KB, Fournier REK, “Human matrix attachment regions in-sulate transgene expression from chromosomal position effects in Drosophila melanogaster” Mol . Cell . Biol., 18:2382-2391, 1998)과 같은, 포지션 영향으로부터 형질전환 유전자를 고립시키는 데 사용되는 매우 잘 도큐멘트된(documented) MARs이었다.

항상 동일한 데이터를 이용하여, 계산된 4개의 이론적 구조 특성 및 AT-함량 사이의 관계를 검증하기 위해 인간 MAR 서열도 사용되었다. 도 2는 분산도(scatterplot) 및 각 쌍의 기준에 대응되는 상관 계수(correlation coefficient) r을 나타낸다.

실시예 2: 생물체에 따른 MAR 서열의 분포도

*다른 생물체의 SMARt DB로부터의 MAR 서열도 상기에 설명한 바와 동일하게 검색하고 분석하였다. 마우스, 닭, 수수(sorghum bicolor) 및 인간에 대한 MAR 서열 농도 분포가 도 3에 함께 플로팅되어 있다.

실시예 3: 전체 염색체 22의 MAR 예측

초기 설정을 사용하고 SMAR Scan

을 이용하여 염색체 22로부터 모든 RefSeq contig를 분석하였다. 그 결과로서 SMAR Scan

에서 전체 803개의 MARs를 예측하였고, 이의 평균 길이는 446 bp이며, 이는 42777 bp 당 평균 1개의 MAR이 예측됨을 의미한다. 예측된 MARs의 전체 길이는 염색체 22의 길이의 1%에 상응하였다. 예측된 부위의 AT-함량은 65.1% 내지 93.3%이고; 이러한 모든 부위의 평균 AT-함량은 73.5%였다. 따라서, 예측된 MARs는 AT가 풍부한 반면, 염색체 22는 AT가 풍부하지 않았다(52.1% AT).

또한, 염색체 22의 전체를 분석하기 위해 SMARTest가 사용되었으며, 이에 의해 1387개의 MAR 후보자를 얻었고, 이의 평균 길이는 495 bp이고 24765 bp 당 평균적으로 1개의 예측된 MAR을 나타내었다. 예측된 MARs의 전체 길이는 염색체 22의 2%에 대응되었다. 2개의 소프트웨어에 의해 예측된 모든 MARs 중에서, 예측된 154개의 MARs는 2개 모두의 프로그램에 의해 발견되었고, SMAR Scan

및 SMARTest에서 MARs의 19% 및 11%를 각각 예측하는 것으로 나타났다. 제시된 예측된 MARs는 SMAR Scan

및 SMARTest에 대한 길이를 의미하고, SMAR Scan

및 SMARTest 예측간에 중첩하는 기회에 의해 얻어지는 확률은 예측 당 0.0027%이다.

SMAR Scan

예측의 특이성을 검증하기 위해, SMAR Scan

분석을 염색체 22의 무작위로 셔플된 서열 상에서 수행하였다(도 4). 셔플된 서열은 다음의 4개의 다른 방법을 이용해 제조하였다: 10bp의 중첩하지 않는 윈도우 내로 염색체 22를 분할(segmentation)하고 각 윈도우에 있는 뉴클레오티드를 각각 셔플링하는 것; 염색체의 모든 뉴클레오티드를 순차교환시키는 것을 의미하는 “스크램블링(scrambling)”; 10bp의 단편에 있는 염색체의 분할 및 이러한 단편의 무작위 조합을 의미하는 “러블링(rubbling)”, 이들 단편의 무작위 어셈블링 및 최종적으로는 오더(order) 1 마르코브(Markov) 체인, 여기서 다른 상태는 다른 DNA 디뉴클레오티드가 되고 이러한 상태간의 전이 가능성은 염색체 22 스캔에 기초한다. 각 셔플링 방법에 대해, 5개의 셔플된 염색체 22가 제조되었고, 초기설정을 이용하여 SMAR Scan

로 분석하였다. 넘버 히트에 대해서는, 평균 3 519 170개 히트(sd: 18 353)가 10bp의 중첩하지 않는 윈도우 내에 있는 순차교환된 염색체 22에서 발견되었고, 171 936,4개 히트(sd: 2 859,04)가 스크램블된 서열에서, 24 708,2개 히트(sd: 1 191,59)가 러블된 염색체 22에서, 평균 2 282개 히트(sd:334,7)가 오더 1 마르코브 체인 모델에 따라 염색체 22로부터 생성된 염색체에서 발견되었으며, 이들 각각은 천연 염색체 22와 함께 발견된 히트의 갯수가 185%(sd:평균 0.5%), 9%(sd:1.5%), 1%(sd:5%) 및 0.1%(sd:15%)로 나타났다. 예측된 MARs의 갯수에 대해서는, 300, 1 997 MARs보다 더 긴 길이의 인접 히트가 10bp(sd:31.2)의 윈도우 내에서 셔플된 염색체 22로 예측되는 것을 의미하며, 단지 2.4 MARs 후보자가 스크램블된 서열(sd:0.96)에서 발견되었고, 러블(rubbled) 및 마르코브 체인 모델에 따라 생성된 서열에서는 발견되지 않았으며, 여기서는 천연 염색체 22에서 발견된 예측된 MARs의 수의 249% 및 0.3% 이하로 각각 표시된다. 이러한 데이터는 DNA 서열이 셔플될때, SMAR Scan

이 조직화를 상실한 특정 DNA 엘리먼트를 검출한다는 사실을 제공한다.

실시예 4: SMAR Scan

을 이용한 인터페론 위치에 있는 공지된 매트릭스 부착 부위 의 분석

SMAR Scan

에 의한 MAR 예측의 관련성은, 염색체 9의 숏트 암(short arm)(9p22) 상에 있는 인간 인터페론 유전자 클러스트의 MAR 부위-최근에 공개된-를 분석함으로써 확인하였다. 고에츠 등(Goetze et al. 이미 인용됨)은 BURs(이 경우 스트레스-유도된 듀플렉스 탈안정화(stress-induced duplex destabilization) 또는 SIDD로 의미됨) 및 핵 매트릭스에 대한 인 비트로 결합(도 9, 하단 부분) 사이의 추측되는 관계를 분석하기 위해, WP18A10A7 위치의 완전(exhaustive) 분석을 보고하였다. SIDD 피크 3개는 인 비트로 결합 분석과 일치하였으나, 나머지는 매트릭스 부착 위치와 매치하지 않았다. SMAR Scan

을 이용한 인터페론 위치의 조사(도 9, 상단 부분)에서는 SATB1, NMP4 및 MEF2 조절자 결합 자리의 클러스터를 동반하는 3개의 메이저 피크가 활성 MARs와 상호연관성이 좋음을 나타내었다. 따라서, 본 발명자들은 예측된 CUEs 및 이러한 전사 인자에 대한 결합 자리의 발생이 cLysMAR에 제한되지 않으나 모든 MARs의 공통적인 특성이 될 수 있다고 결론지었다. 또한, 이러한 결과들은 SMAR Scan

프로그램이 게놈 서열로부터 MAR 엘리먼트를 효과적으로 검출할 수 있다는 사실을 포함한다.

실시예 5: SMAR Scan

예측의 정확도 및 다른 예측 기술을 이용한 비교

실험적으로 확인한 MARs가 매핑된 6개의 게놈 서열을 이용해 SMAR Scan

의 정확도를 검증하였다. 다른 예측 기술을 이용해 비교를 수행하기 위해, 이전의 서열과 동일한 분석된 서열을 MAR-Finder 및 SMARTest를 비교하는데 이용하였다. 이러한 게놈 서열은 전체 310 151bp이고 37개의 MARs로 실험적으로 확인된 3개의 식물 서열 및 3개의 인간 서열(표 1)이다. 표 1에 있는 SMARTest 및 MAR-Finder에 대한 결과는 이전의 비교(Frisch M, Frech K, Klingenhoff A, Cartharius K, Liebich I and Werner T, In silico pre-diction of scaffold/matrix attachment regions in large genomic sequences, Genome Research, 12:349-354, 2001.)로부터 얻었다.

0.4로 설정된 역치 및 프로타민 위치의 분석을 제외하고, 초기설정 파라미터를 이용해 MAR-Finder를 이용하였고, AT-풍부 규칙(rule)은 제외되었다(프로타민 위치에 대해 수행된 것으로 비 AT-풍부 MARs를 검출하기 위해)

SMAR Scan

정확도의 측정

6개의 다른 게놈 서열, 3개의 식물 서열 및 3개의 인간 서열-이들에 대해 실험적으로 확인된 MARs가 공지되어 있음-은 MAR-Finder, SMARTest 및 SMAR Scan

을 이용해 분석하였다. 참 양성(true positive) 매치는 굵게 인쇄되어 있고, 마이너스(-)는 거짓 음성(false negative) 매치를 나타낸다. 1 이상의 인 실리코(in silico) 예측에 포함된 실험적으로 확인된 더 긴 MARs의 일부를 각각 참 양성 매치로서 계수하였다. 따라서, 인 실리코 예측의 참(true)의 갯수는 발견된 실험적으로 확인된 MARs의 갯수보다 더 많다. 특이성은 참 양성 예측의 비율로서 정의되어 있는 반면, 민감성은 발견된 실험적으로 확인된 MARs의 비율로서 정의된다. *AT-풍부 규칙은 MAR-Finder를 이용하여 배제되었다.

SMARTest는 MARs로서 28개의 부위를 예측하였고, 이들 중 19개(참 양성)은 실험적으로 확인된 MARs와 연관성이 있지만(특이성: 68%) 9개(32%)는 비-MARs(거짓 양성)에 위치한다. 1 이상의 인 실리코 예측을 포함하는 실험적으로 결정된 가장 긴 MARs의 일부로서, 19개의 참 양성은 실질적으로 14개의 다른 실험적으로 확인된 MARs와 일치한다(특이성: 38%). MARFinder는 MARs로서 25개의 부위를 예측하였고, 이들 중 20개(특이성: 80%)는 12개의 다른 실험적으로 확인된 MARs(민감도: 32%)에 일치하는 실험적으로 확인된 MARs와 관계가 있다. SMAR Scan

은 22개 부위를 예측하였고, 17개는 14개의 다른 실험적으로 확인된 MARs(민감도: 38%)와 매치하는 참 양성(특이성:77%)이다.

다른 실시예로서, 인간 염색체 1 및 2에 동일한 분석을 적용하여, 23개의 MARs 서열(서열번호 1 내지 23)을 확인하였다. 이들 서열은 ST25 포맷의 첨부문서 1에 리스트되어 있다.

실시예 6: 혼합 방법( SMAR Scan

- pfsearch )을 이용한 전체 게놈의 분석

SMAR Scan

에 의해 계산된 구조적 특징 및 S/MAR 기능적 활성 간의 잠재적 연관성을 테스트하기 위해, 계산된 이론적 구조적 특징에 대해 가장 높은 값을 가지는 서열-이하 “슈퍼” S/MARs로 약칭함-을 얻기 위해 매우 엄격한 파라미터를 사용한 혼합 방법을 이용하여 전체 인간 게놈을 분석하였다. 이는 형질전환 유전자 발현 및 재조합 단백질 생산을 증가시키기 위한 많은 잠재성을 가진 예측된 MAR 엘리먼트를 얻기 위해 수행되는 것이 바람직하다. 먼저, 얻어진 추정의 S/MARs를 이를 특성화하고 분류하기 위한 시도의 관점에서 바이오인포매틱스로부터 분석하였다.

6.1 인간 전체 게놈의 분석으로부터 예측된 S/ MARs

인간 전체 게놈으로서, 모든 인간 RefSeq(National Center for Biotechnology Information, The NCBI handbook [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), Oct. Chapter 17, The Reference Sequence (Ref-Seq) Project, 2002 (Available from http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books) contigs(release 5)를 사용하였으며, 혼합방법-이는 1차 레벨 프로세싱에 있는 필터로서 SMAR Scan

을 이용하고, 가장 높은 벤드 컷오프 값을 제외하고는 초기설정을 이용하는 반면, DNA 벤딩 기준에 대해서는 4.0 도(degree)(3.202 도를 제외하고)의 엄격한 역치가 사용됨-을 이용해 분석하였다.

2차 레벨 프로세싱에서, 예측된 결합 전사 인자는 이러한 서열 상의 어떠한 필터 단계도 수행하지 않는 이전 단계로부터 선택되는 서열로서 생각되었다.

인간 전체 게놈의 혼합 방법에 의한 분석은, 전체 1 065 305 bp(인간 전체 게놈의 0.35%)로 표시되는 1757개의 추정 “슈퍼” S/MARs 전체를 산출하였다. 표 2는 각 염색체에 대해 이의 크기, 이의 유전자의 갯수, 이의 예측된 S/MARs의 갯수, 유전자 당 이의 S/MARs 밀도 및 S/MAR 당 이의 kb를 나타낸다. 이 표는 다른 염색체에 대해 예측된 S/MAR 당 유전자 밀도가 매우 다양함을 나타낸다(표준편차는 예측된 S/MAR 당 평균 유전자 밀도의 50% 이상으로 나타나고, S/MAR 당 더 높은 유전자 밀도 및 더 낮은 밀도 간의 배수 차이는 6.5이다). 또한, 표 2는 S/MAR 당 kb가 S/MAR 당 유전자의 밀도보다 낮게 다양함을 보여준다(표준편차는 S/MAR 당 평균 kb의 25%로 나타나고, S/MAR 당 높은 kb 및 낮은 kb 사이의 배수 차이는 3.2이다).

염색체 당 예측된 S/MARs의 갯수

염색체	염색체 당 유전자 갯수	염색체 크기 (백만 bp )	예측된 S/ MARs 의 갯수	S/ MAR 당 유전자 밀도	S/ MAR 당 Kb
1	2544	230	85	29.9	2705
2	1772	241	143	12.3	1685
3	1406	198	101	13.9	1960
4	1036	190	118	8.7	1610
5	1233	180	116	10.6	1551
6	1247	170	94	13.2	1808
7	1383	160	179	7.7	1754
8	942	145	77	12.2	1883
9	1100	119	48	22.9	2479
10	1003	133	71	14.1	1873
11	1692	132	67	25.2	1970
12	1278	131	78	16.3	1679
13	506	97	70	7.2	1385
14	1168	88	36	32.4	2444
15	895	83	35	25.5	2371
16	1107	81	41	27	1975
17	1421	80	37	38.4	2162
18	396	75	51	7.7	1470
19	1621	56	36	45.02	1555
20	724	60	28	25.8	2142
21	355	34	18	19.7	1888
22	707	34	28	25.2	1214
X	1168	154	170	6.8	905
Y	251	25	30	8.3	833
합계	26 955	3 050	1 757	457	433 12
평균	1 123	127	73	19	1 804
Sd	510	72.8	45	10	462

염색체 당 유전자의 갯수는 GenBank 주석에 기초한 NCBI 인간 게놈 통계학(Build 34 Version 3)(National Center for Biotechnology Information, The NCBI handbook [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), Oct. Chapter 17, The Reference Sequence (Ref-Seq) Project, 2002 (Available from http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi db=Books)에 대응한다. 염색체 크기는 대응되는 인간 RefSeq(National Center for Biotechnology Information, The NCBI handbook [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), Oct. Chapter 17, The Reference Sequence (Ref-Seq) Project, 2002 (Available from http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi db=Books) (release 5) contig 길이의 합이다

6.2 전사 인자 결합 자리에 대한 “슈퍼” MARs 의 바이오인포매틱스 분석

SMAR Scan

에 의해 이미 수득한 1757개의 예측된 “슈퍼” S/MARs 서열을, 잠재적 전사 인자 결합 자리에 대해 분석하였다. 이는 RMatch^TMProfessional(Kel AE, Gossling E, Reuter I, Cheremushkin E, Kel-Margoulis OV, Wingender E, MATCH: A tool for searching transcription factor binding sites in DNA sequences, Nucleic Acids Res . 31(13):3576-9, 2003), TRANSFAC을 기반으로 한 웨이트 매트릭스 기초의 기술(Wingender E, Chen X, Fricke E, Geffers R, Hehl R, Liebich I, Krull M, Matys V, Michael H, Ohnhauser R, Pruss M, Schacherer F, Thiele S, Urbach S, The TRANSFAC system on gene expression regulation, Nucleic Acids Research , 29(1):281-3, 2001)을 이용해 수행하였다. 대부분의 초기설정 Match^TM 분석과 함께 사용되는 Match^TM2.0 Propessional은 TRANSFAC Professional, release 8.2(20040360)를 기초로 하였다. Match^TM에 따라 분석된 1757개 서열 상의 모든 전사 인자 결합 예측의 합은 표 3에 표시되어 있다. 이 표를 기준으로, 1757개 서열 중에서 전체적으로 20개 이상을 히트하는 전사 인자만을 이후의 분석에서 고려하였다.

이하는 1757개의 추정 S/MAR 서열에 가장 잘 결합하는 것으로 예측되는 인간 전사 인자의 일부 및 이의 Match 설명이다: Cdc5 (세포 분할 조절 단백질 5, cell division control protein 5) 전사적 조절자/억제자(regulator/repressor), Nkx3A 안드로젠에 의해 조절되는 호메오도메인(homeodomain) 단백질, POU1F1 (뇌하수체-특이적 양성 전사 인자 1, pituitary-specific positive transcription factor 1) 이는 뇌하수체에 대해 특이적이고 세포 증식을 촉진함. 따라서, SATB1, NMP4 및 MEF2에 추가로, 다른 전사 인자들이 MARs의 활성에 관여할 수 있다.

AP-1	1	AR	2	Bach2	1	Brn-2	1
C/EBP	20	C/EBPgamma	5	CDP CR3	1	COMP1	2
CRE-BP1	34	Cdc5	858	Cdx-2	35	Evi-1	472
FOX	78	FOXD3	79	FOXJ2	244	FOXP3	29
Freac-7	272	GATA-1	2	GATA-3	142	GATA-4	125
HFH-1	12	HFH-3	1	HLF	275	HNF-1	337
HNF-3alpha	23	HNF-3beta	71	HP1	2	Lhx3	22
MEF-2	114	MRF-2	57	Myc	18	NKX3A	849
Nkx2-5	2	Oct-1	191	PBX	5	POU1F1	483
POU3F2	11	POU6F1	29	Pax-3	3	Pax-6	20
Pit-1	505	SRF	8	TEF	2852	TFIIA	14
TTF1	1	V$MTATA_B	4	VBP	53	Vmw65	1
XFD-1	65	XFD-2	418	XFD-3	2

표 3은 분석된 1757개 서열 상의 모든 전사 인자 결합 예측(전체 20개 이상의 히트)의 요약이다.

6.3 디뉴클레오티드 빈도에 대한 예측된 “슈퍼” MARs 의 바이오인포매틱스 분석

“슈퍼” S/MAR 서열을 쉽게 동정하기 위해, 계산을 하지 않고 확인할 수 있는 명시된(explicit) 기준을 이용해 다양한 컴퓨터 분석을 수행하였다. 이들 중에서, 디-뉴클레오티드 분석은 1757개의 슈퍼MARs에서 수행하였고, 5'>3' 방향에 있는 양 가닥으로 간주되는 각 서열에 대한 16개의 가능 디뉴클레오티드 백분율 각각을 계산하였다.

요약(최소, 최대, 중간, 평균, 25th 백분위수 및 75th 백분위수) 뿐만 아니라 1757개 S/MAR 서열에 대한 디뉴클레오티드 백분율 각각의 히스토그램이 표 4에 각각 표시되어 있다. 유사한 분석을, 무작위로 선택된 비-S/MAR 서열(그러나 일부 MARs를 포함할 수 있음)을 나타내는 인간 게놈으로부터 무작위로 선택된 서열에서 수행하였다. 표 5는 이러한 서열에 대한 디뉴클레오티드 함량 분석의 요약을 각각 나타낸다.

1757개 S/MAR 서열에 대한 디뉴클레오티드 백분율

	AA %	AC %	AG %	AT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	0.000 4.234 7.843 7.184 10.110 17.290	0.0000 0.9372 2.2408 3.2117 4.7718 12.9479	0.0000 0.1408 0.4777 1.0865 1.5096 8.1230	18.50 32.11 34.68 34.32 36.94 50.00
	CA %	CC %	CG %	CT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	0.0000 0.9695 1.9776 2.6977 3.7543 10.4061	0.00000 0.00000 0.00000 0.14123 0.09422 4.24837	0.0000 0.0000 0.0000 0.2709 0.1256 7.4410	0.0000 0.1408 0.4777 1.0865 1.5096 8.1230
	GA %	GC %	GG %	GT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	0.00000 0.08696 0.32616 0.63347 0.83333 5.77889	0.0000 0.0000 0.0000 0.2104 0.1914 9.8795	0.00000 0.00000 0.00000 0.14123 0.09422 4.24837	0.0000 0.9372 2.2408 3.2117 4.7718 12.9479
	TA %	TC %	TG %	TT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	28.63 33.48 35.22 35.29 37.14 50.00	0.00000 0.08696 0.32616 0.63347 0.83333 5.77889	0.0000 0.9695 1.9776 2.6977 3.7543 10.4061	0.000 4.234 7.843 7.184 10.110 17.290

요약 표에 있는 예측된 S/MAR 엘리먼트 및 비S/MAR 서열의 결과에 따르면, AT 및 TA 디뉴클레오티드 함량에서는 이들 서열의 두 그룹간에 현저한 차이가 확인되었다. AT 및 TA는, 예측된 S/MAR 서열의 디뉴클레오티드 함량의 18.5% 및 28.6% 이상으로 각각 나타나는 반면, 비S/MAR 서열에서의 동일한 디뉴클레오티드에 대한 최소 백분율은 0.3% 및 0%로 각각 나타났다. 유사하게는, S/MAR 서열에 있는 최대 CC 및 GG 함량이 4.2%이지만, 비S/MAR 서열에 있어서는 이들 2개 디뉴클레오티드에 대한 백분율이 20.8%까지 증가될 수 있다.

AT 및 TA 디뉴클레오티드 백분율 사이의 관계 및 SMAR Scan

에 의해 계산된 바와 같은 가장 높은 DNA 벤드가, 예측된 S/MAR 서열에 대해 도 17에 표시되어 있고, 비S/MAR 서열에 대해 도 18에 표시되어 있다. 이들 도면의 다른 분산도에서는, TA 백분율이 SMAR Scan

에 의해 예측된 바와 같은 예측된 DNA 벤드와 관련성이 좋음을 보여준다.

1757개 비S/MAR 서열 요약에 대한 디뉴클레오티드 백분율

	AA %	AC %	AG %	AT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	0.000 7.096 9.106 8.976 10.939 17.922	1.735 4.586 5.016 5.054 5.494 13.816	1.512 6.466 7.279 7.184 7.969 12.232	0.3257 5.1033 6.8695 7.0108 8.7913 23.1788
	CA %	CC %	CG %	CT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	3.571 6.765 7.410 7.411 8.010 15.714	0.8278 4.1077 5.5556 5.9088 7.2460 20.8415	0.0000 0.4727 0.8439 1.2707 1.5760 12.6074	1.512 6.466 7.279 7.184 7.969 12.232
	GA %	GC %	GG %	GT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	1.319 5.495 6.032 6.065 6.602 10.423	0.4967 3.2615 4.4092 4.7468 5.8824 16.0000	0.8278 4.1077 5.5556 5.9088 7.2460 20.8415	1.735 4.586 5.016 5.054 5.494 13.816
	TA %	TC %	TG %	TT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	0.000 3.876 5.625 5.774 7.464 24.338	1.319 5.495 6.032 6.065 6.602 10.423	3.571 6.765 7.410 7.411 8.010 15.714	0.000 7.096 9.106 8.976 10.939 17.922

신규한 슈퍼 MARs 중 4개를 무작위로 선별하여 AT 및 TA 디뉴클레오티드 함량에 대해 분석하고, 100개 염기쌍의 윈도우로 간주되는 공지된 닭 lysMAR과 비교하였다 (표 6).

놀랍게도, 본 출원인은 슈퍼 MARs 모두의 AT 디뉴클레오티드 빈도가 DNA의 100개 염기쌍의 윈도우에 있는 분석된 전체 디뉴클레오티드의 12% 이상이고, TA 디뉴클레오티드 빈도가 10% 이상임을 밝혔다. 가장 효율적인 MARs는 2개의 디뉴클레오티드 쌍의 34% 근처 값을 나타내었다.

실험적으로 검증한 MARs의 %AT 및 TA 디뉴클레오티드 빈도의 요약

CLysMAR (CUEs의 평균)	AT%　: 12.03	TA%　: 10.29	서열번호
P1_68	AT%　: 33.78	TA%　: 33.93	서열번호
P1_6	AT%　: 34.67	TA%　: 34.38	서열번호
P1_42	AT%　: 35.65	TA%　: 35.52	서열번호
모든 인간 “슈퍼”MARs에 대한 평균값	AT%　: 34.32	TA%　: 35.29
모든 인간 비-MARs에 대한 평균값	AT%　: 7.01	TA%　: 5.77

6.4 인간 및 마우스 게놈의 오쏘로거스 ( orthologous ) 유전자내 ( intergenic ) 부위의 분석

S/MAR 진화에 대한 식견을 얻기 위해, 인간 및 마우스 게놈의 오소로거스 유전자내 부위를 SMAR Scan

로 분석하였다. 이용된 데이터 세트는, 12개의 인간 염색체 및 12개의 마우스 염색체에 위치하는 인간 및 마우스 게놈(Shabalina SA, Ogurtsov AY, Kondrashov VA, Kondrashov AS, Selective constraint in inter-genic regions of human and mouse genomes, Trends Genet, 17(7):373-6, 2001)(평균 길이~12000 bp)으로부터의 87쌍의 완전한 오쏘로거스 유전자내 부위로 구성되어 있으며, 이들 서열의 신터니(synteny)는 쌍단위(pairwise) 서열 정렬 및 플랭킹 유전자의 주석(실험적 또는 예측된)을 고려하여 확인하였다.

87개의 인간 및 마우스 오쏘로거스 유전자내 서열의 분석은 이의 초기 설정을 이용해 SMAR Scan

로 분석하였다. 인간 서열의 분석에서는 5개의 다른 유전자내 서열에 위치한 전체 12개의 예측된 S/MARs(총 길이가 4 750 bp로 나타남)가 산출되었다.

SMAR Scan

엄격한 설정을 이용하여 “슈퍼” S/MAR을 포함하도록 예측된 3개의 인간 유전자내 서열 중에서, 대응되는 마우스 오쏘로거스 유전자내 서열 중의 하나는 S/MAR(인간 EMBL ID: Z96050, 포지션 28 010에서 76 951까지, 마우스 EMBL에 대한 오쏘로거스 ID: AC015932, 포지션 59 884에서 89 963까지)을 포함하는 것으로 예측되었다. 이들 2개 오쏘로거스 유전자내 서열의 국소적 정렬이 수행될 때, SMAR Scan

에 의해 예측된 부위에 상응하는 이러한 2개의 큰 부위의 가장 국소적인 정렬은 S/MAR 엘리먼트가 된다. “슈퍼” S/MAR을 포함하는 것으로 예측된 2개의 다른 인간 유전자내 서열의 마우스 오쏘로거스에 대한 수동 조사를, Ensembl 게놈 브라우저(http://ensembl.org)를 이용해 수행하였다. 이들 2개 인간 서열의 마우스 오쏘로거스 유전자내 서열을, Ensembl 오쏘로거스 예측(유전자 이름을 기준으로 함)-이는 이들 유전자내 부위를 플랭킹하는 인간 유전자 쌍에 대한 오쏘로거스 마우스 유전자를 검색함-을 이용해 검색하였다.

SMAR Scan

은 인간 서열에 대해 조절되어, 마우스 게놈 서열을 가진 작은 “슈퍼”MARs를 산출하기 때문에, 이의 초기설정 컷오프 값은 S/MAR로 간주되는 일치 히트의 최소 크기에 대해 약간 이완되었다(300 bp 대신에 200 bp 사용). SMAR Scan

에 의한 이러한 마우스 서열의 분석에서는, 수개의 S/MARs가 다른 계산된 구조적 특성에 대해 높은 값을 가지는 것으로 예측하였다. 이러한 발견은 인간 MAR 엘리먼트가 종간에 보존되어 있음을 제시해 준다.

실시예 7: 닭 라이소자임 유전자 5'- MAR 의 절단( dissection )

3000개 염기쌍의 5'-MAR을 작은 단편으로 절단하여, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 형질전환 유전자 발현에 영향을 미치는지 모니터하였다. 이를 수행하기 위해, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 7개의 ~400bp 단편을 증폭하였다. 이들 PCR-증폭된 단편들은 말단-말단으로 위치시킬때 전체 MAR 서열과 일치하고 이를 커버하였다. 이들 각 단편의 4 카피를 헤드-테일 방향으로 연결하여, 천연 MAR 길이의 약 절반에 대응되는 길이를 얻었다. 테트라머를, pGL3Control 벡터(Promega)의 변형된 버젼인 pGEGFPControl에 있는 SV40 프로모터의 업스트림에 삽입하였다. 플라스미드 pGEGFPControl은 pEGFP-N1(Clontech)의 EGFP 유전자를 pGL3Control의 루시퍼라아제 유전자로 치환함으로써 얻었다. 제조된 5'-MAR-단편-포함 플라스미드는, 형질전환 시약으로서 LipofectAmine 2000(Invitrogen)을 이용해 CHO-DG44 세포에서 저항성 플라스미드 pSVneo와 함께 이전에 수행된 방법(Zahn-Zabal, M., et al., “Development of stable cell lines for production or regulated expression using matrix attachment regions” J Biotechnol, 2001. 87(1): p. 29-42.)으로 동시-형질전환시켰다. 항생제(G-418) 내성 세포를 선별하고 난 뒤, 폴리클로날 세포 군집을 EGFP 형광물질에 대해 FACS로 분석하였다.

형질전환 유전자 발현은, MAR 부재의 pGEGFPControl 벡터를 이용해 형질전환한 세포의 평균 형광도보다 4배 이상 높은 형광 레벨을 나타내는 세포로서 정의되는 고 발현자 세포의 백분위수로 표시하였다. 도 5는 원래 MAR 서열과 비교해 크기가 더 작음에도 불구하고, 멀티머화된 단편 B, K 및 F가 형질전환 유전자 발현을 증가시킴을 보여준다. 대조적으로, 다른 단편은 거의 활성이 없거나 완전히 불활성이었다.

실시예 8: MAR 컨텍스트에 있는 B, K 및 F 부위의 특이성

5'-MAR을 5'-말단(도 6, 상단) 또는 3'-말단(도 6, 하단) 각각으로부터 순차적으로 절단하였다. 절단된 엘리먼트의 영향은, 이전 섹션에서 기재한 바와 동일한 분석으로 모니터하였다. 도 6은 CHO 세포에서 형질전환 유전자 발현을 촉진시키는 능력의 상실이 고르게 분포하지 않음을 보여준다.

이 절단 분석에서, MAR 활성의 상실은 5'-MAR B-, K- 및 F-단편 각각과 오버랩하는 전이의 이산(discrete) 부위와 일치하였다. 5'-절단에서, 단편 K 및 F가 제거되었을때 활성이 거의 소실되었다. F 및 b 엘리먼트가 제거된 3' 절단은 가장 결정적인(pronounced) 효과를 나타내었다. 대조적으로, 플랭킹 부위 A, D, E 및 G는 그 자신에 대한 형질전환 유전자 발현을 촉진시키는 능력이 낮거나 없고(도 5), 이와 대응되어 5'- 및 3'-말단 절단 연구에서 MAR 활성에 대해 영향을 주지 않았다(도 6).

실시예 9: F 엘리먼트의 구조

465bp의 F 단편을 더 작은 부분(sub)-단편 234, 243 및 213 bp와 122, 125 및 121 bp 각각으로 추가로 절단하였다. 상기 전자(former) 그룹의 단편은 헤드-테일 방향으로 옥타머화(8 카피)하였고, 상기 후자(latter) 그룹의 단편은 유사하게 헥사-데카머화(16 카피)하여 MAR 서열의 길이를 일정하게 유지하게 하였다. 이들 엘리먼트들을 pGEGFPControl 벡터에 클로닝한 뒤, 상술한 바와 같이 CHO 세포에서 이들의 작용을 분석하였다. 흥미롭게도, 단편 FⅢ은 전장 F 단편의 활성을 대부분 유지하였으나, 단편 FⅢ의 오른쪽 부분을 포함하는 단편 FⅡ는 형질전환 유전자를 촉진시키는 능력을 대부분 상실하였다(도 7). 활성 부위에 대한 이 포인트는 FIB 단편에 있는 nt 132 내지 nt 221을 포함한다. 항상, 단편 FI 및 FIB의 복합 카피-이 부위를 포함함-는 유사한 활성을 나타내었다. 이 자체에 있는 FⅡA는 활성이 없다. 그러나, 이것이 FIB에 추가되어 FⅢ를 산출할 때에는, 전자의 활성을 증가시킨다. 따라서, FⅡA는 그 자체에서는 활성이 거의 없지만 FIB에 위치한 최소 도메인의 활성을 증가시키는 보조 서열(auxiliary sequence)을 포함하는 것으로 보인다.

라이소자임 유전자 5'-MAR 내에 있는 각 모티프의 분포 분석이, 본 출원인이 분석에 첨가시킨 일부 추가 모티프와 함께, 도 8A에 표시되어 있다. 이들 모티프의 대부분은 MAR 엘리먼트에 전체적으로 분포되지만, 활성 부분과 특이하게 결합하지는 않는 것으로 확인되었다. 예컨대, 전사 인자의 결합 자리 및 MAR과 결합한 다른 모티프들은 바람직하게는 활성 부위에 위치하지 않았다. 또한, 활성 MAR 서열이 다른 모티프의 조합을 포함할 수 있다는 사실도 제시되었다. 몇가지 컴퓨터 프로그램(MAR Finder, SMARTest, SIDD duplex stability)은, DNA 매트릭스와 결합하는 DNA의 부위로서 MARs를 동정하는 것으로 보고되었다. 이들은 일반적으로, MAR 활성을 포함하고, MAR Finder에 의해 실시되며, 현재 MAR Wiz로서 공지되어 있는 것으로 이전에 제안된, 서열-특이적 패턴의 전-정의된 시리즈를 사용하는 알고리즘을 기준으로 한다. 이러한 프로그램들의 출력은 cLysMAR의 전사적 활성 부위와 잘 연관되지 않았다. 예컨대, MAR Finder로 얻어진 활성 피크는 활성 MAR 부분-부위와 명확하게 매치하지 않았으며, 예컨대 B 단편은 인 비보에서 매우 활성이지만 스코어는 MAR Finder와는 역(negative)이었다(도 8B, 상단 및 중단 패널 비교). 이 프로그램에 의해 예측된 벤트 DNA 구조는 활성과도 연관되지 않았다(도 8B, 상단 및 중단 패널 비교). 다른 이용가능한 프로그램에서도 유사한 결과가 도출되었다(결과 미제시).

따라서, 이용가능한 MAR 예측 컴퓨터 방법에 의해 동정된 모티프는, 바람직하지 않게도, 유전자 발현을 증가시키는 cLysMAR의 활성의 주요한 결정인자가 된다. 따라서, 다른 컴퓨터 기술이 테스트되었다. 놀랍게도, 예측된 뉴클레오좀 결합 서열 및 뉴클레오좀 디스페이버링(disfavouring) 서열은, 활성 B, K 및 F 부위를 오버랩하는 뉴클레오좀 페이버링(favouring) 위치와 함께, MAR 상의 산재된 클러스터에 반복적으로 배열되어 있는 것으로 확인되었다. 뉴클레오좀 위치결정(positioning) 서열은 뉴클레오좀성 히스톤 주위를 쉽게 덮을 수 있지만 MAR 서열과 결합하지 않았던 DNA 스트레치(stretches)를 포함하는 것으로 제안되었다.

뉴클레오좀-페이버링 서열은, 적절히 반복된 서열을 포함하는 DNA 특성 및 굽은 히스톤 표면 상에서 정확하게 DNA를 결합시키고 방향조절을 할 수 있는 다른 물리-화학적 파라미터들의 수집에 의해 모형화될 수 있다. 이러한 많은 DNA 특성의 확인은 컴퓨터 작업화될 수 있으며, 38개까지의 이러한 다른 특성들이 추정의 뉴클레오좀 위치를 예측하는데 사용되었다. 따라서, 본 출원인은 뉴클레오좀 예측 프로그램의 특정 구성요소가 MAR 활성과 관련되는지를 확인하기 위해, 신규하고 게놈 서열로부터 가능한 더 잠재성이 있는 MARs를 동정할 수 있는 수단을 구성하기 위한 목적으로, 설정하였다.

DNA 1차 서열의 어떤 형상이 주변의 MAR 서열로부터 활성 B, K 및 F 부위를 구분할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 본 출원인은 MAR Scan

을 이용해 5'-MAR을 분석하였다. 38개의 뉴클레오좀성 어레이 예측 기술 중에서, 3개는 활성 MAR 부분-도메인의 위치와 연관되는 것으로 확인되었다(도 9A). MAR B, K 및 F 부위의 위치는 DNA 벤딩, 메이저 그루브 깊이 및 마이너 그루브 너비에 대한 최대값과 일치한다. 또한, 미약한 연관성이, GC 함량에 의해 결정된 것으로서 DNA 녹는점의 최소값에 표시된다. MAR F 단편에 대한 개량된 매핑에서는, 녹는점 최하점(valley) 및 DNA 벤딩 최고점(summit)이 MAR 최소 도메인을 포함하는 FIB 서브-단편에 실질적으로 대응됨을 나타내었다. 따라서, 활성 MAR 부분은 이 프로그램에 의해 굽은 DNA 부위로서 예측된 부위에 상응할 것이며, 본 출원인은 이들 부위들을 하기 텍스트에서 CUE-B, CUE-K 및 CUE-F로 지칭할 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 부위들이 실제 벤트 DNA 및 염기쌍 풀린 부위와 대응되는지 여부는 알려져 있지 않으며, 이들은 MAR Wiz에 의해 예측된 바와 같은 벤트 DNA에 대응되지 않았다(도 9B).

실시예 10: F 단편에 있는 다른 조절 엘리먼트의 각인( imprints )

뉴클레오좀 위치결정 특성은 게놈 DNA에 포함된 많은 특정 염색질 코드 중의 하나로 간주될 수 있다. 비록 이런 특정 코드가 F 부위의 활성에 제공되더라도, 이는 아마도 MAR 활성만을 결정하지는 않으며, F 부위의 3' 부분은 FIB 부분에 포함된 최소 MAR 도메인의 증가된 활성을 갖는다. MatInspector 프로그램(Genomatrix)을 이용하여, 본 출원인은 스코어가 0.92 이상인 전사 인자 결합 자리에 대해 조사하였으며, F 단편의 3' 부분에 있는 NMP4 및 MEF2 단백질에 대한 DNA 결합 서열을 확인하였다(도 8B). 이들 전사 인자-결합 자리 모두가 B 및 K 활성 부위와 근접하여 위치하는지를 확인하기 위해, 전체 5'-MAR 서열을 NMP4 및 MEF2 그리고 단일-가닥 또는 이중-가닥 BURs에 결합하는 것으로 보고된 단백질에 의한 결합에 대해 분석하였다. 이들 중에서, SATB1(special AT-rich binding protein 1)은 근처 유전자의 발현을 활성화하거나 억제시킬 수 있는 DNA-결합 전사 인자의 군에 속한다. 본 연구에서는 SATB1, NMP4(nuclear matrix protein 4) 및 MEF2(myogenic enhancer factor 2)와 같은 특정 단백질이, 특이 분포를 갖고 cLysMAR의 최소 MAR 도메인 주위에서 프레임워크를 형성함을 나타내어 준다(도 10). 이들 NMP4 및 SATB1 결합 자리의 일부의 발생도를, 정제된 재조합 단백질의 EMSA 분석으로 실험적으로 확인하였다(결과 미제시).

실시예 11: 정의된 유전 엘리먼트의 결합에 의한 인공 MARs 의 컨스트럭션

다양한 MAR 구성성분의 상대적 역할을 추가로 검증하기 위해, cLysMAR을 CUE 부위 3군데에서 모두 절단하였으며(도 11, 중단 부분), 이에 의해 대조군으로서 이의 모든 구성성분과 유사하게 조합된 완전한 MAR 서열과 비교했을때 이의 활성의 일부가 소실되는 결과를 유발하였다(도 11, 상단 부분). 항상, 각 CUE 단독의 1개 카피 또는 헤드-테일로 조립된 3개 CUEs 각각의 1개 카피는, 플랭킹 서열의 부재하에서 거의 활성을 나타내지 않았다. 이 결과들은 최적의 전사적 활성이 CUEs와 플랭킹 서열의 조합을 필요로 한다는 결론을 강화시킨다. 흥미롭게도, 완전한 MAR 서열이 이들 구성성분 각각으로부터 생성되었으나, 각 DNA 단편을 조립하는데 사용되는 BglII-BamHI 링커 서열(AGATCC)도 포함하였으며, 이러한 분석 시리즈에 있는 원래의 MAR 엘리먼트에 대해 4.8배로 표시되는 것과 비교하여 높은 전사적 활성(6배 활성)을 나타내었다(참조 도 5).

다음으로, 본 출원인은 굽은 DNA 부위가 이의 천연 MAR 컨텍스트에서 확인되는 것과는 차이나는 환경에서 잠재적으로 활성화될 수 있는지 여부를 조사하였다. 따라서, 본 출원인은 플랭킹 서열을 변화되지 않은 상태로 유지하면서, CUE-F, CUE-B 및 CUE-K 엘리먼트를 교환(swap)하도록 설정하였다. CUE-F 엘리먼트를 플랭킹하는 서열들을 PCR로 증폭하고, 그의 원래 방향과 거리를 유지하면서, 다양한 CUEs를 브래킷(bracket) 하도록 또는 CUE를 포함하지 않도록 조립시켰다. 그 후, 이들 조작된 ~1.8 kb MARs를, 형질전환 유전자 발현을 향상시키는 능력에 대해 상술한 바와 같이 분석하였다. 모든 3개의 CUE는 이 컨텍스트에서 활성이었고, 이에 의해 이들의 활성은 주어진 플랭킹 서열의 세트에 제한되지 않았다. 흥미롭게도, CUE-K 엘리먼트는, CUE-F 플랭킹 서열 사이에 삽입될 때, CUE-F보다 훨씬 활성이 높았고, 컨스트럭트를 구성하는 전자(former)는 완전한 천연 MAR(4.8배 활성)에서 관찰된 것 만큼 활성이 높았다. CUE-F 및 CUE-B로부터 CUE-K를 구분하는 것은, 그의 CUE 특성에 추가로, MEF-2 및 SatB1 단백질에 대한 오버랩 결합 자리의 존재이다. 따라서, CUE-B를 CUE-F-플랭킹 도메인과 결합시킴으로써, 모든 3개 결합 자리-증가된 활성을 설명할 수 있는-에서 더 높은 밀도를 나타내었다. 이 결과들은 NMP4, MEF-2, SatB1 및/또는 polyPpolyQ 단백질과 같은 단백질에 대한 결합 자리를 포함하는 서열을 이용한 CUEs의 조립이, 잠재적 인공 MAR 서열을 포함함을 나타내어 준다.

실시예 12: 발현 벡터

본 발명에 따른 3개의 발현 벡터가 도 12에 표시되어 있다.

플라스미드 pPAG01은 5640 bp의 pUC19 치환체이다. 이는 BamHI 및 XbaI 제한효소 위치에 클로닝된 2960 bp의 닭 DNA 단편을 포함한다. 이 인서트는 닭 라이소자임 위치(locus)의 5'-말단의 연변부(border)로부터 도출된 것이며 A/T-함량이 높다.

플라스미드 pGEGFP(또한 pSV40EGFP로도 불림) 대조군은 pGL3-control 벡터(Promega)의 치환체이며, 여기서 루시퍼라아제 유전자 서열이 pGEFP-N1 벡터(Clontech)로부터의 EGFP 유전자 서열에 의해 치환되어 있다. pGEGFP 플라스미드의 크기는 4334 bp이다.

플라스미드 pUbCEGFP 대조군은 pGL3의 치환체이며, 유비퀴틴 프로모터를 가지고 있다.

플라스미드 pPAG01GFP(또한 pMAR-SV40EGFP로도 불림)는 pGEGFP의 치환체이며, SV40 프로모터의 업스트림에 바로 위치하는 MCS에 클로닝된 5'-Lys MAR 엘리먼트를 가지고 있다. pPAG01EGF 플라스미드의 크기는 7285 bp이다.

실시예 13: 형질전환 유전자 발현에 대한 1차 형질전환 세포의 추가 형질전환의 효 과

형질전환시키기 하루 전에, 세포들을 성장 배지가 들어있는 24-웰 플레이트에서 CHO-DG44 세포에 대해 1.35×10⁵ 세포/웰 농도로 평판배양하였다. 접종후 16시간에, 세포가 30-40%의 밀집도에 도달할 때, Lipofect-AMINE 2000(이하 LF2000이라 약칭함)을 사용하여, 제조사의 방침(Invitrogen)에 따라 세포를 형질전환시켰다. 1.4 ㎕의 LF2000을 포함하는 무혈청 배지(Opti-MEM; Invitrogen) 27 마이크로리터를 830 ng의 선형 플라스미드 DNA를 포함하는 Opti-MEM 배지 27 ㎕와 혼합하였다. 항생제 선별 플라스미드 (pSVneo)의 양은 GFP 형질전환 유전자를 함유하는 리포터 플라스미드의 10분의 1이 되게 하였다. 이 믹스(mix)를 실온에서 20분 동안 배양하여, DNA-LF2000 복합체가 형성되도록 놓아두었다. 상기 혼합물을 300 ㎕의 Opti-MEM으로 희석하여 미리 비워둔 세포-포함 웰에 부었다. 세포를 DNA 믹스와 3시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양하고 난 뒤, 1 ㎖의 DMEM-기초 배지를 각 웰에 첨가하였다. 그리고 난뒤, 상기 세포들을 24시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 추가로 배양하였다. 그 후, 상기 세포들을 상술한 방법에 따라-내성 플라스미드는 다른 저항 유전자(pSVpuro)를 포함하는 것을 제외함- 2번째 형질전환시켰다. 2번째 형질전환 24시간 후에 세포들을, 500 ㎍/㎖ G-418 및 5 ㎍/㎖ 퓨로마이신이 첨가된 선별 배지를 포함하는 T-75 플라스크로 넓혀서 계대배양하였다. 2주의 선별기간 후에, 안정하게 형질전환된 세포들을 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 선택적으로, 세포 군집들을 동일한 방법으로 다시 형질전환시켰으며, 이때 pTKhygro(clontech) 및 pSVdhfr을 내성 플라스미드로 사용하였다. GFP의 발현을 FACS(Fluorescence-activated cell sorter)와 플루오로스캔(Fluoroscan)을 사용해 분석하였다.

도 13은 2회-형질전환된 세포(이하 2차 형질전환체라 약칭함)의 표현형을 나타내는데, 이들은 강하게 색을 나타냄으로써 GFP 단백질로부터 녹색을 시각화하는데 특정 벌브(bulb) 및 필터가 필요하지 않을 뿐만 아니라 모체 군집(중간 히스토그램)과 비교될 정도의 생산 세포(아래 오른쪽 부분 FACS 히스토그램)를 주로 포함하고 있었다. 특정 세포 생산도에 대응되는 형광의 레벨은 매일 세포 당 10 pg 이상이었다. 대신에, 마커 단백질을 발현하지 않는 단지 1회 형질전환된 세포(1차 형질전환체)는 재-형질전환된 후에 세포 군집으로부터 거의 부재하였다. GFP 형광이 10¹ 유니트 이하인 막대는 중간 히스토그램에서 30%를 차지하고 오른쪽 히스토그램에서는 5% 이하를 차지하였다. 이는 추가의 세포가 형질전환되어 GFP를 성공적으로 발현함을 제시하여 준다.

특히, 재-형질전환된 세포에 의해 나타나는 형광의 양은, DNA가 2회 삽입된 세포의 서브군집이 예상했던 것보다 2배 이상 많이 GFP를 발현함을 제시해 준다. 대신에, 표 2에 제시된 결과에서는, 2차 형질전환체가 2 세트의 서열이 삽입된 것으로 가정하여 예측한 것보다 평균 2배 이상의 GFP 증가를 나타냄을 보여주며, 각각의 연속적인 형질전환에서 1개는 독립적으로 삽입되어 유사한 효율을 나타낼 것이다. 흥미롭게도, 이는 바이러스 및 세포 프로모터-포함 벡터 모두와 같이 리포터 유전자를 드라이브하는 프로모터 서열에 의존하지 않으며 유사한 GFP 향상을 가져왔다(레인 1 및 2 비교). 그러나, MAR이 없는 플라스미드(레인 3)와 비교했을때 MAR-포함 벡터에서는 두드러진 효과가 나타났으며, 여기서 상기 2회 연속 형질전환은 2번의 다른 실험에서, 5.3배 및 4.6배의 발현 증가를 나타내었다.

GFP 발현 상에서의 1차 형질전환체의 24시간 간격의 재-형질전환 효과

플라스미드 타입	1차 형질전환	2차 형질전환	EGFP 형광 증가 배수
pUbCEGFP	4'992	14'334	2.8
pSV40EGFP	4'324	1227	2.8
pMAR-SV40EGFP	6'996	36'748	5.3
플라스미드 타입	1차 형질전환	2차 형질전환	EGFP 형광 증가 배수
pUbCEGFP	6'452	15'794	2.5
pSV40EGFP	4'433	11'735	2.6
pMAR-SV40EGFP	8'116	37'475	4.6

2개의 독립적인 실험이 제시되어 있다. 내성 플라스미드 pSVneo를 다양한 GFP 발현 벡터로 동시-형질전환시켰다. 형질전환 1일 후에, 내성 플라스미드를 pSVpuro로 바꾸는 것을 제외하고는 동일한 플라스미드를 사용하여 세포를 재-형질전환시켰다. 상기 2개의 내성 유전자를 가지는 세포들을 500 ㎍/㎖ G-418 및 5 ㎍/㎖ 퓨로마이신에서 선별하고, 리포터 유전자 마커의 발현을 Fluoroscan으로 정량하였다. 배수 증가는, 상응하는 개별 형질전환체로부터 수득된 형광의 합과 비교한 2개의 연속 형질전환체로부터 수득한 형광의 비와 대응하였다. 유의적으로 높은 것으로 판단된 배수 증가를 진하게 표시하였고, 이는 개별 형질전환체로부터 수득한 값들의 합에 비해 2배 이상 높게 지속되는 형광 값과 대응된다.

중복(multiply) 형질전환된 세포에서의 GFP 발현 레벨의 증가는 현재의 지식으로부터 예측되지 않았으며, 이러한 효과는 이전에 관찰되지 않은 것이었다.

이와 함께, 본원에 제시된 데이터는, 숙주 게놈으로 첫번째 삽입된 플라스미드 서열이 두번째 플라스미드 분자의 삽입 세트로 동형 재조합시킴으로써 다른 플라스미드의 삽입을 촉진시킬 수 있다는 아이디어를 뒷받침한다. 플라스미드 재조합은 플라스미드 DNA가 핵에 도달하고 난 뒤 1시간 간격 내에 일어나며, 배양된 포유동물 세포에 있는 동시-주입된 플라스미드 분자 사이의 동형 재조합의 빈도는 다수의 플라스미드 카피의 삽입을 설명하는, 어프로칭 유니티(approaching unity)(Folger, K.R., K. Thomas, and M.R. Capecchi, Nonreciprocal exchanges of information between DNA duplexes coinjected into mammalian cell nuclei. Mol Cell Biol, 1985. 5(1): p. 59-69]가 매우 높게 나타나는 것으로 나타났다. 그러나, 새롭게 도입된 DNA 간의 동형 재조합 및 이의 염색체 호몰로그는, 10³ 세포 당 1개의 빈도로 DNA를 받아들여 일반적으로 매우 드물게 나타난다[ Thomas, K.R., K.R. Folger, and M.R. Capecchi, High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Cell, 1986. 44(3): p. 419-28.]. 따라서, 이 결과는 MAR 엘리먼트가 놀랍게도 이러한 재조합 이벤트를 촉진시키는 역할을 함을 나타내어 줄 수 있다. MARs는 인 비보에서 유전자의 조직화를 변형시키고 또한 바이러스 DNA 서열과 결합하여 DNA 복제를 가능하게 할 뿐만 아니라, DNA 재조합 신호로서도 작용할 수 있을 것이다.

실시예 14: MARs 는 복합적으로 형질전환된 세포에서 예측할 수 없을 정도로 높은 레벨의 발현을 유도한다

본 출원인은 만약 MAR-유도된 재조합 이벤트가 복합 형질전환 단계에서 일어나는 경우, 제1 및 제2 플라스미드 DNA 사이의 상승효과가, 1단계 또는 2단계의 형질전환 단계에서 MAR 엘리먼트의 존재에 의해 영향을 받을 수 있다고 예측한다. 본 출원인은 이전에 상술한 방법을 이용해, pMAR 단독 또는 다양한 발현 플라스미드와 조합하여 세포에 여러번 형질전환시킴으로써, 이러한 가능성을 실험하였다. 표 3에서는 pMAR-SV40EGFP 플라스미드를 이용해 세포를 2회 형질전환시키면, GFP의 가장 높은 발현 및 모든 조건의 가장 높은 정도의 향상(4.3배)을 유발함을 제시한다. 대조적으로, MAR이 없이 벡터를 2회 형질전환하면 2배 증가로 예측한 것 대신에, 2.8배로 매우 낮거나 거의 향상시키지 않는다. 본 출원인은 각 형질전환 단계에서의 MAR 엘리먼트의 존재가 최대 단백질 합성에 도달하는데 필요하다고 결론지었다.

1차 형질전환		2차 형질전환
플라스미드 타입	EGFP-형광	플라스미드 타입	EGFP-형광	증가 배수
pMAR	0	pMAR pSV40EGFP pMAR-SV40EGFP	0 15'437 30'488	0 2.3-2.5 2.6-2.7
pMAR-SV40EGFP	11'278	pMAR-SV40EGFP pMAR	47'027 12'319	4.3-5.3 1.0-1.1
pSV40EGFP	6'114	pSV40EGFP pMAR	17'200 11'169	2.8 1.8-2.3

흥미롭게도, 세포가 pMAR 단독으로 1차 형질전환되고, 그 후 pSV40EGFP 또는 pMAR-SV40EGFP로 재-형질전환되면, 이의 GFP 레벨은 후자(later) 플라스미드의 단일 형질전환으로부터 도출된 결과와 비교해 2배 이상 높았다(각각 2.5 및 2.7배임, 1배로 예측된 대신에). 이는 이전의 MAR의 형질전환이 2차 형질전환 단계에서 사용된 플라스미드의 발현을 증가시킬 수 있음을 보여준다. 왜냐하면 MARs가 염색질 구조 및 유전자 발현에서 국소적으로 작용하기 때문이며, 이는 2가지 타입의 DNA가유사한 염색체 위치에 삽입될 수 있다는 사실을 포함한다. 대조적으로, GFP 발현 벡터 단독으로 형질전환하고, 그 다음에 MAR 엘리먼트를 2번째 단계에서 형질전환하면, GFP 레벨이 거의 향상되지 않거나 또는 미약하게 향상된다. 이는 플라스미드 형질전환의 순서가 중요하고, 형질전환 유전자 발현을 유의적으로 높게 하기 위해서는 1차 형질전환 이벤트가 MAR 엘리먼트를 포함해야 한다는 사실을 보여준다.

만약, MAR 엘리먼트가 1차 및 2차 형질전환 단계로부터의 에피좀 형태에 잔존하는 플라스미드를 동형 재조합하고, 1개의 염색체 위치에서 동시-삽입하는데 유리하다면, 플라스미드 형질전환의 순서가 GFP 레벨에 영향을 주지 않음을 예측할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 발견은, 두번째 형질전환 단계 보다는 첫번째 단계에서 MAR 엘리먼트를 형질전환하는 것이 더 유리하다는 것을 나타내어 준다. 이는 다음과 같은 분자 메커니즘을 제시한다: 1차 형질전환 단계동안, MAR 엘리먼트는 세포 염색체 내에 최소 일부분으로 연쇄체화(concatemerize) 및 삽입될 수 있다. 이 삽입된 MAR DNA는 2차 형질전환 단계 동안, 동일 또는 근처의 염색체 위치에, 더 많은 플라스미드의 추가 삽입을 유리하게 한다.

실시예 15: 장기간의 DNA 전달 촉진자(facilitators)로서의 MARs

만약 삽입된 MARs가 영구적인 재조합-허용 염색체 구조를 유도한다면, 일시적으로 도입된 에피좀 DNA의 대부분이 제거되는 시점에 높은 레벨의 발현을 유도할 수 있음-심지어 2차 형질전환이 1차보다 장시간 뒤에 수행되더라도-을 예측할 수 있을 것이다. 이러한 가능성을 검토하기 위해, 3주 동안 항생제 내성에 대해 선별한 표 3으로부터의 세포를, 다시 1회 또는 2회 형질전환하였으며 추가의 DNA 저항성 마커의 삽입에 대해 선별하였다. pMAR 또는 pMAR-SV40EGFP의 조합으로 3차, 또는 3차 및 4차 형질전환 사이클을 수행하였으며, 이전과 같이 GFP 발현에 대해 분석하였다.

DNA 삽입의 촉진자로서 작용하는 MARs

3차 형질전환			4차 형질전환
플라스미드 타입	EGFP-형광	증가 배수	플라스미드 타입	EGFP-형광	증가 배수
pMAR	18368	2.2	pMAR pMAR-SV40EGFP	43'186 140'000	2.4 7.6
pMAR-SV40EGFP	16544	2.0	pMAR-SV40EGFP pMAR	91'000 33'814	5.5 2.0

pMAR-SV40EGFP/pMAR-SV40EGFP 2차 형질전환체는 선별 과정의 말기에 3차 형질전환 사이클에 사용하였다. pMAR 또는 pMAR-SV40EGFP를 이용하고 선별 플라스미드로서 pTKhygro를 이용하여 3차 형질전환을 수행하여 3차 형질전환체를 제조하였다. 24시간 후에, 다른 플라스미드 pSVdhfr로 다시 세포를 형질전환하였으며, 500 ㎍/㎖ G-418 및 5 ㎍/㎖ 퓨로마이신, 300 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B 및 5μM 메토트렉세이트(methotrexate)를 포함하는 성장 배지에서 선별된 4차 형질전환체가 제조되었다. 상기 2차 형질전환체는 처음에 GFP 형광이 8300으로 나타났다. 배수 증가는, 상응하는 개별 형질전환으로부터 수득한 형광의 합과 비교하여 2개의 연속 형질전환으로부터 수득한 형광의 비율과 일치한다. 유의적으로 더 높다고 판단된 배수 증가는 진하게 표시되어 있으며, 이는 개별 형질전환으로부터 수득한 이들의 부가보다 2배 높은 형광 값과 일치한다.

이러한 결과들은 더 많은 카피의 pMAR 또는 pMAR-SV40EGFP의 로딩이 전체 세포 형광에서 유사하게 2배 증가하는 결과를 나타냄을 보여준다. 4차 형질전환에 더 많은 MAR을 로딩하면 그의 활성을 추가로 2.4배 더 향상시킨다. 이는 새롭게 도입된 MAR 서열이 동형 재조합에 의해 염색체 형질전환 유전자 위치에 삽입될 수 있으며, 이에 의해 추가로 형질전환 유전자 발현을 증가시킬 수 있다는 본 출원인의 가설과 동일하다.

세포가 pMAR-SV40EGFP 플라스미드로 3번째 및 4번째 형질전환되면, GFP 활성이 추가로 증가하고, 개별 형질전환으로부터 수득한 형광 레벨의 부가로부터 예측되지 않는 레벨까지 다시 한번 증가한다. GFP 발현은, 일광에서 눈에 보일 정도로 세포에서 녹색으로 빛을 내는 레벨에 도달하였다(도 14). 또한, 이러한 결과는 4차 형질전환의 효율이 3번째 DNA 전달의 효율로부터 예측한 것보다 훨씬 높고, 형질전환 사이의 적절한 타이밍이-4주 동안의 기간 동안 1일이 바람직함- 최적의 유전자 발현 증가를 얻는데 있어서 필수적임을 추가로 나타내어 준다. 본 출원인은 MAR 엘리먼트가, 히스톤 아세틸화의 국지적 증가를 유도함으로써 닫힌 염색질 구조를 풀어지게함으로써, 염색체 삽입의 위치에서 재조합 빈도를 증가시키는 2차 삽입 이벤트에 유리하다고 믿는다(Yasui, D., et al., SATB1 targets chromatin remodelling to regulate genes over long distances. Nature, 2002. 419(6907): p. 641-5.). 선택적으로 또는 부수적으로, 근처의 유전자를 서브핵 위치로 잠재적으로 위치를 바꾸는 MARs는, 토포아이소머라아제(topoisomerase)와 같이 재조합 이벤트에 관여할 수 있는 단백질을 포함하는, 트랜스-작용 인자에 풍부한 것으로 생각된다. 이러한 결과는 MAR 서열이 pSV40EGFP 반복을 브래킷(bracket)할 수 있고, 염색질-유도된 사일런싱(silencing) 효과로부터 형질전환 유전자를 효과적으로 보호할 수 있는 위치에서 도출될 수 있다.

실시예 16: SMAR Scan

II 로 동정된 MARs 의 재조합 단백질의 발현을 증가시키는데 있어서의 용도

SMAR Scan

또는 혼합 방법을 이용해 인간 게놈 서열 전체를 분석하여 얻은 서열로부터 4개의 MAR 엘리먼트들을 무작위로 선별하였다. 이들을 1_6, 1_42, 1_68,(여기서 첫번째 숫자는 서열이 유래된 염색체를 나타내며, 두번째 숫자는 이 염색체를 따라 예측된 MAR에 대해 특이적이다) 및 염색체 상에서 동정된 “슈퍼” MAR인 X_S29로 명명하였다. 이들 예측된 MARs를 pGEGFPControl 벡터의 SV40 프로모터 업스트림과 녹색 형광 단백질의 발현을 유도하는 인핸서에 삽입하였으며, 이들 플라스미드들을 배양된 CHO 세포에 이전에 기재된 방법으로 형질전환하였다(Zahn-Zabal, M., et al., Development of stable cell lines for production or regulated expression using matrix attachment regions . J Biotechnol, 2001. 87(1): p. 29-42). 그리고 난 후, 형질전환 유전자의 발현은, 형광 세포 분류기(FACS)를 이용하여 안정하게 형질전환된 세포의 전체 군집에서 분석하였다. 도 19에서 보는 바와 같이, 이렇게 새롭게 동정된 MARs 모두는, 닭 라이소자임 MAR에 의해 유도된 발현보다 상당히 높도록 형질전환 유전자의 발현이 증가하였으며, “슈퍼” MAR X_S29는 새롭게 동정된 모든 MARs 중에서 가장 유력한 것이 된다.

실시예 17: 인간 MAR (1-68)가 있거나 없는 네트워크 시스템의 일렉트로트랜스퍼에 의한 인 비보 mEPO 발현이 적혈구 용적율에 미치는 영향

치료학적 유전자는 백혈병의 치료에 사용되는 호르몬인 EPO(에리스로포이에틴)를 인코딩한다. EPO 유전자는 독시사이클린 유도성 프로모터의 조절하에 위치하며, 이 유전자에 있는 이전에 기술한 스위치 시스템은 다음부터 네트워크 시스템이라 부른다(Imhof, M. O., Chatellard, P., and Mermod, N. (2000)). 상기 EPO 및 조절 유전자를, 일렉트로트랜스퍼(electrotransfer)로 지칭되는 인 비보 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 마우스의 근육에 주입함으로써, 이 유전자들이 근육 섬유의 핵에 전달되게 하였다. 데옥시사이클린 항생제-이 물질은 EPO의 발현을 유도하는 것으로 예측됨-가 생쥐의 식수에 첨가되면, 이는 높은 수준의 순환하는 EPO에 의해 유도되는 적혈구 계수의 증가로 인해, 적혈구 용적율 레벨의 상승을 유도할 수 있을 것이다. 그러므로, MAR이 EPO의 발현을 증가시키면, 높은 레벨의 적혈구 용적율이 예측될 것이다.

5주령의 C57BL6 암컷 생쥐(Iffa Credo-Charles River, France)에서 인 비보 실험을 수행하였다. 정상 생리 식염수에 녹아있는 30 ㎍의 플라스미드 DNA를 경골 전방 근육에 피부투과 주입하여 전달시켰다. 모든 주입은 케타미놀(Ketaminol)(75 ㎎/㎏) 및 나르콕실(Narcoxyl)(10 ㎎/㎏) 마취하에서 수행하였다. 근육내 DNA 주입 후에, 근육에 전기장을 주었다. 200 V/cm의 전압을 1Hz에서 8 ms 펄스로 주었다(Bettan M, Darteil R, Caillaud JM, Soubrier F, Delaere P, Branelec D, Mahfoudi A, Duverger N, Scherman D. 2000. “High-level protein secretion into blood circulation after electric pulse-mediated gene transfer into skeletal muscle” Mol Ther . 2: 204-10).

16 마리의 마우스에 1_68 MAR이 없이 EPO를 발현하는 네트워크 시스템을 주입하였으며, 나머지 16 마리의 마우스에는 5'의 프로모터/인핸서 서열이 활성자(activator) 및 EPO 유전자의 발현을 드라이브하는 MAR을 포함하는 네트워크 시스템을 주입하였다. 각 그룹에서, 마우스의 절반에는 실험 시작(0일-일렉트로트랜스퍼한 날)부터 식수에 독시사이클린을 포함하도록 하였으며, 나머지 절반에는 21일째부터 시작하여 독시사이클린을 투여하였다.

플라스미드를 주입하고 난 뒤 다양한 시간에 헤파린 처리된 모세관을 이용해 역-안와(retro-orbital) 펀치로 혈액 샘플을 수집하였다. 모세관을 실온에서 5000 rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하고, 혈액 세포의 부피 분획을 전체 혈액 부피에 비교하여 분석하였으며, 백분위수로 표시하여 적혈구 용적율을 결정하였다.

도 16에서 보는 바와 같이, MAR-네트워크를 주입한 마우스 그룹-실험의 시작부터 유도됨-은 MAR이 없이 원래 네트워크를 주입한 마우스와 비교하여 적혈구 용적율이 훨신 유도되는 것으로 나타났다. 2달 후에, “MAR-포함 그룹”에서의 적혈구 용적율은 정상 적혈구 용적율(45-55%)에 비해 여전히 높은 값(65%)을 유지하였다.

더욱 중요하게는, 늦은(late) 유도(21일)가 MAR의 존재에서만 가능하고, 네트워크가 MAR이 없이 주입된 생쥐에서는 가능하지 않았다. 따라서, MAR은 사일런싱으로부터 형질전환 유전자를 보호하는 경향이 있으며, 비-유도 조건에 있는 지연(prolong) 기간 이후에도 그의 발현의 유도를 가능하게 한다.

전체적으로, MAR 엘리먼트는, 적혈구 용적율에 대한 그의 증가된 물리적 영향으로부터 검출된 치료학적 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

단백질 생산 증가 활성을 갖는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서,
상기 DNA 서열은
a) 1 이상의 벤트(bent) DNA 엘리먼트, 및
b) 1 이상의 DNA 결합 단백질에 대한 결합 자리를 포함하고,
그리고 상기 DNA 서열은 서열번호 27의 서열 및 상기 서열의 상보적 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 MAR 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 상기 벤트 DNA 엘리먼트는 100개의 인접 염기쌍 스트레치(stretch) 상에서 10% 이상의 디뉴클레오티드 TA, 또는 12% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
제 2 항에 있어서, 상기 벤트 DNA 엘리먼트는 100개의 인접 염기쌍 스트레치 상에서 33% 이상의 디뉴클레오티드 TA, 또는 33% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 전사 인자인 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
제 4 항에 있어서, 상기 전사 인자는 polyQpolyP 도메인 단백질을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
제 4 항에 있어서, 상기 전사 인자는 SATB1, NMP4, MEF2, S8, DLX1, FREAC7, BRN2, GATA 1/3, TATA, Bright, MSX, AP1, C/EBP, CREBP1, FOX, Freac7, HFH1, HNF3alpha, Nkx25, POU3F2, Pit1, TTF1, XFD1, AR, C/EBPgamma, Cdc5, FOXD3, HFH3, HNF3 beta, MRF2, Oct1, POU6F1, SRF, V$MTATA_B, XFD2, Bach2, CDP CR3, Cdx2, FOXJ2, HFL, HP1, Myc, PBX, Pax3, TEF, VBP, XFD3, Brn2, COMP1, Evil, FOXP3, GATA4, HFN1, Lhx3, NKX3A, POU1F1, Pax6, TFIIA, Vmw65 및 2개 이상의 이들 전사 인자의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 이용하여 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법으로서,
상기 정제 및 분리된 DNA서열은 제1의 분리된 매트릭스 부착 부위(matrix attachment region, MAR) 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 매트릭스 부착 부위 뉴클레오티드 서열은
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 정제 및 분리된 DNA 서열,
- 서열번호 27의 서열 및 상기 서열의 상보적 서열을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 정제 및 분리된 DNA 서열은 목표 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 이용하여 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법으로서,
상기 정제 및 분리된 DNA서열은 제1의 분리된 매트릭스 부착 부위(matrix attachment region, MAR) 뉴클레오티드 서열 및 최소한의 제2의 분리된 매트릭스 부착 부위(MAR) 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 제1의 분리된 매트릭스 부착 부위 뉴클레오티드 서열 및 최소한의 제2의 분리된 매트릭스 부착 부위 뉴클레오티드 서열은 각각
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 정제 및 분리된 DNA 서열,
- 서열번호 27의 서열 및 상기 서열의 상보적 서열을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 제1의 MAR 서열 및 최소한의 제2의 MAR 서열은 프로모터 및 목표 유전자를 포함하는 서열의 5' 및 3' 말단 모두에 위치하는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 제1의 MAR 서열 또는 최소한의 제2의 MAR 서열은 프로모터 및 목표 유전자를 포함하는 서열과 다른 서열상에 위치하는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 정제 및 분리된 DNA 서열은 벡터로서 선형 DNA 서열의 형태인 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
진핵 숙주 세포의 형질전환 방법에 있어서,
a) 1 이상의 목표 DNA 서열, 또는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트로 구성되는 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열을 포함하는, 1 이상의 정제된 DNA 서열을 상기 진핵 숙주 세포에 도입하는 단계,
b) 상기 형질전환된 진핵 숙주 세포에, 1 이상의 목표 DNA 서열을 포함하는 1 이상의 정제된 DNA 서열 또는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트로 구성되는 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열을, 정해진 시간 내에, 1 이상의 추가 형질도입 단계를 수행하는 단계, 및
c) 상기 형질전환된 진핵 숙주 세포를 선별하는 단계를 포함하고,
상기 MAR 뉴클레오티드 서열은 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법:
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 정제 및 분리된 DNA 서열,
- 서열번호 27의 서열 및 상기 서열의 상보적 서열.
제 13 항에 있어서, 상기 정해진 시간은 세포분열 사이클과 관련된 간격(interval)에 상응하는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 정해진 시간은 숙주 세포가 제2(a second) 세포 분열 사이클에 진입하는 순간인 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법.
1 이상의 목표 DNA 서열을 포함하는 제1의 정제 및 분리된 1 이상의 DNA 서열, 및
하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 1 이상의 MAR 뉴클레오티드를 포함하는 제2의 정제 및 분리된 DNA 서열을 진핵 숙주 세포에 동시형질전환(co-transfecting)시키는 단계를 포함하는, 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법:
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 정제 및 분리된 DNA 서열,
- 서열번호 27의 서열 및 상기 서열의 상보적 서열.
a) 제 13 항에 따라 형질전환된 진핵 숙주 세포를, 상기 목표 DNA와 관련된 단백질 발현을 위한 조건 하의 배양 배지에서 배양하고, 그리고
b) 상기 단백질을 회수하는 것
을 특징으로 하는 단백질의 생산 방법.
a) 제 16 항에 따라 형질전환된 진핵 숙주 세포를, 상기 목표 DNA와 관련된 단백질 발현을 위한 조건 하의 배양 배지에서 배양하고, 그리고
b) 상기 단백질을 회수하는 것
을 특징으로 하는 단백질의 생산 방법.
제 13 항에 따라 형질전환된 진핵 숙주 세포.
제 16 항에 따라 형질전환된 진핵 숙주 세포.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 1 이상의 정제 및 분리된 DNA 서열을 포함하는, 세포 형질전환 혼합물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 1 이상의 DNA 서열이 최소한 일부 세포에 안정적으로 삽입된 것을 특징으로 하는 비 인간 형질전환 생물체.