KR101222025B1

KR101222025B1 - Ｍａｒ 서열의 복합 트랜스펙션 방법에 의한 포유동물세포에서의 고효율 유전자 전달 및 발현

Info

Publication number: KR101222025B1
Application number: KR1020067006395A
Authority: KR
Inventors: 니콜라스 메르모드; 삐에르 알랭 기로드; 필립 뷔체르; 두크-쾅 뉴옌; 다비드 칼라브레세; 다미엥 소기; 스테파니아 푸티니
Original assignee: 셀렉시스 에스. 에이.
Priority date: 2003-10-24
Filing date: 2004-10-22
Publication date: 2013-01-15
Also published as: EP1959011A2; CN1863913B; HK1149777A1; JP5396653B2; KR101230838B1; PL2287302T3; KR20110112883A; KR101229989B1; IL198863A; CN1863913A; US20130143264A1; PL1959011T3; RU2006117757A; ATE551420T1; HK1120549A1; US9879297B2; US20070178469A1; HK1151825A1; IN2014DN02484A; AU2004284220A1

Abstract

본 발명은 단백질 생산 증가 활성을 갖는 분리 및 정제된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키기 위한 매트릭스 부착 부위(MARs)의 용도에 관한 것이다. 또한, 상기 활성 부위, 특히 MAR 뉴클레오티드 서열의 동정 방법 및 신규한 복합 형질전환 방법에서 특성화된 활성 MAR 서열의 용도가 개시되어 있다.

Description

ＭＡＲ 서열의 복합 트랜스펙션 방법에 의한 포유동물 세포에서의 고효율 유전자 전달 및 발현{High efficiency gene transfer and expression in mammalian cells by a multiple transfection procedure of MAR sequences}

본 발명은 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 진핵 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키기 위한 매트릭스 부착 부위(MARs)의 용도에 관한 것이다. 또한, 상기 활성 부위, 구체적으로는 MAR 뉴클레오티드 서열의 동정 방법 및 신규 복합 형질전환 방법에서의 이러한 활성 MAR 서열의 용도가 개시되어 있다.

현재는, 진핵 염색체의 루프 도메인 조직화 모델이 잘 받아들여지고 있다 (Boulikas T, “Nature of DNA sequences at the attachment regions of genes to the nuclear matrix”, J. Cell Biochem., 52:14-22, 1993). 이 모델에 따르면, 염색질이, RNP 및 다른 비히스톤 단백질로 구성된 단백질성 네트워크인 핵 매트릭스(nuclear matrix)에 부착하여 50-100 kb로 펼쳐져 있는 루프 내에 조직화되어 있다(Bode J, Stengert-Iber M, Kay V, Schalke T and Dietz-Pfeilstetter A, Crit . Rev. Euk . Gene Exp., 6:115-138, 1996).

핵 매트리스에 부착된 DNA 부위는 스캐폴드 (scaffold, 중기 동안) 부착 부위 또는 매트릭스(간기) 부착 부위로 각각 불리는 SAR 또는 MAR로 정의된다(Hart C and Laemmli U (1998), “Facilitation of chromatin dynamics by SARs”Curr Opin Genet Dev 8, 519-525).

이와 같이, 이러한 부위들은 개별적인 염색질 도메인의 경계를 한정할 수 있으며, 이로 인해 도메인 내에서 유전자 발현을 조절하는 시스-조절성(cis-regulatory) 엘리먼트 만을 포함한다.

그러나, 근처의 염색질 엘리먼트로부터 염색체 위치를 완전히 보호하고, 이로 인해 위치(position)-독립적으로 유전자를 발현하게 하는 능력은, 안정하게 형질전환된 세포에서는 발견되지 않았다(Poljak L, Seum C, Mattioni T and Laemmli U. (1994) “SARs stimulate but do not confer position independent gene expression”, Nucleic Acids Res 22, 4386-4394). 한편, MAR (또는 S/MAR) 서열은 국소적 염색질 접근성을 증가시키기 위해 인핸서와 작용하는 것으로 보고되었다(Jenuwein T, Forrester W, Fernandez-Herrero L, Laible G, Dull M, and Grosschedl R. (1997) Extension of chromatin accessibility by nuclear matrix attachment regions Nature 385, 269-272). 특히, MAR 엘리먼트는 배양 세포주(Kalos M and Fournier R (1995) “Position-independent transgene expression mediated by boundary elements from the apolipoprotein B chromatin domain” Mol Cell Biol 15,198-207), 형질전환 생쥐(Castilla J, Pintado B, Sola, I, Sanchez-Morgado J, and Enjuanes L (1998) “Engineering passive immunity in transgenic mice secreting virus-neutralizing antibodies in milk”Nat Biotechnol 16, 349-354) 및 식물(Allen G, Hall GJ, Michalowski S, Newman W, Spiker S, Weissinger A, and Thompson W (1996), “High-level transgene expression in plant cells: effects of a strong scaffold attachment region from tobacco” Plant Cell 8, 899-913)에서 이종(heterologous) 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 유전자 치료용의 기능이 향상된 벡터를 개발하기 위한 MAR 서열의 유용성도 인정된다(Agarwal M, Austin T, Morel F, Chen J, Bohnlein E, and Plavec I (1998), “Scaffold attachment region-mediated enhancement of retroviral vector expression in primary T cells” J Virol 72, 3720-3728).

최근에는, MARs를 포함하는 염색질-구조 변형 서열, 예컨대 닭 라이소자임 5' MAR이, 안정한 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포의 군집에서 리포터 발현을 유의적으로 증가시킬 수 있다는 사실이 보고되었다(Zahn-Zabal M, et al., Development of stable cell lines for production or regulated expression using matrix attachment regions, J Biotechnol, 2001, 87(1): p. 29-42). 이러한 특성은 고-생산 클론의 비율을 증가시키는데 사용됨으로써, 스크리닝될 필요가 있는 클론의 수를 감소시켰다. 이러한 이점은, 형질전환 유전자(transgene) 발현 카세트를 플랭킹(flanking)하는 MARs을 가진 컨스트럭트(constructs) 뿐만 아니라, 컨스트럭트가 MAR 서열을 이용해 분리된 플라스미드 상에 형질전환될 때 확인되었다. 그러나, MARs을 이용한 동시-형질전환 동안의 발 현 레벨은, 2개의 MARs이 형질전환 유전자 발현 단위를 한정하는(delimitate) 컨스트럭트에서 발견되는 것만큼 높지 않았다. 3번째 바람직한 방법은, 형질전환 유전자 및 개별 플라스미드 상에 모두 연결되는 MARs을 이용해 형질전환 유전자를 형질전환시키는 방법인 것으로 확인되었다(Girod et al., 공개용으로 제출됨). 그러나, 이러한 기술에서 지속적으로 나타나는 한계 중의 하나는, 세포 당 형질전환될 수 있는 DNA의 양이다. 소망하는 유전자의 기능을 특성화하는 형질전환 효율을 높게 유지하기 위해, 많은 복합 형질전환 프로토콜이 개발되었다. 야마모토 등에 의해 적용된 프로토콜(Yamamoto et al, 1999, “High efficiency gene transfer by multiple transfection protocol” Histochem . J. 31(4), 241-243)은 5회의 형질전환이 일어나고 난 뒤에 형질전환 효율을 약 80%로 유도되었으나, 통상적인 형질전환 프로토콜은 단지 ＜40%의 효율에 도달하는 정도였다. 이러한 기술은 발현 세포의 비율을 증가시키고자 할 때에는 유용할 수 있으나, 높은 내재적 생산성을 가진 세포로 유도하지는 않는다. 따라서, 이 방법은 높은 생산성의 모노클로날 세포주를 생산하는데에는 유용하지 않다. 그러므로, 상술한 기술은 다음과 같은 2개의 주요한 결점을 갖는다:

i) 이 기술은, 유전자 카피의 추가 삽입에 유리하지 않거나, 형질전환 유전자를 유리한 염색체 위치(loci)에 삽입하지 않기 때문에, 형질전환된 세포의 동종 집단을 생성하지 않음,

ii) 복합 형질전환 이벤트에서의 동일한 선별가능 마커의 용도는 이중 또는 삼중으로 형질전환된 세포의 선별을 허용하지 않음.

특허 출원 WO 02/074969호에는, 안정한 진핵 세포주를 개발하기 위한 MARs의 용도가 기술되었다. 그러나, 상기 출원특허에서는 MAR DNA 엘리먼트에 대한 모든 보존된 상동성 또는 MAR 서열이 되고자 하는 DNA 서열의 능력을 예측하기 위한 어떠한 기술도 기술되어 있지 않다.

사실, 어떠한 명백한(clear-cut) MAR 일치 서열(consensus sequence)도 발견되지 않았으나(Boulikas T, “Nature of DNA sequences at the attachment regions of genes to the nuclear matrix” J. Cell Biochem., 52:14-22, 1993), 동물 MARs이 식물의 핵 스캐폴드에 결합할 수 있으며 이의 반대도 가능하기 때문에, 진화학적으로는, 이러한 서열의 구조가 진핵 게놈에서 기능적으로 보존되어 있는 것으로 여겨진다(Mielke C, Kohwi Y, Kohwi-Shigematsu T and Bode J, “Hierarchical binding of DNA fragments derived from scaffold-attached regions: correlation of properties in vitro and function in vivo” Biochemistry, 29:7475-7485, 1990).

생화학적 연구에 의한 MARs의 동정은, 장시간이 소요되고 예측불가능한 방법이다; 분석법에 따라 여러가지 결과가 얻어질 수 있다(Razin SV, “Functional architecture of chromosomal DNA domains” Crit Rev Eukaryot Gene Expr., 6:247-269, 1996). 진핵 게놈에 있는 엄청난 수의 예측된 MARs 및 게놈 프로젝트로부터 발행된 서열의 양을 고려한다면, 목표로 하는 실험을 수행하기 위해 포텐셜(potential) MARS를 필터할 수 있는 기술이 매우 유용할 수 있다.

최근에는, MARs에 대한 2개의 다른 예측 기술이 인터넷을 통해 이용가능하 다. 첫번째 기술은, 수개의 MARs 내에서 동정된 패턴의 설정 및 이러한 패턴의 동시-유발의 통계 분석을 기초로 하는 MAR-Finder이다(http://futuresoft.org/MarFinder; Singh GB, Kramer JA and Krawetz SA, “Mathematical model to predict regions of chromatin attachment to the nuclear matrix” Nucleic Acid Research, 25:1419-1425, 1997). MAR-Finder 예측은 서열 컨텍스트(context)에 의존하는데, 이는 예측된 MARs가 등록된 서열의 컨텍스트에 의존함을 의미한다. 다른 예측 소프트웨어인, SMARTest(http://www. genomatix.de; Frisch M, Frech K, Klingenhoff A, Cartharius K, Liebich I and Werner T, In silico prediction of scaffold/matrix attachment regions in large genomic sequences, Genome Research, 12:349-354, 2001)는 실험적으로 확인된 MARs로부터 유도되는 웨이트-매트릭스(weight-matrices)를 이용한다. SMARTest는 스케일이 큰 분석을 수행하는데 적합한 것으로 알려져 있다. 그러나, 실제 이의 상대적으로 낮은 특이성을 제쳐놓더라도, 이를 이용하여 스케일이 큰 분석을 수행할 때 이론적 MARs의 양이 급속하게 많아지며, 이론적 MARs의 수를 억제하기 위한 그의 특이성을 증가시킬 방법이 없으므로, SMARTest는 사이즈가 큰 DNA서열로부터 잠재(potent) MARS를 스크리닝하는데 거의 쓸모없어지고 있다.

인터넷을 통해 이용가능하지 않은 다른 소프트웨어들도 있는데; 이들은 MAR 모티프의 빈도(MRS 판정법;Van Drunen CM et al., “A bipartite sequence element associated with matrix/scaffold attachment regions” Nucleic Acids Res, 27:2924-2930, 1999), (ChrClass; Glazko GV et al., “Comparative study and prediction of DNA fragments associated with various elements of the nuclear matrix” Biochim . Biophys . Acta, 1517:351-356, 2001) 뿐만 아니라 스트레스-유도된 DNA 듀플렉스 위치의 동정(SIDD; Benham C and al., Stress-induced duplex DNA destabilization in scaffold/matrix attachment regions, J. Mol . Biol., 274:181-196, 1997)에 기초한다. 그러나, 게놈 서열을 완전하게 분석하기 위한 이들의 적합성이 여전히 알려져 있지 않은 상태이며, 이러한 기술들이 단백질 생산-증가 서열의 동정을 가능하게 하는지에 대해서도 보고되어 있지 않다.

게다가, 이러한 소프트웨어의 상대적으로 낮은 특이성으로 인해(Frisch M, Frech K, Klingenhoff A, Cartharius K, Liebich I and Werner T, “In silico prediction of scaffold/matrix attachment regions in large genomic sequences” Genome Research, 12:349-354, 2001), 게놈에서 동정된 이론적 MARs의 양은 라지 스케일 분석을 수행할 때 다루기 힘들 정도로 급속히 증가하며, 특히 이들의 대부분은 실제 활성이 없거나 낮은 활성을 나타낸다. 따라서, 이론적 MARs의 수를 억제하기 위한 예측 특이성을 증가시킬 방법이 없으므로, 이용가능한 많은 프로그램들은 재조합 단백질 생산성을 효율적으로 증가시키는 관점에서 잠재 유전자 엘리먼트를 동정하는데 거의 쓸모가 없게 된다.

상기 이용가능한 예측 방법들 모두가, 신규 및 잠재 MARs를 확실히 동정하기 위한 게놈의 라지-스케일 분석법을 방해하는 몇가지 문제점을 가지고 있기 때문에, 본 발명의 목적은 1) 재조합 단백질 발현을 향상시키게 하는 MARs의 기능적 특성을 이해하고, 2) 기능의 예측으로서 MAR 구조적 특성을 컴파일하는 신규한 바이오인포 매틱스 기술을 가짐으로서, 3) 게놈의 라지 스케일 분석을 수행하여 신규하고 더욱 잠재적인 MARs를 동정하고, 최종적으로는 4) 새롭게 동정된 MAR 서열을 이용할 때 진핵 세포 또는 생물체로부터 재조합 단백질의 생산을 향상시키는 향상된 효율성을 보여주는 것이다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 단백질 생산 증가 활성을 가진 DNA 서열, 구체적으로는 MAR 뉴클레오티드 서열을 동정하기 위한 향상되고 신뢰성이 있는 방법 및 진핵 세포에서 재조합 단백질의 생산을 증가시키기 위한 신규한 복합 형질전환 방법에서의 활성 MAR 서열의 용도를 제공함으로써 실현된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 단백질 생산 증가 활성을 가지고 있으며, 1 이상의 벤트 DNA 엘리먼트 및 DNA 결합 단백질에 대한 1 이상의 결합 자리(binding site)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리 및 정제된 DNA서열에 관한 것이다.

어떤 DNA 서열은 상대적으로 “안정한 곡선”을 형성하는 것으로 알려져 있으며, 여기서 상기 DNA는 각각 3차원적 경로(path)를 따른다. 따라서, 보통의 B-DNA 형(“곧은 모양”) 이외에, 일부 DNA는 벤트 DNA(Marini, et al., 1982 “Bent helical structure in kinetoplast DNA”, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 79: 7664-7664)로 정의된 것과 같이 평편하고, 평면의 곡선을 형성할 수 있다.

놀랍게도, 본 출원인은 본 발명의 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열의 벤트 DNA 엘리먼트가 통상적으로 100개의 인접 염기쌍 스트레치(stretch) 상에 10% 이상의 디뉴클레오티드 TA 및/또는 12% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 포함함을 확인하였다. 바람직하게는, 상기 벤트 DNA 엘리먼트는 100개의 인접 염기쌍 스트레치 상에 33% 이상의 디뉴클레오티드 TA 및/또는 33% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 포함하였다. 이러한 데이터는 이후에 기술되는 방법에 의해 얻어졌다.

본 발명에 따르면, 분리 및 정제된 DNA 서열은 일반적으로 서열번호 1 내지 27의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 cLysMAR 엘리먼트 또는 이의 단편을 포함한다. 바람직하게는, 상기 분리 및 정제된 DNA 서열은 서열번호 1 내지 27의 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 24 내지 27의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 MAR 뉴클레오티드 서열이다.

본 발명에 포함되는 것은 PCR 또는 다른 수단에 의해 생산될 수 있는, 상기-언급한 서열번호 1 내지 27의 서열 및 cLysMAR 엘리먼트의 상보적 서열이다.

“엘리먼트”는 공통의 작용 특성(즉, 전사인자에 대한 결합 자리) 또는 구조적(즉, 벤트 DNA 서열) 특성을 갖는 보존된 뉴클레오티드 서열이다.

서열번호 1 내지 27의 서열의 일부 및 cLysMAR 엘리먼트 또는 이의 단편은 서열번호 1 내지 27의 서열 각각의 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 지칭한다. 이러한 서열들은 이들이 유래된 천연 서열과 동일한 특성을 갖는 동안 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 서열들은 서열번호 1 내지 27의 서열 각각의 길이에서 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 뉴클레오티드를 갖는다.

또한, 본 발명은 상기에 언급한 서열번호 1 내지 27의 서열 및 cLysMAR 엘리먼트 또는 이의 단편의 변이체(variant), 즉 보존적 뉴클레오티드 치환에 의해 참조 서열과는 차이나는 뉴클레오티드를 포함하며, 이에 의해 1 이상의 뉴클레오티드가 동일한 특성을 가진 다른 것에 의해 치환된다.

서열번호 1 내지 23의 서열은 SMAR Scan

을 이용해 인간 염색체 1 및 2를 스캐닝함으로써 동정하였으며, 여기서 신규한 MAR 서열의 동정은 그 후 공지된 기술을 이용해 가능하지만, 서열번호 24 내지 27의 서열은 혼합 SMAR Scan

방법을 이용해 인간 게놈을 완전하게 스캐닝함으로써 동정 가능함을 보여준다.

첫번째 단계에서, 도 3에 표시된 바와 같은 가장 높은 벤트, 메이저 그루브 깊이, 마이너 그루브 너비 및 가장 낮은 녹는점과 일치하는 부위로서, 벤트 DNA 엘리먼트를 동정하기 위해, 염색체 1 및 2 모두를 스크리닝하였다. 두번째 단계에서, 도 8B)에 표시된 바와 같은 서열번호 1 내지 23의 서열을 산출하는 SATB1, GATA 등과 같은 조절 단백질의 결합 자리에 대해, 이러한 서열의 집단을 스캐닝하였다. 게다가, 서열번호 21 내지 23의 서열이 인간 게놈 데이터베이스의 공지된 유전자의 다음에 위치하는 것으로 추가로 확인되었다.

서열번호 24 내지 27에 있어서, 이러한 서열들은 혼합 방법에 따라 인간 게놈을 스캐닝함으로써 산출되었으며, 1757개 MAR 엘리먼트 중 일례로서 선별되어 검출되었다.

또한, MAR 서열의 분자 키메라도 본 발명에서 검토되었다. 분자 키메라가, MAR 엘리먼트의 기능적 부분을 포함할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 간주됨으로서, 당업계에 공지된 분자 생물학적 방법에 의해 수득될 수 있다.

또한, MAR 엘리먼트 또는 단편 또는 이의 일부분의 구체적인 조합도 본 발명에서 검토되었다. 이러한 단편들은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 제한 효소를 이용한 절단 및 단편의 회복, 화학 합성 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 서열번호 1 내지 27의 서열의 엘리먼트 또는 단편 및 cLysMAR 엘리먼트 또는 단편의 구체적인 조합도, 얻어지는 작용의 결과에 따라 본 발명에서 간주된다. cLysMAR의 엘리먼트는, 참조 문헌으로서 명세서 전체가 본원에 포함되어 있는 특허공개공보 WO 02/074969호에 개시된 바와 같은 B, K 및 F 부위이다. 본 발명에 사용된 cLysMAR의 바람직한 엘리먼트는 B, K 및 F 부위이다. 단지 1개의 엘리먼트가 사용될 수 있거나, 동일하거나 다른 엘리먼트의 복합 카피(멀티머화된 엘리먼트)가 사용될 수도 있다(참조, 도 8A)).

단편은 각 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주된다. MAR 뉴클레오티드 서열의 단편은 생물학적 활성을 보유할 수 있으며, 이로 인해 정제된 핵 매트릭스에 결합하고 및/또는 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현 패턴을 변화시킨다. MAR 뉴클레오티드 서열의 단편은 약 100 내지 1000 bp 이상, 바람직하게는 약 200 내지 700 bp, 더욱 바람직하게는 300 내지 500 bp 뉴클레오티드가 될 수 있다. 또한, 천연 MAR 엘리먼트 및/또는 단편으로 구성된 합성 MAR 서열에 존재하는 동일한 갯수의 뉴클레오티드를 포함하는, 모든 조합의 단편도 고려된다. 상기 단편은 바람직하게는 링커 서열에 의해 조립된다. 바람직한 링커는 BglII-BamHI 링커이다.

“단백질 생산 증가 활성”은 하기와 같이 정의된 분리 및 정제된 DNA 서열의 활성을 지칭한다: 적합한 조건하에서 진핵 숙주 세포에 도입되고 난 뒤에, 상기 서열은 상기 DNA 서열의 부재하에서 형질전환된 세포의 배양에 비교하여 세포 배양에서의 단백질 생산 레벨을 증가시킬 수 있다. 통상적으로, 상기 증가는 1,5 내지 10배, 바람직하게는 4 내지 10배이다. 이는 매일 세포 당 10 pg 이상의 생산 속도 또는 특이 세포 생산도와 일치한다(참조, 실시예 11 및 도 13).

본원에 사용된, 다음의 정의들이 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다.

“염색질(chromatin)”은 진핵 세포의 염색체를 구성하는 단백질 및 핵산 물질이며, DNA, RNA 및 관련(associated) 단백질로 지칭된다.

“염색질 엘리먼트(chromatin element)”는 염색체로 삽입될 때 염색질 구조를 변형하는 특성을 가진, 염색체 상의 핵산 서열을 의미한다.

“시스(Cis)”는 동일 핵산 분자(동일 벡터, 플라스미드 또는 염색체와 같은) 상의 2개 이상의 엘리먼트(염색질 엘리먼트와 같은)의 배치(placement)를 지칭한다.

“트랜스(Trans)”는 2개 이상의 다른 핵산 분자(2개의 벡터 또는 2개의 염색체와 같은) 상의 2개 이상의 엘리먼트(염색질 엘리먼트와 같은)의 배치를 지칭한다.

염색질 변형 엘리먼트는, 잠재적으로 위치 효과를 극복하는 것이 가능하고, 안정한 세포주를 개발하기 위한 소망하는 유전자가 되며, 경계 엘리먼트(boundary elements, BEs), 매트릭스 부착 부위(matrix attachment regions, MARs), 위치 조절 부위(locus control regions, LCRs) 및 범용 오프닝 엘리먼트(universal opening elements, UCOEs)를 포함한다.

경계 엘리먼트(“BEs”) 또는 인슐레이터(insulator) 엘리먼트는, 많은 경우에 있어서 염색질 내에서 경계를 정의하며(Bell A and Felsenfeld G. 1999; “Stopped at the border: boundaries and insulators”, Curr Opin Genet Dev 9, 191-198), 인 비보에서 전사적 도메인을 한정하는 역할을 할 수 있다. BEs는 내인성 프로모터/인핸서 활성이 부족하지만, 둘러싸는 염색질에 있는 조절 엘리먼트의 전사적 영향으로부터 유전자를 보호하는 것으로 생각된다. 인핸서-방어(block) 분석은 인슐레이터 엘리먼트를 동정하는데 통상적으로 사용된다. 이 분석에서, 염색질 엘리먼트는 인핸서 및 프로모터의 사이에 위치하며, 인핸서-활성화된 전사가 측정된다. 경계 엘리먼트는 초파리, 효모 및 포유동물 세포에서 포지션(position) 효과에 대항하여 안정하게 형질전환된 리포터 유전자를 방어할 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 이들은 유도성 형질전환 유전자 발현과 함께 형질전환 생쥐의 비율을 증가시키는 것으로 확인되었다.

위치 조절 부위(locus control regions, “LCRs”)는 최초의 위치 염색질 활성 및 그 이후의 그의 본래 위치에서의 유전자 전사에 필요한 시스-조절 엘리먼트이다(Grosveld, F. 1999, Activation by locus control regions Curr Opin Genet Dev 9, 152-157). 또한, LCRs의 활성 작용은, 숙주 게놈에 있는 삽입의 위치와는 상관없이, 형질전환 생쥐에 있는 적당한 조직에서 결합된(coupled) 형질전환 유전자의 발현을 가능하게 한다. 일반적으로, LCRs은, 연결된 유전자에서 조직-특이적 발현 레벨을 부여하는 반면, 절단된 인간 T-세포 수용체 LCR 및 쥐 LAP LCR에 대해서는 형질전환 생쥐에 있는 거의 모든 조직에서 효율적으로 발현함이 보고되었다. 가장 광범위하게 특성화된 LCR은 글로빈 위치의 것이다. 겸형 적혈구 병 및 (3-지중해빈혈증의 유전자 치료용 벡터에서의 이의 용도가 최근에 검증되었다.

잘 수용된(well-accepted) 모델에 따르면, “MARs”는 핵 매트릭스에 대한 특정 DNA 서열의 고정을 유도하고, 이종염색질 코어로부터 바깥쪽으로 확장하는 염색질 루프 도메인을 생성할 수 있다. MARs는 어떠한 명백한 일치 서열 또는 인식가능 서열도 포함하지 않지만, 이들의 가장 일치하는 특징은 1개 가닥 상에서 A/T 함량이 전체적으로 높고 C 염기가 우세한 경향이 있다는 것이다(Bode J, Schlake T, Rios-Ramirez M, Mielke C, Stengart M, Kay V and Klehr-Wirth D, “Scaffold/matrix-attached regions: structural propreties creating transcriptionally active loci” Structural and Functional Organization of the Nuclear Matrix: International Review of Citology, 162A:389-453, 1995). 이러한 부위들은 가닥 분리될 수 있는 성향이 있는 벤트 2차 구조를 형성하려는 경향이 있다. 이들은 염기 짝없는 부위(base unpairing regions, BURs)로 종종 일컫어지며, 가닥 분리의 핵 형성 포인트를 나타낼 수 있는 코어-풀림 엘리먼트(core-unwinding element, CUE)를 포함한다(Benham C and al., Stress-induced duplex DNA destabilization in scaffold/matrix attachment regions, J. Mol. Biol., 274:181-196, 1997). 수개의 간단한 AT-풍부 서열 모티프가 MAR 서열 내에서 종종 발견되나, 대부분의 경우, 이들의 기능적 중요성 및 활성의 포텐셜 모드가 여전히 불명확하다. 이들은 A-박스(AATAAAYAAA), T-박스(TTWTWTTWTT), DNA 풀림 모티프(AATATATT, AATATT), SATB1 결합 자리(H-박스, A/T/C25) 및 척추동물(RNYNNCNNGYNGKTNYNY) 또는 초파리(GTNWAYATTNATNNR)에 대한 일치 토포아이소머라제 II 위치를 포함한다.

유비퀴터스 염색질 개방 엘리먼트(“광범위하게 작용하는 염색질 개방 부위”로 알려진, “UCOEs”)가 국제공개공보 WO 00/05393호에 보고되었다.

“인핸서(enhancer)”는 유전자의 상동성, 유전자와 관련한 서열의 위치 또는 서열의 방향과는 독립적으로 유전자의 전사를 가능하게 하는 작용을 하는 뉴클레오티드 서열이다. 본 발명의 벡터는 선택적으로 인핸서를 포함한다.

“유전자”는 주어진 성숙 단백질을 인코딩하는 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 서열이다. 본원에 사용된, 용어 “유전자”는 RNA 전사 개시 신호와 같은 비전사된 플랭킹 부위, 폴리아데닐화 첨가 위치, 프로모터 또는 인핸서를 포함하지 않을 것이다.

“생성물 유전자(product gene)”는 진단 또는 치료적 용도와 같은 요구되는 특성을 가지는 단백질 생성물을 인코딩하는 유전자이다. 생성물 유전자는 예를 들어 구조 유전자 및 조절 유전자를 포함한다.

“구조 유전자”는 구조 단백질을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 구조 유전자의 예는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 세포골격 단백질, 세포외 매트릭스 단백질, 효소, 핵공(nuclear pore) 단백질 및 핵 스캐폴드 단백질, 이온 채널 및 트랜스포터, 수축 단백질 및 샤페론(chaperone)을 포함한다. 바람직한 구조 유전자는 항체 또는 항체 단편을 인코딩한다.

“조절 유전자”는 조절 단백질을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 조절 유전자의 예는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 전사 인자, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 신호 전달 분자, 종양유전자, 원형-종양유전자(proto-oncogenes), 막투과 수용체 및 단백질 키나아제를 포함한다.

“방향성(orientation)”은 주어진 DNA 서열에서의 뉴클레오티드의 순서를 지칭한다. 예를 들어, DNA 서열의 역전된 방향성은, 다른 서열과 관련하는 서열에서의 5'쪽에서 3'쪽으로의 순서가, 서열이 수득되는 DNA에 있는 참조 포인트에 비교했을때 역전되어 있는 것이다. 이러한 참조 포인트는 원천(source) DNA에 있는 다른 특성화된 DNA 서열의 전사의 방향 및/또는 서열을 포함하는 복제가능 벡터의 복제 기원(origin)을 포함할 수 있다.

“진핵 세포”는 진핵 생물체로부터의 모든 포유동물 세포 또는 비-포유동물 세포를 지칭한다. 비-제한적인 실시예에 의하면, 세포 배양 조건하에서 유지가 가능하고 그 후에 형질전환된 모든 진핵 세포가, 본 발명에 포함될 수 있다. 특히 바람직한 세포 타입은 예를 들어 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cells, CHO), COS, BHK21, NIH3T3, HeLa, C2C12, 암 세포 및 1차 분화된 세포 또는 미분화된 세포를 포함한다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.

용어 “숙주 세포” 및 “재조합 숙주 세포”는 본원에서 상호교환하여 사용가능하며, 1개 이상의 본 발명의 벡터가 도입된 진핵 세포를 나타낸다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 왜냐하면, 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 계속되는 세대에서 특정한 변형이 유발될 수 있기 때문이며, 사실, 이러한 자손은 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.

용어 “진핵 숙주 세포로의 정제된 DNA의 도입” 또는 “형질전환”은 수반되는 물질을 포함하거나 포함하지 않는 세포외 DNA가 숙주 세포로 들어가는 모든 과정을 지칭한다. 용어 “형질전환된 세포(cell transfected)” 또는 “형질전환 세포(transfected cell)”는 세포외 DNA가 도입되어 세포외 DNA를 포함하는 세포를 의미한다. DNA가 세포내로 도입될 수 있으며, 이에 의해 핵산은 염색체 삽입물 또는 외부 염색체 엘리먼트로서 복제가능하다.

본원에서 사용된 “프로모터(promoter)”는 유전자의 발현을 조절하는 핵산 서열을 지칭한다.

“동시-형질전환”은 1개 이상의 외인성 유전자, 또는 벡터, 또는 플라스미드, 세포에 대한 외래유전자-이들 중의 하나는 세포에서 선택적 표현형을 부여할 수 있음-를 이용해 진핵 세포를 형질전환시키는 과정을 의미한다.

또한, 단백질 생산 증가 활성을 갖는 분리 및 정제된 DNA 서열은, 1 이상의 벤트 DNA 엘리먼트와는 관계없이, DNA 결합 단백질에 대한 1 이상의 결합 자리를 포함한다.

통상적으로, DNA 결합 단백질은 전사 인자이다. 전사 인자의 예는 polyQpolyP 도메인 단백질을 포함하는 그룹이다. 전사 인자의 다른 예는 SATB1, NMP4, MEF2, S8, DLX1, FREAC7, BRN2, GATA 1/3, TATA, Bright, MSX, AP1, C/EBP, CREBP1, FOX, Freac7, HFH1, HNF3alpha, Nkx25, POU3F2, Pit1, TTF1, XFD1, AR, C/EBPgamma, Cdc5, FOXD3, HFH3, HNF3 beta, MRF2, Oct1, POU6F1, SRF, V$MTATA_B, XFD2, Bach2, CDP CR3, Cdx2, FOXJ2, HFL, HP1, Myc, PBX, Pax3, TEF, VBP, XFD3, Brn2, COMP1, Evil, FOXP3, GATA4, HFN1, Lhx3, NKX3A, POU1F1, Pax6 및 TFIIA를 포함하는 군으로부터 선택되는 전사 인자 또는 이러한 전사 인자 2개 이상의 혼합인 것이 바람직하다. 가장 바람직한 것은 SATB1, NMP4, MEF2 및 polyQpolyP 도메인 단백질이다.

예를 들어, SATB1, NMP4 및 MEF2는 포유동물에서 발생 및/또는 조직-특이적 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 이러한 전사 인자들은 DNA 기하구조를 변화시키고, 상호적으로는 그의 구조를 변형하는 알로스테릭(allosteric) 리간드로서 DNA에 결합하는 능력을 갖는다. 최근에, SATB1이 헤테로염색질을 둘러싸는 케이지-유사(cage-like) 구조를 형성하는 것으로 확인되었다(Cai S, Han HJ , and Kohwi-Shigematsu T, “Tissue-specific nuclear architecture and gene expression regulated by SATB1” Nat Genet, 2003. 34(1): p. 42-51).

또한, 본 발명의 다른 목적은 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편, 이의 상보적 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 제공하는 것이다.

더욱 바람직하게는, 상기 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편은 B, K 및 F 부위로부터 선택되는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 링커 서열들 사이에서 조립된 천연 MAR 엘리먼트 및/또는 단편을 포함하는 합성 MAR 서열을 제공하는 것이다.

바람직하게는, 합성 MAR 서열은 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편, 이의 상보적 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 포함한다. 또한 바람직하게는, 링커 서열은 BglII-BamHI 링커이다.

본 발명의 또 다른 목적은, DNA 벤딩, 메이저(major) 그루브(groove) 깊이 및 마이너(minor) 그루브 너비 포텐셜 및 녹는점에 상응하는 1 이상의 DNA 서열 특성의 값을 계산하는 단계를 포함하는, 바이오인포매틱스 기술을 이용한 MAR 서열의 동정 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 1 이상의 DNA 서열 특성의 확인 방법은 DNA 결합 단백질에 대한 결합 자리와 일치하는 DNA 서열 특성을 추가로 확인하는 것을 포함하며, 이는 본 발명의 방법을 이용하여 계산한다.

바람직하게는, 상기 바이오인포매틱스 기술의 프로파일 또는 웨이트-매트릭스는 디뉴클레오티드 인식에 기초한다.

본 발명에 유용한 바이오인포매틱스 기술은 바람직하게는, Gene Express(http://srs6.bionet.nsc.ru/srs6bin/cgi-bin/wgetz-e+[FEATURES-SiteID:'nR'])에 의해 개발된 알고리즘을 포함하고 레비스키 등의 문헌(Levitsky et al., 1999)를 기초로 하는 SMAR Scan

이다. 이러한 알고리즘은 디뉴클레오티드 웨이트-매트릭스를 기준으로 하는 프로파일을 인식하며, 이로 인해 DNA의 형태학적 및 물리화학적 특성에 대한 이론적 값을 계산한다.

바람직하게는, SMAR Scan

은 DNA 벤딩, 메이저 그루브 깊이 및 마이너 그루브 너비 포텐셜 및 녹는점에 상응하는 DNA 서열 특성으로도 표시될 수 있는 4개의 이론적 기준-가능하다면 이들의 모든 조합-을 사용하며, 다양한 크기의 스캐닝 윈도우를 이용한다(참조, 도 3). 사용된 각 기능에 대해, 컷-오프(cut-off) 값이 설정된다. 상기 프로그램은 주어진 부위의 계산된 값이, 선택된 모든 기준에 대해 설정진 컷-오프 값 이상일 때마다 히트(hit)를 반환(return)한다. 2개의 데이터 출력 모드는 히트를 다루기에 유용하며, 첫번째 모드(“프로파일-유사”로 일컫어짐)는 간단하게 쿼리(query) 서열상의 모든 히트 포지션 및 선택된 다른 기준에 대해 일치하는 값을 리턴한다. 두번째 모드(“일치 히트”로 일컫어짐)는 단순히 수개의 일치 히트의 위치 및 이의 일치하는 서열을 리턴한다. 이 모드에 있어서, 일치 히트의 최소 갯수는 가변 윈도우 사이즈로 다시 세팅될 수 있는 다른 컷-오프 값이다. 이 두번째 모드는 SMAR Scan

의 초기설정 모드이다. 대신에, 의미론적 관점에서, 히트는 코어-풀림 엘리먼트(CUE)로 간주되며, 관련 단백질에 대한 결합 자리의 클러스터를 동반하는 CUEs의 클러스터는 MAR로 간주된다. 따라서, SMAR Scan

은 잠재적 MAR로서 단지 수개의 일치 히트로 간주된다.

4개의 이론적 구조적 기준에 대한 초기설정 컷-오프 값을 조정하기 위해, SMARt DB(http://transfac.gbf.de/- SMARt DB)의 실험적으로 확인된 MARs이 사용되었다. 데이터베이스로부터 모든 인간 MAR 서열을 검색한 뒤 4개의 기준 및 컷-오프 값 설정을 가지지 않는 “프로파일-유사” 모드를 이용하는 SMAR Scan

로 분석하였다. 이는 서열의 각 위치에 대한 각 기능을 설정할 수 있게 하였다. 그리고 난 뒤, 각 기준에 대한 분포를 이러한 데이타에 따라 계산하였다(참조, 도 1 및 3).

벤드, 메이저 그루브 깊이 및 마이너 그루브 너비에 대한 SMAR Scan

의 초기설정 컷-오프 값을 75번째 변위치(quantile) 및 중위수(median)의 평균에 맞추었다. 녹는점에 대해, 초기설정 컷-오프 값은 75th 변위치에 맞추어야 한다. “일치-히트” 모드에 대한 최소 길이는 300에 설정하여야 하는데, 왜냐하면 이것이 MAR의 최소 길이로 예측되기 때문이다(참조, 도 8 및 9). 그러나, 당업자라면, 최소의 실험으로 주어진 생물체에 대한 상기-언급한 기준에 대한 컷-오프 값을 결정할 수 있을 것이다.

바람직하게는, DNA 벤딩 값은 3 내지 5°(각도, radial degree)이다. 가장 바람직하게는, 이들은 도 1의 가장 작은 피크와 일치하는, 3.8 내지 4.4°에 위치한다.

바람직하게는, 메이저 그루브 깊이 값은 8.9 내지 9.3 Å(옹스트롱)이고, 마이너 그루브 너비 값은 5.2 내지 5.8 Å이다. 가장 바람직하게는, 메이저 그루브 깊이 값은 9.0 내지 9.2 Å이고, 마이너 그루브 너비 값은 5.4 내지 5.7 Å이다.

바람직하게는, 녹는점은 55 내지 75℃(섭씨 온도)이다. 가장 바람직하게는, 상기 녹는점은 55 내지 62℃이다.

그 값이 상기 방법에 의해 계산될 수 있는 DNA 결합 단백질은 통상적으로 전사 인자이고, 바람직하게는 polyQpolyP 도메인 또는 SATB1, NMP4, MEF2, S8, DLX1, FREAC7, BRN2, GATA 1/3, TATA, Bright, MSX, AP1, C/EBP, CREBP1, FOX, Freac7, HFH1, HNF3alpha, Nkx25, POU3F2, Pit1, TTF1, XFD1, AR, C/EBPgamma, Cdc5, FOXD3, HFH3, HNF3 beta, MRF2, Oct1, POU6F1, SRF, V$MTATA_B, XFD2, Bach2, CDP CR3, Cdx2, FOXJ2, HFL, HP1, Myc, PBX, Pax3, TEF, VBP, XFD3, Brn2, COMP1, Evil, FOXP3, GATA4, HFN1, Lhx3, NKX3A, POU1F1, Pax6 및 TFIIA를 포함하는 군으로부터 선택되는 전사 인자 또는 이 전사 인자들의 2개 이상의 조합이다.

그러나, 당업자라면 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해 다른 종류의 전사 인자를 결정할 수 있다.

예를 들어, SMAR Scan

이 큰 스케일의 분석을 수행하기 위해 사용되는 경우는, 바람직하게는 상기-언급한 방법은 계산을 줄이기 위해 DNA 전사 인자에 대한 DNA 결합 자리를 예측하는 1 이상의 필터를 추가로 포함한다.

본 발명의 방법의 원리는 상술한 바와 같은 구조적 특성을 계산하기 위한 SMAR Scan

및 예를 들어 pfsearch(Bucher P, Karplus K, Moeri N, and Hofmann K, “A flexible search technique based on gen-eralized profiles” Computers and Chemistry , 20:3-24, 1996에 개시된 바와 같은 pftools 패키지로부터의)와 같은 필터를 결합함으로써, 일부 전사 인자의 결합을 예측하는 것이다.

필터의 예는, 이에 한정되는 것은 아니지만 pfsearch, MatInspector, RMatch Professional 및 TRANSFAC Professional을 포함한다.

이 혼합 방법은 SMAR Scan

의 구조적 특성 및 MARs를 선별하기 위해 순서대로 적용될 수 있어 이로 인해 필터상의 의존성이 상기 방법의 시작 또는 끝에 적용될 수 있는 특정 전사 인자에 대한 필터의 예측된 결합력을 이용한다.

상기 첫번째 레벨은 1차 입력 서열을 제외한 서열을 선별하며, 필터에 구성되어 있는 상기 두번째 레벨은 필터에 의해 사용된 기준을 만족하는 서열로부터 선별된 것 중에서 억제하기 위해 사용될 수 있다.

이러한 혼합 방법에서, 필터는 프로파일 또는 예컨대 MatInspector(Quandt K, Frech K, Karas H, Wingender E, Werner T, “MatInd and MatInspector -New fast and versatile tools for detection of consensus matches in nucleotide sequence data”, Nucleic Acids Research , 23, 4878-4884, 1995.)의 웨이트 매트릭스를 이용해 DNA 결합 자리의 클러스터를 검출한다. 또한, 상기 필터는 DNA 결합 자리의 클러스터의 밀도도 검출할 수 있다.

상기 혼합 방법은 실제적으로 SMAR Scan

에 대해 Perl에 기재된 “래퍼(wrapper)”이며, 이 경우 pfsearch는 pftools의 필터로서 사용된다. 상기 혼합 방법은 잠재적인 “필터”로서 이러한 기술들(SMAR Scan

또는 필터) 중의 하나를 각 레벨에서 이용하는 2 레벨의 과정을 수행하며, 각 필터는 무작위로 선택할 수 있고 어떠한 필터링을 수행하지 않고도 예측된 특성을 계산하는데 사용가능하다.

만약, SMAR Scan

이 연속으로 필터하기 위해 첫번째 레벨에서 사용되면, 이는 서열을 반환하기 위해 “모든 일치 히트” 모드와 함께 사용되어야 한다. 만약 pfsearch가 첫번째 필터로서 첫번째 레벨에서 사용되면, 이는 오직 한개의 프로파일과 함께 사용되어야 하고, 뉴클레오티드에서의 거리가 제공될 필요가 있다. 이 거리는 서열을 반환하기 위해 제공된 거리보다 하위(inferior)의 거리에 위치하는 pfsearch 히트와 함께 사용될 수 있다; 상기 혼합 방법은 pfsearch를 착수하고, 이의 출력을 분석하며, 제공된 거리에 따라 함께 사용되는 pfsearch에 대응되는 서열을 반환한다. 그 후, 첫번째 레벨에서 사용되는 기술이 어느 것이든지 간에, 선별되는 부분(sub)-서열의 길이는 “히트 연장(hit extension)”이라 일컫어지는 파라미터에 따라 양쪽 말단으로 체계적으로 연장될 수 있다.

두번째 레벨 및 무작위 선택적인 레벨은 서열(이미 필터된 서열 또는 필터되지 않은 입력 서열)을 필터하거나, 이러한 서열 상에서 어떠한 필터도 수행하지 않는 SMAR Scan

및/또는 pfsearch의 결과를 얻는데 사용될 수 있다. 만약 혼합 방법의 두번째 레벨이 필터하는데 사용되면, 고려된 각 기준에 대해, 컷오프 값(뉴클레오티드 당 히트)은 이러한 서열들을 필터하기 위해 제공될 필요가 있다(참조, 도 20).

또한, 본 발명의 다른 목적은 프로파일 또는 웨이트 매트릭스를 이용하여 DNA 결합 자리의 클러스터를 검출하는 1 이상의 필터를 포함하는, MAR 서열의 동정방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 상기 방법은 2 레벨의 필터를 포함하며, 이 경우 SMAR Scan

은 상기 방법에서 완전히 제외된다. 통상적으로, 2 레벨은 pfsearch에 포함된다.

또한, 본 발명에 포함되는 것은, 기술된 바이오인포매틱스 기술을 이용해 MAR 서열을 동정하는 방법, 혼합 방법 또는 1 이상의 필터를 포함하는 방법에 따라 동정가능한 분리 및 정제된 MAR DNA 서열이다.

혼합 방법에 의한 전체 인간 게놈의 분석은, 전체 1 065 305개의 염기쌍으로 표시되는 1757개의 추정 MARs를 모두 도출하였다. 결과의 갯수를 감소시키기 위해, 이러한 1757개의 MARs 상에서 디뉴클레오티드 분석을 수행하였으며, 5'에서 3'쪽으로의 방향에 있는 양 가닥으로 여겨지는 각 서열에 대한 16개의 가능한 디뉴클레오티드 백분율을 각각 계산하였다.

놀랍게도, 본 출원인은 혼합 방법에 의해 검출되는 모든 “슈퍼(super)” MARs가 100개의 일치 염기쌍의 스트레치 상에 10% 이상의 디뉴클레오티드 TA를 포함하고 있음을 확인하였다. 바람직하게는, 이러한 서열들은 100개의 일치 염기쌍의 스트레치 상에 33% 이상의 디뉴클레오티드 TA를 포함한다.

또한, 본 출원인은 이러한 동일 서열들이 100개의 일치 염기쌍의 스트레치 상에 12% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 추가로 포함함을 확인하였다. 바람직하게는, 이 서열들은 100개의 일치 염기쌍의 스트레치 상에 33% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 27의 서열로부터 선택되는 서열, 이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 포함하는, 전술한 모든 MARs의 분리 및 정제된 MAR DNA 서열을 제공하는 것이다.

바람직하게는, 상기 분리 및 정제된 MAR DNA 서열은 서열번호 24 내지 27의 서열로부터 선택되는 서열, 이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 포함한다. 이러한 서열번호 24 내지 27의 서열은 혼합 방법에 의해 검출되는 것에 대응되며, 서열번호 1 내지 23의 서열보다 더 높은 단백질 생산 증가 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명은 제1 분리된 매트릭스 부착 부위(matrix attachment region, MAR) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA 서열, 여기서 MAR 뉴클레오티드 서열은 하기를 포함하는 군으로부터 선택됨:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 기재된 바이오인포매틱스 기술을 이용하는 MAR 서열을 동정하기 위한 방법, 혼합 방법 또는 1 이상의 필터를 포함하는 방법에 따라 동정가능한 분리 및 정제된 MAR DNA서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

- 링커 서열들 사이에서 조립된 천연 MAR 엘리먼트 및/또는 단편을 포함하는 합성 MAR 서열,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체

또는 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편의 MAR 뉴클레오티드 서열, 이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체의, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키기 위한 용도를 포함한다.

상기 분리 및 정제된 DNA 서열은 통상적으로 당업계에 공지된 바와 같은 1 이상의 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및/또는 인핸서, 폴리아데닐화 위치 및 단백질을 발현시키기 위해 통상적으로 이용되거나 선택적으로 선별 마커를 인코딩할 수 있는 스플라이스 정션(splice junction)을 추가로 포함한다. 바람직하게는 상기 분리 및 정제된 DNA 서열은 소망하는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.

본 발명의 DNA 서열은 표준 PCR 프로토콜 및 당업계에 공지된 방법에 따라 분리될 수 있다.

숙주 세포와 호환할 수 있게 제공되는 프로모터, 예를들어 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스(아데노바이러스 2와 같은), 파필로마 바이러스(소 파필로마 바이러스와 같은), 조류 사코마 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)[생쥐 또는 인간 사이토메갈로바이러스 이미디어트 얼리 프로모터(immediate early promoter)와 같은], 레트로바이러스, 헤파티티스-B 바이러스 및 시미안 바이러스(Simian Virus) 40 (SV 40 얼리 및 레이트 프로모터와 같은)와 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻어진 프로모터 또는 액틴(actin) 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터와 같은 이종 포유동물 프로모터 또는 열충격 프로모터(heat shock promoters)로부터 얻어진 프로모터가 사용될 수 있다. 이러한 조절 서열들은 직접 구조적(constitutive) 발현을 한다.

더불어, 분리 및 정제된 DNA 서열은 바람직하게는 각 세포 타입에서 핵산을 직접 발현할 수 있는 조절 서열을 추가로 포함한다(예, 조직-특이적 조절 엘리먼트는 핵산을 발현하는데 사용된다). 조직-특이적 조절 엘리먼트는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비-제한적인 예는 알부민 프로모터(간-특이적; Pinkert,et al., 1987. Genes Dev.1: 268-277), 림프-특이적 프로모터(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터(Winoto and Baltimore, 1989. EMBOJ. 8: 729-733) 및 면역글로불린(Banerji, etal., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33:741-748), 뉴런-특이적 프로모터(예, 뉴로필라멘트 프로모터;Byrne and Ruddle, 1989. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), 췌장-특이적 프로모터(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916) 및 포유동물 샘(gland)-특이적 프로모터(예, 유장(milk whey) 프로모터; 미합중국 특허 제4,873,316호 및 유럽특허출원 제264,166호)를 포함한다.

또한, 발생학적으로 조절된 프로모터도 포함된다. 이러한 프로모터의 예는 예를 들어, 생쥐 혹스(hox) 프로모터(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379) 및 티아-태아단백질(thea-fetoprotein) 프로모터(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)를 포함한다.

조절가능성 유전자 발현 프로모터는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 비-제한적인 예로서 CRE/LOX 시스템, TET 시스템, 독시사이클린(doxycycline) 시스템, NFkappaB/UV 광(light) 시스템, Leu3p/이소프로필말테이트 시스템 및 GLVPc/GAL4 시스템과 같은 외인성 분자를 결합시킴으로써 요구되는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 모든 프로모터를 포함한다(참조, 예, Sauer, 1998, Methods 14 (4): 381-92 ; Lewandoski, 2001, Nat. Rev. Genet 2 (10): 743-55; Legrand-Poels et al., 1998, J. Photochem. Photobiol. B. 45: 18; Guo et al., 1996, FEBS Lett. 390 (2): 191-5; Wang et al., PNAS USA, 1999,96 (15): 84838).

그러나, 당업자라면 다른 종류의 프로모터도 본 발명을 수행하는데 적합함을 판단할 수 있다.

인핸서는 본 발명의 정제된 DNA 서열에 선택적으로 포함되어, 조절 서열, 예를 들어 프로모터에 포함될 수 있다.

“소망하는 유전자(gene of interest)” 또는 “형질전환 유전자(transgene)”는 바람직하게는 단백질(구조적 또는 조절 단백질)을 인코딩한다. 본원에 사용된 “단백질”은 일반적으로 약 10개 이상의 아미노산을 갖는 펩타이드 및 폴리펩타이드를 일컫는다. 단백질은 숙주에 대해 “동형(homologous)”(즉, 숙주 세포에 대한 내인성이 이용됨)이거나, 효모에 의해 생산되는 인간 단백질과 같이 “이형(heterologous)”(즉, 숙주 세포에 대한 이종이 이용됨)이다. 단백질은 세포의 원형질막 주위공간(periplasmic space) 또는 세포질, 또는 세포외 배지에서 불용성 응집물(aggregate) 또는 가용성 단백질로서 생산될 수 있다. 단백질의 예는 성장 호르몬 또는 에리스로포이에틴(EPO)와 같은 호르몬, 표피 성장 인자와 같은 성장 인자, 엔케팔린(enkephalin)과 같은 진통(analgesic) 물질, 키모트립신(chymotrypsin)과 같은 효소, 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체 및 항체를 포함하며, 가시화 마커, 예를 들어 녹색 형광 단백질과 같이 통상적으로 사용되는 단백질도 포함한다.

바람직하게는, 정제된 DNA 서열은 최소한 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 제2 분리된 매트릭스 부착 부위(MAR) 뉴클레오티드 서열:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 추가로 포함한다. 분리된 매트릭스 부착 부위(MAR) 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 선택적으로, 1차 및 2차 동일 MAR 뉴클레오티드 서열이 사용된다.

바람직하게는, MAR 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 소망하는 유전자를 포함하는 서열의 5' 및 3' 말단 모두에 위치한다. 그러나, 본 발명은 상기 1차 및/또는 2차 MAR 뉴클레오티드 서열이 프로모터 및 소망하는 유전자를 포함하는 것과는 다른 서열상에 위치한다는 사실도 포함한다.

또한, 본 발명의 목적에 의해 받아들여지는 것은, 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 제1 분리된 매트릭스 부착 부위(MAR) 뉴클레오티드 서열:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를 포함하는 분리 및 정제된 DNA 서열이며, 이들은 공지된 프로토콜에 따라 분리 및 정제된 DNA 서열을 진핵 숙주 세포에 삽입시킴으로써 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는데 사용할 수 있다. 이용되는 진핵 숙주 세포에 DNA를 삽입하는데 통상적으로 적용되는 방법은, 예를 들어 미세주입(microinjection) 또는 미세입자 봄바드먼트(bombardment); 일렉트로트랜스퍼(electrotransfer); 바이러스 벡터의 사용; 전달 시스템내에서의 인캡슐화(encapsulation); 및 칼슘 포스페이트, 디에틸아미노에틸(DEAE)-덱스트란과 같은 형질전환 시약 또는 Lipofect-AMINE 2000(Invitrogen)과 같은 통상적인 형질전환 시스템이다. 바람직하게는, 정제된 DNA 서열을 진핵 숙주 세포에 삽입하는 형질전환 방법은 하기에 기술한 바와 같은 진핵 세포의 형질전환 방법이다.

분리 및 정제된 DNA 서열은 환상(circular) 벡터의 형태에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 분리 및 정제된 DNA 서열은 벡터로서 선형(linear) DNA 서열의 형태에서 사용될 수 있다.

본원에 사용된, “플라스미드” 및 “벡터”는 상호 호환하여 사용되며, 플라스미드는 가장 통상적으로 사용되는 벡터 형태이다. 그러나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니지만, 등가의(equivalent) 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 경향이 있다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법을 추가로 포함한다:

a) 1 이상의 소망하는 DNA 서열을 포함하는 1 이상의 정제된 DNA 서열 및/또는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트를 포함하는 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열을 진핵 숙주 세포에 도입(introducing)하는 단계,

b) 1 이상의 소망하는 DNA 서열을 포함하는 1 이상의 정제된 DNA 서열 및/또는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트를 포함하는 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열을 이용하여, 정해진 시간내에 상기 형질전환된 진핵 숙주 세포에 추가로 1회 이상 형질도입하는 것을 수행하는 단계,

c) 상기 형질전환된 진핵 숙주 세포를 선별하는 단계.

바람직하게는, 최소한 2회 내지 4회의 형질전환 단계가 단계 b)에 적용된다.

성공적으로 형질전환된 세포를 선별하기 위해, 일반적으로 선별가능 마커(예, 항생제에 대한 저항성)를 인코딩하는 유전자가 소망하는 유전자와 함께 숙주 세포에 도입된다. 선별가능 마커를 인코딩하는 유전자는 1 이상의 소망하는 DNA 서열을 포함하는 정제된 DNA 서열 및/또는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트를 포함하는 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열 상에 위치할 수 있으며, 또는 선택적으로는 분리 형태로 예를 들어 플라스미드로 동시-도입될 수 있다. 다양한 선별가능 마커는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 약물에 대해 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 약물의 양은 생산성을 증가시키기 위해 요구되는 만큼 사용될 수 있다.

일반적으로 1 이상의 선별가능 마커가 사용된다. 바람직하게는 다른 형질전환 단계 각각에 사용되는 선별가능 마커는 다르다. 이는 2개의 다른 항생제 마커를 사용함으로써 “복합-형질전환된” 형질전환 세포를 선별가능하게 한다.

단백질 생산 가능하고 세포 벽이 결여된 모든 진핵 숙주 세포가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 인간 배아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양에서 성장한 서브클론된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol 36, 59 (1977)), 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2), 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065)와 같은 인간세포; 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77, 4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol . Reprod 23, 243-251 (1980)), 마우스 유방 세포(MMT 060562, ATCC CCL51)와 같은 설치류 세포; 및 SV4O에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 개(canine) 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 물소 래트(rat) 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442)와 같은 다른 포유동물의 세포; 마이엘로마(예. NS0)/하이브리도마 세포를 포함한다.

바람직하게는, 선별된 형질전환된 진핵 숙주 세포는 매일 세포당 10 pg 이상의 생산 속도를 가진 단백질 고생산 세포이다.

본원에서 사용하기에 가장 바람직한 것은 포유동물 세포이며, 더욱 바람직한 것은 CHO 세포이다.

분리 및 정제된 DNA 서열의 소망하는 DNA 서열은 통상적으로는 소망하는 유전자, 바람직하게는 상술한 바와 같이 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질을 인코딩하는 소망하는 유전자이다. 1 이상의 소망하는 DNA서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA 서열은 소망하는 MAR 뉴클레오티드 서열의 DNA 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트를 추가로 포함할 수 있다.

MAR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA 서열은, 예를 들어 서열번호 1 내지 27의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 서열 및/또는 cLysMAR의 각 엘리먼트, 예를 들어 B, K 및 F 부위 뿐만 아니라 상술한 바와 같은 단편 및 엘리먼트 및 이의 조합이다. 다른 염색질 변형 엘리먼트는 예를 들어 경계 엘리먼트(boundary elements, BEs), 위치 조절 부위(locus control regions, LCRs) 및 범용 오프닝 엘리먼트(universal opening elements, UCOEs)이다(참조, Zanh-Zabal et al. 이미 인용됨). 숙주 세포의 복합 형질전환의 예가 실시예 12에 개시되어 있다(표 3). 1차 형질전환 단계(1차 형질전환)는 소망하는 유전자(SV40EGFP) 단독, MAR 뉴클레오티드 서열(MAR) 단독 또는 소망하는 유전자와 MAR 뉴클레오티드 서열(MAR-SV40EGFP)을 이용하여 수행된다. 2차 형질전환 단계(2차 형질전환)는 소망하는 유전자(SV40EGFP) 단독, MAR 뉴클레오티드 서열(MAR) 단독 또는 소망하는 유전자와 MAR 뉴클레오티드 서열(MAR-SV40EGFP)을 이용하여, 가능하다면 상기 1차 형질전환 단계로부터 얻어지는 조합을 이용하여 수행된다.

바람직하게는, 진핵 숙주 세포는 다음의 단계에 의해 형질전환된다:

a) 1개의 소망하는 DNA 서열 및 추가로 MAR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정제된 DNA 서열을 도입하는 단계,

b) 상기 형질전환된 진핵 숙주 세포에, 1개의 소망하는 DNA 서열 및 추가로 MAR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 단계 a)와 동일한 정제된 DNA 서열을 정해진 시간내에 삽입하는 형질전환 단계를 추가로 1회 이상 수행하는 단계.

또한, 바람직하게는, 본 발명의 MAR 뉴클레오티드 서열은 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 분리 및 정제된 DNA 서열:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 기재된 바이오인포매틱스 기술을 이용한 MAR 서열을 동정하기 위한 방법, 혼합 방법 또는 1 이상의 필터를 포함하는 방법에 따라 동정가능한 분리 및 정제된 MAR DNA서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

- 링커 서열들 사이에들 조립된 천연 MAR 엘리먼트 및/또는 단편을 포함하는 합성 MAR 서열,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체이다.

놀랍게도, 1차 및 2차 형질전환 사이에서 상승작용이 관찰되었다. 각 상승작용은, 형질전환 단계 1개 또는 모두에 MAR 엘리먼트가 존재할 때 관찰되었다. 상기에 기술한 방법을 이용하여 pMAR 단독으로 또는 다양한 발현 플라스미드와 혼합한 것을 이용해 세포의 복합 형질전환을 수행하였다. 예를 들어, 표 3에서는 pMAR-SV40EGFP 플라스미드를 이용해 세포를 2회 형질전환하는 경우, 매우 높은 GFP 발현 및 모든 조건에서의 증가가 가장 높은 정도(4.3배)를 나타냄을 보여준다. 대조적으로, MAR이 없는 벡터로 2회 형질전환하는 경우, 예측된 2배의 증가 대신에, 매우 낮거나 거의 증가가 없었다(2.8배). 이는 각 형질전환 단계에서의 MAR 엘리먼트의 존재가 최대 단백질 합성을 수행하는데 있어서 특히 중요함을 증명해준다.

형질전환 방법의 구체적인 예로서, 1 이상의 소망하는 DNA 서열을 포함하는 상기 정제된 DNA 서열은, 프로모터에 작동가능하게 연결된 소망하는 유전자, 선별가능 마커 유전자, 및/또는 MAR 서열과 같은 단백질 생산 증가 엘리먼트를 포함하는 복합 연결되지 않은 플라스미드의 형태로 전달될 수 있다.

1차 및 그 다음 DNA 서열의 비율은 특정 세포 타입의 사용에 요구되는 것으로서 적용될 수 있으며, 이는 당업자에게 있어서는 통상적인 실험이 된다.

1차 형질전환된 세포에 추가로 형질전환하기 위한 정해진 시간은, 세포 주기 및 이의 지속시간(duration)에 밀접하게 의존한다. 통상적으로, 정해진 시간은 세포 분열 사이클에 관계된 간격(interval)과 일치한다.

따라서, 이 정확한 타이밍은 특정 세포 타입의 사용에 대해 요구되는 것으로서 적용될 수 있으며, 이는 당업자에게 있어서는 통상적인 실험이 된다.

바람직하게는, 상기 정해진 시간은 숙주 세포의 2차 세포분열 사이클 또는 추가의 세포분열 사이클, 바람직하게는 2차 사이클의 동일한 기간에 진입하는 순간이다.

이 시간은 통상적으로 이전의 형질전환이 일어나고 난 후 6시간 내지 8시간, 바람직하게는 20시간 내지 24시간이 적합하다.

또한, 본 발명에 포함되는 것은 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법이며, 상기 방법은 1 이상의 소망하는 DNA 서열을 포함하는 1 이상의 1차 분리 및 정제된 DNA 서열 및 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 1 이상의 MAR 뉴클레오티드를 포함하는 2차 정제된 DNA:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체를, 상기 진핵 숙주 세포에 동시-형질전환하는 단계를 포함한다.

상기 1차 분리 및 정제된 DNA 서열은 상기에 기재한 바와 같은 1 이상의 MAR 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.

또한 고려되는 것은 단백질 생산 방법이며, 여기서 진핵 숙주 세포는 본 발명에 제시된 바와 같은 형질전환 방법에 따라 형질전환되고, 단백질의 발현에 적합한 환경하에서 배양 배지에서 배양된다. 상기 단백질은 당업계에 공지된 모든 회수(recover) 과정에 따라 최종적으로 회수된다.

실시예로서 제시된 바와 같이, 다음과 같은 단백질 생산 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 형질전환 방법으로 형질전환된 진핵 숙주 세포는, 상기 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 상기 세포를 배양하고 상기 단백질을 회수함으로써 단백질을 생산하는 방법에 사용된다. 적합한 배양 조건은 예를 들어 국제특허공개공보 WO 96/39488에 개시된 바와 같은 진핵 세포의 인 비트로 배양에서 통상적으로 사용된 조건이다. 상기 단백질은 예를 들어 면역친화(immunoaffinity) 또는 이온-교환 컬럼 상에서의 분획(fractionation); 침전; 역상 HPLC; 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 젤 여과와 같은 통상적인 분리 기술을 이용하여 배양 세포로부터 분리될 수 있다. 당업자라면 소망하는 폴리펩타이드에 적합한 정제 방법이, 재조합 배양 세포에서 발현되는 동안 폴리펩티드의 특성에 있어서의 변화를 계산하기 위해 변형이 필요함을 잘 알 수 있을 것이다.

본 발명에 따라 생산된 단백질들은 다양한 방법에 의해 기능적으로 테스트될 수 있다. 예를 들어, 항원성 에피토프의 존재 및 리간드에 결합하는 단백질의 능력은 웨스턴 블랏 분석, 형광 세포 선별 분석, 면역침전법, 면역화학 분석 및/또는 경쟁적 결합 분석뿐만 아니라 특이 결합 활성을 측정하는 다른 모든 분석법에 의해 확인될 수 있다.

본 발명의 방법은 이에 한정되는 것은 아니지만 하기를 포함하는 수개의 실제적 적용에 사용될 수 있다:

1. 바이러스/병원체 안타고니스트로서 재조합 숙주 단백질 항원을 이용한 면역화(immunization).

2. 진단 또는 스크리닝 분석용 막 단백질의 생산.

3. 생화학적 연구용 막 단백질의 생산.

4. 구조적 연구용 막 단백질의 생산.

5. 오르판(orphan) 수용체 및 이온 채널의 매핑을 포함하는 면역-조직화학적 매핑을 하기 위한 항체를 생산하기 위한 항원 생산.

또한, 본 발명에 의해 제공되는 것은 모든 선행하는 형질전환 방법에 따라 형질전환된 진핵 숙주 세포이다. 바람직하게는, 진핵 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포주이다.

이미 기재한 바와 같이, 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 인간 배아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양에서 성장한 서브클론된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol 36, 59 (1977)), 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2), 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065)와 같은 인간세포; 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77, 4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol . Reprod 23, 243-251 (1980)), 마우스 유방 세포(MMT 060562, ATCC CCL51)와 같은 설치류 세포; 및 SV4O에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 물소 래트(rat) 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442)와 같은 다른 포유동물의 세포; 마이엘로마(예. NS0)/하이브리도마 세포를 포함한다.

본원에서 사용하기에 가장 바람직한 것은 CHO 세포이다.

본 발명은 본 발명에 따른 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열을 포함하는 세포 형질전환 혼합물(mixture) 또는 킷트(kit)도 제공한다.

본 발명은 형질전환 생물체를 추가로 포함하며, 여기서 상기 생물체 세포의 최소한 일부에는, 하기로부터 선택되는 1 이상의 DNA 서열:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

이의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 길이에서 70% 이상의 뉴클레오티드를 공유하는 이의 부분 서열, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및 변이체가 안정하게 삽입되어 있다.

바람직하게는, 형질전환 생물체의 세포의 일부는 본원에 개시된 방법에 따라 형질전환되어 있다.

또한, 본 발명에 포함되는 것은 형질전환 생물체이며, 이 생물체의 게놈에는 하기로부터 선택되는 1 이상의 DNA 서열:

- 단백질 생산 증가 활성을 가진 분리 및 정제된 DNA 서열,

- 서열번호 1 내지 27의 서열,

- 분리 및 정제된 cLysMAR 엘리먼트 및/또는 단편,

본 발명에 유용할 수 있는 형질전환 진핵 생물체는 예를 들어 포유동물(마우스, 인간, 원숭이 등)을 포함하며, 구체적으로는 일반적으로 설치류, 곤충(초파리 등), 어류(제브라 피쉬 등), 파충류(개구리, 도룡뇽 등...) 및 c.엘레강스(c. elegans), 효모 등과 같은 다른 단순 생물체와 같은 실험 동물을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 개시된 바와 같은 MAR 서열의 동정 방법을 수행하기 위한 컴퓨터-수행가능 수단(instruction)을 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공하는 것이다.

전술한 기재는 하기 실시예를 참조로 함으로써 더 완전하게 이해될 수 있을 것이다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명을 실시하는 방법의 일례이며 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

도 1은 MARs 및 비-MARs 서열의 분포도(distribution plot)를 나타낸다. 히 스토그램은 관찰된 파라미터의 값에 대한 농도 도표(빈(bin) 너비로 나눈 상대 빈도)이다. SMARt DB 데이터베이스에서의 인간 MARs에 대한 농도 히스토그램은 검은색으로 표시되어 있으며, 인간 염색체 22에 대한 농도 히스토그램은 회색으로 표시되어 있다.

도 2는 SMAR Scan

의 사용에 의한 4개의 다른 기준의 분산도 및 SMARt DB로부터의 인간 MARs을 이용한 AT-함량(content)을 나타낸다.

도 3은 생물체에 따른 MAR 서열의 분포도를 나타낸다. SMARt DB로부터 다른 생물체의 MAR 서열을 검색하여 분석하였다. 마우스, 닭, 수수(sorghum bicolor) 및 인간에 대한 MAR 서열 농도 분포가 함께 플로팅되어 있다.

도 4는 인간 염색체 22 및 셔플된(shuffled) 염색체 22 상에서의 SMAR Scan

의 예측을 나타낸다. 상단 도표: 하기 5개를 이용해 SMAR Scan

에 의해 얻어진 평균 히트(hits) 수: 10 bp의 비중복 윈도우 내에서 조각나고(rubble), 스크램블되고(scrambled) 셔플된(shuffled) 것, 오더 1 마르코브 체인(Markov chain) 모델 및 천연(native) 염색체 22. 하단 도표: 하기 5개에서 SMAR Scan

에 의해 예측된 MARs의 평균 갯수: 10 bp의 비중복 윈도우 내에서 조각나고, 스크램블되고, 셔플된 것, 오더 1 마르코브 체인(Markov chain) 모델 및 천연 염색체 22.

도 5는 CHO-DG44 세포에서 형질전환 유전자 발현을 자극하기 위한 닭 라이소자임 유전자 5'-MAR의 활성의 조사(dissection)를 나타낸다. 단편 B, K 및 F는 형질전환 유전자 발현을 촉진시키는 능력이 높은 것으로 나타낸다. 엘리먼트의 표시 된 상대 강도는 고-발현 세포의 수를 기준으로 하였다.

도 6은 형질전환 유전자 발현을 촉진시키는 능력의 소실에 대한 5'-MAR의 5'-말단 (상부) 및 3'-말단(하부)의 순차적-결실의 영향을 나타낸다. 증가된 활성으로부터 감소된 활성으로의 전이는 B-, K- 및 F-단편과 일치한다.

도 7은 형질전환 유전자 발현을 유의적으로 촉진시키는 F 단편의 부분(portion)을 나타낸다. 밝은 회색 화살표로 표시된 F 단편 부위를 다중화시키고(multimerize), pGEGFP control에 삽입하였으며 CHO 세포에 형질전환시켰다. 높은 활성을 나타내는 엘리먼트는 엘리먼트의 중앙 부분에 위치하며 단편 FIII(검은색 막대로 표시된 최소 MAR)와 일치한다. 또한, 인핸서 활성도를 나타내는 엘리먼트는 FIII 단편의 3'-플랭킹 부분(짙은 회색 막대로 표시된 MAR 인핸서)에 위치한다.

도 8은 cLysMAR 내의 다양한 DNA 서열 모티프의 위치의 맵(map)을 나타낸다. 도 8(B)는 cLysMAR 내의 다양한 DNA 서열 모티프의 위치 맵을 표시한다. 수직선은 컴퓨터-예측한 위치(site) 또는 cLysMAR 및 도 5에 표시된 바와 같은 이의 활성 부위의 3034개 염기쌍을 통한 서열 모티프의 위치(position)를 나타낸다. MatInspector(Genomatix)를 이용해, 활성화 인자에 대한 추정되는 전사 인자 위치 (MEF2 05, Oct-1, USF-02, GATA, NFAT) 및 전사 억제 인자에 대한 (CDP, SATB1, CTCF, ARBP/MeCP2)를 동정하였으며, CPGPLOT를 이용해 CpG 섬(island)을 동정하였다. MAR 엘리먼트와 이전에 결합한 모티프는 검은색으로 표시되어 있고, CpG 디뉴클레오티드 및 CpG 섬, 풀린(unwinding) 모티프(AATATATT 및 AATATT), poly As 및 Ts, poly Gs 및 Cs, 6 bp 코어에 대해 동일성을 가진 초파리 토포이소머라제 II 결합 자리 (GTNWAYATTNATTNATNNR) 및 고 이동성 그룹 I(high mobility group I, HMG-I/Y) 단백질 결합 자리를 포함한다. 다른 구조적 모티프는 뉴클레오좀-결합 자리 및 뉴클레오좀 디스페이버(disfavouring) 위치 및 고차 나선형(superhelical) DNA 가닥인 것으로 생각되는 모티프를 포함한다. 도 8(A)는 MarFinder를 이용하는 MAR 예측 점수 프로파일을 이용하여, 전사를 활성화시키는 cLysMAR의 부분의 활성의 비교를 나타낸다. 상단 도표는 도 5에 표시된 바와 같은 MAR 단편의 활성을 나타내는 반면, 중단 및 하단 커브는 MAR 활성 및 벤트 DNA 구조 각각에 대한 MARFinder-예측된 잠재성을 나타낸다.

도 9는 MAR 활성도와 DNA 물리-화학적 특성의 관계를 나타낸다. 도 9(A)는 5'-MAR의 DNA 녹는점, 이중 나선 벤딩(bending), 메이저 그루브 깊이 및 마이너 그루브 너비 프로파일을 나타내며, 이들은 레비츠키 등의 알고리즘(Levitsky VG, Ponomarenko MP, Ponomarenko JV, Frolov AS, Kolchanov NA “Nucleosomal DNA property database” Bioinformatics, 15; 582592, 1999)을 이용하여 검정하였다. 상단에 표시된 가장 활성을 띄는 B, K 및 F 단편은 도 1에 표시된 바와 같다. 도 9(B)는 패널 A에 표시된 데이터를 확장하여 표시해주며, 녹는점(상단 커브) 및 DNA 벤딩(하단 커브)에 대응하여 따라가면서 정렬한 F 단편 맵을 나타낸다. 가장 활성을 띄는 FIB 단편의 위치 및 특정 전사 인자에 대한 단백질 결합 자리는 표시된 바와 같다.

도 10은 5'-cLysMAR 내의 추정되는 전사 인자 결합 자리의 분포를 나타낸다. 큰 화살표는 SMAR Scan

로 동정한 바와 같은 CUE 엘리먼트의 위치를 표시한다.

도 11은 다양한 MAR 부분의 조립에 대한 계획도(scheme)를 나타낸다. cLysMAR의 표시된 부분을 PCR로 증폭하고, 각 말단에 BglII-BanHI 링커 엘리먼트를 삽입한 뒤, 조립함으로써 표시된 복합 엘리먼트를 제조하였다. 예를 들어, 상단의 컨스트럭트는 모든 CUE 및 플랭킹 서열이, 각 엘리먼트를 분리하는 BglII-BanHI 링커 서열을 제외한 그의 원래 위치에 조립된 것으로 구성된다.

도 12는 플라스미드 맵을 나타낸다.

도 13은 GFP 발현에 대한 1차 형질전환체의 재-형질전환의 효과를 나타낸다. 세포(CHO-DG44)를 pSV40EGFP(왼쪽 튜브) 또는 pMAR-SV40EGFP(중간 튜브) 및 내성 플라스미드로서 pSVneo로 동시 형질전환시켰다. pMAR-SV40EGFP로 형질전환된 세포들을 동일한 플라스미드 및 다른 선별 플라스미드인 pSVpuro(오른쪽 튜브)로 24시간 후에 재-형질전환시켰다. 2주 동안의 선별 후에, 안정하게 형질전환된 세포 군집의 표현형을 FACS로 분석하였다.

도 14는 MAR-포함 플라스미드의 복합 로드(load)의 영향을 나타낸다. pMAR-pSV40EGFP/pMAR-SV40EGFP 2차 형질전환체를 선별 단계의 마지막에 형질전환의 3번째 사이클에서 사용하였다. pMAR 또는 pMAR-SV40EGFP을 이용하여 3차 형질전환을 수행함으로써 3차 형질전환체를 제조하였다. 24시간 후에, 세포를 플라스미드로 다시 형질전환시킴으로써, 4차 형질전환체를 제조하였다(참조, 표 4).

도 15는 WP18A10A7 부위로 실시한 SMAR 예측 알고리즘의 비교 수행(performance)을 나타낸다. (A) SMAR Scan

분석을 초기 설정으로 수행하였다. (B) SIDD 분석(상단 커브, 왼쪽 면의 스케일) 및 수개의 DNA 단편의 핵 매트릭스에 대한 인 비트로에서의 부착도(막대-그래프, 오른쪽 면의 스케일)는 고에츠 등의 방법(Goetze S, Gluch A, Benham C, Bode J, “Computational and in vitro analysis of destabilized DNA regions in the interferon gene cluster: potential of predicting functional gene domains.” Biochemistry, 42:154-166, 2003)으로 얻었다.

도 16은 MARs를 이용한 유전자 치료법-유사 프로토콜의 결과를 나타낸다. 실험의 시작 단계에 유도된, MAR-네트워크를 주입한 마우스 그룹은 MAR을 제외한 원래의 네트워크를 주입한 마우스와 비교하여 적혈구 용적율(hematocrit)이 훨씬 더 유도되는 것으로 나타났다. 2달 후에, “MAR-포함 그룹”에서의 적혈구 용적율은 정상 적혈구 용적율 레벨(45-55%)에 비해 여전히 높은 값(65%)을 나타내었다.

도 17은 SMAR can

로 계산한 예측된 DNA 벤딩에 대한 1757개 S/MAR 서열의 AT(상단) 및 TA(하단) 디뉴클레오티드의 백분율의 분산도를 나타낸다.

도 18은 1757개의 비-S/MARs 서열에 대한 디뉴클레오티드 백분율 분포도를 나타낸다.

도 19는 재조합 녹색 형광 단백질(GFP)의 생산에 대한 다양한 S/MAR 엘리먼트의 효과를 나타낸다. 표시된 바와 같이 MAR 엘리먼트를 포함하거나 포함하지 않는 GFP 발현 벡터로 형질전환된 CHO 세포의 군집을 형광-활성화된 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorter, FACS

)로 분석하였으며, 전형적인 프로파일들이 표시되어 있다. 프로파일은 GFP 형광 레벨의 기능으로서 세포 수 계 수(count)를 나타낸다.

도 20은 MAR-네트워크를 주입한 마우스에서의 적혈구 용적율의 유도 효과를 표시한다.

실시예 1: SMAR Sc an

및 MAR 서열

실험적으로 확인된 인간 MARs 및 비-MAR 서열을 분석함으로써 SMAR Scan

의 대략적인 1차 평가를 수행하였다. MAR 서열로서, SMARt Db로부터 인간 MARs를 분서함으로써 얻어진 이전의 결과물을, 도 1에 표시된 바와 같은 각 기준에 대한 밀도 히스토그램을 도표화하는데 사용하였다. 유사하게, 비-MAR 서열도 분석하고 도표화하였다. 비-MAR 서열로서, 염색체 22로부터의 모든 Ref-Seq-contig를 사용하였으며, 이 후자는 비-MAR 서열의 일부로 간주되는 MAR 서열의 무시할 수 있는 부분을 포함하기에 아주 충분한 것으로 고려하였다.

도 1에 표시된 밀도 분포도는 모두 긴 꼬리의 비대칭이었다. 가장 높은 벤드(bend), 가장 높은 메이저 그루브 깊이 및 가장 높은 마이너 그루브 너비에 대한 분포도는 오른쪽으로 비대칭이었다. 가장 낮은 녹는점에 대한 분포도는, 다른 3개와 관련된 기준에 대해 역으로 대응되는 자연적으로 제시된 왼쪽-비대칭이었다. MAR 서열에 대해서는, 실제적으로는 2번째 약한 피크를 가진 2형상(biphasic)의 분포도가 바람직하다. 그리고, MAR 및 비-MAR 서열 분포도 사이에는, 명백한 이동(shift)도 각 도표에서 보인다.

사용된 모든 인간 MAR 서열 중에서, 평균적으로는 이들 중의 약 70%만이 4개의 다른 기준에 대해 인간 MARs 분포의 75th 분위(quantile)보다 큰 값을 가졌다. 유사하게 인간 MARs 분포 각각의 두번째로 약한 피크에 대해서는, 인간 MAR 서열의 15% 만이 이러한 범위밖(outlying) 값을 가졌다. 이러한 인간 MAR 서열의 15% 중에서, 대부분은 인터페론 위치 MAR, 베타-글로빈 위치 MAR(Ramezani A, Hawley TS, Hawley RG, “Performance- and safety-enhanced lentiviral vectors containing the human interferon-beta scaffold attachment region and the chicken beta-globin insulator” Blood, 101:4717-4724, 2003) 또는 아포지방단백질 MAR(Namciu, S, Blochinger KB, Fournier REK, “Human matrix attachment regions in-sulate transgene expression from chromosomal position effects in Drosophila melanogaster” Mol . Cell. Biol., 18:2382-2391, 1998)과 같은, 포지션 영향으로부터 형질전환 유전자를 고립시키는 데 사용되는 매우 잘 도큐멘트된(documented) MARs이었다.

항상 동일한 데이터를 이용하여, 계산된 4개의 이론적 구조 특성 및 AT-함량 사이의 관계를 검증하기 위해 인간 MAR 서열도 사용되었다. 도 2는 분산도(scatterplot) 및 각 쌍의 기준에 대응되는 상관 계수(correlation coefficient) r을 나타낸다.

실시예 2: 생물체에 따른 MAR 서열의 분포도

다른 생물체의 SMARt DB로부터의 MAR 서열도 상기에 설명한 바와 동일하게 검색하고 분석하였다. 마우스, 닭, 수수(sorghum bicolor) 및 인간에 대한 MAR 서열 농도 분포가 도 3에 함께 플로팅되어 있다.

실시예 3: 전체 염색체 22의 MAR 예측

초기 설정을 사용하고 SMAR Scan

을 이용하여 염색체 22로부터 모든 RefSeq contig를 분석하였다. 그 결과로서 SMAR Scan

에서 전체 803개의 MARs를 예측하였고, 이의 평균 길이는 446 bp이며, 이는 42777 bp 당 평균 1개의 MAR이 예측됨을 의미한다. 예측된 MARs의 전체 길이는 염색체 22의 길이의 1%에 상응하였다. 예측된 부위의 AT-함량은 65.1% 내지 93.3%이고; 이러한 모든 부위의 평균 AT-함량은 73.5%였다. 따라서, 예측된 MARs는 AT가 풍부한 반면, 염색체 22는 AT가 풍부하지 않았다(52.1% AT).

또한, 염색체 22의 전체를 분석하기 위해 SMARTest가 사용되었으며, 이에 의해 1387개의 MAR 후보자를 얻었고, 이의 평균 길이는 495 bp이고 24765 bp 당 평균적으로 1개의 예측된 MAR을 나타내었다. 예측된 MARs의 전체 길이는 염색체 22의 2%에 대응되었다. 2개의 소프트웨어에 의해 예측된 모든 MARs 중에서, 예측된 154개의 MARs는 2개 모두의 프로그램에 의해 발견되었고, SMAR Scan

및 SMARTest에서 MARs의 19% 및 11%를 각각 예측하는 것으로 나타났다. 제시된 예측된 MARs는 SMAR Scan

및 SMARTest에 대한 길이를 의미하고, SMAR Scan

및 SMARTest 예측간에 중첩하는 기회에 의해 얻어지는 확률은 예측 당 0.0027%이다.

SMAR Scan

예측의 특이성을 검증하기 위해, SMAR Scan

분석을 염색체 22의 무작위로 셔플된 서열 상에서 수행하였다(도 4). 셔플된 서열은 다음의 4개의 다른 방법을 이용해 제조하였다: 10bp의 중첩하지 않는 윈도우 내로 염색체 22를 분할(segmentation)하고 각 윈도우에 있는 뉴클레오티드를 각각 셔플링하는 것; 염색체의 모든 뉴클레오티드를 순차교환시키는 것을 의미하는 “스크램블링(scrambling)”; 10bp의 단편에 있는 염색체의 분할 및 이러한 단편의 무작위 조합을 의미하는 “러블링(rubbling)”, 이들 단편의 무작위 어셈블링 및 최종적으로는 오더(order) 1 마르코브(Markov) 체인, 여기서 다른 상태는 다른 DNA 디뉴클레오티드가 되고 이러한 상태간의 전이 가능성은 염색체 22 스캔에 기초한다. 각 셔플링 방법에 대해, 5개의 셔플된 염색체 22가 제조되었고, 초기설정을 이용하여 SMAR Scan

로 분석하였다. 넘버 히트에 대해서는, 평균 3 519 170개 히트(sd: 18 353)가 10bp의 중첩하지 않는 윈도우 내에 있는 순차교환된 염색체 22에서 발견되었고, 171 936,4개 히트(sd: 2 859,04)가 스크램블된 서열에서, 24 708,2개 히트(sd: 1 191,59)가 러블된 염색체 22에서, 평균 2 282개 히트(sd:334,7)가 오더 1 마르코브 체인 모델에 따라 염색체 22로부터 생성된 염색체에서 발견되었으며, 이들 각각은 천연 염색체 22와 함께 발견된 히트의 갯수가 185%(sd:평균 0.5%), 9%(sd:1.5%), 1%(sd:5%) 및 0.1%(sd:15%)로 나타났다. 예측된 MARs의 갯수에 대해서는, 300, 1 997 MARs보다 더 긴 길이의 인접 히트가 10bp(sd:31.2)의 윈도우 내에서 셔플된 염색체 22로 예측되는 것을 의미하며, 단지 2.4 MARs 후보자가 스크램블된 서열(sd:0.96)에서 발견되었고, 러블(rubbled) 및 마르코브 체인 모델에 따라 생성된 서열에서는 발견되지 않았으며, 여기서는 천연 염색체 22에서 발견된 예측된 MARs의 수의 249% 및 0.3% 이하로 각각 표시된다. 이러한 데이터는 DNA 서열이 셔플될때, SMAR Scan

이 조직화를 상실한 특정 DNA 엘리먼트를 검출한다는 사실을 제공한다.

실시예 4: SMAR Scan

을 이용한 인터페론 위치에 있는 공지된 매트릭스 부착 부위의 분석

SMAR Scan

에 의한 MAR 예측의 관련성은, 염색체 9의 숏트 암(short arm)(9p22) 상에 있는 인간 인터페론 유전자 클러스트의 MAR 부위-최근에 공개된-를 분석함으로써 확인하였다. 고에츠 등(Goetze et al. 이미 인용됨)은 BURs(이 경우 스트레스-유도된 듀플렉스 탈안정화(stress-induced duplex destabilization) 또는 SIDD로 의미됨) 및 핵 매트릭스에 대한 인 비트로 결합(도 9, 하단 부분) 사이의 추측되는 관계를 분석하기 위해, WP18A10A7 위치의 완전(exhaustive) 분석을 보고하였다. SIDD 피크 3개는 인 비트로 결합 분석과 일치하였으나, 나머지는 매트릭스 부착 위치와 매치하지 않았다. SMAR Scan

을 이용한 인터페론 위치의 조사(도 9, 상단 부분)에서는 SATB1, NMP4 및 MEF2 조절자 결합 자리의 클러스터를 동반하는 3개의 메이저 피크가 활성 MARs와 상호연관성이 좋음을 나타내었다. 따라서, 본 발명자들은 예측된 CUEs 및 이러한 전사 인자에 대한 결합 자리의 발생이 cLysMAR에 제한되지 않으나 모든 MARs의 공통적인 특성이 될 수 있다고 결론지었다. 또한, 이러한 결과들은 SMAR Scan

프로그램이 게놈 서열로부터 MAR 엘리먼트를 효과적으로 검출할 수 있다는 사실을 포함한다.

실시예 5: SMAR Scan

예측의 정확도 및 다른 예측 기술을 이용한 비교

실험적으로 확인한 MARs가 매핑된 6개의 게놈 서열을 이용해 SMAR Scan

의 정확도를 검증하였다. 다른 예측 기술을 이용해 비교를 수행하기 위해, 이전의 서열과 동일한 분석된 서열을 MAR-Finder 및 SMARTest를 비교하는데 이용하였다. 이러한 게놈 서열은 전체 310 151bp이고 37개의 MARs로 실험적으로 확인된 3개의 식물 서열 및 3개의 인간 서열(표 1)이다. 표 1에 있는 SMARTest 및 MAR-Finder에 대한 결과는 이전의 비교(Frisch M, Frech K, Klingenhoff A, Cartharius K, Liebich I and Werner T, In silico pre-diction of scaffold/matrix attachment regions in large genomic sequences, Genome Research, 12:349-354, 2001.)로부터 얻었다.

0.4로 설정된 역치 및 프로타민 위치의 분석을 제외하고, 초기설정 파라미터를 이용해 MAR-Finder를 이용하였고, AT-풍부 규칙(rule)은 제외되었다(프로타민 위치에 대해 수행된 것으로 비 AT-풍부 MARs를 검출하기 위해)

SMAR Scan

정확도의 측정

6개의 다른 게놈 서열, 3개의 식물 서열 및 3개의 인간 서열-이들에 대해 실험적으로 확인된 MARs가 공지되어 있음-은 MAR-Finder, SMARTest 및 SMAR Scan

을 이용해 분석하였다. 참 양성(true positive) 매치는 굵게 인쇄되어 있고, 마이너스(-)는 거짓 음성(false negative) 매치를 나타낸다. 1 이상의 인 실리코(in silico) 예측에 포함된 실험적으로 확인된 더 긴 MARs의 일부를 각각 참 양성 매치로서 계수하였다. 따라서, 인 실리코 예측의 참(true)의 갯수는 발견된 실험적으로 확인된 MARs의 갯수보다 더 많다. 특이성은 참 양성 예측의 비율로서 정의되어 있는 반면, 민감성은 발견된 실험적으로 확인된 MARs의 비율로서 정의된다. *AT-풍부 규칙은 MAR-Finder를 이용하여 배제되었다.

SMARTest는 MARs로서 28개의 부위를 예측하였고, 이들 중 19개(참 양성)은 실험적으로 확인된 MARs와 연관성이 있지만(특이성: 68%) 9개(32%)는 비-MARs(거짓 양성)에 위치한다. 1 이상의 인 실리코 예측을 포함하는 실험적으로 결정된 가장 긴 MARs의 일부로서, 19개의 참 양성은 실질적으로 14개의 다른 실험적으로 확인된 MARs와 일치한다(특이성: 38%). MARFinder는 MARs로서 25개의 부위를 예측하였고, 이들 중 20개(특이성: 80%)는 12개의 다른 실험적으로 확인된 MARs(민감도: 32%)에 일치하는 실험적으로 확인된 MARs와 관계가 있다. SMAR Scan

은 22개 부위를 예측하였고, 17개는 14개의 다른 실험적으로 확인된 MARs(민감도: 38%)와 매치하는 참 양성(특이성:77%)이다.

다른 실시예로서, 인간 염색체 1 및 2에 동일한 분석을 적용하여, 23개의 MARs 서열(서열번호 1 내지 23)을 확인하였다. 이들 서열은 ST25 포맷의 첨부문서 1에 리스트되어 있다.

실시예 6: 혼합 방법( SMAR Scan

- pfsearch )을 이용한 전체 게놈의 분석

SMAR Scan

에 의해 계산된 구조적 특징 및 S/MAR 기능적 활성 간의 잠재적 연관성을 테스트하기 위해, 계산된 이론적 구조적 특징에 대해 가장 높은 값을 가지는 서열-이하 “슈퍼” S/MARs로 약칭함-을 얻기 위해 매우 엄격한 파라미터를 사용한 혼합 방법을 이용하여 전체 인간 게놈을 분석하였다. 이는 형질전환 유전자 발현 및 재조합 단백질 생산을 증가시키기 위한 많은 잠재성을 가진 예측된 MAR 엘리먼트를 얻기 위해 수행되는 것이 바람직하다. 먼저, 얻어진 추정의 S/MARs를 이를 특성화하고 분류하기 위한 시도의 관점에서 바이오인포매틱스로부터 분석하였다.

6.1 인간 전체 게놈의 분석으로부터 예측된 S/ MARs

인간 전체 게놈으로서, 모든 인간 RefSeq(National Center for Biotechnology Information, The NCBI handbook [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), Oct. Chapter 17, The Reference Sequence (Ref-Seq) Project, 2002 (Available from http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books) contigs(release 5)를 사용하였으며, 혼합방법-이는 1차 레벨 프로세싱에 있는 필터로서 SMAR Scan

을 이용하고, 가장 높은 벤드 컷오프 값을 제외하고는 초기설정을 이용하는 반면, DNA 벤딩 기준에 대해서는 4.0 도(degree)(3.202 도를 제외하고)의 엄격한 역치가 사용됨-을 이용해 분석하였다.

2차 레벨 프로세싱에서, 예측된 결합 전사 인자는 이러한 서열 상의 어떠한 필터 단계도 수행하지 않는 이전 단계로부터 선택되는 서열로서 생각되었다.

인간 전체 게놈의 혼합 방법에 의한 분석은, 전체 1 065 305 bp(인간 전체 게놈의 0.35%)로 표시되는 1757개의 추정 “슈퍼” S/MARs 전체를 산출하였다. 표 2는 각 염색체에 대해 이의 크기, 이의 유전자의 갯수, 이의 예측된 S/MARs의 갯수, 유전자 당 이의 S/MARs 밀도 및 S/MAR 당 이의 kb를 나타낸다. 이 표는 다른 염색체에 대해 예측된 S/MAR 당 유전자 밀도가 매우 다양함을 나타낸다(표준편차는 예측된 S/MAR 당 평균 유전자 밀도의 50% 이상으로 나타나고, S/MAR 당 더 높은 유전자 밀도 및 더 낮은 밀도 간의 배수 차이는 6.5이다). 또한, 표 2는 S/MAR 당 kb가 S/MAR 당 유전자의 밀도보다 낮게 다양함을 보여준다(표준편차는 S/MAR 당 평균 kb의 25%로 나타나고, S/MAR 당 높은 kb 및 낮은 kb 사이의 배수 차이는 3.2이다).

염색체 당 예측된 S/MARs의 갯수

염색체	염색체 당 유전자 갯수	염색체 크기 (백만 bp)	예측된 S/ MARs 의 갯수	S/MAR 당 유전자 밀도	S/MAR 당 Kb
1	2544	230	85	29.9	2705
2	1772	241	143	12.3	1685
3	1406	198	101	13.9	1960
4	1036	190	118	8.7	1610
5	1233	180	116	10.6	1551
6	1247	170	94	13.2	1808
7	1383	160	179	7.7	1754
8	942	145	77	12.2	1883
9	1100	119	48	22.9	2479
10	1003	133	71	14.1	1873
11	1692	132	67	25.2	1970
12	1278	131	78	16.3	1679
13	506	97	70	7.2	1385
14	1168	88	36	32.4	2444
15	895	83	35	25.5	2371
16	1107	81	41	27	1975
17	1421	80	37	38.4	2162
18	396	75	51	7.7	1470
19	1621	56	36	45.02	1555
20	724	60	28	25.8	2142
21	355	34	18	19.7	1888
22	707	34	28	25.2	1214
X	1168	154	170	6.8	905
Y	251	25	30	8.3	833
합계	26 955	3 050	1 757	457	433 12
평균	1 123	127	73	19	1 804
Sd	510	72.8	45	10	462

염색체 당 유전자의 갯수는 GenBank 주석에 기초한 NCBI 인간 게놈 통계학(Build 34 Version 3)(National Center for Biotechnology Information, The NCBI handbook [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), Oct. Chapter 17, The Reference Sequence (Ref-Seq) Project, 2002 (Available from http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi db=Books)에 대응한다. 염색체 크기는 대응되는 인간 RefSeq(National Center for Biotechnology Information, The NCBI handbook [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), Oct. Chapter 17, The Reference Sequence (Ref-Seq) Project, 2002 (Available from http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi db=Books) (release 5) contig 길이의 합이다

6.2 전사 인자 결합 자리에 대한 “슈퍼” MARs의 바이오인포매틱스 분석

SMAR Scan

에 의해 이미 수득한 1757개의 예측된 “슈퍼” S/MARs 서열을, 잠재적 전사 인자 결합 자리에 대해 분석하였다. 이는 RMatch^TMProfessional(Kel AE, Gossling E, Reuter I, Cheremushkin E, Kel-Margoulis OV, Wingender E, MATCH: A tool for searching transcription factor binding sites in DNA sequences, Nucleic Acids Res. 31(13):3576-9, 2003), TRANSFAC을 기반으로 한 웨이트 매트릭스 기초의 기술(Wingender E, Chen X, Fricke E, Geffers R, Hehl R, Liebich I, Krull M, Matys V, Michael H, Ohnhauser R, Pruss M, Schacherer F, Thiele S, Urbach S, The TRANSFAC system on gene expression regulation, Nucleic Acids Research , 29(1):281-3, 2001)을 이용해 수행하였다. 대부분의 초기설정 Match^TM 분석과 함께 사용되는 Match^TM2.0 Propessional은 TRANSFAC Professional, release 8.2(20040360)를 기초로 하였다. Match^TM에 따라 분석된 1757개 서열 상의 모든 전사 인자 결합 예측의 합은 표 3에 표시되어 있다. 이 표를 기준으로, 1757개 서열 중에서 전체적으로 20개 이상을 히트하는 전사 인자만을 이후의 분석에서 고려하였다.

이하는 1757개의 추정 S/MAR 서열에 가장 잘 결합하는 것으로 예측되는 인간 전사 인자의 일부 및 이의 Match 설명이다: Cdc5 (세포 분할 조절 단백질 5, cell division control protein 5) 전사적 조절자/억제자(regulator/repressor), Nkx3A 안드로젠에 의해 조절되는 호메오도메인(homeodomain) 단백질, POU1F1 (뇌하수체-특이적 양성 전사 인자 1, pituitary-specific positive transcription factor 1) 이는 뇌하수체에 대해 특이적이고 세포 증식을 촉진함. 따라서, SATB1, NMP4 및 MEF2에 추가로, 다른 전사 인자들이 MARs의 활성에 관여할 수 있다.

AP-1	1	AR	2	Bach2	1	Brn-2	1
C/EBP	20	C/EBPgamma	5	CDP CR3	1	COMP1	2
CRE-BP1	34	Cdc5	858	Cdx-2	35	Evi-1	472
FOX	78	FOXD3	79	FOXJ2	244	FOXP3	29
Freac-7	272	GATA-1	2	GATA-3	142	GATA-4	125
HFH-1	12	HFH-3	1	HLF	275	HNF-1	337
HNF-3alpha	23	HNF-3beta	71	HP1	2	Lhx3	22
MEF-2	114	MRF-2	57	Myc	18	NKX3A	849
Nkx2-5	2	Oct-1	191	PBX	5	POU1F1	483
POU3F2	11	POU6F1	29	Pax-3	3	Pax-6	20
Pit-1	505	SRF	8	TEF	2852	TFIIA	14
TTF1	1	V$MTATA_B	4	VBP	53	Vmw65	1
XFD-1	65	XFD-2	418	XFD-3	2

표 3은 분석된 1757개 서열 상의 모든 전사 인자 결합 예측(전체 20개 이상의 히트)의 요약이다.

6.3 디뉴클레오티드 빈도에 대한 예측된 “슈퍼” MARs 의 바이오인포매틱스 분석

“슈퍼” S/MAR 서열을 쉽게 동정하기 위해, 계산을 하지 않고 확인할 수 있는 명시된(explicit) 기준을 이용해 다양한 컴퓨터 분석을 수행하였다. 이들 중에서, 디-뉴클레오티드 분석은 1757개의 슈퍼MARs에서 수행하였고, 5'>3' 방향에 있는 양 가닥으로 간주되는 각 서열에 대한 16개의 가능 디뉴클레오티드 백분율 각각을 계산하였다.

요약(최소, 최대, 중간, 평균, 25th 백분위수 및 75th 백분위수) 뿐만 아니라 1757개 S/MAR 서열에 대한 디뉴클레오티드 백분율 각각의 히스토그램이 표 4에 각각 표시되어 있다. 유사한 분석을, 무작위로 선택된 비-S/MAR 서열(그러나 일부 MARs를 포함할 수 있음)을 나타내는 인간 게놈으로부터 무작위로 선택된 서열에서 수행하였다. 표 5는 이러한 서열에 대한 디뉴클레오티드 함량 분석의 요약을 각각 나타낸다.

1757개 S/MAR 서열에 대한 디뉴클레오티드 백분율

	AA %	AC %	AG %	AT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	0.000 4.234 7.843 7.184 10.110 17.290	0.0000 0.9372 2.2408 3.2117 4.7718 12.9479	0.0000 0.1408 0.4777 1.0865 1.5096 8.1230	18.50 32.11 34.68 34.32 36.94 50.00
	CA %	CC %	CG %	CT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	0.0000 0.9695 1.9776 2.6977 3.7543 10.4061	0.00000 0.00000 0.00000 0.14123 0.09422 4.24837	0.0000 0.0000 0.0000 0.2709 0.1256 7.4410	0.0000 0.1408 0.4777 1.0865 1.5096 8.1230
	GA %	GC %	GG %	GT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	0.00000 0.08696 0.32616 0.63347 0.83333 5.77889	0.0000 0.0000 0.0000 0.2104 0.1914 9.8795	0.00000 0.00000 0.00000 0.14123 0.09422 4.24837	0.0000 0.9372 2.2408 3.2117 4.7718 12.9479
	TA %	TC %	TG %	TT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	28.63 33.48 35.22 35.29 37.14 50.00	0.00000 0.08696 0.32616 0.63347 0.83333 5.77889	0.0000 0.9695 1.9776 2.6977 3.7543 10.4061	0.000 4.234 7.843 7.184 10.110 17.290

요약 표에 있는 예측된 S/MAR 엘리먼트 및 비S/MAR 서열의 결과에 따르면, AT 및 TA 디뉴클레오티드 함량에서는 이들 서열의 두 그룹간에 현저한 차이가 확인되었다. AT 및 TA는, 예측된 S/MAR 서열의 디뉴클레오티드 함량의 18.5% 및 28.6% 이상으로 각각 나타나는 반면, 비S/MAR 서열에서의 동일한 디뉴클레오티드에 대한 최소 백분율은 0.3% 및 0%로 각각 나타났다. 유사하게는, S/MAR 서열에 있는 최대 CC 및 GG 함량이 4.2%이지만, 비S/MAR 서열에 있어서는 이들 2개 디뉴클레오티드에 대한 백분율이 20.8%까지 증가될 수 있다.

AT 및 TA 디뉴클레오티드 백분율 사이의 관계 및 SMAR Scan

에 의해 계산된 바와 같은 가장 높은 DNA 벤드가, 예측된 S/MAR 서열에 대해 도 17에 표시되어 있고, 비S/MAR 서열에 대해 도 18에 표시되어 있다. 이들 도면의 다른 분산도에서는, TA 백분율이 SMAR Scan

에 의해 예측된 바와 같은 예측된 DNA 벤드와 관련성이 좋음을 보여준다.

1757개 비S/MAR 서열 요약에 대한 디뉴클레오티드 백분율

	AA %	AC %	AG %	AT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	0.000 7.096 9.106 8.976 10.939 17.922	1.735 4.586 5.016 5.054 5.494 13.816	1.512 6.466 7.279 7.184 7.969 12.232	0.3257 5.1033 6.8695 7.0108 8.7913 23.1788
	CA %	CC %	CG %	CT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	3.571 6.765 7.410 7.411 8.010 15.714	0.8278 4.1077 5.5556 5.9088 7.2460 20.8415	0.0000 0.4727 0.8439 1.2707 1.5760 12.6074	1.512 6.466 7.279 7.184 7.969 12.232
	GA %	GC %	GG %	GT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	1.319 5.495 6.032 6.065 6.602 10.423	0.4967 3.2615 4.4092 4.7468 5.8824 16.0000	0.8278 4.1077 5.5556 5.9088 7.2460 20.8415	1.735 4.586 5.016 5.054 5.494 13.816
	TA %	TC %	TG %	TT %
최소 25th 백분위수 중간값 평균 75th 백분위수 최대	0.000 3.876 5.625 5.774 7.464 24.338	1.319 5.495 6.032 6.065 6.602 10.423	3.571 6.765 7.410 7.411 8.010 15.714	0.000 7.096 9.106 8.976 10.939 17.922

신규한 슈퍼 MARs 중 4개를 무작위로 선별하여 AT 및 TA 디뉴클레오티드 함량에 대해 분석하고, 100개 염기쌍의 윈도우로 간주되는 공지된 닭 lysMAR과 비교하였다 (표 6).

놀랍게도, 본 출원인은 슈퍼 MARs 모두의 AT 디뉴클레오티드 빈도가 DNA의 100개 염기쌍의 윈도우에 있는 분석된 전체 디뉴클레오티드의 12% 이상이고, TA 디뉴클레오티드 빈도가 10% 이상임을 밝혔다. 가장 효율적인 MARs는 2개의 디뉴클레오티드 쌍의 34% 근처 값을 나타내었다.

실험적으로 검증한 MARs의 %AT 및 TA 디뉴클레오티드 빈도의 요약

CLysMAR (CUEs의 평균)	AT%　: 12.03	TA%　: 10.29	서열번호
P1_68	AT%　: 33.78	TA%　: 33.93	서열번호
P1_6	AT%　: 34.67	TA%　: 34.38	서열번호
P1_42	AT%　: 35.65	TA%　: 35.52	서열번호
모든 인간 “슈퍼”MARs에 대한 평균값	AT%　: 34.32	TA%　: 35.29
모든 인간 비-MARs에 대한 평균값	AT%　: 7.01	TA%　: 5.77

6.4 인간 및 마우스 게놈의 오쏘로거스 ( orthologous ) 유전자내 ( intergenic ) 부위의 분석

S/MAR 진화에 대한 식견을 얻기 위해, 인간 및 마우스 게놈의 오소로거스 유전자내 부위를 SMAR Scan

로 분석하였다. 이용된 데이터 세트는, 12개의 인간 염색체 및 12개의 마우스 염색체에 위치하는 인간 및 마우스 게놈(Shabalina SA, Ogurtsov AY, Kondrashov VA, Kondrashov AS, Selective constraint in inter-genic regions of human and mouse genomes, Trends Genet, 17(7):373-6, 2001)(평균 길이~12000 bp)으로부터의 87쌍의 완전한 오쏘로거스 유전자내 부위로 구성되어 있으며, 이들 서열의 신터니(synteny)는 쌍단위(pairwise) 서열 정렬 및 플랭킹 유전자의 주석(실험적 또는 예측된)을 고려하여 확인하였다.

87개의 인간 및 마우스 오쏘로거스 유전자내 서열의 분석은 이의 초기 설정을 이용해 SMAR Scan

로 분석하였다. 인간 서열의 분석에서는 5개의 다른 유전자내 서열에 위치한 전체 12개의 예측된 S/MARs(총 길이가 4 750 bp로 나타남)가 산출되었다.

SMAR Scan

엄격한 설정을 이용하여 “슈퍼” S/MAR을 포함하도록 예측된 3개의 인간 유전자내 서열 중에서, 대응되는 마우스 오쏘로거스 유전자내 서열 중의 하나는 S/MAR(인간 EMBL ID: Z96050, 포지션 28 010에서 76 951까지, 마우스 EMBL에 대한 오쏘로거스 ID: AC015932, 포지션 59 884에서 89 963까지)을 포함하는 것으로 예측되었다. 이들 2개 오쏘로거스 유전자내 서열의 국소적 정렬이 수행될 때, SMAR Scan

에 의해 예측된 부위에 상응하는 이러한 2개의 큰 부위의 가장 국소적인 정렬은 S/MAR 엘리먼트가 된다. “슈퍼” S/MAR을 포함하는 것으로 예측된 2개의 다른 인간 유전자내 서열의 마우스 오쏘로거스에 대한 수동 조사를, Ensembl 게놈 브라우저(http://ensembl.org)를 이용해 수행하였다. 이들 2개 인간 서열의 마우스 오쏘로거스 유전자내 서열을, Ensembl 오쏘로거스 예측(유전자 이름을 기준으로 함)-이는 이들 유전자내 부위를 플랭킹하는 인간 유전자 쌍에 대한 오쏘로거스 마우스 유전자를 검색함-을 이용해 검색하였다.

SMAR Scan

은 인간 서열에 대해 조절되어, 마우스 게놈 서열을 가진 작은 “슈퍼”MARs를 산출하기 때문에, 이의 초기설정 컷오프 값은 S/MAR로 간주되는 일치 히트의 최소 크기에 대해 약간 이완되었다(300 bp 대신에 200 bp 사용). SMAR Scan

에 의한 이러한 마우스 서열의 분석에서는, 수개의 S/MARs가 다른 계산된 구조적 특성에 대해 높은 값을 가지는 것으로 예측하였다. 이러한 발견은 인간 MAR 엘리먼트가 종간에 보존되어 있음을 제시해 준다.

실시예 7: 닭 라이소자임 유전자 5'-MAR의 절단(dissection)

3000개 염기쌍의 5'-MAR을 작은 단편으로 절단하여, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 형질전환 유전자 발현에 영향을 미치는지 모니터하였다. 이를 수행하기 위해, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 7개의 ~400bp 단편을 증폭하였다. 이들 PCR-증폭된 단편들은 말단-말단으로 위치시킬때 전체 MAR 서열과 일치하고 이를 커버하였다. 이들 각 단편의 4 카피를 헤드-테일 방향으로 연결하여, 천연 MAR 길이의 약 절반에 대응되는 길이를 얻었다. 테트라머를, pGL3Control 벡터(Promega)의 변형된 버젼인 pGEGFPControl에 있는 SV40 프로모터의 업스트림에 삽입하였다. 플라스미드 pGEGFPControl은 pEGFP-N1(Clontech)의 EGFP 유전자를 pGL3Control의 루시퍼라아제 유전자로 치환함으로써 얻었다. 제조된 5'-MAR-단편-포함 플라스미드는, 형질전환 시약으로서 LipofectAmine 2000(Invitrogen)을 이용해 CHO-DG44 세포에서 저항성 플라스미드 pSVneo와 함께 이전에 수행된 방법(Zahn-Zabal, M., et al., “Development of stable cell lines for production or regulated expression using matrix attachment regions” J Biotechnol, 2001. 87(1): p. 29-42.)으로 동시-형질전환시켰다. 항생제(G-418) 내성 세포를 선별하고 난 뒤, 폴리클로날 세포 군집을 EGFP 형광물질에 대해 FACS로 분석하였다.

형질전환 유전자 발현은, MAR 부재의 pGEGFPControl 벡터를 이용해 형질전환한 세포의 평균 형광도보다 4배 이상 높은 형광 레벨을 나타내는 세포로서 정의되는 고 발현자 세포의 백분위수로 표시하였다. 도 5는 원래 MAR 서열과 비교해 크기가 더 작음에도 불구하고, 멀티머화된 단편 B, K 및 F가 형질전환 유전자 발현을 증가시킴을 보여준다. 대조적으로, 다른 단편은 거의 활성이 없거나 완전히 불활성이었다.

실시예 8: MAR 컨텍스트에 있는 B, K 및 F 부위의 특이성

5'-MAR을 5'-말단(도 6, 상단) 또는 3'-말단(도 6, 하단) 각각으로부터 순차적으로 절단하였다. 절단된 엘리먼트의 영향은, 이전 섹션에서 기재한 바와 동일한 분석으로 모니터하였다. 도 6은 CHO 세포에서 형질전환 유전자 발현을 촉진시키는 능력의 상실이 고르게 분포하지 않음을 보여준다.

이 절단 분석에서, MAR 활성의 상실은 5'-MAR B-, K- 및 F-단편 각각과 오버랩하는 전이의 이산(discrete) 부위와 일치하였다. 5'-절단에서, 단편 K 및 F가 제거되었을때 활성이 거의 소실되었다. F 및 b 엘리먼트가 제거된 3' 절단은 가장 결정적인(pronounced) 효과를 나타내었다. 대조적으로, 플랭킹 부위 A, D, E 및 G는 그 자신에 대한 형질전환 유전자 발현을 촉진시키는 능력이 낮거나 없고(도 5), 이와 대응되어 5'- 및 3'-말단 절단 연구에서 MAR 활성에 대해 영향을 주지 않았다(도 6).

실시예 9: F 엘리먼트의 구조

465bp의 F 단편을 더 작은 부분(sub)-단편 234, 243 및 213 bp와 122, 125 및 121 bp 각각으로 추가로 절단하였다. 상기 전자(former) 그룹의 단편은 헤드-테일 방향으로 옥타머화(8 카피)하였고, 상기 후자(latter) 그룹의 단편은 유사하게 헥사-데카머화(16 카피)하여 MAR 서열의 길이를 일정하게 유지하게 하였다. 이들 엘리먼트들을 pGEGFPControl 벡터에 클로닝한 뒤, 상술한 바와 같이 CHO 세포에서 이들의 작용을 분석하였다. 흥미롭게도, 단편 FⅢ은 전장 F 단편의 활성을 대부분 유지하였으나, 단편 FⅢ의 오른쪽 부분을 포함하는 단편 FⅡ는 형질전환 유전자를 촉진시키는 능력을 대부분 상실하였다(도 7). 활성 부위에 대한 이 포인트는 FIB 단편에 있는 nt 132 내지 nt 221을 포함한다. 항상, 단편 FI 및 FIB의 복합 카피-이 부위를 포함함-는 유사한 활성을 나타내었다. 이 자체에 있는 FⅡA는 활성이 없다. 그러나, 이것이 FIB에 추가되어 FⅢ를 산출할 때에는, 전자의 활성을 증가시킨다. 따라서, FⅡA는 그 자체에서는 활성이 거의 없지만 FIB에 위치한 최소 도메인의 활성을 증가시키는 보조 서열(auxiliary sequence)을 포함하는 것으로 보인다.

라이소자임 유전자 5'-MAR 내에 있는 각 모티프의 분포 분석이, 본 출원인이 분석에 첨가시킨 일부 추가 모티프와 함께, 도 8A에 표시되어 있다. 이들 모티프의 대부분은 MAR 엘리먼트에 전체적으로 분포되지만, 활성 부분과 특이하게 결합하지는 않는 것으로 확인되었다. 예컨대, 전사 인자의 결합 자리 및 MAR과 결합한 다른 모티프들은 바람직하게는 활성 부위에 위치하지 않았다. 또한, 활성 MAR 서열이 다른 모티프의 조합을 포함할 수 있다는 사실도 제시되었다. 몇가지 컴퓨터 프로그램(MAR Finder, SMARTest, SIDD duplex stability)은, DNA 매트릭스와 결합하는 DNA의 부위로서 MARs를 동정하는 것으로 보고되었다. 이들은 일반적으로, MAR 활성을 포함하고, MAR Finder에 의해 실시되며, 현재 MAR Wiz로서 공지되어 있는 것으로 이전에 제안된, 서열-특이적 패턴의 전-정의된 시리즈를 사용하는 알고리즘을 기준으로 한다. 이러한 프로그램들의 출력은 cLysMAR의 전사적 활성 부위와 잘 연관되지 않았다. 예컨대, MAR Finder로 얻어진 활성 피크는 활성 MAR 부분-부위와 명확하게 매치하지 않았으며, 예컨대 B 단편은 인 비보에서 매우 활성이지만 스코어는 MAR Finder와는 역(negative)이었다(도 8B, 상단 및 중단 패널 비교). 이 프로그램에 의해 예측된 벤트 DNA 구조는 활성과도 연관되지 않았다(도 8B, 상단 및 중단 패널 비교). 다른 이용가능한 프로그램에서도 유사한 결과가 도출되었다(결과 미제시).

따라서, 이용가능한 MAR 예측 컴퓨터 방법에 의해 동정된 모티프는, 바람직하지 않게도, 유전자 발현을 증가시키는 cLysMAR의 활성의 주요한 결정인자가 된다. 따라서, 다른 컴퓨터 기술이 테스트되었다. 놀랍게도, 예측된 뉴클레오좀 결합 서열 및 뉴클레오좀 디스페이버링(disfavouring) 서열은, 활성 B, K 및 F 부위를 오버랩하는 뉴클레오좀 페이버링(favouring) 위치와 함께, MAR 상의 산재된 클러스터에 반복적으로 배열되어 있는 것으로 확인되었다. 뉴클레오좀 위치결정(positioning) 서열은 뉴클레오좀성 히스톤 주위를 쉽게 덮을 수 있지만 MAR 서열과 결합하지 않았던 DNA 스트레치(stretches)를 포함하는 것으로 제안되었다.

뉴클레오좀-페이버링 서열은, 적절히 반복된 서열을 포함하는 DNA 특성 및 굽은 히스톤 표면 상에서 정확하게 DNA를 결합시키고 방향조절을 할 수 있는 다른 물리-화학적 파라미터들의 수집에 의해 모형화될 수 있다. 이러한 많은 DNA 특성의 확인은 컴퓨터 작업화될 수 있으며, 38개까지의 이러한 다른 특성들이 추정의 뉴클레오좀 위치를 예측하는데 사용되었다. 따라서, 본 출원인은 뉴클레오좀 예측 프로그램의 특정 구성요소가 MAR 활성과 관련되는지를 확인하기 위해, 신규하고 게놈 서열로부터 가능한 더 잠재성이 있는 MARs를 동정할 수 있는 수단을 구성하기 위한 목적으로, 설정하였다.

DNA 1차 서열의 어떤 형상이 주변의 MAR 서열로부터 활성 B, K 및 F 부위를 구분할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 본 출원인은 MAR Scan

을 이용해 5'-MAR을 분석하였다. 38개의 뉴클레오좀성 어레이 예측 기술 중에서, 3개는 활성 MAR 부분-도메인의 위치와 연관되는 것으로 확인되었다(도 9A). MAR B, K 및 F 부위의 위치는 DNA 벤딩, 메이저 그루브 깊이 및 마이너 그루브 너비에 대한 최대값과 일치한다. 또한, 미약한 연관성이, GC 함량에 의해 결정된 것으로서 DNA 녹는점의 최소값에 표시된다. MAR F 단편에 대한 개량된 매핑에서는, 녹는점 최하점(valley) 및 DNA 벤딩 최고점(summit)이 MAR 최소 도메인을 포함하는 FIB 서브-단편에 실질적으로 대응됨을 나타내었다. 따라서, 활성 MAR 부분은 이 프로그램에 의해 굽은 DNA 부위로서 예측된 부위에 상응할 것이며, 본 출원인은 이들 부위들을 하기 텍스트에서 CUE-B, CUE-K 및 CUE-F로 지칭할 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 부위들이 실제 벤트 DNA 및 염기쌍 풀린 부위와 대응되는지 여부는 알려져 있지 않으며, 이들은 MAR Wiz에 의해 예측된 바와 같은 벤트 DNA에 대응되지 않았다(도 9B).

실시예 10: F 단편에 있는 다른 조절 엘리먼트의 각인(imprints)

뉴클레오좀 위치결정 특성은 게놈 DNA에 포함된 많은 특정 염색질 코드 중의 하나로 간주될 수 있다. 비록 이런 특정 코드가 F 부위의 활성에 제공되더라도, 이는 아마도 MAR 활성만을 결정하지는 않으며, F 부위의 3' 부분은 FIB 부분에 포함된 최소 MAR 도메인의 증가된 활성을 갖는다. MatInspector 프로그램(Genomatrix)을 이용하여, 본 출원인은 스코어가 0.92 이상인 전사 인자 결합 자리에 대해 조사하였으며, F 단편의 3' 부분에 있는 NMP4 및 MEF2 단백질에 대한 DNA 결합 서열을 확인하였다(도 8B). 이들 전사 인자-결합 자리 모두가 B 및 K 활성 부위와 근접하여 위치하는지를 확인하기 위해, 전체 5'-MAR 서열을 NMP4 및 MEF2 그리고 단일-가닥 또는 이중-가닥 BURs에 결합하는 것으로 보고된 단백질에 의한 결합에 대해 분석하였다. 이들 중에서, SATB1(special AT-rich binding protein 1)은 근처 유전자의 발현을 활성화하거나 억제시킬 수 있는 DNA-결합 전사 인자의 군에 속한다. 본 연구에서는 SATB1, NMP4(nuclear matrix protein 4) 및 MEF2(myogenic enhancer factor 2)와 같은 특정 단백질이, 특이 분포를 갖고 cLysMAR의 최소 MAR 도메인 주위에서 프레임워크를 형성함을 나타내어 준다(도 10). 이들 NMP4 및 SATB1 결합 자리의 일부의 발생도를, 정제된 재조합 단백질의 EMSA 분석으로 실험적으로 확인하였다(결과 미제시).

실시예 11: 정의된 유전 엘리먼트의 결합에 의한 인공 MARs 의 컨스트럭션

다양한 MAR 구성성분의 상대적 역할을 추가로 검증하기 위해, cLysMAR을 CUE 부위 3군데에서 모두 절단하였으며(도 11, 중단 부분), 이에 의해 대조군으로서 이의 모든 구성성분과 유사하게 조합된 완전한 MAR 서열과 비교했을때 이의 활성의 일부가 소실되는 결과를 유발하였다(도 11, 상단 부분). 항상, 각 CUE 단독의 1개 카피 또는 헤드-테일로 조립된 3개 CUEs 각각의 1개 카피는, 플랭킹 서열의 부재하에서 거의 활성을 나타내지 않았다. 이 결과들은 최적의 전사적 활성이 CUEs와 플랭킹 서열의 조합을 필요로 한다는 결론을 강화시킨다. 흥미롭게도, 완전한 MAR 서열이 이들 구성성분 각각으로부터 생성되었으나, 각 DNA 단편을 조립하는데 사용되는 BglII-BamHI 링커 서열(AGATCC)도 포함하였으며, 이러한 분석 시리즈에 있는 원래의 MAR 엘리먼트에 대해 4.8배로 표시되는 것과 비교하여 높은 전사적 활성(6배 활성)을 나타내었다(참조 도 5).

다음으로, 본 출원인은 굽은 DNA 부위가 이의 천연 MAR 컨텍스트에서 확인되는 것과는 차이나는 환경에서 잠재적으로 활성화될 수 있는지 여부를 조사하였다. 따라서, 본 출원인은 플랭킹 서열을 변화되지 않은 상태로 유지하면서, CUE-F, CUE-B 및 CUE-K 엘리먼트를 교환(swap)하도록 설정하였다. CUE-F 엘리먼트를 플랭킹하는 서열들을 PCR로 증폭하고, 그의 원래 방향과 거리를 유지하면서, 다양한 CUEs를 브래킷(bracket) 하도록 또는 CUE를 포함하지 않도록 조립시켰다. 그 후, 이들 조작된 ~1.8 kb MARs를, 형질전환 유전자 발현을 향상시키는 능력에 대해 상술한 바와 같이 분석하였다. 모든 3개의 CUE는 이 컨텍스트에서 활성이었고, 이에 의해 이들의 활성은 주어진 플랭킹 서열의 세트에 제한되지 않았다. 흥미롭게도, CUE-K 엘리먼트는, CUE-F 플랭킹 서열 사이에 삽입될 때, CUE-F보다 훨씬 활성이 높았고, 컨스트럭트를 구성하는 전자(former)는 완전한 천연 MAR(4.8배 활성)에서 관찰된 것 만큼 활성이 높았다. CUE-F 및 CUE-B로부터 CUE-K를 구분하는 것은, 그의 CUE 특성에 추가로, MEF-2 및 SatB1 단백질에 대한 오버랩 결합 자리의 존재이다. 따라서, CUE-B를 CUE-F-플랭킹 도메인과 결합시킴으로써, 모든 3개 결합 자리-증가된 활성을 설명할 수 있는-에서 더 높은 밀도를 나타내었다. 이 결과들은 NMP4, MEF-2, SatB1 및/또는 polyPpolyQ 단백질과 같은 단백질에 대한 결합 자리를 포함하는 서열을 이용한 CUEs의 조립이, 잠재적 인공 MAR 서열을 포함함을 나타내어 준다.

실시예 12: 발현 벡터

본 발명에 따른 3개의 발현 벡터가 도 12에 표시되어 있다.

플라스미드 pPAG01은 5640 bp의 pUC19 치환체이다. 이는 BamHI 및 XbaI 제한효소 위치에 클로닝된 2960 bp의 닭 DNA 단편을 포함한다. 이 인서트는 닭 라이소자임 위치(locus)의 5'-말단의 연변부(border)로부터 도출된 것이며 A/T-함량이 높다.

플라스미드 pGEGFP(또한 pSV40EGFP로도 불림) 대조군은 pGL3-control 벡터(Promega)의 치환체이며, 여기서 루시퍼라아제 유전자 서열이 pGEFP-N1 벡터(Clontech)로부터의 EGFP 유전자 서열에 의해 치환되어 있다. pGEGFP 플라스미드의 크기는 4334 bp이다.

플라스미드 pUbCEGFP 대조군은 pGL3의 치환체이며, 유비퀴틴 프로모터를 가지고 있다.

플라스미드 pPAG01GFP(또한 pMAR-SV40EGFP로도 불림)는 pGEGFP의 치환체이며, SV40 프로모터의 업스트림에 바로 위치하는 MCS에 클로닝된 5'-Lys MAR 엘리먼트를 가지고 있다. pPAG01EGF 플라스미드의 크기는 7285 bp이다.

실시예 13: 형질전환 유전자 발현에 대한 1차 형질전환 세포의 추가 형질전환의 효과

형질전환시키기 하루 전에, 세포들을 성장 배지가 들어있는 24-웰 플레이트에서 CHO-DG44 세포에 대해 1.35×10⁵ 세포/웰 농도로 평판배양하였다. 접종후 16시간에, 세포가 30-40%의 밀집도에 도달할 때, Lipofect-AMINE 2000(이하 LF2000이라 약칭함)을 사용하여, 제조사의 방침(Invitrogen)에 따라 세포를 형질전환시켰다. 1.4 ㎕의 LF2000을 포함하는 무혈청 배지(Opti-MEM; Invitrogen) 27 마이크로리터를 830 ng의 선형 플라스미드 DNA를 포함하는 Opti-MEM 배지 27 ㎕와 혼합하였다. 항생제 선별 플라스미드 (pSVneo)의 양은 GFP 형질전환 유전자를 함유하는 리포터 플라스미드의 10분의 1이 되게 하였다. 이 믹스(mix)를 실온에서 20분 동안 배양하여, DNA-LF2000 복합체가 형성되도록 놓아두었다. 상기 혼합물을 300 ㎕의 Opti-MEM으로 희석하여 미리 비워둔 세포-포함 웰에 부었다. 세포를 DNA 믹스와 3시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양하고 난 뒤, 1 ㎖의 DMEM-기초 배지를 각 웰에 첨가하였다. 그리고 난뒤, 상기 세포들을 24시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 추가로 배양하였다. 그 후, 상기 세포들을 상술한 방법에 따라-내성 플라스미드는 다른 저항 유전자(pSVpuro)를 포함하는 것을 제외함- 2번째 형질전환시켰다. 2번째 형질전환 24시간 후에 세포들을, 500 ㎍/㎖ G-418 및 5 ㎍/㎖ 퓨로마이신이 첨가된 선별 배지를 포함하는 T-75 플라스크로 넓혀서 계대배양하였다. 2주의 선별기간 후에, 안정하게 형질전환된 세포들을 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 선택적으로, 세포 군집들을 동일한 방법으로 다시 형질전환시켰으며, 이때 pTKhygro(clontech) 및 pSVdhfr을 내성 플라스미드로 사용하였다. GFP의 발현을 FACS(Fluorescence-activated cell sorter)와 플루오로스캔(Fluoroscan)을 사용해 분석하였다.

도 13은 2회-형질전환된 세포(이하 2차 형질전환체라 약칭함)의 표현형을 나타내는데, 이들은 강하게 색을 나타냄으로써 GFP 단백질로부터 녹색을 시각화하는데 특정 벌브(bulb) 및 필터가 필요하지 않을 뿐만 아니라 모체 군집(중간 히스토그램)과 비교될 정도의 생산 세포(아래 오른쪽 부분 FACS 히스토그램)를 주로 포함하고 있었다. 특정 세포 생산도에 대응되는 형광의 레벨은 매일 세포 당 10 pg 이상이었다. 대신에, 마커 단백질을 발현하지 않는 단지 1회 형질전환된 세포(1차 형질전환체)는 재-형질전환된 후에 세포 군집으로부터 거의 부재하였다. GFP 형광이 10¹ 유니트 이하인 막대는 중간 히스토그램에서 30%를 차지하고 오른쪽 히스토그램에서는 5% 이하를 차지하였다. 이는 추가의 세포가 형질전환되어 GFP를 성공적으로 발현함을 제시하여 준다.

특히, 재-형질전환된 세포에 의해 나타나는 형광의 양은, DNA가 2회 삽입된 세포의 서브군집이 예상했던 것보다 2배 이상 많이 GFP를 발현함을 제시해 준다. 대신에, 표 2에 제시된 결과에서는, 2차 형질전환체가 2 세트의 서열이 삽입된 것으로 가정하여 예측한 것보다 평균 2배 이상의 GFP 증가를 나타냄을 보여주며, 각각의 연속적인 형질전환에서 1개는 독립적으로 삽입되어 유사한 효율을 나타낼 것이다. 흥미롭게도, 이는 바이러스 및 세포 프로모터-포함 벡터 모두와 같이 리포터 유전자를 드라이브하는 프로모터 서열에 의존하지 않으며 유사한 GFP 향상을 가져왔다(레인 1 및 2 비교). 그러나, MAR이 없는 플라스미드(레인 3)와 비교했을때 MAR-포함 벡터에서는 두드러진 효과가 나타났으며, 여기서 상기 2회 연속 형질전환은 2번의 다른 실험에서, 5.3배 및 4.6배의 발현 증가를 나타내었다.

GFP 발현 상에서의 1차 형질전환체의 24시간 간격의 재-형질전환 효과

플라스미드 타입	1차 형질전환	2차 형질전환	EGFP 형광 증가 배수
pUbCEGFP	4'992	14'334	2.8
pSV40EGFP	4'324	1227	2.8
pMAR-SV40EGFP	6'996	36'748	5.3

플라스미드 타입	1차 형질전환	2차 형질전환	EGFP 형광 증가 배수
pUbCEGFP	6'452	15'794	2.5
pSV40EGFP	4'433	11'735	2.6
pMAR-SV40EGFP	8'116	37'475	4.6

2개의 독립적인 실험이 제시되어 있다. 내성 플라스미드 pSVneo를 다양한 GFP 발현 벡터로 동시-형질전환시켰다. 형질전환 1일 후에, 내성 플라스미드를 pSVpuro로 바꾸는 것을 제외하고는 동일한 플라스미드를 사용하여 세포를 재-형질전환시켰다. 상기 2개의 내성 유전자를 가지는 세포들을 500 ㎍/㎖ G-418 및 5 ㎍/㎖ 퓨로마이신에서 선별하고, 리포터 유전자 마커의 발현을 Fluoroscan으로 정량하였다. 배수 증가는, 상응하는 개별 형질전환체로부터 수득된 형광의 합과 비교한 2개의 연속 형질전환체로부터 수득한 형광의 비와 대응하였다. 유의적으로 높은 것으로 판단된 배수 증가를 진하게 표시하였고, 이는 개별 형질전환체로부터 수득한 값들의 합에 비해 2배 이상 높게 지속되는 형광 값과 대응된다.

중복(multiply) 형질전환된 세포에서의 GFP 발현 레벨의 증가는 현재의 지식으로부터 예측되지 않았으며, 이러한 효과는 이전에 관찰되지 않은 것이었다.

이와 함께, 본원에 제시된 데이터는, 숙주 게놈으로 첫번째 삽입된 플라스미드 서열이 두번째 플라스미드 분자의 삽입 세트로 동형 재조합시킴으로써 다른 플라스미드의 삽입을 촉진시킬 수 있다는 아이디어를 뒷받침한다. 플라스미드 재조합은 플라스미드 DNA가 핵에 도달하고 난 뒤 1시간 간격 내에 일어나며, 배양된 포유동물 세포에 있는 동시-주입된 플라스미드 분자 사이의 동형 재조합의 빈도는 다수의 플라스미드 카피의 삽입을 설명하는, 어프로칭 유니티(approaching unity)(Folger, K.R., K. Thomas, and M.R. Capecchi, Nonreciprocal exchanges of information between DNA duplexes coinjected into mammalian cell nuclei. Mol Cell Biol, 1985. 5(1): p. 59-69]가 매우 높게 나타나는 것으로 나타났다. 그러나, 새롭게 도입된 DNA 간의 동형 재조합 및 이의 염색체 호몰로그는, 10³ 세포 당 1개의 빈도로 DNA를 받아들여 일반적으로 매우 드물게 나타난다[ Thomas, K.R., K.R. Folger, and M.R. Capecchi, High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Cell, 1986. 44(3): p. 419-28.]. 따라서, 이 결과는 MAR 엘리먼트가 놀랍게도 이러한 재조합 이벤트를 촉진시키는 역할을 함을 나타내어 줄 수 있다. MARs는 인 비보에서 유전자의 조직화를 변형시키고 또한 바이러스 DNA 서열과 결합하여 DNA 복제를 가능하게 할 뿐만 아니라, DNA 재조합 신호로서도 작용할 수 있을 것이다.

실시예 14: MARs 는 복합적으로 형질전환된 세포에서 예측할 수 없을 정도로 높은 레벨의 발현을 유도한다

본 출원인은 만약 MAR-유도된 재조합 이벤트가 복합 형질전환 단계에서 일어나는 경우, 제1 및 제2 플라스미드 DNA 사이의 상승효과가, 1단계 또는 2단계의 형질전환 단계에서 MAR 엘리먼트의 존재에 의해 영향을 받을 수 있다고 예측한다. 본 출원인은 이전에 상술한 방법을 이용해, pMAR 단독 또는 다양한 발현 플라스미드와 조합하여 세포에 여러번 형질전환시킴으로써, 이러한 가능성을 실험하였다. 표 3에서는 pMAR-SV40EGFP 플라스미드를 이용해 세포를 2회 형질전환시키면, GFP의 가장 높은 발현 및 모든 조건의 가장 높은 정도의 향상(4.3배)을 유발함을 제시한다. 대조적으로, MAR이 없이 벡터를 2회 형질전환하면 2배 증가로 예측한 것 대신에, 2.8배로 매우 낮거나 거의 향상시키지 않는다. 본 출원인은 각 형질전환 단계에서의 MAR 엘리먼트의 존재가 최대 단백질 합성에 도달하는데 필요하다고 결론지었다.

1차 형질전환		2차 형질전환
플라스미드 타입	EGFP-형광	플라스미드 타입	EGFP-형광	증가 배수
pMAR	0	pMAR pSV40EGFP pMAR-SV40EGFP	0 15'437 30'488	0 2.3-2.5 2.6-2.7
pMAR-SV40EGFP	11'278	pMAR-SV40EGFP pMAR	47'027 12'319	4.3-5.3 1.0-1.1
pSV40EGFP	6'114	pSV40EGFP pMAR	17'200 11'169	2.8 1.8-2.3

흥미롭게도, 세포가 pMAR 단독으로 1차 형질전환되고, 그 후 pSV40EGFP 또는 pMAR-SV40EGFP로 재-형질전환되면, 이의 GFP 레벨은 후자(later) 플라스미드의 단일 형질전환으로부터 도출된 결과와 비교해 2배 이상 높았다(각각 2.5 및 2.7배임, 1배로 예측된 대신에). 이는 이전의 MAR의 형질전환이 2차 형질전환 단계에서 사용된 플라스미드의 발현을 증가시킬 수 있음을 보여준다. 왜냐하면 MARs가 염색질 구조 및 유전자 발현에서 국소적으로 작용하기 때문이며, 이는 2가지 타입의 DNA가유사한 염색체 위치에 삽입될 수 있다는 사실을 포함한다. 대조적으로, GFP 발현 벡터 단독으로 형질전환하고, 그 다음에 MAR 엘리먼트를 2번째 단계에서 형질전환하면, GFP 레벨이 거의 향상되지 않거나 또는 미약하게 향상된다. 이는 플라스미드 형질전환의 순서가 중요하고, 형질전환 유전자 발현을 유의적으로 높게 하기 위해서는 1차 형질전환 이벤트가 MAR 엘리먼트를 포함해야 한다는 사실을 보여준다.

만약, MAR 엘리먼트가 1차 및 2차 형질전환 단계로부터의 에피좀 형태에 잔존하는 플라스미드를 동형 재조합하고, 1개의 염색체 위치에서 동시-삽입하는데 유리하다면, 플라스미드 형질전환의 순서가 GFP 레벨에 영향을 주지 않음을 예측할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 발견은, 두번째 형질전환 단계 보다는 첫번째 단계에서 MAR 엘리먼트를 형질전환하는 것이 더 유리하다는 것을 나타내어 준다. 이는 다음과 같은 분자 메커니즘을 제시한다: 1차 형질전환 단계동안, MAR 엘리먼트는 세포 염색체 내에 최소 일부분으로 연쇄체화(concatemerize) 및 삽입될 수 있다. 이 삽입된 MAR DNA는 2차 형질전환 단계 동안, 동일 또는 근처의 염색체 위치에, 더 많은 플라스미드의 추가 삽입을 유리하게 한다.

실시예 15: 장기간의 DNA 전달 촉진자(facilitators)로서의 MARs

만약 삽입된 MARs가 영구적인 재조합-허용 염색체 구조를 유도한다면, 일시적으로 도입된 에피좀 DNA의 대부분이 제거되는 시점에 높은 레벨의 발현을 유도할 수 있음-심지어 2차 형질전환이 1차보다 장시간 뒤에 수행되더라도-을 예측할 수 있을 것이다. 이러한 가능성을 검토하기 위해, 3주 동안 항생제 내성에 대해 선별한 표 3으로부터의 세포를, 다시 1회 또는 2회 형질전환하였으며 추가의 DNA 저항성 마커의 삽입에 대해 선별하였다. pMAR 또는 pMAR-SV40EGFP의 조합으로 3차, 또는 3차 및 4차 형질전환 사이클을 수행하였으며, 이전과 같이 GFP 발현에 대해 분석하였다.

DNA 삽입의 촉진자로서 작용하는 MARs

3차 형질전환			4차 형질전환
플라스미드 타입	EGFP-형광	증가 배수	플라스미드 타입	EGFP-형광	증가 배수
pMAR	18368	2.2	pMAR pMAR-SV40EGFP	43'186 140'000	2.4 7.6
pMAR-SV40EGFP	16544	2.0	pMAR-SV40EGFP pMAR	91'000 33'814	5.5 2.0

pMAR-SV40EGFP/pMAR-SV40EGFP 2차 형질전환체는 선별 과정의 말기에 3차 형질전환 사이클에 사용하였다. pMAR 또는 pMAR-SV40EGFP를 이용하고 선별 플라스미드로서 pTKhygro를 이용하여 3차 형질전환을 수행하여 3차 형질전환체를 제조하였다. 24시간 후에, 다른 플라스미드 pSVdhfr로 다시 세포를 형질전환하였으며, 500 ㎍/㎖ G-418 및 5 ㎍/㎖ 퓨로마이신, 300 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B 및 5μM 메토트렉세이트(methotrexate)를 포함하는 성장 배지에서 선별된 4차 형질전환체가 제조되었다. 상기 2차 형질전환체는 처음에 GFP 형광이 8300으로 나타났다. 배수 증가는, 상응하는 개별 형질전환으로부터 수득한 형광의 합과 비교하여 2개의 연속 형질전환으로부터 수득한 형광의 비율과 일치한다. 유의적으로 더 높다고 판단된 배수 증가는 진하게 표시되어 있으며, 이는 개별 형질전환으로부터 수득한 이들의 부가보다 2배 높은 형광 값과 일치한다.

이러한 결과들은 더 많은 카피의 pMAR 또는 pMAR-SV40EGFP의 로딩이 전체 세포 형광에서 유사하게 2배 증가하는 결과를 나타냄을 보여준다. 4차 형질전환에 더 많은 MAR을 로딩하면 그의 활성을 추가로 2.4배 더 향상시킨다. 이는 새롭게 도입된 MAR 서열이 동형 재조합에 의해 염색체 형질전환 유전자 위치에 삽입될 수 있으며, 이에 의해 추가로 형질전환 유전자 발현을 증가시킬 수 있다는 본 출원인의 가설과 동일하다.

세포가 pMAR-SV40EGFP 플라스미드로 3번째 및 4번째 형질전환되면, GFP 활성이 추가로 증가하고, 개별 형질전환으로부터 수득한 형광 레벨의 부가로부터 예측되지 않는 레벨까지 다시 한번 증가한다. GFP 발현은, 일광에서 눈에 보일 정도로 세포에서 녹색으로 빛을 내는 레벨에 도달하였다(도 14). 또한, 이러한 결과는 4차 형질전환의 효율이 3번째 DNA 전달의 효율로부터 예측한 것보다 훨씬 높고, 형질전환 사이의 적절한 타이밍이-4주 동안의 기간 동안 1일이 바람직함- 최적의 유전자 발현 증가를 얻는데 있어서 필수적임을 추가로 나타내어 준다. 본 출원인은 MAR 엘리먼트가, 히스톤 아세틸화의 국지적 증가를 유도함으로써 닫힌 염색질 구조를 풀어지게함으로써, 염색체 삽입의 위치에서 재조합 빈도를 증가시키는 2차 삽입 이벤트에 유리하다고 믿는다(Yasui, D., et al., SATB1 targets chromatin remodelling to regulate genes over long distances. Nature, 2002. 419(6907): p. 641-5.). 선택적으로 또는 부수적으로, 근처의 유전자를 서브핵 위치로 잠재적으로 위치를 바꾸는 MARs는, 토포아이소머라아제(topoisomerase)와 같이 재조합 이벤트에 관여할 수 있는 단백질을 포함하는, 트랜스-작용 인자에 풍부한 것으로 생각된다. 이러한 결과는 MAR 서열이 pSV40EGFP 반복을 브래킷(bracket)할 수 있고, 염색질-유도된 사일런싱(silencing) 효과로부터 형질전환 유전자를 효과적으로 보호할 수 있는 위치에서 도출될 수 있다.

실시예 16: SMAR Scan

II로 동정된 MARs 의 재조합 단백질의 발현을 증가시키는데 있어서의 용도

SMAR Scan

또는 혼합 방법을 이용해 인간 게놈 서열 전체를 분석하여 얻은 서열로부터 4개의 MAR 엘리먼트들을 무작위로 선별하였다. 이들을 1_6, 1_42, 1_68,(여기서 첫번째 숫자는 서열이 유래된 염색체를 나타내며, 두번째 숫자는 이 염색체를 따라 예측된 MAR에 대해 특이적이다) 및 염색체 상에서 동정된 “슈퍼” MAR인 X_S29로 명명하였다. 이들 예측된 MARs를 pGEGFPControl 벡터의 SV40 프로모터 업스트림과 녹색 형광 단백질의 발현을 유도하는 인핸서에 삽입하였으며, 이들 플라스미드들을 배양된 CHO 세포에 이전에 기재된 방법으로 형질전환하였다(Zahn-Zabal, M., et al., Development of stable cell lines for production or regulated expression using matrix attachment regions. J Biotechnol, 2001. 87(1): p. 29-42). 그리고 난 후, 형질전환 유전자의 발현은, 형광 세포 분류기(FACS)를 이용하여 안정하게 형질전환된 세포의 전체 군집에서 분석하였다. 도 19에서 보는 바와 같이, 이렇게 새롭게 동정된 MARs 모두는, 닭 라이소자임 MAR에 의해 유도된 발현보다 상당히 높도록 형질전환 유전자의 발현이 증가하였으며, “슈퍼” MAR X_S29는 새롭게 동정된 모든 MARs 중에서 가장 유력한 것이 된다.

실시예 17: 인간 MAR(1-68)가 있거나 없는 네트워크 시스템의 일렉트로트랜스퍼에 의한 인 비보 mEPO 발현이 적혈구 용적율에 미치는 영향

치료학적 유전자는 백혈병의 치료에 사용되는 호르몬인 EPO(에리스로포이에틴)를 인코딩한다. EPO 유전자는 독시사이클린 유도성 프로모터의 조절하에 위치하며, 이 유전자에 있는 이전에 기술한 스위치 시스템은 다음부터 네트워크 시스템이라 부른다(Imhof, M. O., Chatellard, P., and Mermod, N. (2000)). 상기 EPO 및 조절 유전자를, 일렉트로트랜스퍼(electrotransfer)로 지칭되는 인 비보 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 마우스의 근육에 주입함으로써, 이 유전자들이 근육 섬유의 핵에 전달되게 하였다. 데옥시사이클린 항생제-이 물질은 EPO의 발현을 유도하는 것으로 예측됨-가 생쥐의 식수에 첨가되면, 이는 높은 수준의 순환하는 EPO에 의해 유도되는 적혈구 계수의 증가로 인해, 적혈구 용적율 레벨의 상승을 유도할 수 있을 것이다. 그러므로, MAR이 EPO의 발현을 증가시키면, 높은 레벨의 적혈구 용적율이 예측될 것이다.

5주령의 C57BL6 암컷 생쥐(Iffa Credo-Charles River, France)에서 인 비보 실험을 수행하였다. 정상 생리 식염수에 녹아있는 30 ㎍의 플라스미드 DNA를 경골 전방 근육에 피부투과 주입하여 전달시켰다. 모든 주입은 케타미놀(Ketaminol)(75 ㎎/㎏) 및 나르콕실(Narcoxyl)(10 ㎎/㎏) 마취하에서 수행하였다. 근육내 DNA 주입 후에, 근육에 전기장을 주었다. 200 V/cm의 전압을 1Hz에서 8 ms 펄스로 주었다(Bettan M, Darteil R, Caillaud JM, Soubrier F, Delaere P, Branelec D, Mahfoudi A, Duverger N, Scherman D. 2000. “High-level protein secretion into blood circulation after electric pulse-mediated gene transfer into skeletal muscle” Mol Ther . 2: 204-10).

16 마리의 마우스에 1_68 MAR이 없이 EPO를 발현하는 네트워크 시스템을 주입하였으며, 나머지 16 마리의 마우스에는 5'의 프로모터/인핸서 서열이 활성자(activator) 및 EPO 유전자의 발현을 드라이브하는 MAR을 포함하는 네트워크 시스템을 주입하였다. 각 그룹에서, 마우스의 절반에는 실험 시작(0일-일렉트로트랜스퍼한 날)부터 식수에 독시사이클린을 포함하도록 하였으며, 나머지 절반에는 21일째부터 시작하여 독시사이클린을 투여하였다.

플라스미드를 주입하고 난 뒤 다양한 시간에 헤파린 처리된 모세관을 이용해 역-안와(retro-orbital) 펀치로 혈액 샘플을 수집하였다. 모세관을 실온에서 5000 rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하고, 혈액 세포의 부피 분획을 전체 혈액 부피에 비교하여 분석하였으며, 백분위수로 표시하여 적혈구 용적율을 결정하였다.

도 16에서 보는 바와 같이, MAR-네트워크를 주입한 마우스 그룹-실험의 시작부터 유도됨-은 MAR이 없이 원래 네트워크를 주입한 마우스와 비교하여 적혈구 용적율이 훨신 유도되는 것으로 나타났다. 2달 후에, “MAR-포함 그룹”에서의 적혈구 용적율은 정상 적혈구 용적율(45-55%)에 비해 여전히 높은 값(65%)을 유지하였다.

더욱 중요하게는, 늦은(late) 유도(21일)가 MAR의 존재에서만 가능하고, 네트워크가 MAR이 없이 주입된 생쥐에서는 가능하지 않았다. 따라서, MAR은 사일런싱으로부터 형질전환 유전자를 보호하는 경향이 있으며, 비-유도 조건에 있는 지연(prolong) 기간 이후에도 그의 발현의 유도를 가능하게 한다.

전체적으로, MAR 엘리먼트는, 적혈구 용적율에 대한 그의 증가된 물리적 영향으로부터 검출된 치료학적 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.

<110> Selexis S.A. <120> HIGH EFFICIENCY GENE TRANSFER AND EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS BY A MULTIPLE TRANSFECTION PROCEDURE OF MAR SEQUENCES <130> ip-2006-0002 <150> US 60/513,574 <151> 2003-10-24 <150> EP 04 002 722.9 <151> 2004-02-06 <160> 241 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 320 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(320) <223> MAR of human chromosome 1, nt from 36686 to 37008 <220> <221> misc_binding <222> (1)..(320) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 36686 to 37008 <400> 1 ttatattatg ttgttatata tattatatta tgttattaga ttatattatg ttgttatatt 60 atataataat attatattat atattatata ttatattata taatatataa taatattata 120 taattatata ttacattata taatatataa taatattata taattatata ttacattata 180 taatatataa taatattata taataatata taattatata atatataata atattatata 240 atattatata atattatata atatataaat atataataat atatattata ttatataata 300 gtatataata ttatataata 320 <210> 2 <211> 709 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(709) <223> MAR of human chromosome 1, nt from 142276 to 142984 <220> <221> misc_binding <222> (1)..(709) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 142276 to 142984 <400> 2 tacaatatat tttctattat atatattttg tattatatat aatatacaat atattttcta 60 ttatatataa tatattttgt attatatata ttacaatata ttttgtatta tataatatat 120 aatacaatat ataatatatt gtattatata ttatataata caatatatta tatattgtat 180 tatatattat atataatact atataatata ttgtattata tattatatat aatactatat 240 aatatatttt attatatatt atatataata caatatataa tatattgtat tataatacaa 300 tgtattataa tgtattatat tgtattatat attatatata atacaatata taataatata 360 ttataatata taataataat ataatataat aataatatat attgtattat atattatata 420 atacaatata taatatattg tattatatat attttattac atataatata taatacatta 480 tataatatat tttgtattat atataatata ttttattatg tattatagat aatatatttt 540 attatatatt atatataata caatatataa tatattttgt attgtatata atatataata 600 caatatataa tatattgtat tatatataat attaatatat tttgtattat atatttatat 660 tttatattat aattatgttt tgcattatat atttcatatt atatatacc 709 <210> 3 <211> 409 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(409) <223> MAR of human chromosome 1, nt from 1368659 to 1369067 <220> <221> misc_binding <222> (1)..(409) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 1368659 to 1369067 <400> 3 tacacataaa tacatatgca tatatattat gtatatatac ataaatacat atgcatatac 60 attatgtata tatacataaa tacatatgca tatacattat gtatatatac ataaatacat 120 atgcatatac attatgtata tatacataaa tacatatgca tatacattat gtatatatac 180 ataaatacat atgcatatac attatgtata tatacataaa tacatatgca tatacattat 240 gtatatatac ataaatacat atgcatatat tatatacata aattatatta tatacataat 300 acatatacat atattatgtg tatatataca taaatacata tacatatatt atgtgtatat 360 atacatgata catatacata tattatgtat atatatacat aaatacata 409 <210> 4 <211> 394 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(394) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 2839089 to 2839482 <400> 4 tatgtatata tacacacata tgtatatata cacacatatg tatatacgta tatatgtata 60 tatacacaca tatgtatata cgtatatatg tatatataca cacatatgta tatacgtata 120 tatgtatata tacacacata tgtatatacg tatatatgta tatatacaca catatgtata 180 tatgtatata tacacacata tgtatatacg tatatatgta tatatacaca catgtgtata 240 tatatataca catatgtata tatgtatata tacacacata tgtatatatg tgtatgtata 300 tatacacaca tatgtatata tacacatata tatgtatata tacacacata cttatatata 360 cacatatata tgtatatata cacatatgta taca 394 <210> 5 <211> 832 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(832) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 1452269 to 1453100 <400> 5 tatattacta tatatacaat atacatatta ctatatatac catgtattac tatatatatc 60 tactatatat attactatat atacaaaata tatattacta tatatacaat atacatatta 120 ctatatatac catatattac tatatatatc tactatatat attactatat atacaaaata 180 tatattacta tatatactat atattactgt atatacaata tatattacta tatatatact 240 atatattact atatatacac tatatattac tatatataca caatatatat attactatat 300 atacacaatg tatataacta tatatacaat atatattact atatatacta tatatattac 360 tatacatact atatattact ctatatatac aatatatata ttacaatata tactacatat 420 tactacatat actttatata ttactatata tactatatat tactgtatat acaatatata 480 ttactaaata tacacaatat atattactat atatacacaa tatatatatt actatatata 540 cacattatat atgactatat atacacacta tatatattac tatatataca caatatataa 600 ctatatatac acagtataca tattactata tatacacaat atatatatta ctatatatac 660 actatatatt actatatata cacaatatat attactctat gtatacacta tatatattac 720 tatatataca gaatatatat aactatatat acactatatt actatatata ctatatatta 780 ctatatgtac tatatatatt actatatata ctatatatta ctatatatac ac 832 <210> 6 <211> 350 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(350) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 831495 to 831844 <400> 6 aatatataat atataaatat taatatgtat tatataatat atattaatat attatattat 60 attactatat aaataatatt aatatattat attaaaatat taataaatat atcatattaa 120 atattatatt aattaaatat taataaatat attatattaa tatatttata tattaaacct 180 ataacatatg catatactta tttatatata acatgcatgt acttatttat atatacaata 240 tatatttata tattatataa tatattatat gtatttatat attatatatc atatattata 300 tgtatttata tattatatat catataatat atatatttat attatatata 350 <210> 7 <211> 386 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(386) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 1447225 to 1447610 <400> 7 acatttaatt taattatata ctgctatata taattaaatc tatatatcta tataacttat 60 aatttatttt aatttaatta tatatactat atagttatat atacatatat gtaattatat 120 atagtataat tatagtatat atgtatatat aatgtaagta aatatatagt atatatttat 180 atatactata tatttataca tatgtcttta tatatactaa tatatataca catatgtaat 240 atgtacatat ggcatatatt ttatagtgta tatatacata tatgtaatat atatagtaat 300 atgtaaatat atagtacata tttaattata tggtaatata tacacatata tgtaatatgt 360 gtattatagt acatatttta tagtat 386 <210> 8 <211> 585 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(585) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 4955365 to 4955949 <400> 8 atacacacat atacacatat gtacgtatat atactatata tacacacata tacacatatg 60 tacgtatata tactatatat acacacatat acacatatgt acgtatatat actatatata 120 cacacatata cacatatgta cgtatatata ctatatatac acacatatac acatatgtac 180 gtatatatac tatatataca cacatataca catatgtacg tatatattat atatacacac 240 atatacacat atgtacgtat atatactata tatacacaca tatacacata tgtacgtata 300 tatactatat atacacacat atacacatat gtacgtatat atactatata tacacacata 360 tacacatatg tacgtatata tactatatat acacacatat acacatatgt acgtatatat 420 actatatata cacacatata cacatatgta cgtatatata ctatatatac acacatatac 480 acatatgtac gtatatatac tatatataca cacatataca catatgtacg tatatatact 540 atatataccc atacacatac gtatatacgt acatatatat acgta 585 <210> 9 <211> 772 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(772) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 5971862 to 5972633 <400> 9 agtaaacata tatatagtaa atatatatag tgtatatata gtaaatatat atagtgcata 60 tatatagtgc atatatatag tgtatatata gtaaatatat agtgtatata tatagtaaat 120 atatatagtg tatatatagt aaatatatat agtaaatata tatatactat atatagtaaa 180 tatatatata ctatatatag taaatatata tatagtatat atatagtaaa tatatatata 240 gtatatatat agtaaatata tatatagtat atatatagta aatatatata tagtatatat 300 agtaaatata tatagtatat atatagtaaa tatatatata gtatatatat agtaaatata 360 tatatagtat atatatagta aatatatata tagtatatat atagtaaata tatatagtat 420 atatatagta aatatatata gtatatatat agtaaatata tatagtatat atatagtaaa 480 tatatataca ctgtatatat atagtaaata tatatacact gtatatatat agtaaatata 540 tatacactgt atatatatag taaatatata tacactgtat atatatagta aatatatata 600 cactgtatat acatagtaaa tatatataca ctgtatatac atagtaaata tatatacact 660 gtatatacat agtaaatata tatacactgt atatacatag taaatatata tacagtgtat 720 atacatagta aatatatata cagtgtatat acatagtaaa tatatataca gt 772 <210> 10 <211> 304 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(304) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 6221897 to 6222200 <400> 10 atatataata tatataatta tattatatat aatatataat atatataatt atattatata 60 ttatatataa tatattatat attatatata taatatatat tatatattaa atatatatta 120 tatatataat atatattata tattaaatat atattatata tataatatat attatatata 180 atatatataa tatatattat atatatatta tatattatat atatatatta tatatatata 240 atatatataa tatatattat atataatata tattatatat atataatata tataatatat 300 atta 304 <210> 11 <211> 311 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(311) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 9418531 to 9418841 <400> 11 tatatataat atttatatat aatattcatg tatttatata taaatattta tatatttata 60 tataaatatt tatatattta tatataaata tttatatatt tatatataat atttatacat 120 tatatataat atttatatat tatatataat atttatatat aatatttata tattatatat 180 aatatttata tatttatatg tataatatat attttatata tgtatgtata atatatattt 240 tatatatgta tgtataatat attttatata tgtatgtata atatattatt atatataata 300 tataatttat a 311 <210> 12 <211> 302 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(302) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 15088789 to 15089090 <400> 12 atataatata tatattatat atataaatat atataaatat ataacatata tattatatat 60 aaatatatat aaatatataa catatatatt atatatataa atatatataa atatataaca 120 tatatattat atatataaat atatataaat atataacata tatattatat atataaatat 180 atattatata tttatatata taatatatat aaatatataa tatatattta tatatataat 240 atatataaat atataatata tatatttata tataatatat ataaatatat aatatataat 300 at 302 <210> 13 <211> 461 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(461) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 6791827 to 6792287 <400> 13 tatataatat atattatata tacacatata taatatatat tatatataca catatataat 60 atatattata tatacacata tataatatat attatatata cacatatata atatatatta 120 tatatacaca tatataatat atattatata tacacatata taatatatat tatatataca 180 catatataat atatattata tatacacata tataatatat attatatata cacatatata 240 atatatatta tatatacaca tatgtaatat atattataca cacacatata atatatatta 300 tatacacata tataatatat attatatata catatataat atatattata tatacacata 360 tataatatat attatatata cacatatata atatatatta tatatacaca tataatatat 420 aatatataca catatataat atatatatta tatatgcaca t 461 <210> 14 <211> 572 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(572) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 163530 to 164101 <400> 14 atattataat tatatatatt atatataatt atataaaata tatattataa ttatatatat 60 tttatataat atatatatta taattaatat attatatata atatatatat tatatataat 120 atatatatta tatatattat atataatata tataatatat ataatatata atataatata 180 tatattatat ataatatata atatatataa tatattataa tataatatat ataatatata 240 atataatata tataatatat aatataatat ataatatata atatatataa tatataatat 300 aatatataat atatataata tataatataa tatataatat atataatata ttataatata 360 atatatataa tatataatat aatatatata atatataata taatatataa tatataatat 420 atatttaata tatttattaa ttatttgtta tatatttatt aatatataat atataatata 480 tttaatatat tataactata tattatatta taattatata tattatatat atacaattat 540 aattatatat tatatatact tataatatat at 572 <210> 15 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(357) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 1842332 to 1842688 <400> 15 tatatctata tatatctata tatatataat atagataata tctatatata taatatagat 60 aatattatct atatataata tagataatat tatctatata taatatagat aatattatct 120 atatataaaa ttatattata tctatatata ttatatatat aaaattatat tatatctata 180 tataatatag ataatatcta tatataaata gataatatct atatatataa tatagatatt 240 atctatatta tagatataga taatattatc tatattatag atattatcta tatataatat 300 agataatatt atctatatta tatatataat atatctatat tatctataat attatct 357 <210> 16 <211> 399 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(399) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 2309560 to 2309958 <400> 16 attatatata atatatatta tatattatat atatcaagca gcagatataa tatataatat 60 atataatata tataatatat attgtatatt atataatata taatatatat aatatatatt 120 gtatattata taatatataa tatatataat atatattgta tattatataa tatataatat 180 atataatata tattgtatat tatataatat ataatatatg taatatatta tgtaatatat 240 tatataatat atattatata ttatatataa tatatattat atataatata tattacataa 300 tatattacat atattacgta atatatgtta tatattacat ataatatata acatatatta 360 cgtaatatat gtaatatatt acatataata tatacatta 399 <210> 17 <211> 394 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(394) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 2231759 to 2232152 <400> 17 atatatactt ataaattata tacttatata tacttataaa ttatatactt atatatactt 60 ataaattata tacttatata tacttataaa ttatatactt atatatactt ataaattata 120 tacttatata tacttataaa ttatatactt atatatactt ataaattata tacttatata 180 tacttataaa ttatatactt atatataatt ataaattata tacttatata taattataaa 240 ttatatactt atatataatt ataaattata tacttatata taattataaa ttatatactt 300 atatataatt ataaattata tacatatata taattataaa ttatatacat atataattat 360 aaattatata catatataat tataaattat atac 394 <210> 18 <211> 387 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(387) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 7406524 to 7406910 <400> 18 tatattatat ataatatata ttatatataa tataaataat atatattata tataatatat 60 aaataatata taatatataa ataatatata atatataata tataaataat atataatata 120 taacatataa ataatatata taatatataa ataatatata taatatataa ataatatata 180 taatatataa aaatatataa tatataatac atatataaat aatatattat attatatatg 240 atacataata tattatatat aatatattat atgatacata atatattata tagaatatat 300 tatatgatac ataatatatt atatagaata tattatatga tacataatat attatatgat 360 acataatata ttatatataa tatatta 387 <210> 19 <211> 370 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(370) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 9399572 to 9399941 <400> 19 catatataca tatatacaca tatatacaca tatatataca catacatatg tacacatata 60 tatacacata tgtatacaca tatatacaca tatatacaca catatataca catatataca 120 cacatatata cacatatata cacatatata cacatataca catatataca catatataca 180 tatatacaca tatatataat atacacacat atatatacac atatatacac acatatatac 240 acatatatac acatatatat acacatatat acacatatat acatatatac acatatatat 300 acatatatac acatatatac atatatacac atatatacat atatacacac atatatacac 360 atacatatac 370 <210> 20 <211> 377 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(377) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 12417411 to 12417787 <400> 20 attatatata atacatataa ttatatattt atatataaat tataataaat acatataatt 60 atatatttat atataaatta tatataataa atacatataa ttacatatat ttataaatta 120 taataaatac atataattac atatatttat atatgaatta tatataataa atacatataa 180 ttatatatat ttatatgtag attatatata aatatatata atttatatat ataataatat 240 atataattta tatatataat tatatatata ataaatatat ataatttata tatataatta 300 tatatataat aaatatataa taatatatat aatttatata tataattata tatataataa 360 atatatataa tttatat 377 <210> 21 <211> 1524 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1524) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 1643307 to 1644830 <400> 21 tataaatata tataaatata taaatatata taaatatata aatatatata aatatatata 60 aatatataaa aatatataaa tatatataaa tatatataaa tatataaaaa cataaaaata 120 tatataaata tatataaata tataaaaata tataaatata taaatatata aaaatataca 180 aatatataaa tatatacata aatatatata aatatatata aatatataaa aatatatata 240 aatatataaa tatatataaa tatatataaa tatatataaa tatataaaaa tatatataaa 300 tatataaata tataaaaata tatataaata tataaatata taaatatata taaatatata 360 aatatataaa taaatataag tatttatgaa tatatatgaa tatataaata tataaaaaat 420 atatataaat atataaatat atataaatat ataaatatat acatatatac atatataaat 480 aaataaatat aagtatttat gaatatatat gaatatataa atatataaaa aatatatata 540 aatatataaa tatatataaa tataaatata taaaaatata taaaaatata tataaatata 600 taaatatata taaatatata aatatatata aatatatata aatatataaa tatatataaa 660 tatatataaa tatataaata tataaatata tataaatata tataaatata taaatatata 720 aatataaata tataaatata tataaatata tataaatata taaatatata taaatatata 780 taaatatata taaatatata taaatatata aatatatata aatatatata taaatatata 840 taaatatata aatatataaa tatataaaaa tatataacaa tatataaata tatataaaaa 900 tatataacaa tatataaata taaatatata taaaaatata taacaatata taaatataaa 960 tatatataaa tatataaata taaatataaa aaatatatat aaatatataa atatatataa 1020 atatataaat gtataaatat atataaaaat atataacaat atataaatat ataaatatat 1080 aacaatatat aaatatataa aaatatataa caatatataa atataaatat atataaaaat 1140 atataacaat atataaatat aaatatatat ataaatatat aaatataaat ataaaaaata 1200 tatataaata tataaatata tatataaata tatataaata tataaatgta taaatatata 1260 taaatatata aatatataaa aatatataaa tatatataaa tatatataaa tatataaata 1320 taaatatata aatatatata aatatataaa tataaatata taaacatata taaatatata 1380 taaataaaca tatataaaga tatataaaga tataaagata tataaatata taaatatata 1440 aagatatata aatatataaa gatatataaa tatataaaga tatataaata tataaagata 1500 tataaatata atatataaat atat 1524 <210> 22 <211> 664 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(664) <223> MAR of human chromosome 1, genomic contig; 1398763 to 1399426 <400> 22 acacatatat atataaaata tatatatata cacacatata tataaaatat atatatatac 60 acacatatat ataaaatata tatatacaca catatatata aaatatatat atacacacat 120 atatataaaa tatatatata cacacatata tataaaatat atatatacac acatatatat 180 aaaatatata tatacacaca tatatataaa atatatatat acacacatat atataaaata 240 tatatataca cacatatata taaaatatat atatacacac atatatataa aatatatata 300 tacacacata tatataaaat atatatatac acacatatat aaaatatata tatacacaca 360 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ataaatatat atataaatat atataaatat ataaatgtat aaatatatat aaatatataa 2280 atatataaaa atatataaat atatataaat atatataaat atataaatat aaatatataa 2340 atatatataa atatataaat ataaatatat aaacatatat aaatatatat aaataaacat 2400 atataaagat atataaagat ataaagatat ataaatatat aaatatataa agatatataa 2460 atatataaag atatataaat atataaagat atataaatat ataaagatat ataaatataa 2520 tatataaata tataaagata tataaatata atataaaaat atataaatat atattaaaaa 2580 tatatacata taaatatatg tatatttttt tgagatgggg tctcgctcag ccacccacgc 2640 tggagtgcag tggcacgagc tcggctcact gcaaccactg tctctcgggt ccaagcaatt 2700 ctgtctcagc ctcccaagta gctgggatta caggcacctg ccatcatgcc cggctaattt 2760 ttgtatttta gtagagatgg agtttcacca tgttggccag gttggtctcg aattcctgac 2820 ctcaggtgat ctgccggcct cggcctccca gtgctgggat tacaggcatg agtcaccacg 2880 cccggcccta tatatatttt tgagacaagc tctgtgtctc ccaggctgga gtgcagcagc 2940 atgatcatga ctcactgtag cctagacctc cagggctcaa gtgattctcc cacctcagcc 3000 tcccaagtag ctgggattac aggcatgcac caccacaccc agctaatttt tgttttgttt 3060 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gcagtgccac gatctcagct cactgcaacc tccccctcct gggatcaagt gattcttttt 3960 tttttaagac tctgtctcaa aaaaaaagaa aaaaaaaaaa aatatatata tatatatata 4020 tatacacgaa ttttgggcca ggcacagtgg cttatgcctg taatcccagc actttgggag 4080 ggccgaggtg ggtggatcac aaggtcagga gtttgagacc agcctggcca atatggtgaa 4140 accctgtctc tactaaaaaa tacaaaaatt agctgggcgt ggtggcacga gcctgtaatc 4200 ctggctactc tggaggctaa ggcaggagaa tcgcttgaac cggggaggca gaggttgcag 4260 tgagccagga tcgcatcact gcactccagc ctgggtaaca gagcaagact ctgtctcaaa 4320 aaacaaacaa aacaaaacaa aacaaaataa ataacggtgc aaaattgaat atgccttttt 4380 gactctctaa atgcctcaga tccatttacc ctggggattt gtcctttcta gccccaccac 4440 catctcccct ctggaagact gctgacctat aaggataaag accagactct tgagcaggca 4500 cttagggtct tcctgcccat ccctatcccc aactccccct cagtaatttt ggctactagt 4560 atttctccac atctgaggct atcgtgggtc tcccttcagt ggtcatgaag gacaaggttg 4620 gagaagtttg ccctcgtgag tctgatgagg gattgggtgg 4660 <210> 27 <211> 3354 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(3354) <223> MAR X_S29 of chromosome X <400> 27 gatcccttta taaaaccaca atataatgga gtgctataat ttcaaacagt gtttggtctg 60 ctggcagagt ggtcattcta acagcagtca cagtagagta gaaataagac tgcagtatat 120 ctaaggcaaa aagctgaggt ttcaggagct tgaaggtaaa gaggaagaaa gaaatgggaa 180 tgggaattgg aaagacaaat atcgttaaga gaaaattgct tttaggagag gggaaagaat 240 ctatgtgtac ttaagactat ggaatcaatc ccatttaagc tgggaaacta gtttcatata 300 taactaataa attttattta cagaatatct atttacctga tctaggcttc aagccaaagg 360 gactgtgtga aaaaccatca gttctgtcat attcctaaaa aaaaattaaa aagttaaaaa 420 taaataaata ataaaacttc ttttctttca aaataatcaa ggtgcttatt cacatccatt 480 ccaatttggg gaaatactta ttttcctatg attagcgaag agaaaagtaa cttgcatttc 540 aattcaagtt gatacatgtc acttttaaga ggtcaactaa tatttgctag ttgagctaac 600 catataggct ttaaatactt tcatagtaga aagaaaatga aaatcattag tgaactgtat 660 aaaatagatc atactttttg aaagaatcag actgaagttt ccgaaaaaaa gaagtaagct 720 tcaatgaaaa ggtaagtgaa tttagcattt actcagcatc tactatggac ttaacaccta 780 acagtagata atctgaaggc aaacatattt gtatagggac tgcagaatga tagatgataa 840 atatcatctc ttctatttga atgaatattt tttcaaatct ttcacacaca gtggtttgct 900 atggaaagat ttgtagtaca ttaaacaaat ctgaagatgg agttagaaag cttaggctat 960 gttttgagca caacatataa tttctctgtg attgtttctt catctttcaa atgaggttac 1020 tgtgaagatt aaatgagata actaaatgat gataaaataa tgtaatctta gcagcacctt 1080 atttaatctg tgcaacaact ctgtgaagtg agtagggctc agcttcagtc acttctctgc 1140 catttattaa ctaagatagt ttggaaagtt acccatctct tcagctgtaa aatgatgagg 1200 atcataccta ttttatgggg ctgcttttag gtacaaatat acaggcaagc actttgttaa 1260 tactaaagca ttacaccaat tagttttact cttttccatt cacacatgaa attaatgtaa 1320 tcagaattct gtagattacc taaatcttct gttaacacgt gatatgcagt tcaggttaaa 1380 tgtcagttga gttaccaaag cacatacata ctcaccaccc tatccaaatc tacaagcctc 1440 ccagtttgtc ttcactattt tggttaaatt aatatgaatt cctagatgaa aatttcactg 1500 atccaaatga aataaaaaat atattacaaa actcacacct gtaatctcaa cattttggga 1560 ggccaaggca ggtagatcac ttgaggccag gagttcaaga ccagcctgat caacatggtg 1620 aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaaat tagccaggtg tggtggcatg 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aatcagtcat 2520 tcaagccacc agagtatttg atcgagattt cacaaactct aactttctga tacccattct 2580 cccaaaaacg tgtaacctcc tgtcgatagg aacaacccac tgcagggatg tttctcgtgg 2640 aaaaaggaaa tttcttttgc attggtttca gacctaactg gttacaagaa aaaccaaagg 2700 ccattgcaca atgctgaagt acttttttca aatttaaaat ttgaaagttg ttcttaaaat 2760 ctatcattta ttttaaaata cggatgaatg agaaagcata gatttgataa agtgaattct 2820 tttctgcaat ctacagacac ttccaaaaat cactacagac actacagaca ctacagaaaa 2880 tcataaataa acaagtgcta gtatcaatat ttttaccaaa aaatggcatt cttagaattt 2940 tttataggct agaaggtttg tacaaactaa tctgccacgg attttaaaat atgagtgaat 3000 aaattatatt gcaaaaaaaa tcaggttaca gagaactggc aaggaagact cttatgtaaa 3060 acacagaaaa catacaaaac gtatttttaa gacaaataaa aacagaactt gtacctcaga 3120 tgatactgga gattgtgttg acatattagc attatcactg tcttgctaaa acataaaaat 3180 aaaaagatgg aagatgaaat tacaatacaa atgatgattt aaacatataa aaggaaaata 3240 aaaattgttc tgaccaacta ctaaaggaag acctactaaa gatatgccat ccagcacatt 3300 gccactctac atgtggtctg taaaccagca gcatagggat cctctagcta gagt 3354 <210> 28 <211> 677 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(677) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 12803267..12803943 <400> 28 ttatatagta tatataatag tatatattat atagtataca taatagtata tattatatag 60 tatacataat agtatatatt ataatataca taattgtata tatcatatag tatacattat 120 agtatatatc atatagtata cattatagta tatatcatat agtatacatt atatagtata 180 tatcatatag tatacattat agtatatatc atatagtata cattatagta tatatcatat 240 agtatacgta atagtatata tcatatagta tacgtaatag tatatatcat atagtatacg 300 taatagtata tatcatatag tatacgtaat agtatatatc atatagtata cgtaatagta 360 tatatcatat agtatacgta atagtatata tcatatagta tacgtaatag tatatatcat 420 atagtatacg taatagtata tatcatatag tatacgtaat agtatatatc atatagtata 480 tattatatag tatatatcat atagtatata ttatatagta tatatcatat agtatatatt 540 atatagtata tatcatatag tatatattat atagtatata tcatatagta tatataatag 600 tatatatcat atagtatata taatagtata tatcatatag tatatatact atactatatt 660 atatatagta tacataa 677 <210> 29 <211> 332 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(332) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 13079684..13080015 <400> 29 ttaattatat tatatatatt atataattat atattaatat atattaatta tattatatat 60 attatataat tatatattaa tatatattaa ttatattata tatattatat aattatatat 120 taatatatat taattatatt atatatatta tataattata tattaatata tattaattat 180 attatatata ttatatatta taattatata ttatataatt ataatatata tgttaatata 240 atatatataa ttaatatata attaaaacta tttaattata tgtatattat atataatatg 300 tattatttaa ataataaata tattatttat at 332 <210> 30 <211> 479 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(479) <223> MAr of chromosome 1 genomic contig; 15682296..15682774 <400> 30 acaagtacat atatatatag tatatatata caagtacata tatatagtat atatatatat 60 acaagtacat atatatagta tatatatata tacaagtaca tatatatagt atatatatat 120 acaagtacat atatatagta tatatatata caagtacata tatatatagt atatatatat 180 acaagtacat atatatagta tatatatata caagtacata tatatatagt atatatatat 240 acaagtacat atatatagta tatatatata caagtacata tatatatagt atatatatat 300 acaagtacat atatatatag tatatatata tacaagtaca tatatatata gtatatatat 360 atacaagtac atatatatag tatatataca tatatacaag tacatatata tagtgtatat 420 atatatatac aagtacatat atatacttgt attagtatat atatatatat atacaagta 479 <210> 31 <211> 531 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(531) <223> MAr of chromosome 1 genomic contig; 15694611..15695141 <400> 31 tataatatat ataatacata atagatatat tatattatat aatagatata taattataaa 60 cataataata tataatgaat ataatataaa ataaatataa taaaatatat aatatatcta 120 ttatgtatta tatattatat atgtttatat ataatataat tatatatgtt tatatataat 180 ataattatat atgtttatat ataatataat tatatattat atattataga tataatatat 240 aatatactat atattataga tataatatat aatatactat atattataga tataatatat 300 aatatactat atattataga tataatatat aatatactat atattataga tataatatat 360 aatatactat atattataga tataatatat aatatatatt atatattata gatataatat 420 ataatatatt atatattata tctatatata atatattgta tattatatat aatatattgt 480 atattatata taatatattg tatattatat ataatatatt 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tatataaata tatataaaaa tataaatata tataaatata tataaatata 240 taaatatata taaatatata taaatatata aatatatata aatatatata aatatatata 300 aatatataaa tatataaaaa tatatataaa tatataaata tatataaata tataaatata 360 taaaaatata tataaatata taaatatata taaatatata taaatatata tataaatata 420 tataaatata tatatatata aatatatata aatatatata taaatatata taaatatata 480 tatatatata taaatatata taaatatata taaatatata tataaatata tataaatata 540 tataaatata tatataaata tatataaata tatatataaa tatatataaa tatat 595 <210> 34 <211> 738 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(738) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 4485716..4486453 <400> 34 ataatagata atatatatta tatgatagat atataatata ttatataata tataatatat 60 tatatatcta tcatataata tatataatat ataatatatt atatatctat catataatat 120 aatatatata atatataata tatatcatat tatattgtat ataatatata tcatattata 180 ttgtatataa tatatatcat attatattgt atataatata tatcatatta tattgtatat 240 aatatatatc atattatatt gtatataata tatatcatat tatattgtat ataatatata 300 tcatattata ttgtatataa tatatatcat attatattgt atataatata tatcatatta 360 tattgtatat aatatatatc atattatatt gtatataata tatatcatat tatattgtat 420 ataatatata tcatattata ttgtatataa tatatatcat attatattgt atataatata 480 tatcatatta tattgtatat aatatatatc atatattatc tattatattg tatataatat 540 atattatata ttatctatta tattgtatat aatatatatt atatattatc tattatattg 600 tatataatat atattatata ttatctatta tattgtatat aatatataat aaatatagta 660 tatataatag ataatatata gtatatatga tatattatat atactatata ttatatatca 720 tatatactat atactata 738 <210> 35 <211> 386 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(386) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 5423067..5423452 <400> 35 taaatatata aaaatatata taaaaatata aaaatattta tataaatata taaaaatatt 60 tatataaata tataaatata taaatatata tttatataaa tatataaata tataaatata 120 taaatatata tttatataaa tatataaata tatatttata taaatatata aatatatata 180 aaatatataa atatatattt atataaatat ataaatatat ataaaatata taaatatata 240 tattttatat aaatatataa atatatataa aatatataaa tatatatatt ttatataaat 300 atataaatat atataaaata tataaatata tatattttat atatttatat atataaatac 360 atatatttca tatatcacat atatga 386 <210> 36 <211> 584 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(584) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 5805559..5806142 <400> 36 taaatatttt taaaatatat atattttata atatataatt tatattataa tgtgtacata 60 atatatatta taatataata tatataatac tgtatattat attatatata ttataatata 120 tattattata tattatatta tatataatat aatatatatt ataatatatt atattataca 180 tattataatg tattataata tatattatat tatatattat aatatatatt atattatata 240 ttataatata tattatatta tatattataa tatatattat attatattat atatattata 300 atacatatta taatacatat tatataatat attataatat gtattataat acatattata 360 taatatatta taatatatta tatataataa tatattataa tacatattat atataatata 420 tattatgtat attatatata atatatatta caatgtatat tatgtatatt atatatatta 480 tatatcatat aatatatatt atatataata tgatatataa tatatattat ataatatatt 540 atatgatata tataatatgt attacatgta atatatatca taat 584 <210> 37 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(345) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 10802644..10802988 <400> 37 tgtatatata tactatatat atactatata tatagtgtat atatatacta tatatatact 60 atatatatag tgtatatata tactatatat atagtatata gtatatatag taatatatat 120 atatagtata tatatacact atatatagta tatatagtat atatatattg tgtatatagt 180 atatatatag tgtatatata gtatatatat attgtatata tagtatatat attgtgtata 240 tatagtatat atatagtata tatagtatat atagtatata tatagtatat atatactata 300 tatatagtat atatatattg tatatatata ctatatatat agtat 345 <210> 38 <211> 474 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(474) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 13496468..13496941 <400> 38 atattatata taatataatt atatctataa ttatatatta tatataatat aattatatat 60 ctataattat atattatata taatatatat tatatataat atataattat atataattta 120 tataatataa tatataatat ataattatat ataattatat aatataatat ataatatata 180 attatatata atttatataa tataatatat aatatataat tatatatatt tatataatat 240 aattatatat aatatataat tatatataat ttatataata taattatata taatatataa 300 ttatatataa tttatataat ataattatat ataattatat attatatata atttatataa 360 tataattata tataatatat aattatatat aatatataat tatatataat tatatataat 420 atataattat atataattta tataatataa ttatatatta tatatattat atat 474 <210> 39 <211> 483 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(483) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 2509163..2509645 <400> 39 caaaatacat aatatataat agtattatat aatagtatgt atagttataa tatatagtat 60 aattacaata tatgatatgg tttatatatt atatatagta taatataata taacataata 120 ctattataat atataaacta tataatatat actattataa tatatgaact attataatat 180 ataaactata tataatatat aatatgtact attataatat ataaactatt ataatataat 240 atataaacta ttataataca taaactatta taatatatat aatactatgt atacatatat 300 tacattatgt acatactaca ttatgtatta tgtatgtata tatacacaaa atacataata 360 tataatagta ttatataata gtatatatag ttataatata tagtataatt acaatatata 420 atatggttta tatattatat atagtataat acaatataac ataatactat tatatataaa 480 cta 483 <210> 40 <211> 641 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(641) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 2776349..2776989 <400> 40 tgttatatat atataacata gatattatat atacatgtta tatatataac atagatatta 60 tatatacatg ttatatatat aacatagata ttatatatat aacatagata ttatatatac 120 atgttatata taacatagat attatatata catgttatat ataacagata ttatatatac 180 atgttatata taacatagat attatatatg tatgttatat ataacataga tattatatat 240 gtttatataa tatataacat atgtttaaca tatataatat ataacatgtt tatataatat 300 ataacataat tatatgttat atatgatata aaacatatat attatatacg ttatatgtaa 360 tatataacat atattgtata cgttatatgt aatatataac atatattgta tacgttatat 420 gtaatatata acatatattg tatacgttat atgtaatata taacatatat tgcatacgtt 480 atatgtaata tataacatat attgtatacg ttatatgtaa tatgtaacat atattgtata 540 cgttatatgt aatatgtaat atataataca tataacatgt atatataaca tatatgtata 600 taacatatat ataacatata taacatatat gttatattat a 641 <210> 41 <211> 745 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(745) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 2858703..2859447 <400> 41 atatttatat atgtaataat atataatata tttatatgta tttgtatatg taataatata 60 tatataataa aatatgtaat aatatataat atatttatat ataaatatat tatattatat 120 atatattatt atatttataa tataatatat atttatatta tatattataa atatatatta 180 tataatatat attataaata tatattatat aatatatatt ataaatatat attatattat 240 atattataaa tatatattat ataatatata ttataaatat atattatata atatatatta 300 taaatatata ttatatttat aatatatatt tttgtatatt atatattata tattataaat 360 attattatat ttataatata ttatatattt tatatataat atatgatata tattataaat 420 atatcttata aatatatata tttatatata tatattataa atatataaat ataaatatat 480 aatataatat aatataatat aataaatata atatataata tatataatat ataataaata 540 taataaatat aaatatatca tataaatata aatataaata taaatatatc atataaatat 600 atatatttat atgatatatt atagtatata taaatatatt tatatattat aaaatattta 660 tataatatat aattataata tatttatata tataaattaa ctaatatata taaactaata 720 taatatataa tgtaataata tagta 745 <210> 42 <211> 307 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(307) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 945522..945828 <400> 42 catatataat atatattacc tatgttatat aggtcatata taacataaat atattacata 60 tatgtaatat atattaaata taaatatata acatatatgt gtaactatat atgtaaatat 120 gtacatatac atatatgtaa atatataata tatatttaca ttatattata taatatatat 180 ttacattata tatttatata tacattatat atatttacat tataaatatt tatataatat 240 atatttacat tatattacat tatataaaat acaatatatt acattataat acattataac 300 agataaa 307 <210> 43 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(357) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 3402743..3403099 <400> 43 aatattatat taaatataat atattaatat ttaatatatt taatataata ttaaataaat 60 atattataaa taaattataa tatataaata tatattatgt atttatgtat aatatataaa 120 aattatatat aatatatata tttttataaa tatataaata tataataaat aaatatatta 180 aataaataat aatatattaa atattaatat attaaatatt atatattaaa tataatatgt 240 aatatgaaat atattaaata ttatatatta aatataatat ataatgtgaa atatattaaa 300 tattatatat taaatataat atataatatg aaatatatta aatattatat attaaat 357 <210> 44 <211> 323 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(323) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 3485830..3486152 <400> 44 atatttatag actatatatt tatatattta gtgtatttgt atactatata tttatatagt 60 tagtatattt gtatactata tatttatata tttagtatat ttgtatacta tatatttata 120 tatttagaat atttgtatac tatatattta tatatttagt atatttgtat actatatatt 180 tagtatattt gtatactata tatttatata tttagtatat ttgtatacta tatatttata 240 tatttagtat atttatatac tatatactta tatatttagt atatttatat actatatact 300 tatatattta gtatatttat ata 323 <210> 45 <211> 498 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(498) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 3548336..3548833 <400> 45 aattattact atattgttaa tataattatt atataatata atataattat atcactatta 60 ttatattata gtattaatat aatagtgtat aacattaata taatatagta ttaatataat 120 agcgtataac attaatataa tatagtatta atataatagc gtataacatt aatataatat 180 agtattaata taatagtgta tattaatata atatagtatt aatatataat attaatataa 240 tatatcaata taatagtata taatataata taatatatca atataatagt atataatata 300 atataatata tcaatataat agtatataat ataatataat atatcaatat aatagtatat 360 aatattaata taatataata tcaatataat agtatataat attaatatat taatataata 420 gtatataata ttaatgtaat ataatattaa cataatgtat ataataatat aatagtatat 480 aatactaata taatataa 498 <210> 46 <211> 400 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(400) <223> MAr of chromosome 1 genomic contig; 4595109..4595508 <400> 46 aaatatatta tattatatat tatatattat tcaatatact ataatatata ttatatatgt 60 ttaatacaat atataatatt tacatatatt cccatttatt tatataacat atattatatg 120 atattatata ttactccata taatataata tattatacat aatatattac tcagtataat 180 acataatata tataatatat tactcggtat aatatataat attatatgtt atgcaatata 240 atatataata ttatatataa tacattattc aatataatat ataatattat atataataca 300 ttattcaata taatatataa tacactattc aatataatat acaatattat atataataca 360 ttattcaata taatatatat tatataatat atatatttat 400 <210> 47 <211> 403 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(403) <223> MAr of chromosome 1 genomic contig; 7205509..7205911 <400> 47 agtatatata tgtgtatata tatgagtata tatatgtgta tatatatgag tatatatatg 60 tgtatatata tgagtatata tatgtgtata tatatgagta tatatatgtg tatatatatg 120 agtatatata tgtgtatata tatgagtata tatatgtgta tatatatgag tatatatatg 180 tgtatatata tgagtatata tatgtgtata tatgagtata tatatgtgta tatatgagta 240 tatatatatg tgtatatatg tgagtatata tatgtgtata tatatgagta tatatgtgta 300 tatatatgag tatacatatg tgtatatata tgagcatata tgtgtatata tatgagtata 360 tatatgtgta tatatatgag tatatatgtg tatatatatg agt 403 <210> 48 <211> 309 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(309) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 7507280..7507588 <400> 48 tataaaatat atattattta tatattatat ataaaatata tattatatta tatattatag 60 atataataaa taaataatat ataatatatt atataattat ttatacataa ttatatataa 120 ttatatgtaa ttgtacaatt atatataatt atatacaatt atacacataa ttatatacaa 180 ttatacaatt atatacataa ttatatatat aatatacata attatatatt aattatacaa 240 ttatatacat aattatatat aattatacaa ttatatacat aattattatg tatattatat 300 tatataata 309 <210> 49 <211> 516 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(516) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 3581085..3581600 <400> 49 atatatatat atatatatat atttatatat atatatatta atatatatta tatataaaaa 60 tatataaaat ttatatatat aatttatata tataaaaata tataaaattt atatatataa 120 tttatatata taaaaatata taaaatttat atatataatt tatatatata aaaatatata 180 aaatttatat atataattta tatatataaa aatatataaa atttatatat ataatttata 240 tatataaaaa tatataaaat ttatatatat aatttatata tataaaaata tataaaattt 300 atatatataa tttatatata taaaatatat aaattatata tataattata tatataatat 360 aaaattatat atataattat atatataata taaaattata tatataatta tatatataat 420 ataaaattat atatatattg tatatatata aaatatacaa aatttatata tataaaatat 480 aaaatataca taaaaataaa tatatataat ttatat 516 <210> 50 <211> 534 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(534) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 3084851..3085384 <400> 50 atataatata tatgactata tattttatat tatattctat ttcaataaaa tatttatatt 60 ttattatata ttataatata taattatata tgtaataata tataatatat aatatatatt 120 ttatattata ttttatattt atttttatat tttatattat attttattat atatattata 180 atatataatt atatatgcaa taatatatta tatattataa tatataatta tatatgcaat 240 aatatattat atattataat atataattat atatgcaata atatattata gattataata 300 tataattata tatgcaataa tatattatat attatatatt agataatata ttaatatata 360 ttataacata taatatataa catataatat ataatatatt atctaatata taatataaca 420 tataatatat aatatattat ataatatatt attacatata taatatattg taatatataa 480 tattacatat atcttcaaaa agagttatgt gtatataata catatatata ccat 534 <210> 51 <211> 583 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(583) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 160087..160669 <400> 51 tatttatata aaatatataa aatatattat atataaatat attatatata atatatttat 60 atattataca atatatttat atattatata taatatattt tatataatat acataatata 120 ttttatatat tatatataat atattttata tataatgtac aatatatttt atatattata 180 tataatatat tttatatata ctatacaata tattttatat attatatatt ttatatatat 240 ttttcatgta acatatatat tttatatata atatatatac catatataat atattttata 300 tataatatat ataccatata taatatattt tatatataat atgtatatca tatatagtat 360 attttatata taataggtat accatatata atatatttta tatataatag gtataacata 420 tataatatat tttatatata atatgtatac catatataat atattttata tattatagat 480 accatatgta atatacttta tatataatat agataccata tgtaatatac tttatatata 540 atatagatac catatgtaat atactttata tataatatag ata 583 <210> 52 <211> 314 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(314) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 4350424..4350737 <400> 52 tatgtgtata taaatatatg tatatatgtg tatataaata tatataaata tatgtatata 60 tgtatatata catatattta tatataaata tatgcatata tttatatata aaatatatgc 120 atatatgtat atatataaaa tatatacata tatgtatata tataaaatat atacatatat 180 gtatatatat aaaatatata catatatgta tatatataaa atatatacat atatgtatat 240 atataaaata tatacatata tgtatatata taaaatatat acatatattt atatatataa 300 aataccaagt ctta 314 <210> 53 <211> 828 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(828) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 8443267..8444094 <400> 53 tattatataa ttatatatac tatataatta tataatatat agttatatag tatatataat 60 atatataata tatactatag tatatataat atatataata tatactatag tatatataat 120 atataattat atataatata tataatatag tatatattat atatatatta tatatatata 180 atatatatat aatatatata atatagtata tataatatat aattatatat aatatataat 240 atagtatata taatatataa tatatatata attatatact ataatatata taatatataa 300 ttatatatta tatactatag tatatattat tatatataat agatataata tatataatta 360 ttatataata tagtatatat aatatataat tatatataat agatataata taatataatt 420 atatataata tagtatatat aatatataat tatattatat tatatataat atataattat 480 aatatataat tatattatat aatatatata atatataatt atattatata attatattat 540 ataatatata taatatataa ttatattata taatatatat aatatataat tatattatat 600 aatatatata atatataatt atattatata atatatataa tatataatta tattatataa 660 tatatataat atataattat atattatata taatatagta tatataatat gtaattatat 720 atcatataat atataacatt gtatataata tataattaca tattatataa tgtatataat 780 atataattat atacattata taatatagta tataattata tattatgt 828 <210> 54 <211> 573 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(573) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 8703190..8703762 <400> 54 tatattatat ataaaatata catataatat acctataata tacatataat atataatata 60 tattatgtac atataatata catataatat atataatata taatgtacat ataatataca 120 tataatatat gttatatatt atatataaaa tataggatat atataatata gaatatatat 180 actatattgt atatataaga tatataatat atagtatata tactatataa tatataatat 240 atagtatata taatatataa tatagaatat atatacaata tataatatag aatataggat 300 atatatagaa tatacatata taatatgtat atattatata ttatattata tattatataa 360 aaatatataa tatataatat aaaaatatat tatatattat ataatataaa atatattata 420 tattatatat tatataatat aaaatatatt atatattata tattatatat aaaatatatt 480 atatattata tattatatat aaaaatatat tatatattat atattatata taaaaatata 540 ttatatatta tatataaaaa tatatattat tac 573 <210> 55 <211> 597 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(597) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 8819076..8819672 <400> 55 acatatctta tatataaaat atataaatat acacatattt tatatataat atatattata 60 tatatgaaat atacacatat ttttatatat ataatatata tattatatat aatatatgca 120 tatattatat ataaaatata tatattatat ataaaatatg catatattat atataatata 180 tataatataa aatatataat atatattata tattatatat aatatatatt atatataata 240 catatatata atatataata tatataaaat ataatatata tattatataa tatatatata 300 aatatatata atatatatat aatatatata ttatatataa aatatatatt atatgtaaaa 360 tatataatat atataatata tatattatat gtaaaatata tattatatat aaaatatata 420 atatataaaa tatatattat atataaaata tataatatat aaaatatata atatatataa 480 aatatataat atatataaat atatattata tataaaatat ataatatata taaatatata 540 ttatatataa aatatataat atatataaat atatattata tataaaatat atattat 597 <210> 56 <211> 646 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(646) <223> MAr of chromosome 1 genomic contig; 759619..760264 <400> 56 taatatatat aatatatatt atataataat atataatata tattatatta taatatataa 60 tatattatat aataatatat attatataat atataataat atatataata catattattt 120 aataatatat aatatatatt atataataat atataatata tattatataa taatatacat 180 tatattatat aatatataat atatataata tatattatat aataatatat aatatatatt 240 atagaatgat atattagata ttatataatt atatatataa tattatatat tatataataa 300 tatataatat atattatata attatatata taatattata tattatataa ttatatataa 360 tatattatat aattatatat ataatattat atattatata attatatata atatatatta 420 tataattata tatataatac tatatattat ataattatat ataatactat atattatata 480 atttatataa ttatatatat tatatattat ataattatat atattatata ttatataata 540 acatatatat tatatattat ataataacat atatattata tattatataa tacatatata 600 ttatatatta tataatacat tattatataa tatataatat atatta 646 <210> 57 <211> 752 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(752) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 1226710..1227461 <400> 57 taaacatata tataaatata tataaatata tatataaata tatataaata tataaatata 60 taaatatata tgaatatata aatatatata aatatatatg aatatataaa tatatatata 120 aatatatata aatatatata taaatatata taaatatata taaatatata taaatatata 180 taaataaata tataaatata tataaatata taaatatata tataaatatg taaataaata 240 tatataaata tataaatata tataaatata tataaatata tatagaaata tatatagaaa 300 tatatataaa tatatataga aatatataga aatatatata gaaatatata taaatatata 360 taaatataga aatatatata aatatatata aatatatata gaaatatata atatatataa 420 atatatataa atatataaat atatatataa atatatatat aaatatatat aaatatatat 480 aaatatatat aaatatatat aaatatatat attaatatat aaatctatat taatatatat 540 taatatataa atctatatta atatatatta atatatatat taatatatat taatatataa 600 atatatatat taatatataa atatatataa atatatatgt aaatatatat ataaatatat 660 ataaatatat atataaatac atataaatat atatataaat atatataaat atatatataa 720 atatatataa atatatatat aaatatatat aa 752 <210> 58 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(300) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 1119049..1119348 <400> 58 taatatacat tttatataat atatgtaata tatattttat atatatgtaa tatatatttt 60 atataatata tgtaatatat attttatata tatgtaatat atattttata taatatatgt 120 aatatatatt ttatataata tatgtaatat atattttata taatatatgt aatatatatt 180 ttatataata tatgtaatat atattttata taatatatgt aatatatatt ttatataata 240 tatgtaatat atattttata taatatatgt aatatatatt ttatatatat gtaatacata 300 300 <210> 59 <211> 617 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(617) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 3603613..3604229 <400> 59 aaaatataat atatataata tataatatat ataatatatt atatataaaa tatataatat 60 ataatatata taataaaata tacataatat ataatgtata ataaaatata cataatatat 120 aatatataat aaatatataa tatataatat ataataaaat atataatata taatatataa 180 taaaatatat aatatattat atataataaa atatataata tattatatat aataaaatat 240 ataatatatt atatataata aaatatataa tatattatat ataataaaat atataatata 300 ttatatataa taaaatatat aatatattat atataataaa atatataata tataatatat 360 aataatatat ataatatata atatatataa taaaatatat ataatatata atatatataa 420 taaaatatat aatatataat atatataata aaatatatat gatatataat atatataata 480 aaatatatga tatataatat atataataaa atatataata tataatataa tatataatat 540 atatactaaa aaatatataa tatataataa aaaatatata atatataata tatataatat 600 ataataaaat atatata 617 <210> 60 <211> 674 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(674) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 2592460..2593133 <400> 60 taagcttata tatatatata agcttatata tatatatata agcttatata tatatagaaa 60 gcttatatat atatagaaag cttatatata taagaagctt atatataaaa gcttatgtat 120 aaatatatat aaatatattt atttatgctt atagatacat atataaatat atttatttat 180 atttatatat aaacatatat ttatatatat ttatataata tttatttatt atataaataa 240 atatataata aataataaat atatataata tatttattgt attatttata taaatttatt 300 aatataatat ataataaaat aataattata taaatatata aatatctata aatatatata 360 aatatatata atatctataa atatatataa atataaatat atataatatc tataaatata 420 gataaatata aatatatata atatctataa atatagataa atataaatat atataactat 480 atataaatat atataactat atataaatat atatataaat atatataact atatatataa 540 ctatatatat aaatatatat aactatatat ataaatatat atataaatat atataactat 600 atatataaat atatataact atatataaat atatatataa atatatataa ctatatatat 660 aaatatatat ataa 674 <210> 61 <211> 1694 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1694) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 2891680..2893373 <400> 61 atatgtaata catatattat atatgcatat atacatgcat atgtatatac atatattata 60 tatgcatata tacatgcata tgtatataca tatataaagt atgattatat ataatatata 120 catgtatatg tatatacatg tatatattat attatatatt atttatacat attattatgt 180 ctatatataa tataatatat acatattaat aatataatac ataatataat ataatatatt 240 atataataca taatataata taatatatta tataatacat aatataatat aatatattat 300 atgatacata atataatata atatattata tgatacataa tataatataa tacatattaa 360 taatatatta ttattattaa tataatatat acatattaat atacatacat atatattata 420 ttatatataa tatacatata atataatatg taatattata tataatataa tacataatat 480 aatacatatt aataatatat tattaataag ataatatata tgtatctata atatatacat 540 atatgtatat gtatgtatat attatagata tacatgttta tacatgtata tattatagat 600 atatacatgt atatacatgt atatattata gatatataca tgtatatacg tatatattat 660 agatatacat gtatatatgt atatatatta tagatataat atatacaaga atataagaat 720 atatataata taatatataa tacacataat acgtatatat tatatataca tgtatattat 780 atatgtacat atatacatgt atattatata tacatgtata ttatatatac atgcatatta 840 tatatatttt tatatataat atccatgtat attatgtata tttgtgtata ttatatatac 900 atgtatatta tatatacatg catattatat atatttttat atataatatc catatatatt 960 atgtatattt gtgtatatta tatatacaca tatattatat atacatggat attatatata 1020 cacatatatt atatatacat atatattata tatacacata tattatatat acatgtatat 1080 tatatataca cgtatattat atatacacac gtatattata tatacacgta tattatatat 1140 acacacgtat attatatata cacgtatatt atatatacac acgtatatta tatatacacg 1200 tatattatat atacacacgt atattatata tacacgtata ttatatatac acacgtatat 1260 tatatataca cgtatattat atatacacac gtatattata tatacacgta tattatatat 1320 acacacgtat attatatata cacgtatatt atatatacac acgtatatta tatatacatg 1380 tatattatat atacatgtat attatatata cacatgtata ttatatatac atgtatatta 1440 tatatacaca tgtatattat atatgcatgt atattatata tacacatgta tattatatat 1500 acacatgtat attatatata catatatatt atatatacat gtatattatg tatacatata 1560 tattatatat acatgtatat tatagataca tatatattaa atatacatgt atattatgta 1620 tacatatata ttaaatatac atgtatattg tatatacata tatattatat acatgtatat 1680 tacatgtata cata 1694 <210> 62 <211> 587 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(587) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 3432560..3433146 <400> 62 gaattatata tatatagctg aattatatac atatataata tatacaatat atattatata 60 tttatatatg atatatacaa tatatattac atattatata tacaatatat aatatataat 120 atataatatt atatattata tattgtatat aatatatatt atataacatt atataatata 180 taatattata tattatatat tgtatataat atatattata taacattata taatatatac 240 tattatatat tataatatat aatatataat aatatataat agtatatatt atatatattg 300 tatatattat atataaatat ataatatata atatatatta tataatatat attatataat 360 atatattatt atatattata tatttatata taatatatat tatatatatt atattttata 420 tataaatata taatatataa taatatataa tttaatatat ataatatata caatatataa 480 tatataatat attaatatat ataatatata caatatataa tatataatat 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ctatataatg tatatttatg tataattgta 240 tacactatat aatgtatatt tatgtataat tgtatacact atataatgta tatttatgta 300 taattgtata taccatataa tgtatattta tgtataattg tatatacca 349 <210> 65 <211> 500 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(500) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 3240166..3240665 <400> 65 ttaatatata atatatatta tatatttata tattaatata taatatatat ttatatataa 60 tatatattat atatttatat tacatatatt tatatgttaa tatatatttt atatatttat 120 atattttata tatttatata ttatatattt atatattata tttatatatt atatatttat 180 attatatatt tatatattat atttatatat tatatattta tattatatat ttatatattg 240 tatatttata ttatatattt atatattgta tttatatatt atatatttat atactatata 300 tatttatata tattatatat ttatatatta tatatattta tatatattat atatttatat 360 attatatata tttatatata ttatatattt atatattata tatatttata tatattatat 420 atatttatat atattatata tttatatata atatatatta tatattttat ctatatattt 480 atatattaat atatattata 500 <210> 66 <211> 866 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(866) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 409429..410294 <400> 66 atatatataa tatattatat atattatata ttatatatat aatacatata ttatatatat 60 aatatataat acatatatta tatatattat atattatata taatatataa tacatatatt 120 atatataata tataatatat aatatattat ataatataat tatataatta tataatataa 180 tataatatat aatattatat aattatataa tatatataat tatattatat attataaata 240 ttatataata tatatattac aaatatatat tatatatatt ataaatatta tataacatat 300 atattatata atatatataa tatataatat atataaaaat ataatatata agatatatat 360 aatatatgat atatatgata tataatatat gatatatatg atatatataa tatatgatat 420 atatgatata tatgatatat ataatatatg atatatatga tatatatgat atatgatata 480 tatgatatat gatatatatg atatatatga tatatgatat atatgatata tatgatatat 540 gatatatatg atatatatga tatatgatat gatatatata atatatgata tgatatatat 600 aatatatgat atatatgata tatgatatgt aatatatatg atatattata tataatatat 660 aatatataca taatatataa tatataatat ataatatata taatatgtga tatatataat 720 atatgatata tgatatatga tatatattat ataatatata taatatatat tatatataat 780 atatattata taatatatat aatatatatt atatataata tataagatat aagatataat 840 atatataata tataatatat ataata 866 <210> 67 <211> 335 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(335) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 614754..615088 <400> 67 acccaatata tgtgtatata tgtatgtata tatacatata catacataca tatatgtaca 60 tacatatata catacataca tatatatgta catacatata tacatacata catatataca 120 tataacatat atacacacat atatacagat atacatatat acatacatat atacatataa 180 catatataca tacatatata catataacac atacatacat acatatatac atacaacata 240 tatacataca tatatacata tgtatacata catatatgta tacatatatg tatacatata 300 tgtatacata tatgtatata tatattgtta tatat 335 <210> 68 <211> 455 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(455) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 1299520..1299974 <400> 68 ggatatatat attattagtt gttatattat tatatattat atatattatt atatataata 60 tattatatca tatatattat tatatataat atattatatc atatatatta ttatataata 120 tattatatca tatatattat tatatataat atatattata tatattatta tatataatat 180 atattatata tattattatg tataatatat atattatata ttatttatat atatataaat 240 tatataataa tatataatta attatacata tatacatata taagtataca tataatatat 300 ttatatagta tatataaata tatatacaat atatttatat attatatatt atatataaat 360 atatacaata tatttatatc atatatttta tatatgatac atataatata tattatatat 420 gatatataat atatatcata tatgatatat aacat 455 <210> 69 <211> 404 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(404) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 1970778..1971181 <400> 69 atatataata tgtataatat ataatatata tcatatattg ttctatgtat attacatata 60 atatgcatta tatattatat attgcatata atatgcatta tatattatat attgcatata 120 atatgcatta tatattatat attgcatata atatgcatta tatattatat attgcatata 180 atatgcatta tatattatat attgcatata atatgcatta tatattatat attgcatata 240 atatgcatta tatattatat aatatataca catataatat atataattta tatatattta 300 tatatattta catttattat atatttatta tatataaata tatttttata tattacttat 360 atattatata taatatatat aatatatata ttatatataa tata 404 <210> 70 <211> 605 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(605) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 3562918..3563522 <400> 70 tatatatata aaatacatat atattatata tattatatat aatacatata ttatatatta 60 tatataatac acgtatataa tatataatat ataatacata taatatatat gatatataat 120 acatataata tatatgatat ataatacata tataatatat atgatatata atacatatat 180 aatatatatt atatataata catatataat atatattata tataatacat atataatata 240 tattatatat aatacatata taatatatat tatatataat acatatataa tatatattat 300 ataatacata tataatatat attatataat acatgtatat aatatatatt atatataata 360 catatatatt atataataca tgtatataat atatattata tataatacat atatattata 420 tattatatat taatatattt atataatagt aatatataat attaatatat tatatatatt 480 aatattatat ataatacata tattatatat aatataaata tatataatac atatataata 540 cacatattat atataataca tatattatat ataatatata tattatatat aatatatatg 600 taata 605 <210> 71 <211> 317 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(317) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 189743..190059 <400> 71 tattttttat atttatatat tatatatatt tttatatgta atatattata tataaaatta 60 tataatttta ctacatataa tatataaaat tatataattt tactacatat aatatataaa 120 attatataat tttactatat ataatatata aaattatata attttatata taatatatat 180 tataatatat attatatgca atatatatta tatattatat tataatatat tgtatatttt 240 tgtatataaa atatataata tataatatat ttatagacaa taatatataa tataatatat 300 aaaattttat atataaa 317 <210> 72 <211> 522 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(522) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 229111..229632 <400> 72 gatatatata tttatatata taaaagatat atattattta tatataaaga tatatattta 60 tatatataaa agatatatat tatttatata tataaaagat atatatttat atatatgata 120 tatattattt atatatataa aagatatata tttatatata tgatatatat tatttatata 180 taaaagatat atataaaaga tatatattat ttatatatat aaaagatata tatataaaag 240 atatatatta tttatatata taaatgatat atattattta tatataaaag atatatatta 300 tttatatata aaagatatat attatttata tatataaaag atatacatat aaaagatata 360 tatttatata taaaagatat atatatttat atataaaaga tacatatatt tatatatata 420 aaagatatat atatttttat atataaaata tatattatat atataaaaga tatatataaa 480 tatatatatc ttttatatat aaaagatata tataaatata ta 522 <210> 73 <211> 1110 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1110) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 1138030..1139139 <400> 73 tatgtatgta tacataatat attatatatg tatattatgt atacataata tattatatat 60 gtatattatg tatacataat atattatata tgtatattat gtatacataa tatattatat 120 attatatgta tattatgtat acataatata ttatatatta tatgtatatt atgtatacat 180 aatatattat atattatatg tatattatgt atacataata tattatatat tatatgtata 240 ttatgtatac ataatatatt atatattata tgtatattat gtatacataa tatattatat 300 attatatgta tattatgtat acataatata ttatatatta tatgtatatt atgtatacat 360 aatatattat atattatatg tatattatgt atacataata tattatatat tatatgtata 420 ttatgtatac ataatatatt atatattata tgtatattat gtatacataa tatattatat 480 attatatgta tattatgtat acataatatt tatatattat atgtatatta tgtatacata 540 atatattata tattatatgt atattatgta tacataatat gtacacataa tatttatata 600 ttatatgtat attatgtata cataatattt atatattata tgtatattat gtatacataa 660 tatttatata ttatatgtat attatgtata cataatattt atatattata tgtatattat 720 gtatacataa tatttatata ttatatgtat attatgtata cataatatat tatatattat 780 atgtatatta tgtatacata atatattata tattatatgt atattatgta tacataatat 840 attatatatt atatgtatat tatgtataca taatatttat atattatatg tatattatgt 900 atacataata tattatatat tatatgtata ttatgtatac ataatatatt atatattata 960 tgtatattat gtatacataa tatattatat attatatatg tatattatgt atacataata 1020 tattatatat tatatatgta tattatgtat tatattatat attatgtata ttatagatta 1080 tgtatgcata cataatatgt attgtatatt 1110 <210> 74 <211> 521 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(521) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 2863407..2863927 <400> 74 aatatatata aatatataaa tatatataaa tatatataca tataaatata taaatatata 60 tatgtaaata tatgtaaata tatgtaaata tatgtatatg tatatatatg taaatgtatg 120 taaatatata taaatatatg taaatatata taaatatacg taaatatata aatatatata 180 actatatata aatatatata aatataaata tataaatata tataaatata tataaatata 240 taaataaata catataaata tataaataaa tacatataaa tatatataaa tatataaaaa 300 tatatataaa tatatatata aatatataaa catatataaa tatataaata tatataaata 360 tataaataca taaaatatat aaatatatat aaatatataa atatatataa atatagataa 420 atatagataa atatataaat atatataaat atataaatat agataaatat ataaatatat 480 aaatataaat atataaaaat atatataaat atataaaaat a 521 <210> 75 <211> 560 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(560) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 5712303..5712869 <400> 75 atataattat atatatatta tatattatat ataattatat attatatata atgtataatt 60 atatattata tataatatat ataaatatat atatttttta tataaatata ttatatattt 120 atatattata tataaattta tatatataaa tttttatata ttatatatat ttatatatta 180 tatattgtat atatttatat attacatatt gtatatattt atatattata tattatatat 240 ttatatatta tatattatat atttatatat tatatattat atatatttat atattatata 300 taaattattt atatataata tataaatata tattatataa tataaatttg tatatataat 360 atatatttat attatatata aaatatttat attatatata aaatataata taaatatata 420 catataatat atatattata tatttataat tatatattat atataataca tataatatat 480 aatatataat acatatatat catatatgaa atatatatca tatattatac atattatata 540 taacatatat attatatatc 560 <210> 76 <211> 479 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(479) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 8578812..8579290 <400> 76 tatggtatac atatagtata tatggggtac atatatggta tatatatggg ttatatatat 60 gatatatatt atatatgtat atggtatata tatggtatat atattataca tgcatatggt 120 atgtatatgg tatatatatg atatatacat atggtgtata tatatgttat atatgatata 180 tataaggtat atatatggta tatataaggt atatatagta tatatatggt atatataagg 240 tatatattgt atatatatgg tatatataag gtatatatat tgtatatatg gtatatatat 300 ggtttatata tatggtgtgt atatatggtg tttatataca cactttatat actatatatt 360 atatacacac tatatataat atatattata tatagttaaa tatatggtat atgcaattag 420 atatatggta tatgtaatta tatatatggt atatagatgg tgtatatatg gtatatata 479 <210> 77 <211> 477 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(477) <223> MAR of chromosome 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gtatatatac actatatata ctatgtatat 240 atacactata tatactatgt atatatacac tatatatact atgtatatat agtgtatata 300 tactgtatat gttatagtgt atatatagta t 331 <210> 79 <211> 410 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(410) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 8580705..8581114 <400> 79 tatagtctat attatataca gtctatataa tatatagtat atactatata tacttttcct 60 cattctgact atatactata tatatactat atatagtata tgtagtgtat atatacacca 120 tatatactat atatagtata cataccatat atagtatact atacatacca tatatagtat 180 acataccgta tatagtatac tatacttacc atatatagta tacatactat atataatata 240 tctggtgtat atatacacta tatatactat atatactata tatagtatat gtacactatt 300 tatagtattt atagtatata tactgtatat atagtatgta gtatatatac tatatattat 360 gtagactata tataatatag actatgtgta gagtatatat actatatata 410 <210> 80 <211> 433 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(433) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 12979167..12979599 <400> 80 atatataata tatatatgtc ctatatataa aatatatcat atatataaat atatatgata 60 tattttatat attaaatata taattatata taaatatata tttatatata aatatattat 120 ttcaatatat ataaatatat ttaaatatat ttaaatagaa tattaaatat ataaatatat 180 aattatattt aatatataaa tatatattaa atatataatt atatttaata tatataaata 240 tatattaaat atataattat atatttatat atttattata tataaatata tatttgttct 300 aaataaatat atattctaaa tatataatat tttatattat ataatatata atataaaata 360 tataataaat atataatata taaataaata aatatttatt ataaaataca tataaatatt 420 aaatatatat taa 433 <210> 81 <211> 385 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(385) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 16336644..16337028 <400> 81 tttatataaa tatctatata aataaatata taaatatata aatataaata tatataaata 60 tataaataaa tatataaata tatataaata taaatatata tataactatg aatttatatt 120 tatataaata tatatctata tgaatataaa tatatattta tataaatata aatatatata 180 taaatatata tatttatata gatataaata tatatataaa tatatatatt tatatagata 240 taaatatata tctatatatg aatatatatc tataggaata taaatatata tctatataaa 300 tataaatata tataagtata aatatatata aatatatatc tatataaata taaatatata 360 tataaatata aatatatata taaat 385 <210> 82 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(363) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 20624448..20624810 <400> 82 tatatatata gttatatata tatttatata tatagttata tatatatttt tatatagtta 60 tatatatagt tatatatata gttatatata tatagttata tatatagtta tatatatagt 120 tatatatata tagttatata tatagttata tatatagtta tatatatagt tatatatata 180 tagttatata tatagttata tatatatagt tatatatata gttatatata tatagttata 240 tatatagtta tatatatagt tatatatata gttatatata tagttatata tatatagtta 300 tatatatata gttatatata tatagttata tatatagtta tatatatata gttatatata 360 tag 363 <210> 83 <211> 310 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(310) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 566025..566334 <400> 83 tatatataat atatattgta tatattatat attgtatata taatatatat tgtatatatt 60 atatattgta tatataatat atattgtata tattatatat tgtatatata atatatatat 120 tgtatatatt atatattgta tatataatat atatattgta tatattatat attgtatata 180 taatatatat attgtatata ttatatattg tatatataat atatatattg tatatattat 240 atattgtata tataatatat atattgtata tattatatat agtatatatt atatatagta 300 tatataatat 310 <210> 84 <211> 1236 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1236) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 1171429..1172664 <400> 84 aaagtattat atgtattata tgtatatgta ttatatatta catatgtatt atatataata 60 tatattatat attattatat attatatatt atatattatt atttatataa tgtattatat 120 attatatagt atatatagta tatataatgt attatatatt atatagtata tatagtatat 180 ataatgtatt atatatagta tatataatgt attatatagt atatatacta tataatgtat 240 tacatattat gtatagtata tgtaatgtat tatatattat atagtatatg taatgtatta 300 tatgtattat atagtatata ttatatatga tgtattattt agtatatata atatatatga 360 tgtattatat aacatatata atatatatga tgtattatat agcatgtata gtatatatga 420 tgtattatat agcatgtata gtatatatga tgtattatat atagcatgta tagtatatat 480 gatgtattat atatagcatg tatagtatat atgatgtatt atatatagca tgtatagtat 540 atatgatgta ttatatatag catgtatagt atatatgatg tattatatat agcatgtata 600 gtatatatga tgtattatat atagcatgta tagtatatat gatgtattat atatagcatg 660 tatagtatat atgatgtatt atatatagca tgtatagtat atatgatgta ttatatatag 720 catgtatagt atatatgatg tattatatat agcatgtata gtatatatga tgtattatat 780 attatatatg gtatatatga tgtattatat attatatatg gtatatatga tgtattatat 840 attatatatg gtatatatga tgtattatat attatatata atatatatga tgtattatat 900 attatatata atatatatga tgtattatat atgatgtatt atatataata tatatgatgt 960 attatatata ttattatcta ttatatacga tgtattatat gcaagttatt atgtataata 1020 tataatgtat tatatattat ataatgtata atatataaat atataaatat ataattatgt 1080 ataaatatag aaatatatac attatacatt atatacatta taatgtataa tatataaata 1140 tattatatat aaatgtatac attatatata aatatattat atacattata tataaaatat 1200 gtatatagtt attatacctt atatatacta aacagt 1236 <210> 85 <211> 309 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(309) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 1925173..1925481 <400> 85 atatatttat ataaatatat tttatataaa tatatattat ataatattat aatatatgtt 60 atattatata tattttatac aatatataat atatattata tatattttat acaatatata 120 atatatatta tatatatttt atataatata taatatatat tatatatatt ttatacaata 180 tataatatat attatatatt atataatata tattatatat attttatata atatataata 240 tatattttat acaatatata atgtatatca ttatattata taatgtatat catattatat 300 aatgtatat 309 <210> 86 <211> 312 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(312) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 4396756..4397067 <400> 86 cacagtgtat atatagtata tatactgtat atatactgtg tatatacact gtatatacac 60 agtgtatata cagtatatat actatatata cactgtgtat atatagtata tataaattct 120 aggaatatat atactatata tatactatat atataaattc taggaatata tacacactat 180 atatacacta tatatacaca tatatacact atatatatta tacacatata ttatatatat 240 acactatata tacacgagat atataacata tacactatat actatacata acatatatac 300 tatatatact at 312 <210> 87 <211> 398 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(398) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 56057..56454 <400> 87 atatatatta catattatat atataatata tattatataa tatatattat attatataat 60 atataatata aatataatat aaattatatt atataatata taatataaat ataatataaa 120 ttatataaat ataatatata ttttattata taatataata tatattatat aaatataata 180 tataaattat ataatataat atatattata taatataata tattttatta tataaatata 240 tattatatta tataatatat attttattat ataatatata ttatatattt atagaatata 300 atatatattt tattatataa tatatattat ataatatata ttatatttat atataacata 360 tattattata taaaatatgt ataatatata ttatataa 398 <210> 88 <211> 391 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(391) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 56984..57374 <400> 88 tactataata catattatat ataatattat atactatata ttactatatt attatattat 60 atataattaa actatattat agtatataat atataatata tactatatgt aatattacta 120 tgatactgat attatattat atataattaa attatattat attaatatat aaattatata 180 taatacataa tatataaatt atattatatt atttatatat aatgtatgcc atataattta 240 tatataatgc attatatata atttatatat aatgcattaa atataaatta tatataatgc 300 attatatata attatatata atgcattata tataatttat atttaatata taaatttata 360 tttaatatat ttatatatta tatataataa a 391 <210> 89 <211> 309 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(309) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 469547..469855 <400> 89 atatatatgt aatatatatg ttatatatgt aatatatatg ttatgttata tatgttatat 60 atatgttata tataatatat atgttatata tacgttatat gttatatata tgttatatat 120 aatatatgtt atatatacgt tatatgttat atatgttata tataatatat gttatatata 180 atatatgtta tatatgttat atataatata tgttatatat attatatata atatatgtta 240 tatatattat atataatata taatatatgt gatatataat ataaaatata tgtgatatat 300 attatatat 309 <210> 90 <211> 441 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(441) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 546190..546630 <400> 90 atacacaaca tatgtgtata tatatagtat atatacacaa catatgtgta tatatatagt 60 atatatacac aatatatgtg tatatatata gtatatatac acaatatatg tgtatatata 120 gtataaatat atactatata tagtatatat agtataaata tatactatat atagtatata 180 catagtataa atatatacta tatatagtat atacatagta taaatatata ctatatatag 240 tatatacata gtataaatat atactatata tagtatatac atagtataaa tatatactat 300 atatagtata tacatagtat aaatatatac tatatatagt atatacatag tataaatata 360 tactatatat agtatataca tagtataaat atatactata tatagtatat acatagtata 420 aatatatact atatatagta t 441 <210> 91 <211> 1367 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1367) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 124643..126009 <400> 91 atatttatat gatatataat atatataata ttatatataa tattatatat gatatataac 60 attatataat attatatatg atatatatta tatatattat atatgatata taatatatat 120 aatattatat atgatattat atatcatata taatatataa aatattatat atgatatata 180 atatatataa tattatatat attatatata ttatatatca tatataatat tctaaatata 240 taatattata tgatatataa gattatatac attatatata atatataata ttatatatga 300 tatataatat tatatacatt atatataata tataatgtat ataatattat atattatata 360 tttatattat atacaatgta tataatatta tatatcatat atatttatat tatatacaat 420 gtatataata ttatatatca tatataatat tatatacaat gtatataata tatattatat 480 atatttatat tatatacaat gtatataata tatattatat atatttatat tatatacaat 540 gtatataata tatattatat atatttatat tatatacaat gtatacaata ttatatatta 600 tatattatat atttatatta tatacaatgt atatattata tattatatat ttatattata 660 tacaatgtat atattatata ttatatattt atattatata caatgtatat attatatatt 720 atatatttat attatataca atgtatatat tatatattat atatttatat tatatacaat 780 gtatatatta tatattatat atttatatta tatataatgt atgtaatatt atatattata 840 tatttatatt atatataatg tatgtaatat tatatattat atatttatat tatatataat 900 gtatgtaata ttatatatta tatatttata ttatatataa tgtatgtaat attatatatt 960 atatatttat attatatata atgtatgtaa tattatatat tatatattta tattatatat 1020 aatgtatgta atattatata ttatatattt atattatata taatgtatgt aatattatat 1080 attatatatt tatattatat ataatgtatg taatattata tattatatat ttatattata 1140 tataatgtat gtaatattat atattatata tttatattat atataatgta tgtaatatta 1200 tatattatat atttatatta tatataatgt atataatatt atatattata tatttatatt 1260 gtatataata ttatatatta tatatttata ttgtatataa tatatattat atatttatat 1320 tgtatataat attatatatt atatatttat attatatata atgtata 1367 <210> 92 <211> 458 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(458) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 58908..59365 <400> 92 tatatgatat atatgatata tatgggatat atatgatata tatgatatat atggtatata 60 tatgatatat agtatatatg atatatatgg tatatatatg atatatagta tatatgatat 120 atatggtata tatgatatat agtatatatg atatatatgg tatatatggt atatatatga 180 tatatgatat atatgatata tatgatatat gatatatatg atatatatga tatatatggt 240 atatatgata tatatggtat atatggtata tatatgatat atatgatata tatggtatat 300 atatgatata tatgatatat atggtatata tatgatatat atgatatata tggtatatat 360 atgatatata tgatatatat ggtatatata tgatatatat gatatatatc atatatatgg 420 tatatatatg atatatatga tatatatcat atatatgg 458 <210> 93 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(330) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 306867..307196 <400> 93 ataatatata aatatatatg atatatatct atatatatca tatataaata tatatgatat 60 atatctatat atatcatata taaatatata tgatatataa atatatatga tatatatcta 120 tatatatcat atataaatat atatgatata taaatatata tgatatatat ctatatatat 180 catatataaa tatatatgat atatatctat atatcatata taaatatata tgatatatat 240 ctatatatat catatataaa tatatatgat atctatctat atatatcata tataaatata 300 tatgatatct atctatatat atcatatata 330 <210> 94 <211> 353 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(353) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 636899..637251 <400> 94 tatgtataca tatacacata tacgtatata tatacatata tacacatata cgtatatata 60 tacgtataca tacatatgta tatgtatacg tatacacaca tatgtatatg tatacgtata 120 cacacatata cgtatatatg tatacgtata cacacatata cgtatatgta tacatatata 180 tgtgtacata tacgtatata cgtatatgta tacatatata cgtttatgta tatatacgta 240 tatacgtata tatgtatatg tatacatata tacatatatg tgtatatacg tatatacgta 300 tatgtgtata tatacaatat acatacatgc acatatatgt gtatatgcac ata 353 <210> 95 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(345) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 1435510..1435854 <400> 95 atcatatata ttatatatca tatatatgat atataaaaat tatatatcat atatatgata 60 tataaaaatt atatatatca tatataatat atataatata ttatatatat aaattatata 120 taatatatat aaattatata tatcatatat atgatatata atttatatat catatatatg 180 atatatataa tatattattt atatataata tattatatat tatataatat gtaatatata 240 ttatatatta catattatat tatttataaa taatatttta taatatatat aatattatat 300 aatatagaat attatatatt atatattaca tattatataa tatat 345 <210> 96 <211> 521 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(521) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 39695..40215 <400> 96 tatatatata atagatatta tatatctatt atatatctat tatatatata atagatatta 60 tatatctatt atatatataa tagatattat atatctatta tatatataat agatattata 120 tatctattat atataatata tatctattat atattatata tctattatat ataatatata 180 tctattatat atattatata tctattatat atataataga tattatatat ctattatata 240 taatatatat ctattatata ttatatatct attatatata tgtatctatt atatatatta 300 tgtatctatt atatataata tatatctatt atatatatat tatatataat atatattata 360 tatattatat atctattata tataatatat atctattata tatattatat atctattata 420 tatattatat atctattata tataatatat atctattata tatattatat atctattata 480 tataatatat attatatata tattatatat tgtatatcta t 521 <210> 97 <211> 484 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(484) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 1286007..1286490 <400> 97 atatcatata tattatatat catatatatg atatataaaa attatatatc atatatatga 60 tatatataaa ttatatatat catatataat atatataata tattatatat ataaattata 120 tataatatta tatataaatt atatatcaca tatatgacat ataaattata tatcacatat 180 atgatatata atttatatat cacatatatg atatataatt tatatatcat atatatgata 240 tataatttat atatcatata tatgatatat aatttatata tcatatatat gatatatata 300 atatattatt tatatataat atattatata ttatataata tgtaatatat attatatatt 360 atataatatg taatatatat tatatattac atattatatt atttataaat aatattttat 420 aatatatata atattatata atatagaata ttatatatta tatattacat attatataat 480 atat 484 <210> 98 <211> 244 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(244) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 73556..73879 <400> 98 attatatatt atattatata atatataata atattatata attatatatt acattatata 60 atatataata atattatata ataatatata attatataat atataataat attatataat 120 attatataat attatataat atataaatat ataataatat atattatatt atataatagt 180 atatattata ttatataata tatgttatta tattatataa tataaactat tatataatat 240 aata 244 <210> 99 <211> 463 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(463) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 179038..179500 <400> 99 tacaatatat tttctattat atatattttg tattatatat aatatacaat atattttcta 60 ttatatataa tatattttgt attatatata ttacaatata ttttgtatta tataatatat 120 aatacaatat aatatattgt attatataat atataatact atataatata ttgtattata 180 tattatatat aatactatat aatatatttt attatatatt atatataata ctatataata 240 tattttatta tatattatat ataatacaat atataatata ttgtattata atacaatgta 300 ttataatgta ttatatataa tatataatac aatatataat attatatata tttatatata 360 tatatatttt gtattatata ttttgtatta tatatatttt gtattatata tttatatttt 420 atattataat tatgttttgc attatatatt tcatattata tat 463 <210> 100 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(390) <223> MAR of chromosome 1 genomic contig; 55617..56006 <400> 100 tgtataatat atatacttta tatataatat atatacttta tatatatact atatactaat 60 atatataata tatactatat ataatatata ctaatatata taatatatac actatatata 120 atatatacta atatatatta tatatacttt atataatata tactaatata tataatatat 180 atactttata tataatatat actaatatat ataatgtata tactttatat ataatatata 240 ctaatatata atatatatac tttatatata atatatacta atatatatta tatatacttt 300 atatatataa tatatactta tatattatat atgcttatat ataatatata cactaatata 360 taatatatat actttatata ttatatttta 390 <210> 101 <211> 582 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(582) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 1157405..1157986 <400> 101 tgtatatgta tatatacaca tacgcacata tatgtatatg tatatataca catacgcaca 60 tatatgtata tgtatatata cacatacgca catatatgta tatgtatatg tatatgtata 120 tatacacata tacacatata tgtatatgta tatatacaca tatacacata tatgtatatg 180 tatatataca catatacaca tatatgtata tgtatatata cacatacaca tatatgtata 240 tgtatatgta tatatacaca tacacatata tgtatatgta tatgtatata tacacatata 300 cacatatata catatatgta tacatatatg tgtatatata tacacatata tatacatata 360 tgtatacata tatgtgtata tatacacata tatatacata tatacatata catatatatg 420 tgtatgtata tatacacata tacatatata tgtatatgtg tatatatatt agacagatat 480 atatgtacat atacatatat atgtatatgt atatgtatat gtatatgtat atgtatatgt 540 atatgcatat ataatataca tatacatata tgtatatgta ta 582 <210> 102 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(322) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 1858638..1858959 <400> 102 acaccatata tacaccatat atatacatac catatatata ccatatatat acataccata 60 tatataccat atatatacat accatatata caccatatat atacatacca tatatataca 120 ccatatatat acataccata tatataccat atatatacat accatatata taccatatat 180 atacatacca tatatataca ccatatatat acataccata tatatacacc atatatatac 240 ataccatata tataccatat atacaccata tatatacacc atatatacac accatatata 300 ccatatatat acaccatata ta 322 <210> 103 <211> 914 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(914) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 5712196..5713109 <400> 103 aaatatatat tctatatata gaaaatatat attctatata tatagaatat atatagaata 60 tatattctat atatattcta tatatataga atatatatat aaaacatata ttctatatat 120 aaaatatata ttctatatat ataaaatata tattctatat atatagaatg tatataaaat 180 atatattcta tatatataga atgtatataa aatatatatt ctatatatat agaatgtata 240 taaaatatat attctatata tatagaatgt atataaaata tatattctat atatatagaa 300 tatatataac atatatatga aatatatata aaatatatat aaatacatat ttctatatat 360 aaatatatat aaatacatat ttctatatat aaatatatat caatacatat ttctatatat 420 aaatatatat aaatatatat tcatatatat aaaaatatat aaatatatat tcatatatat 480 aaaatatata tgaatatata ttctctatat ataaaatata tataatatat attatatata 540 taaaatatat ataatatata ttatatatat aaaatatata taatatatat tcatatatat 600 aaattatata taaatatata ttcatatata taatatatat aaatatttat ttcatatata 660 aaatatattt aaatatatat ttctatatag aatatatatt ctatatataa aatatatata 720 taaatatatt ttctatatag aaatatatat gaaatatata gaatatatat aaatatatat 780 tatatatact atatatacaa tatatattat atataaaata tatatacaat atatattcta 840 tatattaata tatagaatat atattaacat atatttcaat atattaatat atgaaatata 900 tataaatatt tcat 914 <210> 104 <211> 370 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(370) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 5713613..5713982 <400> 104 tatttcatat ataatatata tataaaatat atatttcata tacataatat atataatata 60 aataaaatat atatttcata tatataatat atataatata tataaaacat atatttcata 120 tataatatat ataaactata tatttcatat ataatatata taaactatat atttcatata 180 cataatatat ataatatata tttcatttat attatatata taatatatat ttcatatata 240 taatatataa aatagatata aatatatata aatatatatt tcatatataa tatatataaa 300 atatatatta atatatattt tatatataat atatatattt catatataaa tataaaaaaa 360 tatatatttc 370 <210> 105 <211> 442 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(442) <223> MAR of chromosome 2 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tattccatat atataaatat atatatattc catatatata aatatatata tattccatat 300 atataaatat atatatattc catatatata aatatata 338 <210> 107 <211> 364 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(364) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 10519720..10520083 <400> 107 ttatatatat ttataataat atatataagc tatatatatt tatatataat atattatata 60 tattagctat atatatttat ataataatat attatatatt agctatatat atttatatat 120 aataatatat ataagctata tatttatata tattatatat tagctatata tatttatata 180 taatatatta tatattagct atatatttat atataataaa taatatatat attagctata 240 tatatttata tataataata tatataagct atatatttat atataatata ttatatatta 300 gctatatata tttatatata ataatatatt atatattagc tatatatatt tatatataat 360 atat 364 <210> 108 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(342) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 11481943..11482284 <400> 108 tacatataat atataattat atataatata tattatatat tacatatata atatatatat 60 tacatatgta atatatatat tatatatgta atatatatta tatatgtaat atatatatta 120 tatatgtaat atatattata tatatgtaat atatatatta tatatgtaat atatatatta 180 tatgtaatat atatatgtaa tatatatata atatatatgt aatatatata taatatatat 240 gtaatatata tataatatat atgtaatata tatattatat atatgtaata tatatcatat 300 atatgtaata tatatcatat atatgtaata tatatcatat at 342 <210> 109 <211> 415 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(415) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 13499598..13500012 <400> 109 tatatatata tatatatata atataatata atatatatat aaatatatat aatataaatt 60 tatatatata tatttatata tacatatata aatatatatt tatatttata tataaatata 120 tataaatata tataaatata tatttatata tacatatata aatatatatg ttcatataaa 180 tatatatgta tatatacata tataaatata tattatatat gtatatatat aatataatat 240 ataataataa tataatatat attatataaa tataatatat tatatataat atatataata 300 tataatatat aatatataat atataatata tattatatat tatataatat ataaaatata 360 tattatataa tatatataca taatatatat aaataaatat atataaagat ataaa 415 <210> 110 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(330) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 16370976..16371305 <400> 110 catttacata tgtatgtata agtatgtata ttacatactt atacatacat acttataaat 60 atataagtat aatacataca tacttataaa tatataagta taatacatac atacttatac 120 atatataagt ataatacata catacttata catatataag tataatacat acatacttat 180 acatatataa gtataataca tacatactta tacatataag tataatacat acatacttat 240 acatatataa gtataataca tacatactta tacatatata agtataatac atacttatta 300 catatgtata taagtatatt acatacttat 330 <210> 111 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(702) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 626641..627342 <400> 111 tatatataca catatacata tataatatat atacatatac atatatatta tatatacata 60 tatattacat atatcatata tacatatata ttatatatac atatatatta tatatatcat 120 atatacatat atatattata tattatatat atcatatata catatatatt atatatatta 180 tatatatcat atatacatat atattatata tattatatat acatatatat tatatatatc 240 atataaacat atatattata tatatcatat atacatatat attatatata ttatatatat 300 catatataca tatatattat atatatcata tataatatat attatatata ttatatataa 360 tatatattat atatacatat atattatata tacatatata ttatatatac atatatatta 420 tatatacata tatattatat atacatatat attatatata tacatatata ttatatatac 480 atatatatta tatatacata tattatatat acatatatat tatatataca tatattatat 540 atatacatat atattatata tacatatatt atatatatac atatatatta tatatacata 600 tattatatat atacatatat attatatata catatattat atatacatat atattatata 660 tacatatata ttttatatat atataatata tattttatat at 702 <210> 112 <211> 679 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(679) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 3196047..3196725 <400> 112 atatattata tattcatata tcataaatat atatattata tattcatata ttatatatct 60 atatatttat atattcatat attatatatc tatatattta tatattcata tattatatat 120 ctatttatat attcatatat tatatatcta tatattttat atattcgtat attatatatc 180 tatatattat atattcgtat attatatatc tatatattat gtattcatat atatctatat 240 attatatata ttcatatata ttataaatta tattcatata gtatatatct attataaatg 300 tatattcata tagtatatat ctatatatta taaatataca tatattatat atttatatat 360 tatatattca tatagatcta tatattatat atattcatat atgaatatat atattatatg 420 tatatatatt ataaatatat ttatatagta tagatattat atagtatatg catatttata 480 ttataaataa tttacatagt atatgtatat ttataaatta tatatattta catattacat 540 gtatatttat atattataaa tacatattta catattataa atatatttat atattatgaa 600 tataatttat atattattac atatttacat atatgcatag ttatatatta taaatatgca 660 tttatgtaaa tatatattt 679 <210> 113 <211> 728 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(728) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 3196778..3197505 <400> 113 tacataaata tatatttaca atatgtaaat atctgatatg taaatatgta tttataatat 60 ataaatatac atataatatg taaatatata aatatacata tactatgtaa atatatgtta 120 tatatacata tactatataa atatagaata tataaatata catatactat ataaatatgt 180 aatatataaa tatatactat ataaatatac atatactata taaatgtatt tataatatat 240 aaatatacat atactatata aattcatata tgaatatata atatataaat atatataata 300 tatgaatata tactcatata taaatatata tgaatatata tttataatat atagatataa 360 tatgaatata tatttataat atatagatat atattatatg aatatatatt tataatatat 420 agatatatac catatgaata tatattatac actatatgaa tatatattta taatatataa 480 atagatatat actatatgaa tatataatat atatactcta tgaatatata atatatatac 540 tatatgaata tattatatac tgtatgaata tataatatat agatgtatac tatatgaata 600 tataatatat agatatatat actatatgaa tatatataat atatagatat atactatatg 660 aatatatatg atatatagat atatactata tgaatatata atatatagat atatatttat 720 gatatatg 728 <210> 114 <211> 413 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(413) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 2560638..2561050 <400> 114 atataaatat atatttatat attttatata aatatatata tttatatatt tttatataaa 60 tatatatatt tatatatatt tatataaata tatatattta tatatattta tataaatata 120 taaatatata tatttatata aatatataaa atatataaat atatttatat aaatatataa 180 aatatataaa tatatttata taaatatata aaatatataa atatatttat atataaatat 240 ataaaatata taaatatctt tatatataaa tatataaaat atataaatat ctttatatat 300 aaatatataa aatatataaa tatatttata tataaatata taaaatatat 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tacgtatata cgtatatata catatatgta 180 tacgtatacg tatatacgta tatatacata catatgtata cgtatacgta tatatgtata 240 tatacgtata tgtatacgta tacatatata cgtatatata cgtatatgta tatgtatata 300 cgtatatgta tatatgtaca tatac 325 <210> 117 <211> 1508 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1508) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 6057499..6059006 <400> 117 atataatata tataaattat ataatatata aaaattaata tataatatat ataaattata 60 taatatataa attaattata taatatatat aaattatata atatataaat taattatata 120 atatatataa attatataat acatataaat taattatata atatataaat tatataatat 180 atacaaatta tatactatat taattatata ttatataatt aattatataa tatatataaa 240 ttatatatta ttaaattaat tatataatat ataaattata taatatataa attaattata 300 taatatataa attatataat atataaatta attatataat atataaatta tataatatat 360 aaattaattg tataatatat aaattaatta tataatatat aatatataat taataaataa 420 ttatatatta attatataat taataaataa ataataaata tatataatta atatataata 480 tacatcatat atatcacata tagattatat aatagttata tattatataa taaattatat 540 ataatatata ataaacatat ataacatatg ttatatatta cataatatag tataatatat 600 aacatatgtt atatattaca taatatagta taatatataa catgttatat attacataat 660 atagtataat atataacata tgttatatat tacataatat agtataatat ataacatatg 720 ttatatatta cataatatag tataatatat aacatatgtt atatattaca taatatagta 780 taatatataa catatgttat atattacata atatagtata atatataaca tatgttatat 840 attacataat atagtataat atataacata tgttatatat tacataatat agtataatat 900 ataacatatg ttatatatta cataatatag tataatatat aacatatgtt atatattaca 960 taatatagta taatatataa catatgttat atattacata atatagtata atatataaca 1020 tatgttatat attacataat atagtataat atataacata tgttatatat tacataatat 1080 agtataatat ataacatatg ttatatatta cataatatag tataatatat aacatatgtt 1140 atatattaca taatatagta taatatataa catgttatat attacataat atagtataat 1200 atataacata tgctatatat tacataatat agtataatat atatgttata tattacataa 1260 tatagtataa tatataacat atgttatata ttacatatta tagtataata tatatgttat 1320 atattatata atatagtata atatataatg tatgttatat attatataat atagtataat 1380 atataacatg ttatatatta tataatatag tataatatat atgttatata ttatataata 1440 tagtataata tataatatat gttatatatt atataatata gtataatata tatgttatat 1500 attatata 1508 <210> 118 <211> 415 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(415) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 7996866..7997280 <400> 118 caattatata atatacatat tatataattg tataaattat acaatcatat aattatatta 60 tatataatat acatataata taattatata taattatata attttataat ataattatat 120 ataattatat aattatatat aatatatatt ataattatat atataatata tatattatat 180 atattatata taatatataa ataatatata taatatatat ataattatat ataataatat 240 atgtaatata tataatatat atataatata ttatttataa ttatatatta tatatatatt 300 ataatatata taattataaa taatatatat tataatatat ataataatat atatataatt 360 atatataata atatatatta taattatata taataatata tataatttat ataat 415 <210> 119 <211> 526 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(526) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 8300930..8301455 <400> 119 tatatcatat gatatattat acaatatatc atataatatg atatattata tgatatattg 60 tacaatatat catatgatat atgatatatt atacaatata tcatataagg tatatattat 120 atcatatata atatataata taatatatga tataatatat gatatatgat atataatata 180 tgatatatga tatatgatat ataatatatg atatatgata tatgatatat aatatatgat 240 atatgatata tgatatataa tatatgatat atgatatatg atatgatata tgatatatga 300 tataatatat gatataatat atgatatata ttatatgata tataatatat gatataattt 360 atatgatata taatatatga tatataatat ataatatatg atatgatata tattatatca 420 tatataatat ataatataat atatgatata tattatatat ttttatacat tatatatata 480 aactatataa caatataaca tattatgtgt ataatatata ttacat 526 <210> 120 <211> 402 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(402) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 8576553..8576954 <400> 120 atgtatatta tatacaatat agtatatcat atatagtata tattatatag taatgtatta 60 tatataatgt ataatgtata aatatataat atatactaca tactatacta ttatatatac 120 tatatattat atatgataca tatactatat aatatgctat atattatact atataatatg 180 ctatatatta tactatataa tatgctatat attatactat ataatatgct 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taaatatata taaaatatat atattaaaaa tatatataaa atatatatat taaaaatata 780 tataaaatat atatattaaa aatatatata aaatatatat attaaaaata tatattaaat 840 ataaatatat atattaaaaa tatatattaa atataactat atattaaata tatattaaat 900 ataactatat attaaatata tattaaatat aactatatat taaatatata ttaaatataa 960 ctatatatta aatatatatt aaatataact atatattaaa tatatattaa atataactat 1020 atattaaata tatattaaat ataactatat attaaatata tattaaatat aactatatat 1080 taaatatata tgaaatataa ctatatatta aatatatatt aaatataact atatgtatta 1140 aatataaata tatgtcttaa atatatatta aatataaata tatgtattaa atatatatta 1200 aatataaata tgtgtattaa atatatatta aatataaata tgtgtattaa atatatatta 1260 aatataaata tgtgtattaa atatatatta aatataaata tgtgtattaa atatctatat 1320 taaatataaa tatatgtatt aaatatatat taaatataaa tatatattaa atatatatat 1380 taaatataaa tatatattaa atataaatat atatattaaa tatatatatt aaatataaat 1440 atatataaaa tatatatatt aaatataaat ataaatataa aatatatatt aaatataaat 1500 acatatatta aatatatgta ttaaatatat atataaaata tatgtattaa atat 1554 <210> 124 <211> 650 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(650) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 3944813..3945462 <400> 124 catgatatat tatgtataat atatattata gattacatat aaattatata tataatatat 60 aattatataa tatataatat tatataatat attatatata ttatacaatt atataatata 120 tataatatac aattatataa tatataatat acaattatat aatatataat acaatataat 180 atatatttaa tatattatat aatacatatt taatatatta tatattatat gttatatact 240 aaatatataa tatgtattta atatatacta ttatatatgt aatatattat ataatttatg 300 taacatatta tatattatat atgcaatata ttacatgtta catatatatt acatataata 360 tatgtaatat ataatataca ctatattatt atagtatata atatactata ttatgtaatt 420 atataatata gtatattata cactatatta tattatcata taattatata ttatatacta 480 tattacatat atattatgta atataatatg caatatgtta catatataat atatatgtat 540 tatatagtat atatactata gtatatataa aatatatgct ataatatata ttttatatat 600 tatataatac atataatgta tcatatatta tatataatat attttataat 650 <210> 125 <211> 441 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(441) <223> 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ttatatattg tatatataat atacatatta tatattatat attgtatata taatatacat 180 attatatatt atatattgta tatataatat acatattata tattatatat tgtatatata 240 atatacatat tatatattat atattgtata tataatatac atattatata ttatatattg 300 tatatataat atacatatta tatattatat attgtatata taatatacat attatatatt 360 atatattgta tatataatat acatattata tattatatat tgtatatata atatacatat 420 tatatattat atattgtata tataatatac atattatata ttatatattg tatatataat 480 atacatatta tatatt 496 <210> 130 <211> 317 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(317) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 16942865..16943181 <400> 130 tctcctagta gttatatata tatatatgtg tatatatata tatcctagta gatatatata 60 tatatatatc ctagtagata tatatatata tatatcctag tagatatata tatatatata 120 tcctagtagt tatatatata tatatatcct aacagttata tatatatata tcctagtagt 180 tatatatata tatatcctag tagttatata tatatatata tcctagtagt tatatatata 240 tatatcctag tagttatata tatatatatc ctagtagtta tatatatata ttatatatta 300 tataatatat atataat 317 <210> 131 <211> 464 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(464) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 17217049..17217512 <400> 131 acatactata tatatacaca tactatatat actatataca gtatatagta tacatatact 60 atacatatac atatactata catatacata tacatatact aagtatacgt atatacagta 120 catagtatat gtatactata tagtatgtat atatagcata tagtatgcgt atactctata 180 tagcatatag tatgcatata cgctatatag catatagtat gcatatacta tatatagtat 240 agagtatgcg tatactatat atatagtata gagtatgcgt atactatata tatagtatag 300 agtatgcgta tactatatat atagtataga gtatgcgtat actatatata tagtatagag 360 tatgcgtata ctatatatat agtatagagt atgcgtatac tatatatata gtatagagta 420 tgcgtatact atatatatag tatagagtat gtatatatat agta 464 <210> 132 <211> 430 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(430) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 19647266..19647695 <400> 132 tgtaaatata tgtaaatata tatttatatt atatattata taaaaatata atatataata 60 tataatatat aaactatata ttaatataat atatataaac tattatataa atacatatta 120 aatatattat atttttaata tttatatatt aaatataata tatatttaat atttatatat 180 taaatatata atatatttaa tatttatata atatatagca tattttatat ttatattata 240 tataacattt tatatttata tttatattta tatatattta atttatattt atattatatt 300 tatatttata ttatatataa cataattata tatattttca tattgtatat aataaagaaa 360 tgtatatttg ttatatataa tatatattat ataatttatt atatattata taatatatat 420 tatataatat 430 <210> 133 <211> 2131 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(2131) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 20481223..20483353 <400> 133 tatatataaa tatatttata tttaatatat atttatataa atatattttt atataaatat 60 atatttaata taaatatctt tatatttaat atatatttaa tataaatatc tttatattta 120 atatatattt atatataaat atatatttat atttaatata tattaatatt taatatacgt 180 ttatatttaa tatatatttc tatataaata tatttatatt aacatatatt tatatataaa 240 tatatttata tttaatatat ttacatataa atatatttat atgtaatata tttacatata 300 aatatattta tatttaatat atatgcatat gtaaatatat ttatatttaa taatatttat 360 atataaatat atttatattt aataatattt atatataaat atatttatat ttaatatata 420 ttaaatatat atttatattt aatatatatt aatatttaat atatatttat atttaatata 480 tattatatat aaacatatat ttatatttaa tatatattat atataaacat atatttatat 540 ttaatatata ttatatataa acatatattt atatttaata tatatttata tttaatatat 600 tatatataaa catatattta tatttaatat atatttatat taaatatata ttatatataa 660 acatatattt atatttaata tatatttata ttaaatatat atttatattt aatatatata 720 tattaaatat atatttatat ttaatatata tttatattaa atatatattt atattaaata 780 tatttatatt taatatatat ttatattaaa tatatattaa atatttaata tatatttata 840 tttaatatat acatatatat ttatatttaa tatatacata tatatttata tttaatatat 900 acatatatat ttatatttaa tatatacata tatatttata tttaatatat aaatttatat 960 tttatatata taaaaatata tatttatatt taatatatat aaatatatat ttatatttaa 1020 tatatatatt tatattgaat atatacataa atatatattt atatttaata tataaacata 1080 tatttatatt tatatattaa atatatattt atatttaata tataaatata tatttatatt 1140 taatatattt atatatacta atatatttat atttaatata tttatatata gatatattta 1200 tatttaatat atttatgtgt attaatatat ttatatttaa tatatttata tattaatata 1260 tttatatttt atatttatat attaatatat ttatatttta tatttatatt ttatatattt 1320 atatattaat atatttatat ttatatatat ttttatatat taataaattt atattttata 1380 tatttatata ttaataaatt tatattttat acagttatat aaatatattt atattttata 1440 cagttatata aatatattta tattttatag ttatataaat atatttatat tttatacagt 1500 tatataaata tatttatatt ttatacagtt atataaatat atttatattt tatacagtta 1560 tataaatata tttatatttt atacagttat ataaatatat ttatatttta tacagttata 1620 taaatatatt tatattttat acagttatat aaatatattt atattttata cagttatata 1680 aatatattta tattttatac agttatataa atatatttat attttataca gttatataaa 1740 tatatttatg ttttatacat ttatataaat atatttatat tttatacatt tgtatttaat 1800 atatatttat atataaatat attttatatt taatatattt atatataaat atatattgat 1860 atttaatata tatttatata taaatatata ttgatattta atatgtttat atataaatat 1920 atatttatat ttaatatata tgtttatata tcaatatata tttatattta atatatattt 1980 acatataaat atatatttat atttgatata tatttatatt tgatatatat tttatatata 2040 ttaatatatt tacatttgat atatatttta tatatattaa tatatttaca tttgatatat 2100 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atatattata tatttattta tatatattta tatgttatat 720 atatttatat ttatatttat tttttattta tatattttat atatatattt atatatgtat 780 attatatata ttatatatta tataatatat tatatatatt atattatata tttatattat 840 at 842 <210> 135 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(645) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 20897566..20898210 <400> 135 gtatatttat attatatatt atataatata tattatatat taataaatta tatataatat 60 aatatatatg tatatttata tttatgttat aatatacata taattatata tgtatgtata 120 catgtataca tatacgtata tgtgtatatg tatacatata ggtatatgtg tacatgtata 180 catataggta tatgtatatg tatacatgta tacatataat ataattacat atgtatgtat 240 acatacatat gtaattatat tatatatgta tatgtatatt tatataatat ataatatgta 300 ttatatatta tacatgcata tttatatgta tattatatat acacatataa tataattata 360 tatgtatgta tatatacaca tatatattta tattatatat gtatattata tacatatatt 420 tatattatat atgtatatat atttatcata tttatatgta atatgcatgt gtaataaata 480 atatacacat ttatatatgt atattatata catatattta tattgtatat gtatatatat 540 ttatatatat 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tatataaaat aatataatat atattatata taaaataata 660 tataatatat tatataaaaa tataaatata ttatataaaa atataaaata taaaatatta 720 ca 722 <210> 137 <211> 305 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(305) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 22834991..22835295 <400> 137 aatataaaat atatgatata taatacgtat tatatatgta taatacgtat tatatattaa 60 tatataatat ataatacata ttatatatgt atataatata tactaatata tataatgtat 120 acattatata tttacataat atataataca taatatagaa ttataattat atataataca 180 taatatataa ttatatatat tattatatat gtatttatat tatatataat atattatata 240 taatatatat tatataatta tataagtata taattatgtt atatacataa taatatataa 300 tatat 305 <210> 138 <211> 352 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(352) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 25277762..25278113 <400> 138 taatatatat aatatattat atattatata taatatattt tataatatat aaaatatatt 60 atatataata tataatatat tttataatat atataatata ttatatataa tatataatat 120 attttataat atatataata tattatatat attatatatt tatatttatt tatatattca 180 taaatatata tttatatata atatatttta taatatatta tatataatat ataatatatt 240 ttataatata ttataatata taatatataa tatattttat aatatatata atatataata 300 tattatatat ttatatttat ttatatattc ataaatatat atatttatat ta 352 <210> 139 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(342) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 25378452..25378793 <400> 139 tatgtacata tatattttat atattatata taatatatat tatatgatat atataatata 60 ttatataata taatatataa aatatatata atatatatta tattatataa attatattat 120 atatatcata taatatattt tatatattat ataatatata ttatattata tatattttat 180 atattatatt atatattata tatatcatat aatatatatt atattatata ttttatatat 240 tatataatat atattatata tttttatata ttatataata tatattatat attttatata 300 ttatataata catatattat atataatata atatatatta ta 342 <210> 140 <211> 663 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(663) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 30209437..30210099 <400> 140 aatatatatt acatattgta tatatagtat atgtaatgta 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ataatatata cttacatatg ctcacatata 120 ttataatgta tattgtatat attatataca tattatatat gtataatgta tatatacatt 180 atatatgtat aatgtatata tacattatat atgtataatg tatatataca ttatatatgt 240 ataatgtata taatatatac aatatatgta taatatataa tatatacaat atatgtataa 300 tatacaatat atgtataata tacaatatat gtatagtata taatatatat tatatatgta 360 tagtatatta tatattatat atgtatagta tataatatgt ataatgtata tattataata 420 tattatatat aatatctata acaatataat atattgtata tattatatat aatatatatt 480 tatataatat atattatata taatatatta tgtatttatt tatattatat ataatataaa 540 tatatataat ataaataata tttattatat attaatataa atatttatat taatatatat 600 ttattatata taaataatat ctatgatata aataatatat aatatacatg tatatgttat 660 aatatataca tataatatac atgtgtatat atactataca tgtatatata acatgtatat 720 atatacatgt atatatatta tgtatacatg tatagtatat atacatgtat atatatacat 780 atatactata catgtatata tacatgtata tatatacata tatactatac atgtatatat 840 acatgtatat atacacatat atactataca tgtatatata catgtatata tatacatgta 900 tgttatatac attattataa tatacatata tagtatacat tatatacatt atataatatg 960 cattattata atataatata cattattata atatacatta ttataatata atatacatta 1020 ttataatata cattattata atatacatta taataatata cattattata atatacatta 1080 taatattgaa gtatatatac tataatatat gtatatatta taatgtatat aatatacatt 1140 attatatata agtatgtatt atatataagt atatattata atatatgtat atacatatat 1200 1200 <210> 142 <211> 325 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(325) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 32147252..32147576 <400> 142 aaatacaaat atttatttat atataatata taatataata tatttattta tatataatat 60 ataatttata attatataaa tatataatat atttatatat aatatataat tttattatat 120 attaattata tatataataa atatatataa tatataattt tattatatat taattatata 180 tataataaat atatataata tataataata ttatatacat tatatataaa tataaatatt 240 tatataatat ataatataat atatttattt atatataaat atataatata taattatata 300 aatatataat atatttatat ataac 325 <210> 143 <211> 507 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(507) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 32312662..32313168 <400> 143 attatttata taaatattat atttatatta tttatataaa tattatattt atattattta 60 tataaatatt atatttatat tatttatata aatattatat ttatattatt tatataaata 120 ttatatttat attatttata taaatattat atttatatta tttatataaa tattatattt 180 atattattta tataaatatt atatttatat tatttatata aatattatat ttatattatt 240 tatataaata ttatatttat attatttata taaatattta tttatattat ttatataaat 300 attatattta tattatttat ataaatattt atttatatta tttatataaa tatttattta 360 tatttatata aataatatat aaataaatat tttatatgta tataaatatt atttatatta 420 tttatttaaa taaataatat aaattaatat aaatattaat attatttatt ttattataaa 480 taatataaat attatattta tatttat 507 <210> 144 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(339) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 33651118..33651456 <400> 144 aaatataata tattatttat atataatata aatgatatat tatgtatata taaaatataa 60 ataatatatt atgtatatat aaaatataaa tattatttat atataaaata taaataatat 120 ttatatataa aatataaata ttatattatt tatatataaa atataaataa tatattattt 180 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chromosome 2 genomic contig; 45487691..45488852 <400> 146 attatattat ctatataaat ctattatatc tattatatta tctatataat atctattata 60 tatattatat tatctatata aatctattat atatattata ttatctatat aaatctatta 120 tatatattat attatctata tatctattat atattatatt atattatatt atatataata 180 tctattatat atattatatt atattatatt atatataata tctattatat atattatatt 240 atctatataa tatctattat atattatata ttatattata tataatatct attatatata 300 ttatattata ttatatataa tatctattat atctattata tatattatat atatctatta 360 tatctattat atatattata tataatatct attatatcta ttatatatat tatatataat 420 atctattata tctattatat tatattatat ataatatcta ttatatctat tatatatatt 480 atatatatct attatatcta ttatatatat tatatataat atctattata tctattatat 540 atattatata taatatctat tatatctatt atatattata tatataatat ctattatatc 600 tattatatat tatatatata atatctatta tatctattat atctattata tatatatcta 660 ttatatctat tatatatatt atatacataa tatctattat atctattata tatattatat 720 atataatatc tattatatct attatatata tactatctat tatatctatt atatatatta 780 tatatgtact atctattata tctattatat 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tattatataa atattgtata tattatataa atattatata tattatatat aaatattata 420 tatattatat aaatatatat aaatatataa aatatataaa tatgtaaaat ttatatttat 480 aaatatataa tataaatata taaatataaa tataaattat atataatata taatatatta 540 tacataatat atactatata ta 562 <210> 148 <211> 801 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(801) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 45727251..45728051 <400> 148 atatatatat ataatatata catatataga atatatatat tattatattc tatatataga 60 atatatatat agaatatata tatatagaat atatatatag aatatatata tagaatatat 120 atatagaata tatatataga atatatatat atagaatata tatatagaat atatatatat 180 agaatatata tatatagaat atatatatat agaatatata tatatagaat atatatatag 240 aatatatata tagaatatat atatatagaa tatatatata gaatatatat atatagaata 300 tatatataga atatatatat atagaatata tatatagaat atatatatat agaatatata 360 tatagaatat atatatatag aatatatata tagaatatat atatatagaa tatatatata 420 gaatatatat atatagaata tatatataga atatatatat atagaatata tatatagaat 480 atatatatat agaatatata tatagaatat atatatatag aatatatata tagaatatat 540 atatatagaa tatatatata gaatatatat atatagaata tatatataga atatatatat 600 atagaatata tatatagaat atatatatat agtatatata gaatatatat atatagtata 660 tatagaatat atatatatag aatatatata tagaatatat atatatagaa tatatatata 720 gaatatatat atatagaata tatatataga atatatatat atatagaata tatatataga 780 atatatatat atatatagaa t 801 <210> 149 <211> 346 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(346) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 50937238..50937583 <400> 149 taaaattata tatattatat ataatatata atatattata tataatatat attataatat 60 atataatata tattatataa aatatattct atagaatata tattctatta tataatatat 120 attctattat aatatatatt atatataata tatattctat tataatatat attatatata 180 atatattcta ttatgatata tattatatat aataacatat attatatata atatatattc 240 tattatataa aatatatatt atataaaata tatattctat tatataaaat atatattata 300 taaaatatat attatattat ataaaatata tattatacta tatata 346 <210> 150 <211> 462 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(462) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 55672627..55673088 <400> 150 taaatatata ttatatatta tattatatat aatatattta tatttatata tactataatt 60 tatatataat atatattata tatataatat atttataata tatatcatat aaataatata 120 tatttataat atatatcata taaataatat atatttataa tagatatcat ataaataata 180 tatatttata atagatatca tataaataat atatatttat aatagatatc atataaataa 240 tatatattta taatagatat catataaata atatatattt ataatatata tcatataaat 300 aatatatatt tataatatat atcatataaa taatatatat ttataatata tatcatataa 360 ataatatata tttataatag atatcatata aataatatat atttataata gatatcatat 420 aaataatata tatttataat agatatcata taaataatat at 462 <210> 151 <211> 401 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(401) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 56081352..56081752 <400> 151 tatacatgta tgtattcgta tatgtatgtt atatatgtat atgtgttata tacatataca 60 tatatacatg tatatgtgtt atatacatat acatatatac atgtatatgt gttatataca 120 tatacatata tacatgtata tgtgttatat acatatacat atatacatgt atatgtgtta 180 tatacatgtg tatgtgtata tgtatatata catatatgtg tatgtgcatg tgtatatata 240 catatatgta tatgtgtata tgtatatata catatatgta tatgtgtatg tgtatacgta 300 tatatacata tatgtgtatg tgtatgtgta tacgtatata tatacatata tgtgtatgtg 360 tatacgtaca tatacatata tgtgtatgtg tatacgtaca t 401 <210> 152 <211> 765 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(765) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 56404208..56404972 <400> 152 tatattatat aaagaatata tattatataa tatgtaaaga atatatatta tataatatgt 60 aaagaatata tattatatat tatgtaaaga atatatatta tatataatat ataaagaata 120 tatattatat aatatataaa gaatatatat tatatattat ataaagaata tatattatat 180 ataatatata aagaatatat aatatataat atataaagaa tatatattat atataatata 240 taaagaatat atattatata taatatataa agaatatata ttatatatta tataaagaat 300 acatatatat aatatataaa gaatatatat tatatataat atataaagaa tatatattat 360 atataatata taaagaatat atattatata taatatataa agaatatata ttatatataa 420 tatataaaga atatatatta tatataatat ataaagaata tatattatat atattatata 480 aagaatatta tatattatat aaagaatata tattatatat aatatataaa gaataaacat 540 atatactata tataaagaat atacattata tatactatat ataaagaata tacattatat 600 atactatata taaagaatat atataatata taaagaatat acattatata taatatataa 660 agaatatatt atatattata taaagaatac attataatat aaagaataca ttatatataa 720 tataaagaat acattataat atataaagaa tatatataat atata 765 <210> 153 <211> 443 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(443) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 61953416..61953858 <400> 153 tttatatatt atagataaaa ttatattata ttacatgtaa tatataatat gtaaaatata 60 ttatattaca tatataatat ataatatgta aaatatatta tattacatat ataatatata 120 atatgtaaaa tatattatat tacatatata atataaaata ttacatataa tatattttac 180 ataaatatat attatctatt acatatttat tatatgtaat aatatgtaca tatgtataaa 240 tatgtatata tttatacata tgtatatatt atatatacat atatatgtat atattatata 300 tacatatata tgtatatatt atattatata tacatatata tgtatatatt atattatata 360 tacatatata tgtatatatt atattatata tacatatata tgtatatata ttataaatat 420 gtataataaa gatttatatg taa 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ataaaatata tattatatgt aattatatat aatataaaat 240 atatatataa tataaaatat atattatata taattataat ataaaatata tattatatag 300 tatatattat ataaaatata tattatatat aattatatat tatataaaat atatattata 360 tataattata taatataaaa tatatattgt atataattat atataatata aaatatatat 420 aatatatgaa ataagatata tactatatat aatatatata atttacatat aagatatata 480 tcat 484 <210> 156 <211> 644 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(644) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 68145036..68145679 <400> 156 tatatatatg ctaatatatg taatatatat tatatatatg ctaatatata tatgctaata 60 tataatatat attatatata aatatataat atatatttat ataaatatat aatatattat 120 atataaatat ataatataaa tatatataat atatactata ttatatatta tgtataacat 180 ataatacata tttgttatat ataatatata tattatatgt tatatattat atattatata 240 taatataaca atatatttta tatattatat gttatatatt atatattata tataatataa 300 cataatatat aatatatatt atattatata ttacatatat tagcaatatt atatataaaa 360 tatatataat atatataaaa tatatataaa aatataaaat atatatcaaa atataaacta 420 tataatatat 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ttcatatata tttaaataat taatacatat 240 ttaaataatt aatatatatt tatataatat atatttatat attaaataat taatatatat 300 ttatagatta aattaatata tatttatata ttaaattaaa tttaatatat tatatattta 360 tataatttaa atttaataat ttatataatt taatttaatt taatataatt aaaatatatt 420 aaacattata taatatataa tatatttaat atataatata tatttaatat ataatatatt 480 taatatataa tatatttaat atataatata tatttaatat ataatatatt taatatataa 540 tatatttaat atataatata tatttaatat ataatatatt taatatataa tatatattta 600 atatataata tatttaatat ataatatata tttaatatat aatatattta atatataata 660 tatatttaat gtataatata tttaatatat aatatatatt taatgtataa tatatttaat 720 atataatata tatttgatgt ataatatatt taatatatat ttgatgtata atatatttaa 780 tatataatat atatttgatg tataatatat ttaatatata atatatattt gatgtataat 840 atatttaata tataatatat atttgatgta taatatattt aatatataat atatatttga 900 tgtataatat atttaatata taatatatat ttgatgtata atatatttaa tatataatat 960 atatttgatg tataatatat ttaatatata atatatattt gatgtataat atatttaata 1020 tataatatat atttgatata taatatattt aatatataat atatatttga tatatattta 1080 atatataata tatatttgat atataatata tttaatatat aatatatatt tgatatataa 1140 tatatttaat atataatata tatttgatat ataatatatt taatatataa tatatatttg 1200 atatataata tatttaatat ataatatata tttgatatat aatatattta atatataata 1260 tatatttgat atataatata ttttcttatt aattatttat atataatata taaatatata 1320 ttaattaatt atatattaaa 1340 <210> 160 <211> 937 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(937) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 78226855..78227791 <400> 160 tgtgtatata tacatatatg tgtatctatg tgtatatata catatgtgta tatatacata 60 tatgtgtata tatacatatg tgtatatatg tgtatatatg tgtatatata catatatgtg 120 tatatatgtg tatatatgtg tatatataca tatatgtgta tatatgtgta tatatacata 180 tgtgtatata tgtgtatata tacatatatg tgtatatatg tgtatatata catatatgtg 240 tatatatgtg tatatataca tatatgtgta tatatgtgta tatatgtgta tatatacata 300 tatgtgtata tatgtgtata tatacatata tgtgtatata tgtgtatata tacatatatg 360 tgtatatatg tgtatatgtg tgtatatata catatatgtg tatatacaca catatatgtg 420 tatatatgtg tatatataca tatatgtata tatacatata tgtgtatata tgtgtatata 480 tacatatatg tgtatatatg tgtatatata catatatgtg tatacataca tatatgtgta 540 tatatgtgta tatatacata tatgtgtata catacatata tgtgtatata tgtgtataca 600 tacatatatg tgtatacata catatatgtg tgtatatgtg tatacataca tatatgtgtg 660 tatatatgtg tatacatatg tgtgtatatg tgtatatata catatatgtg tgtatatatg 720 tgtatatata catatatgtg tgtatatatg tgtatatata catatatgtg tgtatatatg 780 tgtatatata catatatgtg tgtatatatg tgtatatata catatatgtg tgtatatatg 840 tgtatatata catatatgtg tgtatatatg tgtatatata catatatgtg tgtatatatg 900 tgtatatata catatatgtg tgtatatatg tgtatat 937 <210> 161 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1350) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 79287748..79289097 <400> 161 tatatatatt atatatatag taactgttct attatatata tattatatat atttctgttc 60 tattatatat tatatatatt atattatata ttatatgtaa tatattatat atattataag 120 taatatatta tatatattat atgtaatata ttatatatat tatatgtaat atattatata 180 tattatatgc aatatgttat atatattata tgcaatatgt tatatatatt atatgcaata 240 tattatatat attatatgca atatattata tataatatat gtaatatatt atattatata 300 ttatatgtaa tatcttatat attatatgta atatattata tatattatat gtaatatctt 360 atatatatta tatgtaatat attatatatt atatgtaata tattatctta tatatattat 420 atgtaatata ttatattata tattatatgt aatatatatt atatgtaata tattacatat 480 tatatgtaat atatattata tgtaatatat tacatattat atgtaatata tattatatgt 540 aatatattac atattatatg taatatatta catattatat gtaatatatt atatgtatta 600 tatgtaatat attatatgta ttatatgtaa tatattatat gtattatatg tattatatgt 660 aatatattat atgtattata tgtaatatat tatatattat atgtaattat attatatgta 720 atatattata ttatatatta tatatattat atgtaatata ttatattata tattatatat 780 attatatgta atatattata ttatatatta tatatattat atgtaatata ttatattata 840 tattatatat attatatgta atatattata ttatatatta tatatattat atgtaatata 900 ttatattata tattatatat attatatgta atatattata ttatatatta tatatattat 960 atgtaatata ttatattata tattatatat attatatgta atatattata ttatatatta 1020 tatatattat atgtaatata ttatattata tattatatat attatatgta atatattata 1080 ttatatatta tatatattat atgtaatata ttatattata tattatatat attatatgta 1140 atatattata ttatatatta tatatattat atgtaatata ttttatatta tatatattat 1200 attatatatt atatgtaata tattatatta tttattatat attatatatt atatgtaata 1260 tattatatta tttattatat atattatatt atttattata tataatatat tatattatat 1320 atattatatt atatatattt ctgttctaat 1350 <210> 162 <211> 332 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_difference <222> (1)..(332) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 81142998..81143329 <400> 162 ctatgtatat aactatatat aactattata taacttaata agatatataa ctattatata 60 acttaataag ttatatataa ctattatata taacttaata agttatatat aactattata 120 taacttaata agttatatat aactattata taacttatta agttatatat aactatatat 180 aacttaataa gttatatata actattatat aacttaataa gttatatata actattatat 240 aacttaataa gttatatata actattatat aacttaataa gttatatata actatatata 300 acttatatac aacttattaa gctatatata ta 332 <210> 163 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(327) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 84019536..84019862 <400> 163 actgacagta tacatactgt atatatatac agtatgtata catatacagt atgtatacta 60 tatacagtat gtatactgta tatatatata cagtatgtat actgtatata tatacagtat 120 gtatacgtat gtatactgta tatatgtatt atagtgtata tatgtattat agtgtatata 180 tgtattatat atattatagt gtatgtatta tatgtgtata tacatataat atattataca 240 tatacatatg cacaatatgt atatgtatta tatgtattca tatacatata tgtatatgta 300 taatatatgt atacatataa tacacat 327 <210> 164 <211> 407 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(407) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 1448030..1448436 <400> 164 tatataatat atattacata tatattatat ctatattatt tatattacat atgtaatata 60 tattatattt atattattta tataatatat tatatatatt atattattta tatgtaatat 120 atttatattg tttatatata ttatatttat attatttata tataatacat attatattta 180 tattatttat atataatata tataataaat atataatata tataaaaata tatatattta 240 atatatctat aatatatatt atatatatta tatataatat atataattgt acatatattt 300 attatatata ttatatatat aatatatatt ataaatataa 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1500 gtgtatacta tatacactgt atatatagta tattatatat actatatatg tatatatagt 1560 atacatatat attatatata cagtatatat agtatatata ctatgtagta tatatagtat 1620 atatactata tagtatgtat agtatactat atagtatata tagtatatta tatagtatat 1680 atactatata gtatatatag tatattgtat atatagtata tatactatat agtatatata 1740 gtatattgta tatatagtat attgtatata tagtatacat agtatgtata tatagtatat 1800 atagtataca tatatagtat gtacacagta tatatagtct atatgtatac tacatatagt 1860 atacatgtat actatactac atatagtata catgtatact atactacata tagtatacat 1920 gtatagtata ctacatatac tatacatgta tagaatact 1959 <210> 166 <211> 520 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(520) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 2119984..2120503 <400> 166 tatgtatgca tcgtatacat atatagtata tatatgtatg catcgtatac atatatacag 60 tatatatagt atgcatcgta tacatacagt atactatata tacagtatat acagtatact 120 atatatacag tatatacagt atactatata tacagtatat acagtatact gtatatacag 180 tatatacagt atatatagta tactatatat acagtatata tactatgtat tctatatata 240 gtatagtgta catagtatac atatagtata cactatacta tatatagtat actatatata 300 ctctatatag tatatatagt atactatata tagtatatat gtatactata tatagtgtat 360 atatatacta tatatagtgt atatatatac tatatatagt atatatatac actatatatt 420 gtatagtata gtgtatatat agtatagtat atgtatatat acacatgtat acatgtatat 480 atgtatacta atatatacta atatatgtat aaatatatat 520 <210> 167 <211> 954 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(954) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 2578285..2579238 <400> 167 tattatatat aactttataa tatataatat atattatata taactttata atatataata 60 tatattatat ataactttat aatatataat atatattata tataacttta taatatataa 120 tatatattat atataacttt ataatatata atatatatta tatataactt tataatatat 180 aatatatatt atatataact ttataatata taatatatat tatatataac tttataatat 240 ataatatata ttatatataa ctttataata tataatatat attatatata actttataat 300 atataatata tattatatat aactttataa tatataatat atattatata taactttata 360 atatataata tatattatat actatatata atatataact ttataatata taatatatat 420 tatatactat atataacttt ataatatata 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tatactatat gtactacata 660 tataatagta tatatagtat atatactata ctatatgtag tacatatata gtttagtata 720 tatactagta tatagatata tagttatata gatatataat agtatatata gtatatatag 780 catatatagt atatatgcta tatatactat atagcatata ctatatacta tatatacagt 840 atatatagca tatatagcat atataatata tatacttttg atatacatac tatatacagt 900 atatatagta tatatactgt ataaatatac tatatatacc gtatatgcac actatatgct 960 atatatacta tatacactat atacagtata tatagtacac tatactatat aaagtatata 1020 tagtatacag tacactatac tatatacatt atatatagta tatattatac atagtatata 1080 gtatataaat agtatatata gtatatacag tatatatata gcatacttta tatagtatac 1140 acagtatata gatactatat atgctatata tagtatctat atactgtata ttatatatac 1200 taatatagta tatatgtata tatatactgt atatataata tatacatata tagtatatat 1260 actatacata cacactatac atatgtatat atactataca tactatatac tatatatcct 1320 atatatacta tatagtatat tatatatcct atatatacta tatagtatat tatatatcct 1380 atatatacta tatagtatat tatatatact atataccata tatactatat atactgtata 1440 gtatactata tatactatat agtatactgt atatactata tagtatactg 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catataacat atattatatt 600 atatataaca tataacatat attatattat atataacata taacatatat tatattatat 660 ataatatata acatatatat tatatataat atataacata taacatatat tatatataat 720 ataatatata acatatatta tatataatat aatatataac atatattata tataatataa 780 tatataacat atattatata taatataata tataacatat attatatata atataatata 840 taacatatat tatatataat ataatatata acatatatta tatataatat aatatataac 900 atatattata tataatataa tatataacat atataatata taacatatag catatataat 960 atataacata taacatatat tatatataac atataacata tattatatat aacatataac 1020 atatataata tgtaacatta tatataac 1048 <210> 175 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(375) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 8909678..8910052 <400> 175 tatatacaca tatatacgta tgaatatata tacacatata cgtatgaata tatataccca 60 tatacgtatg aatatacaca tatatatacg tacgtatata tatacacata tatacgtacg 120 tatatatata cacatatata cgtacgtata tatatacaca tatatacgta cgaatatata 180 tacacatata tacgtacgaa tatatataca catatatacg tacgaatata tatacacata 240 tatacgtacg aatatatata cacatatata cgtacgaata tatatacaca tatatacgta 300 cgaatatata tacacatata tacgtacgaa tatatataca catatatacg tacgaatata 360 tatacacata tatac 375 <210> 176 <211> 563 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(563) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 10572503..10573065 <400> 176 atttataata tatatgtata aatatatgta tatatttata tttaaatata tgtatatata 60 tttatattta aatatacgta tatatattta tatttaaata tacgtgtata tatttatatt 120 taaatatacg tgtatatatt tatatttaaa tatacgtgta tatatttata tttaaatata 180 cgtgtatata tttatattta aatatacgtg tatatattta tatttaaata tacgtgtata 240 tatttatatt taaatatacg tgtatatatt tatatttaaa tatacgtgta tatttatatt 300 taaatatacg tgtatattta tatttaaata tatgtatgta tttataaata tatatttaaa 360 gtatatattt ataaatgtat acatgtatat ataaatatat atattttaaa tatatattta 420 tatatatatt tatatattta tataagtata tatatattta aatatatgta tatatttata 480 tatttatata agtatatata tttaaatata tgtatatatt tataatatat attttaaata 540 tatatttata tatttattat ata 563 <210> 177 <211> 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gtatattatg tataacataa tatatagtat attatgtata acataatata 1860 tagtatatta tgtataacat aatatatagt atattatgta taacataata tatagtatat 1920 tatgtataac ataatatata gtatattatg tataacataa tatatagtat attatgtata 1980 tataatatac atattatata gtatattatg tatatataat atacatatta tatagtatat 2040 tatgtatata taatatacat attatatagt atattatgta tatataatat acatattata 2100 tagtatatta tgtatatata atatacatat tatatagtat attatgtata tataatatac 2160 atattatata gtatattatg tatatataat atacatatta tatagtatat tatgtatata 2220 taatatacat attatatagt atattatgta tatataatat acatattata tagtatatta 2280 tgtatatata atatacatat tatatagtat attatgtata tataatatac atattatata 2340 gtatattatg tatatataat atacatgtta tgtagtatat tatgtatata taatatacat 2400 gttatgtagt atattatgta tatataatat acatgttatg tagtatatta tgtatatata 2460 atatatataa ggtgtatata tattatgtat atataatata taaggtatat atattatgta 2520 tatataatat atataaggtg tttatataat gtatatataa tatataaggt atgtatatta 2580 tgtatatata atatgtatat tatatataat atatattatt tatatacatt atgtatctat 2640 ataatatata ttatgtatat attaggtatc tatataatat atattatgta tatatattat 2700 gtatctatat aatatatata ttatgtatat atattatgta tctatataat atatatatta 2760 tatgtatatt atgtatctat ataatatata taatgtatat agatatatta tatattatgt 2820 atatatatta tgtatctatt ttatatataa tgtatataga tatacaatat atattatgta 2880 tatattatgt atctatataa tatatattat ttatatagat atatatatta tgtatatata 2940 cataatatat tacatattat gtatatatac ataatatata atatattatg tatatataca 3000 taatatataa tatattatat attacatata ttatatataa tatattatat tatgtatata 3060 tattatgtat atataatgta tatataatat ataaagtgta tatatattgt gtatatataa 3120 tgtatatata ttacatatat tatgtgtata tatattatac ataatatata tactacatta 3180 tacataatat g 3191 <210> 181 <211> 314 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(314) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 728676..728989 <400> 181 tgtgtatata tgtatatata atatatatta tataatatgc atatgtataa aatatgtata 60 ttatatatgt atattttata tatatgtata tattatatgt atattttata tatgtatatt 120 ttatatatat gtatatatta tatatgtata ttttatatat atgtatatat tatatgtata 180 ttttatatat atgtatatat tatatatgta tattttatat atatgtatat attatatatg 240 tatattttat atatatgtat attttatata tatgtatatc atatatatgt atatattata 300 tatatgtata tctt 314 <210> 182 <211> 423 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(423) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 737493..737915 <400> 182 ataatatata gtgtctttta tattatctaa tatgtaatat aatgtatttt atattatgta 60 ttttatatta tataatatat aatataatgt attttatatt atatgttata taatatatag 120 tgcattatat attatgttat attatatata ttttatttat ataaattata tattatatgt 180 tattttatat atattatata acatataata taacaatgca ttatatatta taaaatatat 240 aatacattac atatattata taatatataa tacattacat atattatata atatataata 300 cattatcata tattacaaat attacattag tataatagta attataatat aatatattat 360 atattacata tattatatta atgtaatagt aattataata taatatatat tatattttat 420 att 423 <210> 183 <211> 724 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(724) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 1069556..1070279 <400> 183 tattataata tattatatac attatattgt atatatacta tatatggtat atatagtata 60 cataatataa aatgtatatt gtaatataca ttatatatat acatagtgta cattatataa 120 tataatataa tgtatattat aatatacatt ataatataat agtgtactat gtatatagta 180 tatataatgt atattataat gtattatata gtataatata atataatata cattatatag 240 tattgcatta tatatgctat ataatatata atatattatg tatatataca ttatatatac 300 tatattatat agtacatata atgtatatta tatagtatat ataatataat acattataca 360 tacaatatat aatgtatatt atatagtatg tataatgtaa tacattatac atagtacata 420 aagtatatta taatatatta taatatataa tatacattat atattataat gtatataata 480 tattgtatat atactatata taatgtatat acaattatat ataattgtat atatacatgt 540 atatgtatat gtatatatac atgtatatgt atgtgtatat atacatatat gtatatgtat 600 gtgtatatat gtatatgtat atatgtatat gtatacgtat atatgtatat acaatgtata 660 tataatgtat ataaaaatat ataatatata caatatgtat ataatgtata taattatata 720 atat 724 <210> 184 <211> 383 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(383) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 2719918..2720300 <400> 184 atatttatat tttatatatt atttatatat aaatatatat ttatatttta tatattattt 60 atatataaat atatatttat attttatata ttatttatat ataaatatat atttatattt 120 tatatattat ttatatataa atatatattt atattttata tattatttat atataaatat 180 atatttatat tttatatatt atttatatat aaatatatat ttatatttta tatattattt 240 atatataaat atatatttat attttatata ttatatattt atatattata tatatttata 300 ttaatttgtg tataatatat attattaaat ataataaata tatttatttt tatatattat 360 ataaaaatat ataatatata aaa 383 <210> 185 <211> 309 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(309) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 4994249..4994557 <400> 185 tataatatat aattgttata acattataac aattatatat tatatataat acaattatat 60 aatatatatt atataattgt aatatataat ataattatat aatatatatt atataatata 120 atatataata tatcatatat gttatatatt ttattatata atatatatta tatataatat 180 tatatataat atatattata tataatatta tatataatat atattatata taatatattt 240 atatatatta tatataatat atattatata ttaaatatta tatatataat atatataaca 300 ttattgtta 309 <210> 186 <211> 740 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(740) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 5034916..5035655 <400> 186 tttatatata aaatattata tataatatta tatataatat tttctatata aaatgtgtat 60 ataattatat ataattatat aaaatataat atagaatatc taataatgta taatatataa 120 catataaaaa taatattatt taatatataa tattttatat ataatatttt tatatataat 180 ataatatata ttttatatat aattattaat tatataatta atatataata tatattttat 240 acataattat taattatata taattaatat ataatatatc ttatacataa ttatcaatta 300 tatataatta atatataata tatattttat acataattat taattatata taattaatat 360 ataatatatc ttatacataa tatatataaa tatattatat ataatatata ttatatataa 420 tattatatat aatatatatt atatatataa aatttatata taatattata tataatatta 480 tatattttat atacaatatg atatataata taatttatat attatatata tttatatata 540 attattatat aaattatata aatataaatt atatatttat atataattat tatataaatc 600 attatataat tattataatt ataatatata atataatata atattatata taatatatag 660 tattctatat aaataatata acatatattt tatatagaat attatatata atataatata 720 tattttatat agaatattat 740 <210> 187 <211> 847 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(847) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 6074678..6075524 <400> 187 aatatagaca taaatatata tgcataaata tatatatgca taaatatata taaaaatata 60 tataaatata tacataaata tatataaata tatacaaaaa tatatataaa tatataaaaa 120 aatatataaa tatatataca catatataaa tatatataca tacatatata aacatatata 180 cataaatata tatgtataaa tatatataca cataaatata tgtatgaata tatatacata 240 aatatatatg tataaatata tatacataaa tatataaaga tatatacata aatatatata 300 aatatatata cataaatata tataaatata tataaataga tatataaata tatatataaa 360 tatataaata tatatataaa tatataaata tataaaaata gatatataaa tatatatata 420 aatatataaa tatatatata aatatatata aatatataaa tatatatata aatatatata 480 aatatataaa tatatataaa tatataaata tatatataaa tatatataaa tatataaata 540 tatataaata tatataaata tataaatata tatataaata tatataaata tataaatata 600 tatataaata tataaatata taaatatata tataaatata taaatatata taaatatata 660 taaatatata aatatatata aatatatata aatatataaa tatatataaa tatatataaa 720 tatatataaa tatataaata tatataaata tatataaata tatataaata tatataaata 780 tataaatata tatataaata taaatatata taaatatata aatatatata taaatatata 840 taaatat 847 <210> 188 <211> 784 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(784) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 6108986..6109769 <400> 188 atttatttat atatttaata tataaaatat atatttaata tataaaatgt atatatatac 60 atatattata tataatacaa tatatattat atataatata tattatatat aatattatat 120 attatattat aatataatat atattatata taatataata tatattatat attattatat 180 ataatataat atatattata tattattata tataatataa tatatattat atattattat 240 atataatata atatatatta tatattatta tatataatat aatatatatt atatatatat 300 tttatatata taatatataa tatatatatt atatatatat tttatatata taatatataa 360 tatatatatt atatatatat tttatatata taatatataa tatatatatt atatatatat 420 tttatatgta taatatataa tatatatatt atatatatat tatatatata taatatgtaa 480 tatatatatt atatatatat tatatatata atatatatta tacataaaat atatattata 540 tataatatat ataatatata ttatatataa aatatatttt atgtataata tatattatat 600 ataatatata atgtatattt atatataaaa tatatattta tatacaatgt atatttatat 660 ataaaatata tatttatata caatgtatat ttatataaat atgtgtttaa tatatgaaat 720 atatatttat atataatata tatttaatct ataaaatata tattaaatat atatttatat 780 ttaa 784 <210> 189 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(381) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 10389032..10389412 <400> 189 tatacacata tagagtatat agagtatata tagagtatat ctatagagta tatatgtata 60 tagagtatat aatacagcct accatatata tagtatacat atatatatac tctatatact 120 atatatatag tgtgtatata tatagtatag accctaccat atatatatat aggagtatat 180 atatatacac actcctacta tatatagtat gtatatagag agtatataga gtatatatac 240 agtatatata cacagtatat atatgccata tatagtatct atatacttat atatagtatg 300 tatctatata cttatatata gtatgtatct atatactata tatagtatgt atctatatac 360 tatatagagt atatatgtat a 381 <210> 190 <211> 507 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_difference <222> (1)..(507) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 11097807..11098313 <400> 190 aattatatat aatttattat atataatttt atatttataa tatttttata tacatatttt 60 atatatcttt ataattatat attacatata taatattata taatatatat aatatatata 120 atatatatta tatattatat aatatatatt atatatatta tatataatat atataatata 180 tataatatat ataatatata taatatataa tatatattat ataatatata ttatatataa 240 tatatattat atataatata tattatatat aatatataat atatataata tatataacat 300 ataataatat attatacata atttatatat aatttttata taattatata tatttatata 360 tttttatata attatatata tttatatatt tttatataat tatatatatt tatatatttt 420 tatataatta tatatataat ttttatataa atatatataa ttttatataa ttttatataa 480 ttataaaata tataattata tataatt 507 <210> 191 <211> 329 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(329) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 11234628..11234956 <400> 191 ttatagttaa atatataaat ataaaatata cagttttata cagtatatat aaaatataca 60 atatataata cataatacat tagttatata tactatatat actatatata ctacacgtat 120 agtatatata tgaaactata tatatactat acgtgtagta tatatatgaa actatatata 180 tactatacgt gtagtatata tatgaaacta tatactatac gtatagtata tatatgaaac 240 tatatatact atatatactt aactataatt gtatatagtt aaaaatataa atataaaata 300 tacagttaaa tatattaata tataatagt 329 <210> 192 <211> 584 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(584) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 797844..798427 <400> 192 tattatttta tgttataaat agataaaaat atatactaat atatatgtac ttatatatac 60 atcaatatat aatgtattat tttatactaa cgtatattat atatactagt atataatcta 120 tattatttta tatgttataa atatataata aaatatataa atattttatg catatattaa 180 tatataatat atactaacat gctaatttat atatacttat atataattta tatagtatat 240 aatatataaa tgtatataat acataattta tatatttata tattaatagt ttatatatta 300 gtatatatac taattttata tactaataaa taaattatat aatatataaa ttatatatta 360 tagtacataa tatatattat atagttaaat aactatgtaa ctataatata taactatata 420 tgatatacag ttatatataa tataaatttt acatacagta tataaattat atactataca 480 tttatataca tatggtatat aaattatata ctatacattt atatacatat ggtatataaa 540 ttgtatacta tataatgtgt attagtatat atactaatat atac 584 <210> 193 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(363) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 1093824..1094186 <400> 193 tatacacaca catatatata cacatatata tacacatata tatatacaca tatatataca 60 catatatata cacgtatata tgtatacaca tatatatgta tatatataca catatataca 120 cacatatata cgtgtatata cgtatatacg tacatatata cgtgtatata cgtatatgcg 180 tacatatata cgtgtatata cgtatatgcg tacatatata cgtgtatata cgtatatgcg 240 tacatatata cgtgtatata cgtatatgcg tacatatata cgtgtatata cgtatatgcg 300 tacatatata cgtgtatata cgtatatgcg tacatatata cgtgtatata cgtatatgcg 360 tac 363 <210> 194 <211> 545 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(545) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 3456187..3456731 <400> 194 tattataata tatatttata tattataata tatattatat tatatattta tatattataa 60 tatatattat attatatatt tatatattat aatatatatt atattataat atatatttat 120 attataatat attatattat aatatatatt atattattat atattataat ataatatata 180 ttataatata tattatatta taatttatat attatatata ttataatata tattatatta 240 tatatatatt tatattataa tatatattat tatatattat atattataat ttatattata 300 ttacaatata tattataaat atatatatta tattataaat atatattttt atattacaat 360 atatattata aatatatatt ttatattaca atatatatta taaatatata tattatatta 420 caatatatat tataaatata tattatatta caatatatat tatattataa tatatattta 480 tatatgatat attatattta atatattata taacataata tataatatat aatatattaa 540 tataa 545 <210> 195 <211> 356 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(356) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 5001567..5001922 <400> 195 tataaaatat atgttatata tataatatat attatataat atataatata tataatatat 60 aaaatatata aaatatataa tatataatat aatatataat atatataata tataaaatat 120 atataatata aaatatatat aatatataat atatataata tataatacat ataatatata 180 atatataata tataatatat ataatatata atatataata tataatatat ataatatata 240 atatataata tatataatat ataatatata atatataata tataaatata taaatatata 300 tacacacata cacacacata tatgcatata tatacatata catgtgtaca tagata 356 <210> 196 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(321) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 5457330..5457650 <400> 196 tatacaatat attataaatt atatataatt tatatataat atatattata tataaattat 60 atataattta tataatatat aaattatata taatataaat tatatataat ttatataata 120 tataaattat atattatata aattaaatat aatttatatt atatataaat tatatttaat 180 ttatataata tataaattat atttaattta tatataatat aaattatatt tttatatatt 240 atgtataatt tatatattta tacatatata cattataata tattgtatag tatatataat 300 atatagtata tataaagcat a 321 <210> 197 <211> 361 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(361) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 8124469..8124829 <400> 197 tatatataat atatattata tatattatat aaattatata taatatgtaa tataaatttt 60 gtaatataaa ttatatatat aaattatata taatatatat taatatatat aatataaatt 120 aatatatata atatataatt atatataatt tatatgatat atataaatat atattatata 180 taaattatat atatcataaa ttatatatca tataaattat atataatata cattatgtac 240 ataatatatg atatataata tataatatat attatatata attatatata 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aatatatatt atatatatta tatataatta tatataatat 120 atattatata tattatatat ataatatata tataatatat atattttata tatgtattat 180 atatatttta tatatattat atatattata tatatatttt atatatatta tattttatat 240 atataatata acatatataa tatataatta tatattatat atatattata ttatatataa 300 tatatattat atataatata atatataatt atatatatta tatattttat atatttatat 360 aaaaattatt ttatattatt ttatatataa atat 394 <210> 200 <211> 1194 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1194) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 14996824..14998017 <400> 200 taatatttat atatacatat aaaatttata tataatatat aatatttata tatacatata 60 aaatttatat atatatataa tatttatata tacatataaa atttatatat aatatataat 120 atttatatat acatataaaa tttatatata atatataata tttatatata catataaaat 180 ttatatataa taaatattta tatatacata taaaatttat atataattta tatataacat 240 ataatattta tatataaaat ttatatataa catatattta tatataattt atatataaca 300 tataatattt atatataata tatatttatt tatacaattt atatataata tataatactt 360 atatatacat acataattta tatgatatat attatatata taatttatat gatatataat 420 atatctaata tatattatat atattatata tattatatat aatttatata atatatatta 480 tatatataat ttatataata tatatattat atatataatt tatataatat atatattata 540 tatataattt atataatata tattatatat ataatttata taatatatat tatatatata 600 atttatataa tatatattat atataattta tatataacat attttatata catatataat 660 ttatatataa tatatattta catatacata tataattttt atataatata aaatatttct 720 atatacatat ataattttta tataatataa aatatttcta tatacatata taatttttat 780 ataatatata tttctatata catgtctaat ttttatataa tatatatttc tatatacata 840 tataattttt atataatata taatattttt atatacataa tttttatata atatatattt 900 acatatacat atataatttt tatataatat atatttatat atacatatat aatttttaca 960 taatatatat tatatataca tatataattt atatacaaca tataatatat acatatataa 1020 tttatataca acatataata tttatgtata catatataat gtatacacaa tatataatat 1080 ttatatatac atatataatt tatatgtaat atatacatat ataatttata tgtaatatat 1140 atacatgtat aatttatatg tagtatatat acatgtataa tttatatgta gtat 1194 <210> 201 <211> 487 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(487) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 14998429..14998915 <400> 201 tagtatacat ttacacatac atgtataatt atatgtaata tataatattt acatatataa 60 ttatagataa tatatattta catatacata tataattata tataatatat aatgtttaca 120 tatacataca taattatata taatatatat ttaaatatac atatacaatt atatataata 180 tatatttaca tatgcatata taattataga taatatatat ttacatatac atatataatt 240 atatataata tataatgttt acatatacat atataattat atataatata tatttaaata 300 tacatataca attatatata atatatattt acatatgcat atataattat agataatata 360 tatttacata tacatatata attatatata atatataata tttacatata catatataat 420 gtatatataa tatataatat ttacatatac atatataatt tatatataat atatattata 480 tatatta 487 <210> 202 <211> 421 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(421) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 16562490..16562910 <400> 202 tatatgaata tatatatgaa tatatacgta tatatgaata tatacatgta tgtatatatg 60 aatatatgta tatatatgaa tatatatgta tatatgaata tatgtatata tatgaatata 120 tatgtatata tgtatatata tgaatatata tgtatatatg tatatatatg aatatatatg 180 tatatatgta tatatgtata tatatgaata tatatgtata tatgaatata tatgaatata 240 tatgtatata tatgaatata tatgaatata tgtgtatata tatgaatata tatgtatata 300 tatgaatata tgtatatata tatgaatata tatgtatata tgtatatatg aatatatatg 360 tgtatatgaa tatatatatg aatatatatg tgtatatgaa tatatatgaa tatatatgtg 420 t 421 <210> 203 <211> 479 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(479) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 21592301..21592779 <400> 203 tatatgtata cgtatataat atattatata ttatatacgt gtacgtatat atgtaatata 60 taatgtatat gtacacgtat ataatatata atatattata tacgtatacg tatacattat 120 atattacata tatacgtata tacgtatata aaatatatgt atatattata tatacgtata 180 taatatatat tatataatat ataatatata cgtatacata taatatatta tatatacata 240 ttatatatta tatatttaaa ttatatatta tatcatatat aatatatatg atataatata 300 taatatacat atattacata atatatatta tatacatata catatataat atataatata 360 ttatatacat atacatatat aatatataat atattatata catatacata tataatatat 420 aatatattat 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tattttatat attatatata ttatatatta 540 tatatttata tattatataa tatatattat atatagaata tataatatat attatatata 600 atataatata atatatatta tataaaatat atataatata taaaatatat aatatatgat 660 atatataata tatattctat atttatacat atatatttaa tattatatta atatataatt 720 atatattatc atatgtaata atagatataa tatgtaatat ataaattata attatatatt 780 aatattatat attatttaat atgtatattt acacatatat taattattaa atatatatat 840 ttaatatatt aaatattatg tattaaatat atataatata tttataaata ttttatatat 900 aatatataca tatattaaca tatatgtata tatgtatata ttatatataa cattatatat 960 attatgttac atatactata ttttatatgt tacatatact atatattata tgttacatat 1020 aatatatata acatatatta taatatgtaa catattatat ataacatata atatatagta 1080 tatata 1086 <210> 206 <211> 406 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(406) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 36233909..36234314 <400> 206 attataaata tatattatag atattagata ttatagatat aatatatata atatatatta 60 tagatattat agatatagat ataatagata ttatagatat tatagatata atatatatta 120 tagatattat agatataata tatattatag atattataga tataatatat attatagata 180 ttatagatat aatatatatt atagatataa tatatattat agatattata gatatagata 240 ttatagatat tatatatatt atagatataa tatatattat agatattata gatatagata 300 ttatagatat aatatatatt atagatatta tagatataat atatattata gatattatag 360 atataatata tattatagat ataagatata ttatagatat tacaga 406 <210> 207 <211> 797 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(797) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 36271745..36272541 <400> 207 atataaacat atacgtatat acacatatat acaaatacat atatacatat attatatata 60 tgtatatata ttatattata catatattat atatatatta tattatacat atatacatac 120 acacataaac atattacata catatacaaa ttatacacat atacatatat acatatatgt 180 atatacatac attatatata aatatatgta tataaaatgt acattatata tacatatata 240 ttatgtataa ataatatata aaataaacat aatatatatt tatagatatg atatatataa 300 tatatatgta tacatatata catatatgta tatataatgt acattataca tacataaaca 360 tcatatataa atgttatata tataatataa atatatataa tatataatat atactttata 420 tactatatat aatatatata atatgatata acatatacta tatatactat atataatata 480 tactatatat actgtatata atatataata taatatatac tatatatact aaatataata 540 tacataatat aatatatact atatataata tataatatat aatatagtat atatactata 600 tataataatt acatattata tattatacat tatatattat ataattatta tatataatta 660 tatattacat actttgtata taatgtaaat atacattaga atatataatg tatatatatg 720 tacatatata atgtatatat gtatacatta tataaactat atataaacat tatattatat 780 aaacattata tataaac 797 <210> 208 <211> 423 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(423) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 36498521..36498943 <400> 208 tattatatta tatatttaat attatatatt taatatatta tatatttaat attatatatt 60 taatatatta tatatttaat attatatatt taatatatta tatatttaat attatatata 120 taatatatta tatatttaat attatatata taatattata tatataatat tatatattta 180 atattatata tataatatta tatatataat atattatata tttagtatta tgtatttaat 240 atattatata tttagtatta tgtatttaat atattattta tttagtatta tatatttaat 300 atattattta tttagtatta tatatttaat atattatata tttaatatat tatatattta 360 ttatatattg tatatttaat atattatata tttattatat attatatata attatatatt 420 taa 423 <210> 209 <211> 304 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(304) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 37179891..37180194 <400> 209 gtgtatatat atcatatata ttatatcata tatatgtgta tatatatcat atattatatc 60 atatatatgt gtatatatat catatatata tcatatatgt gtatatatca tatatattat 120 atatcatata tgtgtatata tatcatatat tatatatcat atatatgtgt atatatcata 180 tatattatat atatctcata tgtgtatata tatcatatat aatatatatg tgtatatatc 240 atatatcata tataacatat atatgtgtat atatcatata tataacatat atcatatatg 300 tgta 304 <210> 210 <211> 693 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(693) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 38440448..38441140 <400> 210 tatatattct tttatatatt atatataata tatattcttt tatatattat atatagtata 60 tattctttta tatattatat atagtatata ttcttttata tattatatat agtatatatt 120 cttttatata ttatatatag tatatattct tttatatatt atatatagta tatattcttt 180 tatatattat atatagtata 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acatatattg tacgtacaat 480 atataaacat atattatacg tacaatatat aaacatatat tatacgtaca atatataaac 540 atatattata cgtacaatat ataaacatat attatacgta caatatataa acatatatta 600 tacgtacaat atataaacat atattatacg tacaatatat aaacatatat tatacgtaca 660 atatataaac atatattata cgtacaatat ataaacatat attatacgta caataaacat 720 atattatacg tacaatatat aaacatatat tatacgtaca atatataaac atatattata 780 cgtacaatat ataaacatat attgtacgta caatatataa acatatatta tatgtataat 840 atataaacat ataatatata atatatatta tatatatgtt tattatatat gtttatatat 900 tatatataac atatattatt atattatata tgtttatata ttatatatta tataatatat 960 atgtttatat attatatatt atataatata tatgtttata tattatatat tatataatat 1020 atatgtttat atattatata ttatataata tatatgttta tatattatat attatataat 1080 atatatgttt atatattata tattatataa tatatatgtt tatatattat atattatata 1140 atatatatgt ttatatatta tatattatat aatatatatg tttatatatt atataaataa 1200 taaacttaca tattttatta a 1221 <210> 213 <211> 543 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(543) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 45818200..45818742 <400> 213 tatgtatata tacatatata tttatacatg tatatatgta tatatacata tatatttata 60 catgtatata tatacatata tatttataca tgtatatata tacatatata tttatacatg 120 tatatatata catatatatt tatacatgta tgtatatata catatatatt tatacatgta 180 tgtatatata catatatatt tatacatgta tgtatatata catatatatt tatacatgta 240 tgtatatata catatatatt tatacatgta tgtatatata catatatatt tatacatgta 300 tgtatatata catatatatt tatacatgta tgtatatata catatatatt tatacatgta 360 tgtatatata catatatatt tatacatgta tgtatatata catatatatt tatacatgta 420 tgtatatata catgtatatt tatacatgta tgtatatata catgtatatt tatacatgta 480 tgtatatata catgtatatt tatacatgta tgtatatata catgtatatt tatacatgta 540 tac 543 <210> 214 <211> 463 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(463) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 47055478..47055940 <400> 214 atacatacat atatacatat atacacatat atacatataa tacacacata tttacatata 60 tacacacata tatacatata tacatatata cacatatata catgcataca catatataca 120 tatatacaca catatacaca catatataca tatatacaca tatatacaca tatacacata 180 tatacacaca tatacatata tacacatata tacatatata catatataca cacatataca 240 catatataca tatacacata tatacacata tacatatata cacatatata cacatatata 300 catatataca catatataca tatatacaca tatatacaca catatacaca tatatacata 360 tatacatatg tatacacata tatacatatg tatacacata tatacacata tacatatata 420 catacacata tatacgtata tatgtgtata tatacacata tac 463 <210> 215 <211> 2482 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(2482) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 47492696..47495177 <400> 215 aatatatata aaatatatta tattctatgt aatatataga atatataaaa tatattctat 60 atattatata gaatatatat tttataatat atattattta tatattttta tatatttata 120 ttatttatat atttatatat aatttatata atttatacat ataatttata tataatttat 180 ataaattata tatataattt atatataatt tatatataat ttatataaat tatatatata 240 atttatatat aatttatatg atttttatat ataatttata tataatttat ataattttta 300 tatataattt atatataatt tatataattt ttatatataa tttatataat atatatatat 360 aatttatata taatttatat aatttatata tataatttat atataattta tataatttat 420 atatataatt tatatataat ttatataatt tatatatata atttatatat aatttatata 480 atttatatat ataatttata cataatttat ataatttata tatataattt atataattta 540 tatatataat ttatatatat aatttatata atttatatat atgatttata taatttatat 600 atataattta tataatttat atatataaat tatatatata atttttatat aatttatata 660 tttataattt atatatttat ataatttata tatttataat ttatatattt atataattta 720 tatatttata atttatatat ttatataatt tatatataat tattcatata tttatataat 780 ttacatataa ttatttatat attcatatat aatttatata tttatatata atttatatat 840 aattatttac atatttatat atttatatat aatttatata tatttatata taatttataa 900 ataaaatata taatatataa tatataatat tataatagat aaaatatata ctatatatta 960 tatattttac attatattta atattatatg tataatttta tatcatatat aatatatatg 1020 atatatataa ttttatatca tatataatat atatggtata tataatttta tatcatatat 1080 aatatatatg gtatatataa ttttatatca tatataatat atgatatata attttatatc 1140 atataatata tattatatat aattttatat ctacatatta tatattatat atacaatttt 1200 atatctatct ataatatata 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<400> 218 tacgtatata aaaatgtata tttacatata taaaataaat attttatata cgtatataaa 60 atatatattt attttatata cgtatataaa atatttattt tatatatgta tataaaatat 120 ttattttata tacatgtata ttaaatatat atttatatat gtatataaaa atatatatta 180 tatacatgta tataaaatat atattatata tgtatataaa aatatatatg tatataaaat 240 atatatatta tatagatata taaaatatat attatataga tatataaaat atatatatta 300 tatagatata taaaatatat atattatata gatatataaa atatatatat tatatagata 360 tataaaatat atatattata tagatatata aaatatatat attata 406 <210> 219 <211> 1452 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1452) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 55113305..55114756 <400> 219 ataatatata atatatattg tatattatat tattatatat tatatattat taaatatata 60 tattatatta tatattatat aatatatatt atatataata atatagaata tataattata 120 tattatatta tatattatat aatatatatt atatataata atatagaata tataattata 180 tattatacta tatattatat aatatatatt atatataata atatagaata tataattata 240 tattatataa tatgtgaata atgtaatata taattatatt atttacatat tatataatat 300 ataattatat tatataatat ataattatat tatttgtata ttatatataa catatacatt 360 atattatata taatataatt atatataatt aattataaat taattatata taattatata 420 atataatata taatatacat aatatataat atataataca taatatacat aatataatat 480 atattatata taatataata tatataatat aatataatat aatgtataat ataattatat 540 attatatata atatataatg ttatataatt atattatatt atataattaa ttatatgtaa 600 ttaatataat ataattatta tatataattt tttatataat ataatatata attatataat 660 ataatataat tatattatat tatataatat atatatatta tataatataa tataattata 720 ttatataatt atataatata atataattat atattatatt atataataaa tataattata 780 taatataata tgattatata atatattatg tatattatat attatatatt gtattatgta 840 tattatatat tatatattat gtatattata tattatgtat attatatatt atgtatatta 900 tatattatat attatattat gtataatata ttatgtatgt tatatataat ataaattata 960 ttatatatta tgtatattat atataaatta tattatatat tatgtatatt atatataata 1020 taaagtatat attatgtata ttatatataa tataaagtat atattatgta tattatatat 1080 aatataaagt atatattatg tatattatat ataatataaa gtatatatta tgtatattat 1140 atataatata 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tatatttata tatataatta 120 tatatactta tatataatta tatatatatt tatatatata attatgtata cttatatata 180 tttatatata taattatata tacaatttat atatataatt atatataatt tatatataat 240 tatatatata aattatatat aagtatatat aattatatat atgtttatat ataattatat 300 atataaatga tatgtataat atataactat atataattat atataaatat atatatagat 360 tttatatata 370 <210> 224 <211> 306 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(306) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 57693125..57693430 <400> 224 tacgtatata cacgtataaa tataaatata tacatgtata tacgtatata catgtataaa 60 tataaatata tatatgtata tacgtatata catgtataaa tatatatatg tatatacgta 120 tatacatgta taaatatata tatatgtata tacgtatata catgtataaa tatatataca 180 tgtatatacg tatgttgtgt atacatacaa atctgtacat atatacatat atgttgtgtg 240 tatatataca tctatacatg tgtatgcgta tatatgtata tgtatatata gtatatataa 300 tacatg 306 <210> 225 <211> 500 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(500) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 59810331..59810830 <400> 225 tttattatat gtaatatata ttgtattatt atatatatta tatataatat atattgtatt 60 attatatata ttatatataa tatatattgt attattatat atattatata taatatatat 120 tgtattatta tatatattat atataatata tattgtatat tatatatatt atatattata 180 ttattatata ttatatatat tatattatta tatattatat attatatata ttatattata 240 tattatatat tatattatat atattatatt atatattata tattatatta tatatattat 300 attatatatt atatattata ttatatatat tatattatat atattatata ttatatatta 360 tatatattat atattatata ttatatatat tatatattat atataatata tattatatta 420 ttatataata ttatatatta tatatattat atattatata taatatatat tatattatta 480 tataatatta tatattatat 500 <210> 226 <211> 565 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(565) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 59974589..59975153 <400> 226 atatatgtat aatatgtata tatgtatata ttatgtatat gttatatatg taatatatgt 60 atgtatatat tatatatcat atataatata taatgtgtat atatgtatat atgtatgtat 120 acatgtatat actatgtata tattgtatat attatatatg tatatataca tatacatata 180 taatatatac atatattata tacaatatat acatgtatat tatatacgat atatacatat 240 atattatata caatatatac atagtatata aatgtataca tacatacata tatacatatt 300 atatatgtat atatgtatac ataaatgtat atataatata tatacatata taaatgtata 360 catacgtaca tatacgtata tgtatatgca tatatgtata tatgtgcata catatatatg 420 tatatacata tatgtacata tgtacatata cgtatatatg tacatatgta catatacgta 480 tatatgtaca tatgtacata tacgtatata tgtacatatg tacatatacg tatatatgta 540 catatgtaca tatatacata tatat 565 <210> 227 <211> 427 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(427) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 60605573..60605999 <400> 227 tatataatgt atataatgga tatagatata gatatagata tatattttat ataatatata 60 ttatatatta tatataatat atgttatata tattatatat tttatataat atatatatta 120 tataaattat atatatataa tatataatat atatattata tatattttat ataatatata 180 tttaatatta tctattatat attttatata atatatattt tatataatat ataatatata 240 atatatattt tacataatat ataatatata atacgtatta tatataatat ataatacgta 300 ttttatataa tatataatac gtattatata taatacgtat tatatattat ataatatata 360 atacgtatta tataatatac gtaattatat tttattataa tacgtattat atattatata 420 atatata 427 <210> 228 <211> 1199 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1199) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 61229949..61231147 <400> 228 gtatacatat ataaagtgta tatataatgt atatacatat atacatatat aaagtatata 60 tataatatat acatatataa agtatatata taatatatac atatataaag tatatataat 120 atatacatat ataaagtata tataatatat acatatataa agtatatata tcatatatac 180 atatataaag tatatatata atatatacat atatacatat ataaagtata tataacatat 240 atacatatat aaagtatata taacatatat acatatataa agtatatata taatatatac 300 atatatacat atataaagta tatataacat atatacatat atacagtata tataacatat 360 atacatatat acagtatata taacatatat acatatatac agtatatata acatatatac 420 atatatacag tatatataac atatatacat atatacatga agtatatata acatatatac 480 atatatacat gaagtatata taacatatat acatatatac atgaagtata tataacatat 540 atacatatat acatgaagta tatataacat atatacatat atacatatat aaagtatata 600 taacatatac atatatacat atataaagta taacatatac atatatacat 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atatatatat aactatatat ataactatat atatataact atatatataa ctatatatat 480 ataactatat atataactat atatataact atatatataa ctatatatat ataactatat 540 atataactat atatatataa ctatatatat aactatatat ataactatat atataactat 600 atatatataa ctatatatat aactatatat atataactat atatataact atatatat 658 <210> 231 <211> 1486 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1486) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 62384127..62385612 <400> 231 attatatcta atctattata tattatatct aatacatatt atatctaatc tattgtatat 60 tatatctaat atataatata ttatatataa tatattatat attatatatt atatacaata 120 tattatatat tatataatat ataatatatt atatataata tattatatct aatatattac 180 atattatatc taatctatta tagatataat atgtaatata ttatatatta tatctaatag 240 atattagata taatatataa tatattatta atataatata ttagatataa tatataatat 300 aataatatat aatatatatt attggtaata tataatatat aattaataat atatattata 360 tataattatt atgaataata tatcatatat aatatctagt atattatata ttaataacat 420 ataaatatta tattaataat aaataacata ttaatattat attaataata tataatatac 480 taatattata ttaataatat ataatatact aatattatat taataatata taatatacta 540 atattatatt aataatatat aatatactaa tattatatta ataatatata atatactaat 600 attatattaa taatatataa tatactaata tattaagaat atataatata ctaatatatt 660 aagaatatat aatatactaa tattatatta ataatatata tttatattaa taatatatta 720 attattatta attaattatt aataattata taatattgat tatattaata ttatcaattt 780 aataatattg attatatatt atatattata tattatatat tatatattat atattatata 840 ttatatatta ataatatata ttagatataa tataatatat taataatata taagatataa 900 tataatatat taataatata tattagatat aatataatat attaataata tatattagat 960 ataatataat atattaataa tatatattag atataatata atatattaat aatatatatt 1020 agatgtaata taatatatta ataatatata ttagatgtaa tataatatat taataatata 1080 tattagatgt aatataatat attaataata tatattagat gtaatataat atattaataa 1140 tatatattag atgtaatata atatattaat aatatatatt agatgtaata taatatatta 1200 ataatatata ttagatgtaa tataatatat taatatatat tagatgtaat ataatatatt 1260 aataatatat attagatata atataatata ttaataatat attagatata atataatata 1320 ttaataatat 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<211> 407 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(407) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 63935888..63936294 <400> 235 tataatatat taatataata tatagacagt atataatata atatacagac agtatataat 60 atacagacag tatataatat ataatattat atataatatt atatataata ttatataata 120 tattatatta tatatattat ataatatatt atattatata taatatatgt aatattatat 180 attatattat acataatata ttatatataa tatattatat ataatattat atatattata 240 tataatatat ataataataa tattataata tataatatat aatagtacag tatatattat 300 atatataatt ctatatataa tatatagaat tctatctatt tataatatat atagaattct 360 atatataata tataatatac agaattctat atatattata tatagaa 407 <210> 236 <211> 302 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(302) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 66958350..66958651 <400> 236 tattatatat attgtatata tatgtatatt atatatattg tatatataat gtatattata 60 tatattatat atatatgtat attatatata ttgtatatat atgtatatta tatatattgt 120 atatatgtat atgtatatat gtatgtgtat atatatacac atatacacat atatgtgtat 180 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cattatatat ataaacatta tatatatatg tg 402 <210> 241 <211> 421 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_binding <222> (1)..(421) <223> MAR of chromosome 2 genomic contig; 32415..32835 <400> 241 ataaatattt tatatataat atataatata tatactatat tatatgttat atatactatt 60 ataatatata taatatatat attatatatt atatatacta ttattatata tgatactatt 120 atatattaat ataattatat ataatatata tattatataa tatactatta tatattatat 180 ataatagtat attatataat atatatatta tatataatag tattatatat actattatat 240 attatatata ttatatatat ataaaatata atataatata tataatatat aatattaata 300 ttatatatat aatataatat aatatataat ataatataat atatatatta ataaaattat 360 attaatatat aatatataat agtatattat atacatatat aatatataca atatataata 420 t 421

Claims

단백질 생산 증가 활성을 갖는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서,

상기 DNA 서열은

a) 1 이상의 벤트(bent) DNA 엘리먼트, 및

b) 1 이상의 DNA 결합 단백질에 대한 결합 자리를 포함하고,

그리고 상기 DNA 서열은 서열번호 25의 서열 및 상기 서열의 상보적 서열을 포함하는 군에서 선택되는 MAR 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 상기 벤트 DNA 엘리먼트는 100개의 인접 염기쌍 스트레치(stretch) 상에서 10% 이상의 디뉴클레오티드 TA, 또는 12% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
제 2 항에 있어서, 상기 벤트 DNA 엘리먼트는 100개의 인접 염기쌍 스트레치 상에서 33% 이상의 디뉴클레오티드 TA, 또는 33% 이상의 디뉴클레오티드 AT를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
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제 1 항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 전사 인자인 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
제 7 항에 있어서, 상기 전사 인자는 polyQpolyP 도메인 단백질을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
제 7 항에 있어서, 상기 전사 인자는 SATB1, NMP4, MEF2, S8, DLX1, FREAC7, BRN2, GATA 1/3, TATA, Bright, MSX, AP1, C/EBP, CREBP1, FOX, Freac7, HFH1, HNF3alpha, Nkx25, POU3F2, Pit1, TTF1, XFD1, AR, C/EBPgamma, Cdc5, FOXD3, HFH3, HNF3 beta, MRF2, Oct1, POU6F1, SRF, V$MTATA_B, XFD2, Bach2, CDP CR3, Cdx2, FOXJ2, HFL, HP1, Myc, PBX, Pax3, TEF, VBP, XFD3, Brn2, COMP1, Evil, FOXP3, GATA4, HFN1, Lhx3, NKX3A, POU1F1, Pax6, TFIIA 및 Vmw65 또는 2개 이상의 이들 전사 인자의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
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정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 이용하여 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법으로서,

상기 정제 및 분리된 DNA서열은 제1의 분리된 매트릭스 부착 부위(matrix attachment region, MAR) 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

상기 매트릭스 부착 부위 뉴클레오티드 서열은

- 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 7 항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 정제 및 분리된 DNA 서열,

- 서열번호 25의 서열 및 상기 서열의 상보적 서열을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
제 42 항에 있어서, 상기 정제 및 분리된 DNA 서열은 목표 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
정제 및 분리된 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 이용하여 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법으로서,

상기 정제 및 분리된 DNA 서열은 제1의 분리된 매트릭스 부착 부위(matrix attachment region, MAR) 뉴클레오티드 서열 및 최소한의 제2의 분리된 매트릭스 부착 부위(MAR) 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

상기 제1의 분리된 매트릭스 부착 부위 뉴클레오티드 서열 및 최소한의 제2의 분리된 매트릭스 부착 부위 뉴클레오티드 서열은 각각

- 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 7 항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 정제 및 분리된 DNA 서열,

- 서열번호 25의 서열 및 상기 서열의 상보적 서열을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
제 44 항에 있어서, 상기 제1의 분리된 매트릭스 부착 부위 뉴클레오티드 서열 및 최소한의 제2의 분리된 매트릭스 부착 부위 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 목표 유전자를 포함하는 서열의 5' 및 3' 말단 모두에 위치하는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
제 44 항에 있어서, 상기 제1의 분리된 매트릭스 부착 부위 뉴클레오티드 서열 또는 최소한의 제2의 분리된 매트릭스 부착 부위 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 목표 유전자를 포함하는 서열과 다른 서열상에 위치하는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
제 42 항에 있어서, 상기 정제 및 분리된 DNA 서열은 벡터로서 선형 DNA 서열의 형태인 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포에서 단백질 생산 활성을 증가시키는 방법.
하기 단계를 포함하는 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법:

a) 1 이상의 목표 DNA 서열, 또는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트로 구성되는 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열을 포함하는, 1 이상의 정제된 DNA 서열을 상기 진핵 숙주 세포에 도입하는 단계,

b) 상기 형질전환된 진핵 숙주 세포에, 1 이상의 목표 DNA 서열을 포함하는 1 이상의 정제된 DNA 서열 또는 MAR 뉴클레오티드 서열 또는 다른 염색질 변형 엘리먼트로 구성되는 1 이상의 분리 및 정제된 DNA 서열을, 정해진 시간 내에, 1 이상의 추가 형질도입 단계를 수행하는 단계, 및

c) 상기 형질전환된 진핵 숙주 세포를 선별하는 단계.
제 48 항에 있어서, 상기 목표 DNA 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질을 코딩하는 목표 유전자인 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법.
제 48 항 또는 제 49 항에 있어서, 상기 선별된 형질전환된 진핵 숙주 세포는 매일 세포당 10 pg 이상의 생산 속도를 갖는 단백질 고생산 세포인 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법.
제 48 항에 있어서, 상기 MAR 뉴클레오티드 서열은 하기를 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법:

- 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 정제 및 분리된 DNA 서열,

- 서열번호 25의 서열 및 상기 서열의 상보적 서열.
제 48 항에 있어서, 상기 MAR 뉴클레오티드 서열은 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 정제 및 분리된 서열, 및 상기 서열의 상보적 서열인 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법.
제 48 항에 있어서, 상기 정해진 시간은 세포분열 사이클과 관련된 간격(interval)에 상응하는 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법.
제 53 항에 있어서, 상기 정해진 시간은 숙주 세포가 제2(a second) 세포 분열 사이클에 진입하는 순간인 것을 특징으로 하는, 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법.
1 이상의 목표 DNA 서열을 포함하는 제1의 정제 및 분리된 1 이상의 DNA 서열, 및

하기를 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 MAR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2의 정제 및 분리된 DNA 서열을 진핵 숙주 세포에 동시형질전환(co-transfecting)시키는 단계를 포함하는, 진핵 숙주 세포의 형질전환 방법:

- 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 정제 및 분리된 DNA 서열,

- 서열번호 25의 서열 및 상기 서열의 상보적 서열.
a) 제 48 항에 따라 형질전환된 진핵 숙주 세포를, 상기 목표 DNA와 관련된 단백질 발현을 위한 조건 하의 배양 배지에서 배양하고, 그리고

b) 상기 단백질을 회수하는 것

을 특징으로 하는 단백질의 생산 방법.
제 48 항에 따라 형질전환된 진핵 숙주 세포.
제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 1 이상의 정제 및 분리된 DNA 서열을 포함하는, 세포 형질전환 혼합물.
제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 1 이상의 DNA 서열이 최소한 일부 세포에 안정적으로 삽입된 것을 특징으로 하는 비 인간 형질전환 생물체.
제 1 항 내지 제 3 항, 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 1 이상의 DNA 서열이 게놈(genome)에 안정적으로 삽입된 것을 특징으로 하는 비 인간 형질전환 생물체.
삭제
a) 제 55 항에 따라 형질전환된 진핵 숙주 세포를, 상기 목표 DNA와 관련된 단백질 발현을 위한 조건 하의 배양 배지에서 배양하고, 그리고

b) 상기 단백질을 회수하는 것

을 특징으로 하는 단백질의 생산 방법.
제 55항에 따라 형질전환된 진핵 숙주 세포.
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