DE60214400T2

DE60214400T2 - Verfahren zur proteinproduktion in pflanzen

Info

Publication number: DE60214400T2
Application number: DE60214400T
Authority: DE
Inventors: Yurii Moscow DOROKHOV; Eugene Moscow SKURAT; Victor Klimyuk; Yuri Gleba
Original assignee: Icon Genetics AG
Current assignee: Icon Genetics AG
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-08-28
Publication date: 2007-10-11
Also published as: AU2002331090B2; CA2455882C; MXPA04001871A; DE10143205A1; WO2003020938A3; JP4401772B2; US20050015830A1; EP1423524A2; DE60214400D1; ATE338138T1; DE60214400T8; EP1423524B1; WO2003020938A2; IL160338A; IL160338A0; CA2455882A1; JP2005501558A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Vektoren für die Herstellung eines gewünschten Proteins in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen sowie so erhaltene Proteine und Polypeptide. Ferner betrifft die Erfindung Vektoren für dieses Verfahren und Pflanzen oder Pflanzenzellen, die damit transformiert werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die rekombinante Herstellung von Proteinen in pflanzlichen Systemen ist sehr erfolgreich für viele verschiedene Produkte, darunter Proteine für industrielle Anwendungen, Nahrungsmittel- und Futterzusätze, tiermedizinische Produkte und Pharmazeutika für Menschen, wie Antigene und Proteine der Immunantwort.
Es gibt viele Übersichtsartikel, die dieses Feld beschreiben (Daniell et al., 2001, Trends Plant Sci., 6, 219-226; Larrick & Thomas, 2001, Curr. Opin. Biotech., 12, 411-418; Doran, 2000, Curr. Opin. Biotech., 11, 199-204; Hood & Jilka, 1999, Curr. Opin. Biotech., 10, 382-386). Pflanzen werden für wirtschaftliche Produktionssysteme für Proteine angesehen, die im Vergleich mit Produktionssystemen auf der Grundlage von Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Säugerzellen deutlich billiger sind. Jedoch wurde den technischen Herausforderungen der Proteinreinigung aus pflanzlichen Materialien wenig Beachtung geschenkt. Die Isolierung und Reinigung von Proteinen aus Biomasse ist ein teurer und technisch komplizierter Prozess, der mehr als 90% der Gesamtproduktionskosten ausmachen kann, insbesondere bei billigen Produktionssystemen wie in Hefe- oder Bakterienzellen. Die Reinigung aus pflanzlicher Biomasse ist a priori sogar noch schwieriger und kann bei der industriellen Entwicklung von pflanzenbasierten Produktionsplattformen den schwierigsten Flaschenhals (Engpass) darstellen. Die verfügbaren Daten bestätigen das Gesagte. Zum Beispiel macht die Extraktion von β-Glucuronidase aus transgenen Maiskörnern 94% der Produktionskosten aus (Evangelista et al., 1998, Biotechnol. Prog., 14, 607-614).
Eine Anzahl von Verfahren wurden entwickelt, um dieses Problem anzupacken. Die Kompartimentalisierung des rekombinanten Proteins in der Pflanzenzelle gefolgt von seiner Sekretion ist eine Vorbedingung dafür, dass das Produkt leicht zu reinigen ist. Die Rhizosekretion von rekombinanten Proteinen wurde in genetisch verändertem Tabak demonstriert (Borisjuk et al., 1999, Nat. Biotechnol., 17, 466-469; US 6 096 546 ). Es wurde gezeigt, dass das Targeting (Leiten, Einschleusen) eines Proteins in das endoplasmatische Retikulum durch Verwendung einer Fusion mit einem Signalpeptid es erlaubt, das sekretierte Protein in bereits teilweise gereinigter Form zu erhalten (in der Sekretionsflüssigkeit mit nur rund einem Dutzend von Proteinen, die normalerweise von der Pflanze sekretiert werden), sowie in deutlich höheren Mengen im Vergleich mit einer Isolierung aus homogenisiertem Pflanzengewebe, das eine sehr komplizierte Mischung tausender Proteine und anderer Moleküle ist. Ein ähnlicher Ansatz wurde mit pflanzlichen viralen Expressionsvektoren gewählt, wobei das Protein in den Apoplast geleitet wurde, so dass die Reinigung mit einem stark angereicherten Produkt beginnt (für eine Übersicht siehe: Yusibov et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94). Eine andere, von M. Moloney ( US 5 650 554 ) entwickelte Technik löst das Problem durch Targeting des gewünschten Proteins als Teil einer Oleosinfusion in Ölkörper, d.h. eine Zellfraktion, die leicht abtrennbar ist.
Eine weitere wichtige Strategie besteht darin, das rekombinante Protein mit einem Affinitäts-Tag (affinity tag) zu versehen, das die Proteinreinigung durch Affinitätschromatographie erleichtert. Dies ist ein weit verbreiteter Ansatz für die Proteinreinigung unter Verwendung verschiedener Affinitäts-Tags wie z.B. Polyhistidin, Flag, Protein A, Gluthation-S-Transferase, Cellulose-bindende Domänen (CBD) usw. (Sassenfeld, 1990, TIBTECH, 8, 88-93). Im Fall von CBD-Fusionsprotein wird das gewünschte Protein an eine substratbindende Region einer Polysaccharidase (Cellulasen, Chitinasen und Amylasen sowie Xylanasen und β-1,4-Glycanasen) gekoppelt. Eine Affinitätsmatrix, die das Substrat, wie z.B. Cellulose, enthält, kann zur Immobilisierung des Polypeptids verwendet werden. Das Polypeptid oder Fusionsprotein kann von der Matrix durch Verwendung einer Proteanen-Spaltstelle entfernt werden. Verschiedene Varianten dieses Verfahrens unter Verwendung von CBD pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs werden in mehreren Publikationen und Patenten beschrieben (Ong et al., 1991, Enzyme Microb. Technol., 13, 59-65; Linder et al., 1998, Biotechnol. Bioeng., 60, 642-647; US 5 137 819 ; US 5 202 247 ; US 5 670 623 ; US 5 719 044 ; US 5 962 289 ; US 6 060 274 ). Diese Reinigungsweise wurde mit Pflanzen noch nie getestet wegen Befürchtungen, dass das gewünschte Material an die cellulosehaltige pflanzliche Zellwand anhaftet und nicht mehr gereinigt werden kann.
Die oben beschriebenen Ansätze beruhen entweder auf dem Targeting (Einschleusen) eines rekombinanten Proteins in einen Sekretionsweg oder auf der Verwendung von Affinitäts-Tags, wie Cellulose-bindenden Domänen für ein in-vitro-Reinigungsverfahren. Es gibt auch Erfindungen, die das subzelluläre Targeting von cellulolytischen Enzymen für die Cellulaseproduktion und den Celluloseabbau in großem Maßstab beschreiben (WO 9811235) oder für die Erzeugung transgener Pflanzen mit veränderter Struktur oder Morphologie ( US 6 184 440 ). Keines dieser Patente beschäftigt sich mit der Verbesserung des Verfahrens der Proteinreinigung. Stattdessen beschäftigen sie sich mit Problemen der Giftigkeit cellulolytischer Enzyme bei der Herstellung in großem Maßstab und/oder mit deren Verwendung zur Modulierung der Zellwandmorphologie. Diese Technologien beschränken sich auf die Expression von Enzymen, die die Zellwand abbauen oder modifizieren. Für die Produktion solcher Enzyme in Pflanzen ist natürlich eine subzelluläre Lokalisierung bevorzugt. Cellulasen und Enzyme, die die Zellwand modifizieren, stellen jedoch nur einen geringen Anteil an wirtschaftlich wertvollen Proteinen dar. Es gibt keine Technologie für die billige Produktion von rekombinanten Proteinen in Pflanzen und Reinigung in großen Maßstab, die allgemein anwendbar wäre, wie z. B. von zytotoxischen Proteinen.
US 5,474,925 beschreibt eine Methode zum Targeting eines gewünschten rekombinanten Proteins in Baumwollfasern in Baumwolle. Das gewünschte Protein wird auf den Baumwollfasern immobilisiert und wird für industrielle Verfahren im immobilisierten Zustand verwendet.
Ziv & Shoseyov ( US 6,331,416 ; WO 00/77174) beschreiben eine Methode zur Expression eines gewünschten rekombinanten Proteins als Fusionsprotein mit einer Cellulosebindedomaine (cellulose binding domain, CBD), wobei die Bindung der CBD an Cellulose der Zellwand bei der Aufarbeitung zur Affinitätsreinigung des Fusionsproteins verwendet wird. Da das Binden eines Proteins an die Cellulose der Zellwand mit dem Wachstum der Pflanze interferiert und das Wachstum stoppt, kompartimentalisieren die Autoren das Fusionsprotein innerhalb von Zellen, um das Fusionsprotein von der Zellwand abzuschirmen. Die Fusionsproteine werden durch Homogenisieren des pflanzlichen Materials mit der Cellulose der Zellwand in Kontakt gebracht. Diese Methode weist mehrere schwere Nachteile auf, die sie praktisch für Anwendungen im großen Maßstab oder für kommerzielle Anwendungen wie das Molecular Farming unbrauchbar machen:

(i) da das Fusionsprotein während des Wachstums der Pflanze exprimiert wird und in zellulären Kompartiment akkumuliert, leidet die Pflanze während des Wachstums unter einer beträchtlichen Last. Daher verlangsamt sich das Wachstum, und die maximale Größe der Pflanze ist geringer als diejenige von wildtyp Pflanzen, was zu einem Verlust an Biomasse und zu einer begrenzten Menge von erzeugtem rekombinanten Protein führt. Mehr Pflanzen müssten gezogen werden, um dieselbe Biomasse zu erreichen, was zu einem größeren Verbrauch an teurem Gewächshausraum führt, und zu größeren Aufwendungen für das weitere Prozessieren und für die Proteinreinigung.
(ii) Proteine, die für die Pflanze toxisch sind, können nicht exprimieren werden.
(iii) Pflanzen, die ein bestimmtes Fusionsprotein exprimieren, müssen ausgehend von transgenen Samen oder Setzlingen gezogen werden, was im wesentlichen eine vollständige Saison für die Produktion eines gewünschten Proteins benötigt. Der Landwirt kann nicht auf kurzfristige Bestellungen eines bestimmten Proteins reagieren. Daher ist diese Methode extrem unflexibel.

Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in Pflanzen oder Pflanzenzellen bereitzustellen, bei dem eine Beeinträchtigung des Wachstums der Pflanze durch die Expression des Fremdproteins kein Problem darstellt. Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Produktion eines gewünschten Proteins in Pflanzen bereitzustellen, das die Produktion von für die Pflanze toxischen Proteinen erlaubt. Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Produktion eines gewünschten Proteins in Pflanzen oder in Pflanzenzellen bereitzustellen, wobei das Verfahren einfacher als derzeit existierende Technologien ist und einen wirtschaftlichen Weg zur Produktion von Proteinen in Pflanzen darstellt.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins oder Polypeptids in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen gelöst, umfassend:

(i) Transformieren oder Transfizieren einer Pflanze oder von Pflanzenzellen mit einem viralen Vektor, wobei der virale Vektor eine Nucleotidsequenz enthält, die eine kodierende Region aufweist, die für ein Fusionsprotein kodiert, wobei das Fusionsprotein das gewünschte Protein oder Polypeptid, ein Signalpeptid, welches das Fusionsprotein in den Apoplast leiten kann, und ein Polypeptid umfasst, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann,
(ii) Anreichern von Zellwandkomponenten, die exprimiertes und gebundenes Fusionsprotein aufweisen, und
(iii) Abtrennen des gewünschten Proteins oder Polypeptids oder eines Proteins, das das gewünschte Protein oder Polypeptid umfasst, von den Zellwandkomponenten.

Die Erfinder dieser Erfindung haben es geschafft, die Nachteile des Standes der Technik zu bewältigen, indem sie erkannt haben, das die Lebenszeit einer Pflanze, die zur Expression eines gewünschten Proteins verwendet wird, in zwei konzeptionell verschiedene Phasen unterteilt werden kann: (i) das Leben der Pflanze und das Wachstum vor der Transformation oder Transfektion und (ii) das Leben der Pflanze und das Wachstum nach der Transformation oder Transfektion.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine für die Expression des Fusionsproteins verwendete Pflanze vorzugsweise zuerst bis zu einer gewünschten Größe vor der Transformation oder Transfektion herangezogen. Die gewünschte Größe der Pflanze kann eine Größe sein, die für die Expression eines bestimmten Fusionsproteins geeignet ist. Diese Größe ist vorzugsweise nahe der maximalen Größe der Pflanze, d. h. wenn die maximale oder annähernd maximale Biomasse akkumuliert ist. Die Transformation oder Transfektion einer Pflanze, die eine wesentliche Biomasse akkumuliert hat, weist die folgenden Vorteile auf: (a) viele Zellen und/oder eine große Menge von Biomasse der Pflanze ist für die Expression des Fusionsproteins verfügbar; (b) das Binden des Fusionsproteins hat die Zellwand im Apoplast interferiert nicht mit dem Wachstum der Pflanze oder verhindert nicht das erfindungsgemäße Verfahren; (c) die Nucleotidsequenz, die für die Transformation verwendet wird, kann in einem späten Stadium ausgewählt werden, was ein hohes Maß an Flexibilität für den Landwirt bedeutet.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist den wesentliche Vorteile auf, dass das Pflanzenwachstum nicht von der Expression des Fusionsproteins gestört wird. The Pflanzen, insbesondere wildtyp Pflanzen, können bis zu einer gewünschten Größe ohne jegliche Belastung durch die Expression des Fusionsproteins gezogen werden. Da die maximale Menge eines gewünschten Proteins, die erzeugt werden kann, von der Biomasse der Pflanzen abhängt, kann mehr gewünschtes Protein pro Pflanze produziert werden als in Verfahren des Standes der Technik, bei denen das Wachstum der Pflanze durch die Expression eines Fremdproteins und/oder die Akkumulierung eines Fremdproteins in Kompartimenten der Zellen oder der Zellwand behindert wird. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren effizienter, produktiver und billiger als Verfahren des Standes der Technik.
Eine Pflanze, die das Fusionsprotein exprimiert hat, kann zur Durchführung von Schritt (ii) zu jeder gewünschten Zeit geerntet werden. Wie oben beschrieben ist es bevorzugt, eine gewachsene Pflanzen gemäß der Erfindung zu transformieren oder zu transfizieren, da die benötigte Zeit zwischen der Transformation oder der Transfektion und der Ernte der Pflanzen enorm vermindert werden kann. Die Pflanzen werden vorzugsweise bald nach der Transformation oder der Transfektion geerntet. Bevorzugter werden die Pflanzen zwischen einem und sieben Tagen, am bevorzugtesten zwischen zwei und vier Tagen, nach der Transformation oder Transfektion geerntet. Im Gegensatz zum Stand der Technik ist daher eine Störung der Zellwand durch das Binden des Fusionsproteins kein Problem.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt ferner dem Landwirt ein großes Maß an Flexibilität, da die Entscheidung, welches Protein exprimiert (welche Nukleinsäuren transformiert) werden soll, bis zu einer späten Phase in der Entwicklung der Pflanze verschoben werden kann. Wenn ein Landwirt über ausgewachsene Pflanzen verfügt sowie über eine Anzahl an Vektoren, von denen jeder für ein kommerzielles Protein codiert, kann er schnell auf Marktbedürfnisse reagieren und große Menge eines gewünschten Proteins kurzfristig, z. B. innerhalb einer Woche, liefern. Das erfindungsgemäße Verfahren erfüllt daher moderne Marktbedürfnisse wie die just-in-time Produktion. Im Gegensatz dazu benötigen die Verfahren des Standes der Technik eine langfristige Planung hinsichtlich des zu produzierenden Proteins.
Das Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins oder Polypeptids gemäß der Erfindung umfasst die Expression des gewünschten Proteins oder Polypeptids als Fusionsprotein, das aus den Zellen, die das Fusionsprotein exprimieren, mittels eines Signalpeptids sekretiert wird. Im Apoplast bindet das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente durch das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann. So wird die pflanzliche Zellwand oder ihre Komponenten als Affinitätsmatrix für die Reinigung des gewünschten Proteins oder Polypeptids oder eines Proteins, das das gewünschte Protein oder Polypeptid enthält, ausgenutzt.
Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Pflanze oder Pflanzenzellen mit einem viralen Vektor transformiert oder transfiziert, wobei der virale Vektor eine Nucleotidsequenz enthält, die eine Kodierregion, die für das Fusionsprotein kodiert, aufweist. Die Transformation kann stabil transformierte Pflanzen oder Pflanzenzellen, z.B. transgene Pflanzen, hervorbringen. Alternativ kann die Pflanze oder die Pflanzenzellen für eine transiente Expression des Fusionsproteins transfiziert werden.
Mehrere Transformations- oder Transfektionsmethoden für Pflanzen oder Pflanzenzellen sind im Stand der Technik bekannt. Beispiele sind unter anderem die Agrobacterium-vermittelte Transformation, die Partikelbombardierung, die PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten, virale Infektion usw. In der bevorzugten Ausführungsform einer transienten Expression durch entsprechende Transfektion, wird die virale Infektion oder die Agrobacterium-vermittelte Transformation vorzugsweise verwendet.
Die Nucleotidsequenz kann DNA oder RNA sein, je nach der Transformations- oder Transfektionsmethode. In den meisten Fällen wird sie DNA sein. In einer wichtigen Ausführungsform wird die Transformation oder Transfektion jedoch mit Vektoren durchgeführt, die auf RNA-Viren beruhen, so dass in diesem Fall die Nucleotidsequenz RNA ist.
Ein sehr bequemer Weg besteht in der Verwendung eines DNA-Vektors, der auf einem Virus beruht. Vorzugsweise beruht der DNA-Vektor auf einem RNA-Virus, d. h. die DNA-Vektoren enthalten die cDNA von RNA-viralen Sequenzen zusätzlich zu der Nucleotidsequenz. Beispiele für pflanzliche DNA- oder RNA-Viren, die für die erfindungsgemäßen viralen Vektoren verwendet werden können, werden in WO 02/29068 und in PCT/EP02/03476 angegeben. Solche DNA-Vektoren enthalten ferner einen Transkriptionspromotor zur Erzeugung des RNA-viralen Transkripts. In diesen Ausführungsformen wird die Transformation oder Transfektion vorzugsweise durch virale Transfektion, noch bevorzugter über Agrobaceerium-vermittelte Transformation, durchgeführt.
Die Nucleotidsequenz umfasst eine kodierende Region, die für das Fusionsprotein kodiert. Das Fusionsprotein umfasst das gewünschte Protein oder Polypeptid (im folgenden das "gewünschte Protein" genannt). Das gewünschte Protein kann irgendein Protein oder Polypeptid sein, das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt und isoliert werden kann. Es kann in einem ungefalteten, falsch gefalteten oder in einem natürlichen, funktionellen Faltungszustand vorliegen. Letztere Alternative ist bevorzugt. Pharmazeutische Proteine sind besonders bevorzugt.
Das Fusionsprotein umfasst ferner ein Signalpeptid, das das Fusionsprotein in den Apoplast leiten kann. Dies kann mit einem Signalpeptid erreicht werden, das das Fusionsprotein in das endoplasmatische Retikulum (ER) und den sekretorischen Weg einschleust. Alle Signalpeptide von Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie sekretiert oder in den Apoplast geleitet werden, können für die Zwecke dieser Erfindung verwendet werden. Bevorzugte Beispiele sind die Signalpeptide von Calreticulin aus Tabak oder der Reisamylase. Weitere Beispiele sind die Signalpeptide der Pektinmethylesterase oder des tyrosin- und lysinreichen Proteins (tyrosine and lysine rich protein) aus N. tabacco (NtTLPR). Ein weiteres Beispiel ist das Signalpeptid der apoplastischen Isoperoxidase aus Zucchini (APRX) (Carpin et al. 2001, The Plant Cell, 13, 511-520). Das Signalpeptid muss so in dem Fusionsprotein enthalten sein, dass es für das Targeting (Leiten) funktionell ist. Diese Bedingung kann an jeder Stelle des Fusionsproteins erfüllt sein. Im allgemeinen ist das Signalpeptid jedoch am N-Terminus des Fusionsproteins lokalisiert, um das Fusionsprotein in den Apoplasten zu leiten.
Das Fusionsprotein umfasst ferner ein Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann. Über dieses Polypeptid wird ein Großteil des in den Apoplasten sekretierten Fusionsproteins an die Zellwand gebunden oder dort immobilisiert. Das Binden an die Zellwand kann zu irgendeiner Zellwandkomponente stattfinden. Zellwandkomponenten für die Zwecke dieser Erfindung sind unter anderem Polysaccharide wie Cellulose, Hemicellulose, β-1,4-Glycan, Pektin usw. und Nicht-Polysaccharide, wie Proteine oder Lignin. Ein Binden an die Polysaccharidkomponenten der Zellwand ist bevorzugt. Das Binden an Cellulose ist am bevorzugtesten.
Pectin ist ein weiteres wichtiges Polymer der Zellwand, das in allen Landpflanzen vorkommt (Willats et al. 2001, Plant Mol Biol 47, 9-27). Pectin bildet ein komplexes polymeres Netzwerk von Polysacchariden wie Homogalacturonan und Rhamnogalacturonan. Die wichtigste monomere Komponente dieses Netzwerks ist Galacturonsäure und nicht Glucose wie im Falle der Cellulose. Peroxidasen sind bei der Produktion der Zellwand und bei der Kontrolle der Plastizität der Zellwand durch Katalysieren der Vernetzung aromatischer Reste unter Verwendung von Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor involviert. Eine weitere Reaktion, die von Peroxidasen katalysierten wird, ist die Erzeugung kovalenter Bindungen zwischen Hydroxyzimtsäureestergruppen oder Flavonoiden, die mit Pectinen oder Hemicellulosen assoziiert sind. Für viele Peroxidasen wurde eine spezifische Interaktion zwischen dem Zellwandpolymer Homogalacturonan gefunden, die für ihre Aktivität wesentlich zu sein scheint. In einem Beispiel dieser Erfindung haben wir eine Ca²⁺-Pectat Bindungsstelle der apoplastischen Isoperoxidase aus Zucchini (APRX) (Carpin et al. 2001, The Plant Cell, 13, 511-520) verwendet. Diese Bindungsstelle bindet in vivo und in vitro eine Pectinketten durch Vernetzungen, die durch Ca²⁺-Ionen gebildet werden (siehe Beispiele 6 und 7).
Beispiele für Polypeptide, die das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden können, sind Proteine, die eine solche Zellwandkomponente als Substrat verwenden, wie Cellulasen oder Hemicellulasen. Vorzugsweise wird die Substratbindedomäne solcher Enzyme als das Polypeptid verwendet, das an die Zellwandkomponente binden kann. Weitere Beispiele sind Polysaccharid-bindende Domänen (PBD) mikrobieller Herkunft (siehe unten). Ein Beispiel, das hier besonders beschrieben ist, ist Pektinmethylesterase (Beispiele 1 bis 3). In diesen Beispielen wird das Binden an eine Zellwandkomponente im allgemeinen nicht kovalent sein. Alternativ kann das Binden eine kovalente Bindung an eine Zellwandkomponente umfassen (cross-linking). Ein Beispiel hierfür ist NtTLPR, das Disulfidbindungen mit einer Proteinzellwandkomponente ausbilden kann.
In Schritt (ii) des Verfahrens der Erfindung werden Zellwandkomponenten angereichert, die exprimiertes und gebundenes Fusionsprotein aufweisen. Dieser Schritt umfasst das Entfernen vieler Verbindungen, die in Pflanzen enthalten sind, und ergibt eine wesentliche Reinigung des herzustellenden gewünschten Proteins. Während die Sekretion des Fusionsproteins aus der exprimierenden Zelle (Protoplast) das Fusionsprotein, das das gewünschte Protein enthält, von den meisten Verbindungen des Protoplasten räumlich trennt, können diese Protoplasten-verbindungen in diesem Schritt entfernt werden. Im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Präparation von Zellwänden können in Schritt (ii) verwendet werden. Schritt (ii) kann z.B. durchgeführt werden, indem die Pflanze oder die Pflanzenzellen geerntet werden, gefolgt von einer Homogenisierung des Pflanzengewebes, das erfindungsgemäß exprimiertes Fusionsprotein enthält. Die flüssige und die feste Phase des Homogenisats sollten dann getrennt werden, z.B. durch Zentrifugation oder Filtration. Die Zellwandkomponenten können auch durch Auspressen oder Ausdrücken, z.B. zwischen Rollen, angereichert werden. Der feste Rückstand, an den das Fusionsprotein gebunden oder immobilisiert ist, wird dann vorzugsweise mit einem geeigneten Waschpuffer gewaschen, um lösliche Verunreinigungen zu entfernen, wiederum gefolgt von dem Zurückgewinnen des unlöslichen Zellwandmaterials. Die in Schritt (ii) angewandten Bedingungen werden vorzugsweise so gewählt, dass der Faltungszustand der Domäne des gewünschten Proteins in dem Fusionsprotein gewahrt bleibt. Der Waschpuffer ist vorzugsweise wässrig. Jedoch kann auch ein organisches Lösungsmittel je nach dem herzustellenden Protein vorteilhaft sein. Um die Vorteile der Erfindung am besten auszunutzen, sollte die Zellwandkomponente, die das Fusionsprotein trägt, unlöslich bleiben, vorzugsweise zumindest in der frühen Phase des Anreicherns gemäß Schritt (ii). Das Anreichern/die Reinigung kann jedoch auf viele verschiedene Arten durchgeführt werden und kann auch das Abtrennen von Zellwandkomponenten beinhalten.
Im letzten Schritt (iii) der Erfindung wird das gewünschte Protein oder ein Fusionsprotein, das das gewünschte Protein enthält, von der Zellwandkomponente, an die es in Schritt (i) gebunden hat, abgetrennt. Dieses Abtrennen kann auf viele verschiedene Arten durchgeführt werden. In einer Ausführungsform kann das Fusionsprotein von der Zellwand oder der betreffenden Zellwandkomponente abgetrennt werden. (Es wird angemerkt, dass das Fusionsprotein in den meisten Fällen das Signalpeptid infolge des Abspaltens bei der Sekretion des Fusionsproteins nicht mehr enthalten wird.) Die Art und Weise, wie dies durchgeführt werden kann, hängt von den Umständen ab, insbesondere von dem Polypeptid, das zum Binden des Fusionsproteins an die Zellwandkomponente verwendet wurde. Für viele Polypeptide, die an eine Zellwandkomponente binden, sind die Bedingungen, unter denen eine feste oder eine lose Bindung auftritt, bekannt. Alternativ können diese Bedingungen experimentell bestimmt werden. Wenn die Bindung nicht kovalent ist, kann die Bindung z.B. durch Anpassen der Ionenstärke, des pH, der Temperatur oder der Pufferkomponenten (z.B. ein chaotropisches Mittel) unterbrochen oder geschwächt werden (Greenwood et al. (1988), FEBS Lett. 224, 127-131; Shoseyov et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3483-3487). Im Falle einer kovalenten Bindung muss der Typ der kovalenten Bindung in Betracht gezogen werden. Im Falle von NtTLRP als Polypeptid, das an eine Zellwandkomponente binden kann, kann z.B. ein reduzierendes Mittel, das freie -SH-Gruppen enthält, wie z.B. Mercaptoethanol oder Dithiothreitol, zum Spalten von Disulfidbindungen eingesetzt werden.
Vorzugsweise beinhaltet die Abtrennung von Schritt (iii) die Spaltung des Fusionsproteins, so dass das gewünschte Protein frei oder im wesentlichen frei von anderen Proteinkomponenten erhalten wird. Diese Ausführungsform beinhaltet die Spaltung von mindestens einer Peptidbindung. Zu diesem Zweck kann das Fusionsprotein ferner eine Spaltsequenz aufweisen, die die Spaltung des Fusionsproteins erlaubt. Die Spaltsequenz kann ein Peptid sein, das von einer ortsspezifischen Protease erkannt wird. Die Zugabe einer geeigneten Protease kann dann zum Herausschneiden des gewünschten Proteins aus dem Fusionsprotein führen, das noch immer an eine Zellwandkomponente gebunden ist. Das Entfernen der verbleibenden Zellwandkomponenten führt dann zum Erhalt des gewünschten Proteins frei von der Mehrzahl des Pflanzenmaterials. Als Spaltsequenz/Proteasesysteme können diejenigen verwendet werden, die üblicherweise zum Entfernen von Affinitäts-Tags von affinitätsgereinigten Proteinen verwendet werden. Solche Systeme sind kommerziell erhältlich, z.B. von Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden. Ein spezifisches Beispiel, das häufig zum Entfernen eines His-Tags eingesetzt wird, ist das Faktor-Xa-System. In einer anderen Ausführungsform kann Ubiquitin als Bestandteil des Fusionsproteins verwendet werden, und das Spalten kann mit einer Ubiquitin-spezifischen Hydrolase erreicht werden. Die Spaltsequenz kann auch autokatalytisch sein, wobei das Spalten durch Bereitstellen geeigneter Bedingungen für das Spalten erreicht wird. Das so erhaltene gewünschte Protein kann aufkonzentriert werden. Je nach Sitation kann das gewünschte Protein weiter gereinigt werden.
Die Konstruktion der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz kann nach Standardverfahren der Molekularbiologie durchgeführt werden. Die Nucleotidsequenz enthält vorzugsweise einen pflanzenspezifischen Promotor, der operationell mit der Kodiersequenz verbunden ist, und einen Transkriptionsterminator hinter der Kodierregion. Gewebsspezifische Expression des Fusionsproteins kann, wenn gewünscht, durch geeignete Wahl des Promotors erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Vektoren auf der Basis von Viren zur Durchführung dieser Erfindung verwendet. Die Konstruktion solcher Vektoren ist in den Referenzbeispielen beschrieben.
Weitere Informationen hinsichtlich praktischer Aspekte der Schritte (ii) und (iii) der Erfindung können in WO 00/77174 und darin zitierten Referenzen gefunden werden.
Die Nucleotidsequenz enthält eine Kodierregion, die für das Fusionsprotein kodiert. Die Komponenten des Fusionsproteins können in verschiedenen Reihenfolgen angeordnet sein. Das Signalpeptid wird jedoch vorzugsweise an das N-terminale Ende des Fusionsproteins gesetzt, damit es für das Targeting (Leiten) funktionell ist. Das gewünschte Protein wird vorzugsweise an den C-Terminus des Fusionsproteins gesetzt, was seine Abtrennung vom Rest des Fusionsproteins über eine einzige Spaltung einer Peptidbindung erlaubt. Das Polypeptid, das an eine Zellwandkomponente binden kann, liegt dann zwischen dem Signalpeptid und dem gewünschten Protein. Andere Anordnungen sind jedoch auch von dieser Erfindung umfasst, z.B. das Setzen des Polypeptids, das an eine Zellwandkomponente binden kann, an den C-Terminus des Fusionsproteins. Weiterhin kann das gewünschte Protein auf beiden Seiten von einem Polypeptid, das an eine Zellwandkomponente binden kann, flankiert werden, wobei diese Polypeptide die gleichen oder verschieden sein können. Das gewünschte Protein kann dann durch zwei proteolytische Schnitte herausgeschnitten werden. Vorzugsweise benutzen diese beiden proteolytischen Schnitte die gleiche Spaltsequenz. Das gewünschte Protein kann ferner in einem Intein enthalten sein, um die Isolierung zu vereinfachen.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins oder Polypeptids in einer Pflanze bereit, umfassend:

(ia) Wachsenlassen einer Pflanze bis zu einem gewünschten Zustand;
(ib) transientes Transformieren oder Transfizieren der Pflanze von Schritt (ia) oder von Zellen derselben mit einem viralen Vektor, wobei der virale Vektor eine Nukleotidsequenz enthält, die eine kodierende Region aufweist, die für ein Fusionsprotein kodiert, wobei das Fusionsprotein das gewünschte Protein oder Polypeptid, ein Signalpeptid, welches das Fusionsprotein in den Apoplast leiten kann, und ein Polypeptid umfasst, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann,
(ii) Anreichern von Zellwandkomponenten, die exprimiertes und gebundenes Fusionsprotein aufweisen, und
(iii) Abtrennen des gewünschten Proteins oder Polypeptids oder eines Proteins, das das gewünschte Protein oder Polypeptid umfasst, von den Zellwandkomponenten.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins oder Polypeptids in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen bereit, umfassend

(i) Transformieren oder Transfizieren von einer Pflanze oder von Pflanzenzellen mit einem viralen Vektor, wobei der virale Vektor eine Nukleotidsequenz enthält, die eine kodierende Region aufweist, die für ein Fusionsprotein kodiert, wobei das Fusionsprotein das gewünschte Protein oder Polypeptid, ein Signalpeptid, welches das Fusionsprotein in den Apoplast leiten kann, und ein Polypeptid umfasst, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann,
(ii) Anreichern von Zellwandkomponenten, die exprimiertes und gebundenes Fusionsprotein aufweisen, und
(iii) Abtrennen des gewünschten Proteins oder Polypeptids oder eines Proteins, das das gewünschte Protein oder Polypeptid umfasst,

Noch bevorzugter wird die Pflanze oder Zellen derselben mit mindestens zwei Vorläufervektoren versehen. Alternativ wird die Pflanzenzelle infolge der Prozessierung mit mindestens zwei Replikons ausgestattet, die

(a) infolge der Prozessierung miteinander strukturell verwandt sind,
(b) funktionell voneinander verschieden sind, und
(c) die Amplifizierung oder Expression erlauben.

Die Ausführungsformen mit Vorläufervektoren werden unten weitergehend beschrieben und sind in Beispielen 6 und 7 exemplifiziert.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt ein allgemeines Schema zur Herstellung eines rekombinanten Proteins in Pflanzenzellen gemäß der Erfindung.

A – Einführung eines Transgens in eine Pflanzenzelle über verschiedene Methoden (virale Vektoren-RNA- oder DNA-Viren; stabile Kern- oder Plastiden-Transformation; transiente Agrobacterium-vermittelte Expression – "Agroinfiltration");
B – Rekombinante Proteinsynthese und Anhaften an die Zellwand;
C – Anreichern des Pflanzengewebes durch Auspressen des Cytosols;
D – Abtrennen des rekombinanten Proteins von dem Pflanzengewebe.

2 zeigt die cDNA-Sequenz des Pektinmethylesterase(PME)-Gens voller Länge aus Tabak. Die Translationsstart- und -stoppkodons sind fett gezeigt.
3 zeigt ein Alignment der abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen der PME-Gene aus Tabak (Zugriffsnr. AJ401158), Tomate (Zugriffsnr. U49330) und Orange (Zugriffsnr. U82976). Das Alignment der abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen wurde mit dem Genebee-Programmpaket durchgeführt. Der Pfeil deutet den N-Termins eines prozessierten PME-Proteins an. Die Transmembran-Helix (schwarze Box) und die PME-Signaturen 1 und 2 sind eingerahmt.
4 zeigt Klonierschemata für verschiedene Versionen von PME-GFP-Fusionen:

(A) Klonierschema für die Vektoren pIC2452 (Gesamt-PME-GFP) und pIC2462 (reifes PME);
(B) Klonierschema für die Vektoren pIC2472 (GFP-Gesamt-PME) und pIC2482 (GFP-reifes PME).

5 zeigt in vitro RRL(Kaninchen-Reticulozytenlysat)-Translation vier verschiedener GFP-Fusionen mit dem PME-Gen. Spur 1: pIC2482, Spur 2: pIC2452, Spur 3: pIC2472 und Spur 4: pIC2462.
6 zeigt das Klonierschema verschiedener GFP-PME-Fusionen in einer pflanzlichen Expressionskassette für transiente Expressionsexperimente.
7 zeigt N. benthamiana-Zellen, die GFP exprimieren (helle Regionen), das in die Zellwand geleitet wurde nach der Bombardierung mit einer Gesamt-PME-GFP-Fusion unter der Kontrolle des 35S-Promotors.
8 zeigt die T-DNA-Region eines binären Vektors, der die flPME-GFP-Fusion trägt.
9 zeigt eine T-DNA-Region eines binären Vektors, der die NtTLPR-GFP-Fusion trägt.
10 zeigt eine T-DNA-Region eines binären Vektors, der die NtTLPRubq-GFP-Fusion trägt.
11 zeigt einen crTMV-Vektor, der die NtTLPR-GFP-Fusion trägt.
12 zeigt die Vektoren T7/crTMV und SP6/crTMV.
13 zeigt die Vektoren T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS, T7/crTMV/IRES_MP,75 ^UI-GUS, T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS, T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS, T7/crTMV/SPACER_CP,148 ^UI-GUS und T7/crTMV/PL-GUS.
14 zeigt Vektoren pICH8600-C uhd pIC9666-C. IRESmp75^CR steht für die interne Ribosomeneingansstelle des Movement Proteins eines crucifereninfizierenden Tobamovirus; siehe WO 02/29068 für Details.
15 zeigt die T-DNA-basierten Vektoren pICH4851, der das 5'-Ende des viralen Provektor-Systems bereitstellt, und pICP1010, der die ortsspezifische Rekombinase PhiC31 bereitstellt, die eine Rekombination zwischen den attP (pICH4851) und attB (pICH9666-C, 14) vermittelt. Das Klonieren dieser Vektoren ist in PCT/EP02/03476 beschrieben.
16 zeigt die Vektoren pICH9666-RIA und pICH9666-RI, die zur Expression der Restriktionsendonuklease EcoRI vorgesehen sind.
17 zeigt die Struktur eines Vorläufervektors auf PVX Basis, seine Generierung durch Transkription von pIC3242, um vollständige Form des Transkripts zu erhalten, und sein Spleißprodukt. Die Expression kann vom Transkript (Vorläufervektor und Replicon) und vom gespleißten Transkript aus geschehen.
18 zeigt grundlegende Konstrukte und die Klonierstrategie für das Klonieren der cDNA eines Vorläufervektors auf PVX Basis.
19 zeigt ein Schema für die Expression zweier Gene (CP and GFP) unter Verwendung eines spleißbaren Vorläufervektors (Provektor) auf CrTMV Basis.
20 zeigt die Klonierstrategie für das Zwischenkonstrukt pIC3342.
21 zeigt die Klonierstrategie für die Zwischenkonstrukte pIC3378 and pIC3382.
22 zeigt die letzten Schritte der Klonierung des Plasmids pIC3393.
23 zeigt ein allgemeines Schema der Expression mehrerer Gene über Vorläufervektoren auf CrTMV Basis (a-c und der oben gezeigte Vektor) und die Generierung von Replicons (A-C) durch ortsspezifische Rekombination an LoxP-Stellen katalysiert durch Cre-Rekombinase.
24 zeigt das Klonierschema von Konstrukt pIC3461 – eine primäre Komponente eines Rekombinationssystems.
25 zeigt das Klonierschema von Konstrukt pIC3441 – eine der sekundären Komponenten eines Rekombinationssystems.
26 zeigt das Klonierschema von Konstrukt pIC3491 – eine der sekundären Komponenten eines Rekombinationssystems.
27 zeigt das Klonierschema von Konstrukt pIC3521 – eine der sekundären Komponenten eines Rekombinationssystems.
28 zeigt das Grundprinzip der Transgenexpression über einen nichtansteckenden viralen Vektor.
29 zeigt die Struktur von Plasmid pIC1593 zur Einführung des CreRecombinase Gens in das Genom von N. benthamiana.
30 zeigt schematisch die Expression mehrerer Gene über CrTMV-basierte Vorläufervektoren (a-c und der oben gezeigte Vektor) sowie die Bildung von Replikons (A-C) unter Verwendung des Integrase/att-Systems zur ortsspezifischen Rekombination. Die Vorläufervektoren werden in binäre Vektoren mit T-DNA-Enden (LB für left border, RB für right border) kloniert.
31 zeigt schamatisch die Klonierung von Konstrukt pICH4851, das eine der sekundären Komponenten des Rekombinationssystem darstellt.
32 zeigt schamatisch die Klonierung von Konstrukt pICH5151, das eine der sekundären Komponenten des Rekombinationssystem darstellt.
33 zeigt schamatisch die Klonierung von Konstrukt pICH5161, das eine der sekundären Komponenten des Rekombinationssystem darstellt.
34 zeigt schamatisch die Klonierung von Konstrukt pICH5951, das eine der sekundären Komponenten des Rekombinationssystem darstellt.
35 zeigt schamatisch die Klonierung der Konstrukte pICH6871 und pICH6891, zwei der sekundären Komponenten des Rekombinationssystem.
36 zeigt schamatisch die Klonierung von Konstrukt pICH4371, das eine der sekundären Komponenten des Rekombinationssystem darstellt.
37 zeigt schamatisch die Klonierung von Plasmid pICH4461, das eine der sekundären Komponenten des Rekombinationssystem darstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das allgemeine Prinzip der Erfindung ist in 1 gezeigt. Ein Gen, das für ein Fusionsprotein mit einem sekretorischen Signalpeptid und eine Zellwand-bindenden Domäne kodiert, wird in eine Pflanzenzelle eingebracht, vorzugsweise mit einem DNA- oder einem RNA-Vektor. Das rekombinante Protein wird exprimiert, in den intrazellulären Raum (Apoplast) geleitet infolge der Gegenwart eines Sekretionssignalpeptids und über seine Zellwand-bindende Domäne an die Zellwand gebunden. Pflanzen, die dieses Fusionsprotein enthalten, werden dann prozessiert (Auspressen oder Homogenisieren), um die Zellwandmatrix von dem Zellinhalt zu trennen. Die Zellwandmatrix wird dann auf eine Art und Weise behandelt, die die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Matrix erlaubt.
Es gibt verschiedene Methoden, um einen DNA- oder RNA-Vektor in eine Pflanzenzelle einzuführen, darunter das direkte Einführen des Vektors in eine Pflanzenzelle mittels Mikroprojektilbombardierung, Elektroporation oder PEG-vermittelter Behandlung von Protoplasten (für eine Übersicht siehe: Gelvin, S.B.., 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; Hansen & Wright, 1999, Trends Plant Sci., 4, 226-231). Pflanzliche RNA- und DNA-Viren stellen weitere effiziente Systeme dar (Hayes et al., 1988, Nature, 334, 179-182; Palmer et al., 1999, Arch. Virol., 144, 1345-1360; Lindbo et al., 2001, Curr. Opin. Plant. Biol., 4, 181-185). Diese Vektoren können ein Transgen entweder stabil in das Genom/Plastom einer Pflanze integrieren (direkte oder Agrobacterium-vermittelte DNA-Integration) oder für die transiente Expression des Transgens ("Agroinfiltration").
Die Nukleinsäure, die die für das gewünschte Protein kodierende Kodierregion mit einem sekretorischen Signalpeptid und einer Zellwandbindungsdomäne aufweist, kann auf viele verschiedene Arten entworfen werden. Üblicherweise ist das Signalpeptid am N-terminalen Ende des Fusionsproteins lokalisiert. Die Zellwand-bindenden Domänen können das Signalpeptid mit dem gewünschten Protein verknüpfen oder können am C-terminalen Ende des Fusionsproteins lokalisiert werden. Ferner können zwei Zellwand-bindende Domänen das gewünschte Protein umschließen. In einer Ausführungsform dieser Erfindung wurde das vollständige Pektinmethylesterase-Gen aus Tabak (PME cDNA, siehe 2; PME-Proteinvorläufer, siehe 3) mit dem Gen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als gewünschtes Protein verknüpft. Pektinmethylesterase (PME) (Gaffe et al., 1997, Plant Physiol., 114, 1547-1556; Dorokhov et al., 1999, FEBS Lett., 461, 223-228) ist ein sekretorisches Protein, das im endoplasmatischen Reticulum (ER) und in der Zellwand detektiert werden kann. Die Mitglieder der PME-Multigen-Familie, die posttranslational prozessiert werden (Gaffe et al., 1997, Plant Physiol., 114, 1547-1556), sind beim Zellwand-Turnover beteiligt und scheinen beim Pflanzenwachstum und der – entwicklung beteiligt zu sein (Wen et al., 1999, Plant Cell, 11, 1129-1140). PME ist ein ubiquitäres Enzym im Pflanzenreich und reguliert den Zellwandabbau, indem es die Demethoxylierung von Pektinen katalysiert. Reifes 33 kDa-PME ist in der Zellwand lokalisiert, während der PME-Vorläufer als 70 kDa-Polyprotein synthetisiert wird. Es ist offensichtlich, dass die Prozessierung von PME und die Weiterleitung zur Zellwand vom Entfernen der N-terminalen Leader-Sequenz begleitet ist, während das Verankern von PME in der Zellwand die spezifische Pektinbindungsdomäne benötigt.
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung (siehe Beispiele 4 und 5) wurde als Fusion mit dem gewünschten Protein das kleine Zellwandprotein NtTLPR (106 Aminosäurereste) aus Tabak verwendet, das eine Peptidsignalsequenz und eine Cysteindomäne (CD) enthält. Die CD ist beim Crosslinking des Proteins mit der Zellwand beteiligt (Domingo et al., 1999, Plant J., 20, 563-570).
Das erfindungsgemäße Fusionsprotein oder das gewünschte Protein oder Polypeptid kann ferner einen Affinitätspeptidtag (Affinitätspeptidmarkierung) aufweisen. Der Affinitätspeptidtag kann einer aus der folgenden Gruppe sein: ein Oleosinprotein oder ein Teil desselben, ein Intein oder ein Teil desselben, eine weitere Zellwandbindedomäne, ein Stärke bindendes Protein, ein Streptavidinepitopmarkierungssequenz, Gluthathion-S-Transferase (GST)-Affinitätsmarkierung, ein 6 × His-Affinitätsmarkierung, ein Calmodulinbindepeptid (CBP)-Affinitätsmarkierung. Wenn der Affinitätspeptidtag eine weitere Zellwandbindedomäne ist, kann sie dazu benutzt werden, die Affinität und/oder Wahrscheinlichkeit einer Bindung des Fusionsproteins an die Zellwand zu erhöhen. Wenn mehr als ein Polypeptid verwendet wird, das an die Zellwand binden kann, können sie an dieselbe oder an verschiedene Komponenten der Zellwand binden. Affinitätspeptidtags können verwendet werden, um das Fusionsprotein oder das gewünschte Protein mit nützlichen Eigenschaften zu versehen, wie z. B. für die (Affinitäts-) Reinigung oder für das gewünschte Protein.
Das gewünschte Protein kann mit einer Signalsequenz und Zellwand-bindenden Domänen von verschiedenen Genen, sogar von verschiedenen Organismen verknüpft werden, z.B. kann ein ER-Signalpeptid pflanzlichen Ursprungs (z.B. Tabak-Calreticulin-Signalpeptid) und eine Polysaccharidbindungsdomäne (PBD) bakteriellen Ursprungs verwendet werden. Einige Pflanzenpathogene (Bakterien und Pilze) können Polysaccharide wie Cellulose, Pektin, Xylan, und mehrere andere Kohlenstoffquellen für ihr Wachstum verwenden und synthetisieren Enzyme, die PBDs enthalten. Die Cellulosebindungsdomänen dieser Enzyme sind gut charakterisiert und finden weite Verwendung zur Proteinreinigung auf einer Cellulosematrix. Die Affinität einer bestimmten Cellulose- oder Polysaccharidbindungsdomäne für eine bestimmte Zellwandkomponente hängt von der fraglichen Domäne ab. Elutionsbedingungen für ein bestimmtes Fusionsprotein mit einer bestimmten CBD oder PBD werden vorzugsweise experimentell bestimmt. CBD zur Verwendung in dieser Erfindung sind z.B. die in US 6 174 700 genannten.
In Anbetracht der Tatsache, dass die Herstellung eines Proteins gemäß dieser Erfindung die Fusion des gewünschten Proteins mit einem Signalpeptid und einer oder mehrere Zellwand-bindenden Domänen beinhaltet, kann die präzise Abtrennung des gewünschten Proteins aus dem Fusionsprotein ein wichtiger Punkt sein. Vektoren, die proteolytische Stellen auf beiden Seiten der gewünschten kodierenden Sequenz enthalten, erlauben die Spaltung des Fusionsproteins und die Freisetzung des gewünschten Proteins in reiner Form, wenn die Bedingungen für eine solche proteolytische Spaltung gegeben sind. Eine solche Spaltung ist besonders vorteilhaft, wenn die Zellwandbindedomaine des Fusionsproteins eine starke Bindung zeigt und das Fusionsprotein schlecht von der Zellwandmatrix wiedergewonnen werden kann. Dies wurde mit der Zellwandbindedomaine des NtTLPR Proteins beobachtet.
Die Spaltung eines Translationsfusionsproteins kann über eine Peptidsequenz erreicht werden, die von einer viralen ortsspezifischen Protease erkannt wird oder mittels eines katalytischen Peptids (Dolja et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10208-10212; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; US 5 162 601 , US 5 766 885 , US 5 491 076 ). Weitere Beispiele für ortsspezifische Proteasen, die für diese Erfindung verwendet werden können, sind Enterokinasen aus Säugern, wie z.B. die leichte Kette der menschlichen Enterokinase, die die Sequenz DDDK-I erkennt (Kitamoto et al., 1994, Proc. Natl. Acad: Sci., 91, 7588-7592) und spezifisch Lys-Ile-Bindungen spaltet; virale Proteasen, wie z.B. Hc-Pro (Camngton JC & Herndon KL, 1992, Virology, 187, 308-315), die die Proteolyse in dem Gly-Gly- Dipeptid katalysiert, jedoch 4 Aminosäuren für die Erkennung der Spaltstelle benötigt; ortsspezifische Proteasen des Semliki-Forest-Virus (Vasiljeva et al., 2001, J. Biol. Chem., 276, 30786-30793); und bei der Prozessierung von Polyubiquitin beteiligte Proteasen, Ubiquitin-carboxyterminale Hydrolasen (Osava et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., 283, 627-633).
Ubiquitin-spezifische Proteasen eröffnen eine weitere Möglichkeit. Die Expression von Proteinen und Polypeptiden als Fusion mit Ubiquitin hat den weiteren Vorteil, dass das Expressionsniveau häufig stark ansteigt sowie die Möglichkeit, durch Ubiquitin-Spaltung jeden gewünschten aminoterminalen Rest zu erhalten. Klonierte Ubiquitin-spaltende Enzyme sind seit kurzem erhältlich, was diese Technik sowohl für bakterielle als auch für eukaryotische Wirtssysteme gefördert hat (für eine Übersicht siehe Baker, R.T., 1996, Curr. Opin. Biotech., 7, 541-546). Expressionssysteme mit Ubiquitin-Fusionen sind bereits für Pflanzen ( US 5 773 705 ), Hefen ( US 6 068 994 ) und Bakterien ( US 545 905 ) beschrieben worden. In einer Ausführungsform dieser Erfindung wird das Ubiquitinpolypeptid zwischen das N-terminale NtTLPR-Protein und das GFP-Gen inseriert (10, Beispiel 4). Dies erlaubt es, jedes gewünschte Protein mit einem natürlich vorkommenden N-Terminus nach der Spaltung des Ubiquitin-Moleküls mit einer Ubiquitin-spezifischen Protease zu erhalten. Die Genauigkeit einer solchen Spaltung hängt nicht von der N-terminalen Aminosäure-Sequenz des gewünschten Proteins ab.
Das gewünschte Gen kann in Pflanzen oder Pflanzenzellen mit Hilfe von viralen Vektoren eingeführt werden. Ein solcher Ansatz hat den offensichtlichen Vorteil im Vergleich mit der konstitutiven Expression eines Transgens in stabil transformierten Pflanzen, dass wesentlich höhere Expressionslevel erhalten werden können, sowie die Unabhängigkeit von cytotoxischen Effekten, die von großen Mengen transgenen Produkts hervorgerufen werden können. Ein virales System für diese Erfindung ist in Beispielen 5 (11) und 6 (14 bis 16) beschrieben. Die NtTLPR-GFP-Fusion wird in einen crTMV-Expressionsvektor inseriert. Die Fusion aus der EcoRI Endonuclease und der Ca²⁺-Pectat Bindungsstelle, die in den Apoplast geleitet werden soll, wird in das 3'-Ende eines TMV-basierten Provektors inseriert (Beispiel 6). Die Verwendung dieses Systems in Pflanzen wird in den Referenzbeispielen 1 bis 3 und in WO 02/29068 beschrieben.
Gewünschte Proteine oder deren Fragmente, die gemäß dieser Erfindung exprimiert und isoliert werden können, sind unter anderem: Stärke-modifizierende Enzyme (Stärke-Synthase, Stärke-phosphorylierendes Enzym, Debranching-Enzym, Stärke- verzweigendes Enzym, Stärke-verzweigendes Enzym II, granuläre (granule bound) Stärke-Synthase), Sucrosephosphat-Synthase, Sucrose-Phosphorylase, Polygalacturonase, Polyfructan-Sucrase, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, Cyclodextrin-Glycosyltransferase, Fructosyl-Transferase, Glycogen-Synthase, Pectin-Esterase, Aprotinin, Avidin, Bacterielle Levansucrase, Ecoli glgA Protein, MAPK4 und Orthologe, Stickstoff-Assimilierungs/Methabolismus-Enzyme, Glutamin-Synthase, pflanzliches Osmotin, 2S Albumin, Thaumatin, ortspezifische Recombinasen/Integrasen (FLP, Cre, R-Recombinase, Int, SSVI Integrase R, Integrase phiC31, (oder ein aktives Fragment oder Variante derselben), Isopentenyl-Transferase, Sca M5 (Sojabohnen-Calmodulin), Coleopteran-artige Toxine oder ein insektizidaktives Fragment, Fusionsproteine des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms (E2), Enzyme die Lipide, Aminosäuren, Zucker, Nukleinsäuren und Polysaccharide metabolisieren, Superoxide-Dismutase, inaktives Proenzym einer Protease, pflanzliche Proteintoxine, Merkmale die in faserproduzierenden Pflanzen Fasern verändern, gegen Coleoptera-aktives Toxin von Bacillus thuringiensis (Bt2 Toxin, insektizides Kristallprotein (ICP), CryIC Toxin, Delta-Endotoxin, Polyopeptidtoxin, Protoxin etc.), insektenspezifisches Toxin AaIT, Cellulose-abbauende Enzyme, E1 Cellulase von Acidothermus celluloticus, Lignin-modifizierende Enzyme, Cinnamoylalkohol-Dehydrogenase, Trehalose-6-phosphat-Synthase, Enzyme des Cytokinin-Wegs, HMG-CoA Reductase, E. coli anorganische Pyrophosphatase, Samenlagerungsprotein (seed storage protein), Erwinia herbicola Lycopen-Synthase, ACC Oxidase, pTOM36 kodiertes Protein, Phytase, Ketohydrolase, Acetoacetyl-CoA-Reductase, PHB (Polyhydroxybutanoat)-Synthase, Acylcamer-protein, Napin, EA9, Phytoen-Synthase aus nichthöheren Pflanzen, pTOM5-kodiertes Protein, ETR (Ethylen-Rezeptor), plastidäre Pyruvat-Phosphat-Dikinase, Nematoden-induzierbares Transmembranporenprotein, merkmalsfördernde photosynthetische oder plastidäre Funktion der Pflanzenzelle, Stilben-Synthase, Enzyme, die Phenole hydroxylieren können, Catechol-Dioxygenase, Catechol-2,3-Dioxygenase, Chloromuconat-Cycloisomerase, Anthranilat-Synthase, Brassica AGL15 Protein, Fructose-1,6-Biphosphatase (FBPase), AMV RNA3, PVY Replicase, PLRV Replikase, Potyvirus-Hüllprotein, CMV-Hüllprotein, TMV-Hüllprotein, Luteovirus Replicase, MDMV messenger RNA, mutierte geminivirale Replicase, Umbellularia californica C12:0-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase, pflanzliche C10 or C12:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase, C14:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase (luxD), pflanzlicher Synthasefaktor A, pflanzlicher Synthasefaktor B, Δ6-Desaturase, ein Protein mit einer enzymatischen Aktivität in der peroxysomalen β-Oxidation von Fettsäuren in Pflanzenzellen, Acyl-CoA-Oxidase, 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase, Lipase, Acetyl-CoA-Carboxylase aus Mais, 5-Enolpyruvylschikimat-3-Phosphat-Synthase (EPSP), Phosphinothricin-Acetyl-Transferase (BAR, PAT), CP4 Protein, ACC-Deaminase, Proteine mit posttranslationaen Spaltstellen, DHPS Gen, das Sulfonamid-Resistenz verleiht, bakterielle Nitrilase, 2,4-D Monooxygenase, Acetolactat-Synthase oder Acetohydroxysäure-Synthase (ALS, AHAS), Polygalacturonase, Taq Polymerase, bakterielle Nitrilase, viele andere Enzyme von Bakterien oder Phagen einschließlich von Restriktionsendonukleasen, Methylasen, DNA- oder RNA-Ligasen, DNA und RNA Polymerasen, Reverse-Transkriptasen, Nucleasen (DNasen und RNasen), Phosphatasen, Transferasen usw.
Unsere Erfindung kann ebenso für die Zwecke des Molecular Farming und die Reinigung kommerziell wertvoller und pharmazeutisch wichtiger Proteine einschließlich von industriellen Enzymen (Cellulasen, Lipasen, Proteasen, Phytase usw.) eingesetzt werden. Irgendein humanes oder tierisches Protein kann gemäß der Erfindung exprimiert und gereinigt werden. Beispiele für solche Proteine sind unter anderem Proteine der Immun-Antwort (monoklonale Antikörper, Einzelketten-Antikörper, T-Zell-Rezeptoren usw.), Antigene, Kolonie-stimulierende Faktoren, Relaxine, Polypeptid-Hormone wie Somatotropin (HGH) und Proinsulin, Cytokine und deren Rezeptoren, Interferone, Wachstumsfaktoren und Koagulationsfaktoren, enzymatisch aktives lysosomales Enzym, fibrinolytische Polypeptide, Blutgerinnungsfaktoren, Trypsinogen, Alphal-Antitrypsin (AAT), humanes Serumalbumin, natives Cholera-Toxin B, sowie funktionskonservative Proteine wie Fusionen, Mutantenversionen und synthetische Derivate der oben genannten Proteine.
Wirtspflanzen zur Ausführung dieser Erfindung können Monokotyledonen oder Dikotyledonen sein. Die am bevorzugtesten Pflanzen sind unter anderem Nicotiana-Arten einschließlich N. Tabacum, Brassica-Arten einschließlich Canola, Kartoffel, Mais, Weizen, Hafter, Reis, Zuckerrüben, Sojabohnen, Pennisetum, Baumwolle, Alfa-alfa, Sonnenblumen, Flachs, Erbsen, Karotten, Gurken, Tomaten usw. sein. Jede Pflanzenart mit einem etablierten Transformations- und/oder Transfektionsprotokoll kann für die Erfindung eingesetzt werden.
Erzeugung eines gewünschten Proteins oder Polypeptids unter Verwendung von Vorläufervektoren (Provektor-System)
Diese Erfindung kann mit anderen Verfahren zum Engineering von Pflanzen kombiniert werden. Ein bevorzugtes Beispiel eines solchen Verfahrens ist das Provektor-System (WO 02/088369). Beispiele 6 und 7 zeigen die Kombination dieser Erfindung mit Vorläufervektoren (Provektoren). Verfahren zum Bewirken der Amplifikation und/oder der Expression einer oder mehrerer gewünschter Nucleinsäuresequenzen in einer Pflanze unter Verwendung von Vorläufervektoren, welche mit dieser Erfindung kombiniert werden können, werden als nächstes beschrieben.
Verfahren zum Bewirken der Amplifikation und/oder der Expression einer oder mehrerer gewünschter Nucleinsäuresequenzen in einer Pflanze, Pflanzengewebe, Pflanzenzell oder Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, dass eine Pflanzenzelle mit mindestens einem Vorläufervektor versehen wird, der so entworfen ist, dass er in der Zelle prozessiert wird, wobei die Pflanzenzelle infolge der Prozessierung mit mindestens einem Replikon ausgestattet wird, das die Amplifikation und/oder Replikation bewirkt, wobei das mindestens eine Replikon vorzugsweise strukturell mit jedem des mindestens einen Vorläufervektors infolge des Prozessierens verwandt ist.
Verfahren zum Bewirken der Amplifikation und/oder der Expression einer oder mehrerer gewünschter Nucleinsäuresequenzen in einer Pflanze, Pflanzengewebe, Pflanzenzell oder Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, dass eine Pflanzenzelle mit mindestens einem Vorläufervektor versehen wird, der so entworfen ist, dass er in der Zelle prozessiert wird, wobei die Pflanzenzelle infolge der Prozessierung mit mindestens zwei Replikons ausgestattet wird, die

Verfahren zum Bewirken der Amplifikation und/oder der Expression einer oder mehrerer gewünschter Nucleinsäuresequenzen in einer Pflanze, Pflanzengewebe, Pflanzenzell oder Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, dass eine Pflanzenzelle mit mindestens zwei Vorläufervektoren versehen wird, die so entworfen sind, dass sie vorzugsweise durch ortsspezifische Rekombination in der Zelle prozessiert werden, wobei die Pflanzenzelle infolge der Prozessierung mit mindestens einem Replikon ausgestattet wird, das die Amplifikation und/oder Replikation bewirkt. Vorzugsweise ist das mindestens eine Replikon strukturell mit jedem der mindestens zwei Vorläufervektoren infolge des Prozessierens verwandt.
Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung eines biochemischen Produktes, ein Verfahren zur Ermittlung einer Genfunktion, und ein Verfahren zur künstlichen oder dirigierten Evolution (directed evolution) beschrieben, wobei jedes dieser Verfahren eines der oben beschriebenen Verfahren zur Bewirkung der Amplifikation und/oder Expression umfasst.
Außerdem werden Vektoren oder Vorläufervektoren und virales Material für das Verfahren bereitgestellt, sowie virales Material, Replikons und pflanzliches Material, das durch das Verfahren erhältlich ist oder erhalten wird. Virales Material umfasst Nukleinsäuren, die zur Replikation in einer Pflanzenzelle befähigt sind. Es umfasst infektiöse DNA oder RNA. Virales Material kann nackt sein oder mit einem Hüllprotein umhüllt.
Ferner wird ein Kit bereitgestellt, umfassend (i) Pflanzellen, Samen oder Pflanzen und (ii) die genannten Vektoren, Vorläufervektoren, virales Material, oder Replikons. Ein weiterer Kit wird bereitgestellt, umfassend (i) Pflanzenzellen, Samen oder Pflanzen und (ii) Agrobakterium Zellen, die die genannten Vektoren, Vorläufervektoren, virales Material oder Replikons enthalten.
Das Provektor-Verfahren bewirkt die Amplifikation und/oder die Expression einer oder mehrerer gewünschter Nucleinsäuresequenzen in einer Pflanzenzelle, in Pflanzengewebe, in einer Pflanze oder in Zellkultur. Amplifikation bezeichnet die Produktion von DNA oder RNA (z.B. für Anti-Sense-Technologie). Expression bezeichnet die Bildung eines Polypeptids oder Proteins. In beiden Fällen kann das eigentliche Ziel ein biochemisches Produkt sein, dessen Herstellung die Amplifikation dieser DNA oder RNA und/oder die Expression eines Polypeptids oder Proteins voraussetzt.
Das Provektor-Verfahren kann also in einer Pflanze, in Pflanzengewebe, in einer Pflanzenzelle oder in Zellkultur durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das Verfahren in Pflanzenzellen durchgeführt. Am geeignetsten wird das Verfahren in einer Pflanze durchgeführt.
Das Versehen einer Pflanzenzelle mit einem Vorläufervektor kann virale Transfektion, Agrobacterium-vermittelte Transformation, nicht-biologische Transformation beinhalten oder die Umwandlung der DNA eines Prävorläufervektors, die zuvor in die pflanzliche Kern-DNA integriert wurde, wobei durch die Umwandlung ein Vorläufervektor oder Vektoren gebildet werden. Jedoch kann das Versehen einer Pflanzenzelle mit einem Vorläufervektor weiterhin, zusätzlich zur Transfektion oder Transformation, eine Umwandlung durch die Zelle umfassen. Z.B, kann es sein, dass im Fall von Vorläufervektoren auf der Basis von RNA-Viren eine primäre transformierte oder transfizierte DNA transkribiert werden muss, um den RNA-Vorläufervektor in der Zelle zu ergeben. Im Fall der Agrobacetrium-vermittelten Einführung kann es sein, dass der Vorläufervektor aus T-DNA, die über Agrobacetrium eingeführt wurde, herausgeschnitten oder von der T-DNA transkribiert werden muss.
Ein Replikon ist ein DNA- oder RNA-Molekül, das in einer Zelle der Pflanze autonom replizieren kann. Beispiele hierfür sind unter anderem: bakterielle und Hefeplasmide, Plastide und mitochondriale DNA, DNA- und RNA-Viren, Viroide, Phagen. Ein Replikon muss einen Replikationsursprung aufweisen. Der Replikationsursprung kann von einer DNA- oder RNA-Polymerase der Wirtszelle erkannt werden, je nachdem, ob das Replikon ein DNA- oder RNA-Replikon ist, oder von einer heterologen Polymerase, z.B. viraler Herkunft. In diesem Fall muss die Pflanzenzelle mit der heterologen Polymerase z.B. über eines der Replikons versorgt werden. Die autonome Replikation der Replikons in der Pflanzenzelle hat vermutlich die Wirkung, dass dessen Konzentration erhöht wird, was das Expressionsniveau der gewünschten Sequenz erhöhen und die Zellausbreitung und die Ausbreitung durch die Pflanze unterstützen kann. Vorzugsweise haben Replikons eine erhöhte Infektiösität und Fähigkeit zur Ausbreitung im Vergleich zu Vorläufervektoren.
Das mindestens eine oder die mindestens zwei Replikons können weitere virale Fähigkeiten beibehalten wie z. B. die Assemblierung eines viralen Partikels, Infektivität, Unterdrückung des Gene Silencing, reverse Transkription, Integration in ein Chromosom des Wirts, Ausbreitung von Zelle zu Zelle, systemische Ausbreitung. Eines der Replikons kann im wesentlichen ein Helper Virus sein, der in trans Funktionen bereitstellt für die Replikation eines oder mehrerer anderer Replikons. Ferner kann eines der Replikons im wesentlichen ein wildtyp Retrovirus oder Retrotransposon sein, das in trans Funktionen bereitstellt, die für die Replikation, reverse Transkription, oder für die Integration in ein Chromosom des Wirts eines anderen Replikons nötig ist.
Das mindestens eine oder die mindestens zwei Replikons sorgen, vorzugsweise gemeinsam, für die Amplifikation und/oder die Expression der gewünschten Nucleinsäuresequenzen. Wenn eine gewünschte Sequenz von einem der Replikons amplifiziert oder exprimiert wird, kann das andere Replikon z.B. für eine Funktion für die Replikation der Replikons oder für die Ausbreitung mindestens eines Replikons zu Nachbarzellen nötig sein, wenn das Verfahren in Zellkultur oder in einer Pflanze durchgeführt wird. In diesem Fall kooperieren die Replikons funktionell miteinander.
Wenn mehr als eine gewünschte Sequenz amplifiziert oder exprimiert werden soll, kann jede Sequenz von einem Replikon exprimiert werden, wodurch die Replikons die Amplifizierung oder Expression gemeinsam erlauben. Auch in diesem Fall kooperieren die Replikons vorzugsweise funktionell miteinander. Zum Beispiel kann eine Funktion für die Replikation oder die Ausbreitung der Replikons von einem oder mehreren der Replikons, die die gewünschten Sequenzen amplifizieren oder exprimieren, oder von einem weiteren Replikon exprimiert werden. Ohne die funktionelle Kooperation wäre die Amplifikation oder die Expression viel geringer oder sie wäre auf die Zellen beschränkt, die mit den Vorläufervektoren versorgt wurden, wenn Amplifikation oder Expression in Pflanzenzellen oder einer Pflanze gewünscht wird.
Die Replikons sind funktionell verschieden voneinander, indem sie verschiedene Funktionen für die Amplifikation und/oder Expression der gewünschten Sequenz(en) bereitstellen. Beispiele für solche Funktionen sind unter anderem, zusätzlich zu der Kodierfunktion der gewünschten Nucleinsäuresequenzen, die Expression von Produkten, die für die Replikation der Replikons nötig sind, die Expression von Faktoren oder Produkten (vorzugsweise Enzymen), die die Prozessierung der Vorläufervektoren zu den Replikons erleichtern, die Expression von Produkten, die für die Ausbreitung der Replikons von Zelle zu Zelle, über weite Distanzen, oder von Pflanze zu Pflanze, nötig sind (z.B. movement protein oder Hüllprotein) usw. Diese Produkte können in trans oder in cis wirken. Funktionelle Verschiedenheit bezieht sich nicht auf zufällige Mutationen in den Replikons, was bei der Prozessierung in der Pflanzenzelle auftreten kann.
Infolge der Prozessierung sind die mindestens zwei Replikons strukturell miteinander verwandt, da sie gleiche Sequenzabschnitte aufweisen. Die Art der Verwandtschaft hängt von der Art der Prozessierung ab (Modifikationsprozess). Wenn in dem Verfahren eine Replikon produziert wird, ist das Replikon strukturell zu dem mindestens einen oder zu jedem der mindestens zwei Vorläufervektoren infolge der Prozessierung verwandt.
Die Vorläufervektoren werden in der Pflanzenzelle durch eine der folgenden DNA- oder RNA-Modifikationsprozesse prozessiert, was die Pflanzenzelle mit den erfindungsgemäßen Replikons ausstattet. Das Prozessieren in der Pflanzenzelle kann eine DNA-Modifizierung wie eine DNA-Rekombination, -Insertion, oder -Exzision usw., umfassen. Alternativ kann es eine RNA-Modifizierung wie RNA-Spleißen, Ligation oder Rekombination usw., umfassen. Im Rahmen dieser Erfindung umfasst Prozessieren nicht die Transkription. Der Vorläufervektor kann selber ein DNA- oder RNA-Molekül sein, das sich in einer Zelle der Pflanze autonom replizieren kann.
Die Vorläufervektoren stammen vorzugsweise von einem Pflanzenvirus ab, vorzugsweise von einem RNA-Virus oder einem DNA-Virus. Beispiele für spezifische Viren werden unten angegeben. Vorläufervektoren können wie Replikons die Fähigkeit haben, sich in der Pflanzenzelle autonom zu replizieren.
Die Pflanzenzelle kann mit einem oder mehreren Vorläufervektoren ausgestattet werden. Wenn die Zelle nur mit einem Vorläufervektor ausgestattet wird, versorgt dieser Vorläufervektor die Pflanzenzelle mit mindestens zwei Replikons. Wenn die Zelle mit zwei oder mehreren Vorläufervektoren ausgestattet wird, wird die Zelle vorzugsweise mit den mindestens zwei Replikons durch eine Prozessierung ausgestattet, die eine Interaktion zwischen den Vorläufervektoren erfordert, z.B. Rekombination. Das Ausstatten der Pflanzenzelle mit zweien oder mehreren Vorläufervektoren erhöht die Möglichkeiten für die Erzeugung der Replikons deutlich. Mehrere verschiedene DNA- oder RNA-Modifizierungen können in der Pflanzenzelle stattfinden, je nach dem Design der Vorläufervektoren.
Das Prozessieren beruht auf der Verwendung einer Wild-Typ-Pflanzenzelle oder -zellen oder auf Pflanzenzellen, die genetisch modifiziert sind, so dass sie für das Prozessieren nötige Funktionen zur Verfügung stellen können, oder in Trans eine oder mehrere Funktionen bereitstellen, die für die Infektiösität, die Ausbreitung von Zelle zu Zelle, oder die Ausbreitung über weite Distanzen der sich ergebenden Replikons nötig sind. Die Pflanzenzellen oder Pflanzen für das Verfahren dieser Erfindung sind vorzugsweise höhere Pflanzen oder Zellen davon. Nutzpflanzen sind besonders bevorzugt.
Das Verfahren zum Bewirken der Amplifikation und/oder der Expression weist mehrere wichtige Vorteile gegenüber dem Stand der Technik auf. Die Größe der zu amplifizierenden oder zu exprimierenden gewünschten Nucleinsäuresequenzen ist bei weitem weniger beschränkt als im Stand der Technik, da für die Amplifikation oder die Expression nötige Funktionen auf mindestens zwei Replikons verteilt sind, wodurch die Replikons kleiner sind als ein Vektor gemäß dem Stand der Technik sein würde. Folglich ist die Amplifikation oder Expression effizienter.
Weiterhin erlaubt das Verfahren die Amplifikation und/oder die Expression von mehr als einer Nucleinsäuresequenz. Es werden Beispiele für die Expression von zwei gewünschten Genen gegeben. Jedoch ist auch die Expression von dreien, vieren und sogar von noch mehr Nucleinsäuresequenzen gemäß dieser Erfindung möglich. Dies erlaubt die Expression eines gesamten biochemischen Weges oder einer Kaskade oder eines Proteins mit mehreren Untereinheiten. Vorzugsweise kann jede gewünschte Sequenz von einem Replikon exprimiert werden. Weitere Funktionen für eine effiziente Funktion des Prozesses, wie z.B. die unten genannten, können auf einem weiteren Replikon lokalisiert sein. Alternativ kann ein Replikon für mehr als eine dieser Funktionen kodieren.
Ein weiterer wichtiger Vorteil besteht darin, dass mehrere Möglichkeiten für die Verbesserung der biologischen Sicherheit im Vergleich zu Verfahren des Standes der Technik bestehen. In Ausführungsformen, bei denen mehr als ein Vorläufervektor benutzt wird, funktioniert das Verfahren nur, wenn alle Vorläufervektoren in die Pflanzenzelle gelangen. Alternativ kann das Prozessieren in der Zelle zur Generierung der Replikons von einer zusätzlichen Komponente abhängen, wie z.B. einem Enzym, das die Prozessierung katalysiert. Dann ist das System nur funktionell, wenn die zusätzliche Komponente in die Zelle eingebracht wird, oder wenn eine transgene Zelle, die die Komponente exprimiert, verwendet wird. In einer Ausführungform kann das Replikon, das die gewünschte Sequenz exprimiert, sich innerhalb der Pflanze von der primär infizierten Zelle aus verbreiten, jedoch ist die Ausbreitung auf andere Pflanzen nicht möglich.
Beispiele für gewünschte Nucleinsäuresequenzen sind unter anderem kodierende Sequenzen oder Teile davon oder irgendein genetisches Element. Unter einem genetischen Element wird hier jedes DNA- oder RNA-Element verstanden, das eine bestimmte genetische Funktion hat, die nicht darin besteht, für einen strukturellen Teil eines Gens zu kodieren. Beispiele sind unter anderem: Transkriptionsenhancer, Promotoren, Translationsenhancer, Rekombinationsstellen, Transkriptionsterminationssequenzen, interne Ribosomeneingangsstellen (IRESs), Restriktionsstellen.
Ein bevorzugtes genetisches Element ist eine tobamovirale IRES_mp75, die als Translationsenhancer verwendet wird, der operativ mit einer heterologen Nukleinsäurensequenz, die für ein gewünschtes Protein codiert, verbunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Pflanzenzelle mit mindestens einem (Typ) Replikon ausgestattet. Dieses Replikon wird vorzugsweise durch ortsspezifische Rekombination zwischen mindestens zwei Vorläufervektoren gebildet. Die ortsspezifische Rekombination findet vorzugsweise auf der DNA-Ebene statt. Deshalb kann das Replikon DNA sein. Alternativ kann das Replikon RNA sein, die durch Transkription im Anschluss an die ortsspezifische Rekombination gebildet wird. In dieser Ausführungsform sind die Vorläufervektoren vorzugsweise nicht zur autonomen Replikation in der Pflanzenzelle befähigt. Diese Ausführungsform ist insbesondere vom Standpunkt der biologischen Sicherheit aus betrachtet bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Pflanzenzelle mit der cDNA eines Vorläufervektors ausgestattet (17 und 19). Nach der Transkription, die den Vorläufervektor produziert, stattet die Prozessierung in der Zelle durch Spleißen die Zelle mit einem RNA-Virus-basierten Replikon aus, von dem eine gewünschte Sequenz amplifiziert oder exprimiert werden kann. Da das Spleißen langsam ist und/oder nicht in allen Vorläufervektormolekülen in der Zelle abläuft, verbleiben ungespleißte Vorläufermoleküle in der Zelle. Für die Zwecke dieser Erfindung sind diese verbleibenden ungespleißte Vorläufervektoren ebenfalls Replikons, vorausgesetzt, sie können sich autonom replizieren. Sie werden für die Expression von einer oder mehreren Funktionen verwendet, die für die Amplifizierung oder die Expression der gewünschten Sequenz nötig sind, z.B. eine Funktion für die Ausbreitung der Replikons auf Nachbarzellen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Satz von Replikons des Typs AB₁, AB₂, ...., AB_n oder des Typs B₁A, B₂A, ..., B_nA in einer Zelle durch ortsspezifische Rekombination eines primären Vorläufervektors (A) mit einem Satz von mindestens zwei sekundären Vorläufervektoren (B₁, B₂, ..., B_n) generiert, wobei n eine ganze Zahl größer oder gleich 2 ist. In der in 23 gezeigten Ausführungsform werden Vorläufervektoren (sekundäre Vektoren), die eine zu exprimierende oder zu amplifizierende Sequenz enthalten, mit einem anderen Vorläufervektor (primärer Vorläufervektor) rekombiniert, um Replikons vom Typ AB₁, AB₂ und AB₃ zu bilden, von denen diese Sequenzen amplifiziert oder exprimiert werden können. Mindestens drei Vorläufervektoren sind dazu nötig, die Zelle mit mindestens zwei Replikons auszustatten. Vorzugsweise werden Funktionen für die Ausbreitung der Replikons von einem oder mehreren Replikons exprimiert.
Zur Durchführung dieser Verfahren können Vorläufervektoren direkt für die Transformation oder Transfektion einer Pflanze oder Pflanzenzelle benutzt werden. Dies gilt insbesondere für Replikons auf der Basis von DNA-Viren. Für Replikons auf der Basis von RNA-Viren müssen DNA-Vektoren, die für die Transformation oder die Transfektion benutzt werden, transkribiert werden, um die Vorläufervektoren innerhalb der Zelle zu produzieren.
Die hier beschriebenen Verfahren können zur Herstellung großer Mengen eines oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen in einer Pflanze, in Pflanzengewebe, Pflanzelzellen oder Zellkultur auf umweltsichere Weise verwendet werden. Insbesondere können diese Verfahren zur Erzeugung großer Mengen des mindestens einen oder der mindestens zwei Replikons verwendet werden. Sie Replikons können gereinigt oder aus dem Pflanzenmaterial angereichert werden. Die Replikons können Vektoren oder virales Material sein, die/das, wahlweise nach dem Reinigen oder Anreichern, zur Transformation oder Transfektion einer weiteren Pflanze, Pflenzengewebe, Pflanzenzellen oder Zellkultur verwendet werden kann. In dieser Ausführungsform können die fraglichen Verfahren biologisch sichere Verfahren zur Erzeugung infektiösen Materials oder Vektoren sein zur Transformation oder Transfektion von Pflanzen in großen Maßstab, wie zum Beispiel im landwirtschaftlichen Maßstab. Das infektiöse virale Material oder die Vektoren kann können umschlossenes oder umhülltes virales Material sein. Das Proteinmaterial, das zum Umschließen des viralen Materials nötig ist, kann von den Replikons exprimiert werden.
Detaillierte Beschreibung des Provektor-Systems
Viren, die zu verschiedenen taxonomischen Gruppen gehören, können zur Konstruktion der virusbasierten Vektoren gemäß den Prinzipien des Pro-Vektor-Systems verwendet werden. Dies trifft auf RNA- und auf DNA enthaltende Viren zu; Beispiele hierfür werden in WO 02/088369 angegeben.
Vektoren von Pflanzen viraler Herkunft werden üblicherweise als Plasmide verwendet, die sich in Pflanzen autonom replizieren können (Replikon). Jedoch sind die Prinzipien für die gentechnische Herstellung solcher Plasmide unter Verwendung von nicht-viralen Elementen bekannt. Zum Beispiel wurden viele vermutliche Replikationsursprünge aus Pflanzenzellen beschrieben (Berlani et al., 1988, Plant Mol. Biol., 11, 161-162; Hernandes et al., 1988, Plant Mol. Biol., 10, 413-422; Berlani et al., 1988, Plant Mol. Biol., 11, 173-182; Eckdahl et al., 1989, Plant Mol. Biol., 12, 507-516). Es wurde gezeigt, daß die autonom replizierenden Sequenzen (ARS-Elemente) aus den Genomen höherer Pflanzen Struktur- und Sequenzmerkmale mit ARS-Elementen aus Hefe und höheren Tieren gemeinsam haben (Eckdahl et al., 1989, Plant Mol. Biol., 12, 507-516). Pflanzliche ARS-Elemente können Plasmiden die Fähigkeit verleihen, sich in Saccharomyces cerevisiae autonom zu replizieren. Untersuchungen von Kern-DNA-Sequenzen in Mais, die die autonome Replikation von Plasmiden in Hefe fördern können, zeigten, dass sie zwei Familien von hochgradig repetitiven Sequenzen im Maisgenom repräsentieren. Diese Sequenzen zeigen ein charakteristisches genomisches Hybridisierungsmuster. Typischerweise gab es nur eine Kopie einer ARS-homologen Sequenz auf jedem 12 bis 15 kb genomischen Fragment (Berlani et al, 1988, Plant Mol. Biol., 11:161-162). Eine andere Quelle von Replikons pflanzlichen Ursprungs sind pflanzliche ribosomale DNA-Spacerelemente, die die Amplifikation und Expression heterologer Gene in Pflanzen stimulieren können (Borisjuk et al., 2000, Nature Biotech., 18, 1303-1306).
Deswegen ist ein hier betrachtetes Replikon oder Vorläufervektor nicht notwendigerweise pflanzenviralen Ursprungs. Pflanzliche DNA-Viren können leicht zur gentechnischen Herstellung von Replikons (Vektoren) verwendet werden, wobei diese Replikons besonders nützlich für die gezielte DNA-Transformation sind. Jedoch sind auch Vektoren möglich, die ganz oder teilweise aus Elementen von pflanzlichen RNA-Viren oder sogar aus nicht-pflanzlichen Viren hergestellt werden. Replikons auf der Basis von Pflanzenviren sind offensichtlich vorteilhaft. Solche Replikons können zusätzlich zur Replikation weitere nützliche Funktionen bereitstellen, wie z.B. für die Ausbreitung von Zelle zu Zelle und über weite Distanzen. Ferner können sie häufig einfacher a posteriori aus der Pflanzenzelle entfernt werden gemäß bekannten Methoden der Entfernung von Viren aus infizierten Pflanzen (virus eradication).
Im einfachsten Beispiel wird ein Typ eines Vorläufervektors (Provektor) (A) in die Pflanzenzelle gebracht, wo er infolge der Prozessierung in der Zelle mindestens zwei strukturell verwandte und funktionell verschiedene Replikons (F und G) ergibt, die die Amplifikation und/oder Expression der gewünschten Sequenzen besorgen können. Mehr als ein Vorläufervektor kann in die Pflanzenzelle eingeführt werden [A(+C,D,E...)]. Wahlweise kann die Pflanzenzelle transgen sein und eine weitere Komponente (B) enthalten, die für die Prozessierung des Vorläufervektors und/oder die Expression, Replikation, Ausbreitung von Zelle zu Zelle oder für die Ausbreitung in der gesamten Pflanze nötig ist.
In einer Ausführungsform beschreiben wird das System eines Provektors (Vorläufervektors), das auf dem Spleißen der Provektor-RNA im Pflanzenzellkern beruht. Dieses System umfasst ein DNA-Molekül des Provektors, der Teile der cDNA des pflanzenviralen Genoms, gewünschte Gene und in Pflanzenzelle funktionsfähige Spleißstellen enthält (siehe z.B. 17 oder 19). Nach der Transkription in der transfizierten Pflanzenzelle kann das primäre RNA-Produkt (Provektor oder Vorläufervektor) durch Spleißen prozessiert werden. Infolge des Designs des Provektors ersetzt das gewünschte Gen (z.B. GFP) eines der viralen Gene (z.B. CP) in der gespleißten Form. Dies erlaubt es, das gewünschte Gen (GFP) über den normalen viralen Weg anstatt des substituierten viralen Proteins zu exprimieren. Da das Spleißen jedoch mit 100%iger Effizienz vonstatten geht, verbleibt ein Anteil des primären Transkripts ungespleißt und wird aus dem Zellkern wie die gespleißte Form auch exportiert. Als Ergebnis erscheinen zwei Typen von selbstreplizierenden viralen Vektor-RNAs (Replikons) im Cytoplasma der transfizierten Pflanzenzelle. Dies führt zur Expression sowohl von GFP als auch von CP von Replikons, die von einem Vorläufervektor generiert wurden. Es soll erwähnt werden, dass in diesem Beispielfall die GFP-Expression wahrscheinlich viel stärker als die Expression von CP ist. Für Tobamoviren wurde gezeigt, dass die Menge des bei der Infektion produzierten viralen Proteins vom Abstand des das Protein kodierenden Gens zum 3'-Terminus des Virus abhängt. Da GFP von der gespleißten RNA-Form exprimiert wird, ist die entsprechende subgenomische RNA signifikant kürzer als die RNA, von der CP exprimiert wird (19; sGFP steht für ein synthetisches oder gentechnisch verändertes GFP).
Zur Exemplifizierung dieser Ausführungsform haben wir zwei Provektoren konstruiert, die auf bekannten Pflanzenviren basieren: Kartoffelvirus X (PVX) und Kreuzblütler infizierender Tobamovirus (CrTMV). In beiden Fällen wurde das CP-Gen der Viren mit Spleißdonor- (stromaufwärts) und Spleißakzeptorstellen (stromabwärts) (SA bzw. SD) flankiert. GFP wurde stromabwärts der Akzeptorstelle kloniert, um nur vom gespleißten Transkript exprimiert zu werden. Die physiologischen Rollen von CP in PVX und CrTMV sind verschieden. Im Falle von PVX ist CP für die Ausbreitung von Zelle zu Zelle des Virus nötig. Im Falle von CrTMV ist CP vor allem bei der Ausbreitung des Virus über weite Distanzen (systemische Infektion) beteiligt und ist nicht für die Infektion von Nachbarzellen unbedingt erforderlich. Diese Beispiele zeigen zwei verschiedene Reportergenexpressionsmuster (GFP). Im Falle des PVX-Systems stoppt die virale Ausbreitung in primär transfizierten Zellen, bis die nötige Menge an CP von einem weniger effizienten Replikon, das von ungespleißter RNA abstammt, exprimiert ist. Dies führt zur Überproduktion von viel schneller synthetisiertem GFP in derselben Zelle. Schließlich akkumuliert die nötige Menge von CP und beide Replikons penetrieren Nachbarzellen, wo sich der Prozess wiederholt. Dagegen ist die virale Ausbreitung im Falle des Pro-Vektors auf CrTMV-Basis nicht auf die Ausbreitung von Zelle zu Zelle limitiert. Beide Formen des Vektors wirken unabhängig, was zu einem schnelleren Wachstum des infizierten Gebietes führt.
Obwohl die spezifischen Beispiele, die die RNA-Modifizierung als Mechanismus für die Regenerierung von Replikons auf dem RNA-Spleißen beruhen, können auch andere RNA-Modifzierungsmechanismen verwendet werden. Hierzu gehören unter anderem Modifizierungen wie RNA-Ligation oder RNA-Rekombination. Eine Ligation von verschiedenen RNA-Molekülen durch Enzyme, wie z.B. RNA-Ligase, erlaubt die Erzeugung einer Vielzahl von verschiedenen RNA-Replikons in einer Zelle auf der Grundlage der internen enzymatischen Aktivität der Pflanzenzellen oder auf der Grundlage der Expression einer bekannten Ligase, wie z.B. der T4-RNA-Ligase (Nishigaki et al., 1998, Mol. Divers., 4, 187-190) oder mitochondrieller RNA-Ligase aus Leishmania (Blanc et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 24289-24296). RNA-RNA-Rekombination ist ein gut untersuchtes Phänomen. Es geschieht leicht in Pflanzenwirtszellen zwischen viralen RNA-Molekülen mit einem bestimmten Grad an Homologie (Allison et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 1820-1824; Rao et al., 1990, J. Gen. Virol., 71, 1403-1407; US 5 877 401 ).
In einer anderen Ausführungsform werden die Vorläufervektoren durch ortsspezifische DNA-Rekombination prozessiert, was zu teilweise verschiedenen Replikons führt. In diesem Fall geschehen die molekularen Umordnungen auf DNA-Ebene. Mehrere Moleküle (Pro-Vektoren) werden durch Rekombination umgeordnet (shuffled), um mehrere Vektormoleküle (Replikons) zu erzeugen. Die erste DNA-Komponente des Systems kann einen Pflanzenpromotor enthalten (Arabidopsis Actin 2), der an den Hauptteil des CrTMV-Genoms gekoppelt ist – das Polymerasegen und das MP-Gen, gefolgt von einer spezifischen Rekombinationsstelle. Sekundäre Komponenten sind Plasmid-DNAs, die dieselbe Rekombinationsstelle umfassen, gefolgt von einem oder mehreren gewünschten Genen (irgendein Reportergen) oder dem viralen CP-Gen. Die 3' nicht translatierte Region (3' UTR) des CrTMV sollte stromabwärts des gewünschten Gens kloniert werden. Die letzte Komponente des Systems ist Cre-Rekombinase-exprimierende DNA. Dieses Enzym fördert die Umorganisation von Pro-Vektorkomponenten zu aktiven Vektormolekülen (Replikons). Es muss betont werden, dass keine der Pro-Vektorkomponenten für sich allein infektiös ist, was für die biologische Sicherheit des Systems wichtig ist.
Nachdem die Pflanzenzelle mit allen Komponenten des beschriebenen Multi-Komponentensystems versehen ist, tritt Rekombination ein, und mehrere Replikons können gebildet werden (siehe 23 A,B,C). Diese umorganisierten DNA-Moleküle können im Kern transkribiert (da sie den Arabidopsis Actin 2-Promotor enthalten) und in das Cytoplasma exportiert werden. Schließlich erscheinen wie im Fall des RNA-Spleißens mehrere replizierende Vektor-RNAs im Cytoplasma der transfizierten Zelle. In dieser Ausführungsform beschreiben wir ein System, in dem alle diese Vektoren ein funktionelles MP-Gen und ein stromabwärts gelegenes Gen enthalten. Dies ermöglicht jeder Vektor-RNA, sowohl ein funktionelles MP-Gen und ein stromabwärts gelegenes Gen zu exprimieren und in Nachbarzellen zu penetrieren. Andere Kombinationen sind jedoch auch möglich.
Zwei verschiedene Möglichkeiten zur Versorgung mit der Rekombinase werden hier betrachtet. Die Rekombinase kann durch Co-Bombardment mit anderen DNA-Komponenten des Systems in die Zelle gebracht werden. Als andere Möglichkeit wurde eine transgene Pflanze erhalten, die Cre-Rekombinase exprimiert. Dies reduziert die Anzahl der Komponenten, mit denen die Zelle versorgt werden muss, und erhöht im Ergebnis die allgemeine Effizienz des Systems. Dies verbessert außerdem die Sicherheit des Verfahrens, da es nicht außerhalb einer für die Unterstützung des Verfahrens genetisch manipulierten Pflanze ablaufen kann.
Beim Klonieren von Provektor-Komponenten wurde eine LoxP-Rekombinationsstelle stromaufwärts der gewünschten Gene kloniert. Eine LoxP-Stelle enthält zwei kleine invertierte Wiederholungen (repeats), getrennt von mehreren Nucleotiden, und sie bildet auf RNA-Ebene eine Stamm-Loop-Struktur. Der Stamm enthält nur 4 GC-Basenpaare, so dass er nicht sehr stabil ist. Jedoch kann dieser Stamm die Effizienz der Translation eines stromabwärts gelegenen Gens reduzieren. Um dieses Problem zu lösen, kann irgendein Translationsenhancer zwischen LoxP und das gewünschte Gen kloniert werden. In den Beispielen mit Cre-Rekombinase verwendeten wir eine Omega-Leitsequenz von TMV U1. Jedoch kann auch jede andere Translations-steigernde Sequenz verwendet werden (z.B. IRES_mp75 aus CrTMV) sowie pflanzliche IRESs. IRES_mp75-Elemente können vorzugsweise als Translationsenhancer verwendet werden wie in den Beispielen mit der Integrase des Phagen PhiC31. In diesem Fall wurden in einem Satz von Provektoren die LoxP Rekombinationsstellen durch att-Stellen (attachment-sites) des Phagen aus Stroptomyces PhiC31 ersetzt (Thorpe & Smith, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci.; 95, 5505-5510; Groth et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 5995-6000), die die Sequenzen für das Rekombinationsenzym Integrase darstellen. Zwei verschiedene att-Stellen wurden in die Provektoren kloniert: während attP in die Vektoren vom Typ Polymerase-MP-LoxP inseriert wurde, wurde eine attB-Rekombinationsstelle in die Provektoren kloniert, die das gewünschte Protein gefolgt von einer 3'NTR Sequenz und einem nos-Terminator tragen. Ähnlich des Cre-Systems, beschränken die att-Rekombinationsstellen die Translationseffizienz eines Gens, das stromabwärts gelegen ist. Daher wurden auch in diesem System Translationsenhancer zwischen die attB-Stellen und das gewünschte Gen kloniert. Es wurde gezeigt, dass IRES_mp75-Sequenzen eine vergleichbare oder sogar eine bessere Wirkung als Translationsenhancer aufweisen im Vergleich mit dem Omega-Leader aus TMV U1.
Geeignete Rekombinasen/Rekombinationsstellensysteme sind unter anderem das Cre-Lox-System aus dem Bakteriophagen P1 (Austin et al., 1981, Cell, 25, 729-736), das Flp-Frt-System aus Saccharomyces cerevisiae (Broach et al., 1982, Cell, 29, 227-234), Das R-Rs-System aus Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al., 1985, J. Mol. Biol., 182, 191-203), the Integrase aus dem Streptomyces-Phagen PhiC31 (Thorpe & Smith, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 5505-5510; Groth et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 5995-6000) sowie Resolvasen. Ebenso gehören weitere Methoden zur DNA-Umordnung zum Umfang dieser Erfindung. Andere Enzymsysteme zur DNA-Modifikation können ebenso dazu verwendet werden, verwandte jedoch funktionell verschiedene Replikons in einer Wild-Typ oder genetisch veränderten Pflanzenzelle zu generieren: Restriktionsendnuklease, Transposase, allgemeine oder spezifische Rekombinase usw.
Verschiedene Methoden können zur Ausstattung einer Pflanzenzelle mit einem Vorläufervektor verwendet werden. DNA kann in Pflanzenzellen mit einem Ti-Plasmid-Vektor aus Agrobakterium ( US 5 591 616 ; US 4 940 838 ; US 5 464 763 ) oder durch Teilchen- oder Mikroprojektil-Bombardierung ( US 5 100 792 ; EP 00 444 882 B1 ; EP-00 434 616 B1) transformiert werden. Andere Pflanzentransformationsmethoden wie Mikroinjektion (WO 09209696; WO 09400583 A1; EP 175 966 B1 ), Elektroporation ( EP 00564595 B1 ; EP 00290395 B1 ; WO 087056614A1) oder PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten usw. können ebenso verwendet werden. Die Wahl der Transformationsmethode hängt von der zu transformierenden Pflanzenart ab. Zum Beispiel wird die Mikroprojektil-Bombardierung im allgemeinen für die Transformation von Monocotyledonen verwendet, während für zweikeimblättrige die Agrobakterium-vermittelte Transformation bessere Ergebnisse liefert.
Die Konstruktion von pflanzlichen viralen Vektoren für die Expression nicht-viraler Gene in Pflanzen wurde in mehreren Berichten beschrieben (Dawson et al., 1989, Virology, 172, 285-293; Brisson et al., 1986, Methods in Enzymology, 118, 659; MacFarlane & Popovich, 2000, Virology, 267, 29-35; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; Vionnet et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14147-14152). Diese Methoden können von einem Fachmann leicht angewendet werden.
Die beschriebenen Verfahren weisen eine Anzahl von Vorteilen gegenüber bereits existierenden Strategien für die Expression von Fremdgenen in Pflanzen auf der Basis viraler Vektoren auf.
Besonders wichtig ist, dass das Verfahren für die Expression von mehr als einer gewünschten Nucleinsäuresequenz verwendet werden kann und somit für die Expression mehrerer Gene einer biochemischen Kaskade oder eines biochemischen Stoffwechselweges verwendet werden kann. In dieser Hinsicht ist das Verfahren dieser Erfindung die einzige verfügbare Methode, die effizient für die Expression von Genen mit dem Ziel der Bestimmung der Genfunktion oder mit dem Ziel der biochemischen Produktion verwendet werden kann.
Das Provektor-System bietet weiter eine große Bandbreite von Möglichkeiten für jede Art der Konstruktion einer biologischen Kaskade. Ein Beispiel ist in 28 gezeigt. Dieses System verwendet die Rekombination von drei Vorläufervektor-Komponenten zu zwei Replikons. Zuerst exprimiert Replikon A MP und ein gewünschtes Gen (GFP in diesem Beispiel). Infolge der Expression des Movement-Proteins (MP) kann sich dieser Vektor von Zelle zu Zelle im inokulierten Blatt ausbreiten. Jedoch kann er sich nicht systemisch in der infizierten Pflanze ausbreiten und auch nicht auf andere Pflanzen übertragen werden wegen der Abwesenheit des Hüllproteins (CP). Mit anderen Worten ist diese Replikon nur infektiös, wenn es künstlich in eine Pflanzenzelle eingebracht wird. Das zweite Replikon B exprimiert nur CP. Man beachte, dass dieses keine viralen Partikel bilden kann, da der RNA der Ursprung der Virenbildung (origin of virus assembly), der im MP-Gen lokalisiert ist, fehlt. Jedoch exprimiert es CP in signifikanten Mengen.
Das vorgeschlagene Verfahren ist inhärent sicherer, da es nur funktionieren kann, wenn alle Vorläufervektoren zugegen sind. Wenn beide der oben beschriebenen Replikons in derselben Zelle zugegeben sind, komplementieren sie sich und beide Komponenten können sich auf Nachbarzellen ausbreiten. Jedoch kann nur Vektor A mit CP eingehüllt werden, um virale Partikel zu bilden, so dass sich nur diese Komponente vom infizierten Blatt auf die gesamte Pflanze ausbreiten kann. Wenn solche virale Partikel in nicht-infizierte Blätter eindringen, führen sie nur die infektiöse Komponente A, nicht jedoch B mit sich. Dies führt zur systemischen Ausbreitung der Infektion in der gesamten Pflanze, jedoch kann der Virus nicht andere Pflanzen infizieren, da virale Partikel nur in primär inokulierten Blättern gebildet werden können, und diese Partikel nur eine Replikon-Komponente enthalten, was für die systemische Infektion einer anderen Pflanze nicht ausreicht. Dieses System stellt ein einzigartiges Beispiel für die hoch effiziente Expression eines Transgens in einer gesamten Pflanze über einen nicht ansteckenden viralen Vektor dar.
Ferner garantiert die Assemblierung eines viralen Replikons aus mindestens zwei Replikon-Vorläufern über ortsspezifische DNA-Rekombination ein höheres Maß an Sicherheit im Vergleich mit einem herkömmlichen viralen Vektor, der für die Infektion von Pflanzenzellen verwendet wird. Das Verfahren der Assemblierung von viralen Replikons aus mindestens zwei Komponenten verlangt die Anwesenheit der mindestens zwei Komponenten und einer ortsspezifischen Rekombinase in derselben Pflanzenzelle. Die Rekombinase kann in cis zusammen mit einer der anderen Komponenten eingebracht werden. Vorzugsweise kann die Rekombinase separat eingebracht werden. Bevorzugter ist es, die Wirtspflanze genetisch so zu verändern , dass sie die Rekombinase exprimiert. Im letzteren Fall wird die Assemblierung eines funktionalen Vektors aus Vorläufer-Elementen auf die genetisch veränderte Wirtspflanze beschränkt sein. Das Provektorsystem wird in den Referenzbeispielen 4 bis 17 exemplifiziert.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Konstruktion von Vektoren, die verschiedene Fusionen von GFP mit dem Gen der Pektinmethylesterase (PME) aus Tabak enthalten, für die transiente Expression und stabile Kerntransformation von Pflanzen
Eine rot-verschobene Mutante von GFP (GFPst65T) wurde zur Fusion mit PME gewählt, um die Lokalisierung von GFP in vivo zu bestimmen. Die folgenden vier Konstrukte wurden hergestellt: 1) gesamt-PME-GFP; 2) GFP-reifes PME; 3) GFP-gesamt-PME und 4) reifes PME-GFP. Das erste Konstrukt wurde entworfen, um das gewünschte Protein (GFP) zur Zellwand zu leiten. Die Konstrukte 2 bis 4 wurden als Negativkontrollen benutzt.
Das Plasmid pUC8, das die vollständige Sequenz eines unprozessierten PME-Gens mit untranslatierten 5'- und 3'-Regionen enthält, wurde zur PCR-Amplifikation mit den folgenden Primern verwendet:

a) 5'-TGACCCATGGTGGATTCCGGCAAGAACGTT-3', entsprechend dem N-terminalen Teil der PME-Kodiersequenz mit einer NcoI-Stelle.
b) 5'-TTTTGGATCCACGGAGACCAAGAGAAAAAG-3', entsprechend dem C-terminalen Teil der PME-Kodiersequenz mit einer BamHI-Stelle. Dieses Primerpaar wurde entworfen, um PME ohne Translationsterminationssignal zu erzeugen.
c) 5'-TGACGGATCCTTGGATTCCGGCAAGAACGTTAAT-3', entsprechend dem N-terminalen Teil der PME-Kodiersequenz voller Länge mit einer BamHI-Stelle.
d) 5'-CCCCTCTAGATCAGAGACCAAGAGAAAAAGGGAA-3', entsprechend dem C-terminalen Teil von PME voller Länge mit einer XbaI-Stelle. Dieses Primerpaar wurde entworfen, um PME ohne den ersten Methioninrest, jedoch mit einem Translationsterminationssignal zu erhalten.
e) 5'-TTTTCCATGGTGAGGCCCGACGTGGTTGTGGC-3', entsprechend dem N-terminalen Teil des reifen PME-Gens mit einem Translationsstartkodon in der NcoI-Stelle. Dieser Primer wurde entworfen, um ein reifes PME-Gen mit einem Translationsstart, jedoch ohne einem Translationsterminationssignal zu kreieren.
f) 5'-ATAAGGATCCGTGAGGCCCGACGTGGTTGTGGC-3', entsprechend dem N-terminalen Teil des reifen PME-Gens ohne Translationsterminationssignal in der BamHI-Stelle. Dieser Primer wurde entworfen, um ein reifes PME-Gen ohne Startkodon, jedoch mit einem Translationsstartsignal zu kreieren.

Die verschiedenen PCR-Produkte wurden in den pGEM-T-Vektor (Promega) unter die Kontrolle des T7-Promotors kloniert, was die Plasmide pIC2406 (Primer a) und b)), pIC2396 (Primer b) und c)), pIC2425 (Primer a) und f)) und pIC2415 (Primer b) und f)) ergab.
Dann wurde das GFP-Gen für eine N- oder C-terminale Translationsfusion mit PME modifiziert. Zwei Modifizierungen des GFP-Gens wurden in den pGEM-T-Vektor unter der Kontrolle des T7-Promotors kloniert. GFP mit einem Translationsstartkodon und ohne einem Translationsterminationssignal wurde mit Primern g) und h) (pIC2441) erhalten. GFP ohne einem Translationsstartkodon, jedoch mit einem Translationsterminationssignal, wurde mit dem Primern i) und j) (pIC2431) erhalten.
Verwendete GFP-Primer:

g) 5'-TTTTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3', entsprechend dem N-terminalen Teil des GFP-Gens mit einem Translationsstartkodon in der NcoI-Stelle.
h) 5'-TTTTGGATCCTATTCTTGCGGGCCCTCGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3', entsprechend dem C-terminalen Ende des GFP-Gens mit einer BamHI-Restriktionsstelle.
i) 5'-TTTTGGATCCATAAGAACGGGGCCCAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3', entsprechend dem N-terminalen Teil des GFP-Gens mit einer BamHI-Stelle.
j) 5'-TTTTTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA-3', entsprechend dem C-terminalen Teil des GFP-Gens und mit einem Translationsterminationssignal in der XbaI-Stelle.

Für die PME-GFP-Fusionen wurde das NcoI/BamHI-Fragment aus pIC2431 mit GFP ohne Translationsstartkodon mit den großen NcoI/BamHI-Fragmenten von pIC2406 und pIC2425 ligiert, was die Konstrukte pIC2452 bzw. pIC2462 ergab. Das allgemeine Klonierverfahren ist in 4A gezeigt. Für die GFP-PME-Fusionen wurde das kleine NcoI/BamHI-Fragment aus pIC2441 mit dem großen NcoI/BamHI-Fragment aus pIC2396 oder mit dem großen NcoI/BamHI-Fragment aus pIC2411 ligiert, was die Plasmide pIC2472 bzw. pIC2482 ergab. Das Klonierverfahren ist in 4B gezeigt.
Um die Korrektheit der PME-GFP-Fusionen zu überprüfen, wurden die Konstrukte pIC2452, 2462, 2472 und 2482 zur in-vitro-Translation in Kaninchen-Reticulozytenlysat (RRL) verwendet. Die in 5 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die verschiedenen PME-GFP-Fusionsprodukte intakt waren.
Für transiente Expressionsexperimente wurden die großen NcoI-Klenow/SalI-Fragmente aus pIC2452, 2462, 2472 und 2482 mit dem großen SmaI/SalI-Fragment der pIC056-Expressionskassette zwischen dem 35S-Promotor und der Nos-Terminator-Sequenz ligiert, was Konstrukte mit den folgenden Fusionen ergab: p35S:volllänge (fl)-PME-GFP, p35S:reifes PME-GFP, p35S:GFP-flPME und p35S:GFP-mPME. Das Klonierschema ist in 6 gezeigt.
BEISPIEL 2
Transiente Expression der PME-GFP-Fusion in Nicotiana benthamiana-Blättern
Präparation der Plasmid-DNA
Plasmide, die die p35S:flPME-GFP-, p35S:mPME-GFP-, p35S:GFP-flPME- und p35S:GFP-mPME-Fusionen trugen, wurden in den E. coli-Stamm DH10B transformiert, Maxipreps wurden in LB-Medium gezogen und die DNA wurde mit dem Qiagen-Kit gereinigt.
Mikroprojektilbombardierung
Die Mikroprojektilbombardierung wurde mit einem Biolistic-PDS-1000/He-Particle Delivery System (Bio-Rad) durchgeführt. Die Zeilen wurden bei 900 bis 1100 psi, einem 15 mm Abstand vom Makroträgerstartpunkt zur Stoppscheibe und 60 mm Abstand von der Stoppscheibe zum Zielgewebe bombardiert. Der Abstand zwischen der Bruchscheibe und dem Startpunkt des Makroträgers betrug 12 mm. Die Zellen wurden nach 4-stündiger osmotischer Vorbehandlung bombardiert.
Die DNA-Goldbeschichtung gemäß dem originalen Bio-Rad-Protokoll (Sanford et al., 1993, in: Methods in Enzymology, Hg. R.Wu, 217, 483-509) wurde folgendermaßen durchgeführt: 25 μl Goldpulver (0,6, 1,0 mm) in 50% Glycerin (60 mg/ml) wurden mit 5 μl Plasmid-DNA in einer Konzentration von 0,2 μg/ml, 25 μl CaCl₂ (2,5 M) und 10 μl 0,1 M Spermidin gemischt. Die Mischung wurde 2 Minuten gevortext, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur, Zentrifugation (2000 U/min, 1 min) und Waschen mit 70% und 99,5% Ethanol. Schließlich wurde das Pellet in 30 μl 99,5% Ethanol (6 μl/Schuss) resuspendiert.
Ein neues DNA-Goldbeschichtungsverfahren (PEG/Mg) wurde folgendermaßen durchgeführt: 25 μl Goldsuspension (60 mg/ml in 50% Glycerin) wurden mit 5 μl Plasmid-DNA in einem Eppendorfgefäß gemischt, dann wurden 30 μl 40% PEG in 1,0 M MgCl₂ zugesetzt. Die Mischung wurde 2 Minuten lang gevortext und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur, ohne zu schütteln, inkubiert. Nach einer Zentrifugation (2000 U/min, 1 min) wurde das Pellet zweimal mit 1 ml 70% Ethanol, einmal mit 1 ml 99,5% Ethanol gewaschen und schließlich in 30 μl 99,5% Ethanol dispergiert. Aliquots von 6 μl der DNA-Goldsuspension in Ethanol wurden auf Makroträgerscheiben geladen und 5 bis 10 Minuten trocknen gelassen.
Die Blätter der Nicotiana benthamiana wurden mit diesen mit verschiedener Plasmid-DNA beschichteten Goldpartikeln beschossen. Die in 7 gezeigten Ergebnisse der Experimente zeigen, dass das flPME-GFP-Fusionsprodukt zur Zellwand geleitet wird.
BEISPIEL 3
Agrobacterium-vermittelte Transformation von Arabidopsis thaliana
Entwurf der Konstrukte
Die großen Nhe1-EcoR1-Fragmente der in Beispiel 1 beschriebenen Plasmide p35S:flPME-GFP, p35S:mPME-GFP, p35S:GFP-flPME und p35S:GFP-mPME wurden mit dem großen Xba1-EcoR1-Fragment des binären Vektors pICBV1 ligiert. Die erhaltenen Plasmide pICBV flPME-GFP, pICBV1 mPME-GFP, pICBV1 GFP-flPME und pICBV1 GFP-mPME enthielten die p35S:flPME-GFP-, p35S:mPME-GFP-, p35S:GFP-flPME- und p35S:GFP-mPME-Expressionskassetten in der T-DNA-Region mit dem BAR-Gen als Selektionsmarker. Die T-DNA-Region eines Konstrukts, pICBV flPME-GFP, ist in 8 gezeigt.
Transformation von Arabidopsis thaliana in planta
Die Plasmide (Carbenicillin-resistent) wurden mittels Elektroporation in Agrobacterium tumefaciens (Stamm GV 2260) eingebracht. Die Bakterienzellen wurden in 300 ml 2YT-Medium mit Antibiotika herangezogen, abzentrifugiert und in 5% Sucrose auf eine OD₆₀₀ = 0,8 resuspendiert.
A. thaliana-Pflanzen wurden bis zur Blüte herangezogen. Dann wurden Blüten (flowering bolts) der Arabidopsis-Pflanzen in Agrobacterium-Lösung eingetaucht, wobei für einige Sekunden Vakuum angelegt wurde. Transformierte Pflanzen wurden 24 Stunden lang an einem dunklen Ort bei hoher Luftfeuchtigkeit gehalten und dann ins Gewächshaus gebracht. Die Samen wurden 3 bis 4 Wochen später gesammelt, in Erde ausgesät und mit 100 mg/l Phosphinothricin, 0,01% Silvet, besprüht. Diese Behandlung wurde zwei- bis dreimal wiederholt, je nach der Effizienz der Selektion und der Häufigkeit von späten Keimereignissen. Transgene Arabidopsis-Pflanzen wurden zum Studium der GFP-Lokalisation in den Pflanzengeweben verwendet.
Selektion von Transformanten
Zwei bis vier Tage nach der Bombardierung wurde das Filterpapier mit den Zellen auf eine Platte mit dem geeigneten Selektionsmittel (10 bis 15 μg/ml PPT) versetzten CIM transferiert. Alle sieben Tage wurde das Material in frisches Selektionsmedium transferiert. Die Platten wurden im Dunkeln gehalten, und nach ungefähr 6 Wochen wurde das Pflanzenmaterial auf Petrischalen mit Morphogenese-induzierendem Medium (MIM) (siehe Appendix) ergänzt mit dem jeweiligen Selektionsmittel (10 bis 15 μg/ml PPT) transferiert. Die Platten wurden bei hoher Lichtintensität 16 Stunden pro Tag inkubiert.
BEISPIEL 4
Zellwand-Targeting von GFP mit einer Translationsfusion mit dem NtTLRP-Gen
Die Translationsfusion von GFP mit dem Tabak-Zellwandprotein TLPR (Domingo et al., 1999, Plant J, 20, 563-570; Zugriffsnr. Y19032) mit einem binären Vektor wurde wie für die PME-GFP-Fusion beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme von unterschiedlichen Primern.

a) 5'-TGACCCATGGGTTCTAAGGCATTTCTGTTTCTTG-3', entsprechend dem N-terminalen Teil der NtTLPR-Kodiersequenz mit einer NcoI-Stelle.
b) 5'-TTTTGGATCCTTGTGAAGGCTGAACTTCAGTAAG-3', entsprechend dem C-terminalen Teil der NtTLPR-Kodiersequenz mit einer BamHI-Stelle.

Die Klonierstrategie war ähnlich zu der für die flPME-GFP-Fusion von Beispiel 1 und 3. Das fertige Konstrukt mit der p35S:NtTLPR-GFP-Expressionskassette innerhalb der T-DNA-Grenzen ist in 9 gezeigt.
Um eine Proteinspaltstelle einzuführen, die genau an einem vorbestimmten Ort vor irgendeinem Aminosäurerest gespalten werden kann, wurde das Arabidopsis-Ubiquitin-Gen (UBA11, US 5 773 705 ) zwischen die NtTLPR- und GFP-Gene eingeführt. Die Primer für die UBQ11-Amplifizierung waren wie folgt:

c) 5'-TTTTGGATCCAGATCTTCGTAAAGACTTTGACCG-3', entsprechend dem N-terminalen Teil der UBQ11-Kodiersequenz mit einer BamHI-Stelle.
d) 5'-TTTTGGATCCTTGTGAAGGCTGAACTTCAGTAAG-3', entsprechend dem C-terminalen Teil von NtTLPR-Kodiersequenz mit einer BamHI-Stelle.

Das mit BamHI behandelte und gelgereinigte PCR-Fragment des IBQ11-Gens wurde mit dem BamH1-verdauten und mit alkalischer Phosphatase behandelten Vektor pICBV1 NtTLPR-GFP ligiert. Die Orientierung des klonierten Fragments wurde mittels PCR überprüft, wobei verschiedene Kombinationen von UBQ1- und GFP-Primern verwendet wurden. Die T-DNA-Region des erhaltenen Plasmids ist in 8 gezeigt.
Experimente zur transienten Expression und die stabile Transformation von Pflanzen wurde wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben durchgeführt.
BEISPIEL 5
Expression der NtTLPR-GFP-Fusion von einem crTMV-Vektor
Das NcoI-SalI-Fragment der NtTLPR-GFP-Fusion wurde in einen crTMV-Vektor (11) transformiert und für die Transfektion von Nicotiana benthamiana-, Nicotiana tabaccum- und Brassica-Pflanzen verwendet. Einzelheiten der Herstellung eines crTMV-basierten Vektors und der Expression eines Reportergens über ein IRES-Element sind in den Referenzbeispielen 1 bis 3 und in WO 02/29068 beschrieben.
BEISPIEL 6
Die Verwendung einer Ca²⁺-Pectat Bindungsstelle als Polypeptid, das an eine Zellwandkomponente binden kann
In diesem Beispiel wird eine Ca²⁺-Pectat Bindungsstelle der apoplastischen Isoperoxidase aus Zucchini (APRX) (Carpin et al., 2001, The Plant Cell, 13, 511-520) verwendet. Es wurde gezeigt, dass diese Bildungstelle sowohl in vivo als auch in vitro an Pectinketten über von Ca²⁺-Ionen gebildete Vernetzungen binden kann. Diese Bildungsstelle weist ein Motiv aus vier geclusterten Argininresten auf, die ihre positiven Ladungen an der Oberfläche der Peroxidase exponieren. Komplexbildner von Ca²⁺ wie EGTA oder EDTA können die ionische Interaktion zu den Pectinketten unterdrücken wegen ihrer stärkeren Affinität an die Ca²⁺-Ionen. Das Peptid von 27 Aminosäuren mit einer α-Helixstruktur wurde mit dem C-Terminus von Calreticulin-Targetingsignals – GFP Gens verbunden, um den Expressionsvektor pICH8600-C (14) und die 3'-Komponente (pICH9666-C, 14) des viralen Provektor Systems (PCT/EP02/03476) herzustellen. Das Peptid enthält drei Argininreste der Ca²⁺-Pectat Bindungsstelle, die hauptsächlich für die Bindung des APRX-Proteins an Pectin verantwortlich sind.
Das GFP-Protein wurde aus agroinokulierten N. benthamiana Pflanzen auf drei verschiedene Weisen isoliert: a) aus Rohextrakt; b) aus intrazellulärer Flüssigkeit (IF); c) aus ausgepresstem und gewaschenen Pflanzengewebe in Gegenwart von Ca²⁺-haltigem Puffer.
Im Fall a), wurde das GFP-Protein an die Zellwandfraktion des Rohextrakts in Gegenwart von Ca²⁺ gebunden. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und das gebundene GFP-Protein konnte in EGTA-Puffer gelöst werden. Im Fall b) wurde GFP vom Apoplast mit Hilfe von EGTA-haltigem Puffer eluiert. Derselben Puffer wurde verwendet, um GFP von ausgepresstem Pflanzengewebe zu extrahieren. SDS-PAGE und Western Blotting wurden verwendet, um die Ausbeuten und die Effizienz der Reinigung der drei verschiedenen Reinigungsverfahren zu prüfen.
a) Klonieren der Proteinexpressionsvektoren pICH8600-C und pICH9666-C
Die GFP-Sequenz wurde mittels PCR von Konstrukt pICH5290 (35Sprom-sGFP-NOS term) amplifiziert, um die Ca²⁺-Pectat Bindungsstelle im Leserahmen mit dem C-terminalen Ende des GFP-Gens zu fusionieren. Die Sequenz des Vorwärtsprimers (5'-TTTTCC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTGT-3') führte eine NcoI-Stelle am 5'-Ende der GFP-Sequenz ein, während der Rückwärtsprimer (5'-TTTT GGA TCC TAT TCT TGC GGG CCC TCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3') einen 24 bp Spacer nach dem letzten Codon der GFP-Sequenz einführte, gefolgt von einer BamHI-Stelle.
Dieses PCR-Produkt wurde in Konstrukt pICH5290 als NcoI/BamHI-Fragment kloniert, wodurch Konstrukt pICH8155 (35Sprom-sGFP spacer mit 8 Aminosäureresten ohne Stopkodon-NOS Transcriptionsterminationssignal). Die Ca²⁺-Pectat Bindungsstelle wurde in Konstrukt pICH8155 mittels eines Adapters mit Hilfe der folgenden Oligos eingeführt: 5'-cgggatccat tgttaaccgt cttggttctc gtgaaggaa ctttctttag acaatttcgt g-3' und 5'-tgctctagat tacctaatgt ttcccatctt aatcatagaa acacgaaatt gtctaaagaa agttccttc-3'. Vorstehende Enden des Adapters entsprechen BamHI- and XbaI-Stellen, die zum Subklonieren der Ca²⁺-Pectat Bindungsstelle in Konstrukt pICH8155 verwendet wurden. Das Endkonstrukt pICH8600 wurde mit Cla1-Nco1 verdaut und zum Klonieren des Calreticulinsignalpeptids (CSP) als Cla1-Nco1 Fragment (Borisjuk et al., 1999, Nat. Biotechnol., 17, 466-469) verwendet. The GFP-Fusionskassette wurde in den 3'-Provector pICH9422 (nicht gezeigt) als NcoI/XbaI-Fragment kloniert, wobei der 3'-Provector pICH9666 erhalten wurde. pICH9666 wurde mit Cla1-Nco1 verdaut, gelgereinigt und mit dem Cla1-Nco1 Fragment des Calreticulinsignalpeptids ligiert. Das Endkonstrukt pICH9666-C ist in 14 gezeigt.
b) Expression eines GFP-Fusionsproteins in N. benthamina Blättern nach Agroinfiltration der Konstrukte pICH8600-C und pICH9666-C
Die Agroinfiltration von Tabakpflanzen wurde gemäß eines modifizierten Verfahrens von Yang und Kollegen durchgeführt (Yang et al., 2000, Plant J, 22, 543-551). Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101, der mit dem jeweiligen Konstrukt transformiert war, wurde in LB-Medium, das mit Rifampicin 50 mg/L, Carbencillin 50 mg/l and 100 μM (micromolar) Acetosyringone ergänzt war, bei 28°C gezogen. Agrobacterium Zellen einer Übernachtkultur (5 ml) wurden durch Zentrifugieren gewonnen (10 min, 4500 g) und resuspendiert in 10 mM MES (pH 5.5) Puffer, der 10 mM MgSO₄ und 100 μM Acetosyringon enthielt. Bakterialle Suspensionen wurden auf eine OD₆₀₀ of 0.8 eingestellt. Für die Verabreichung mehrerer Konstrukte wurden Agrobacterium Suspensionen verschiedener Konstrukte vor der Infiltration gemischt. Die Agroinfiltration wurde auf beinahe voll expandierten Blättern, die noch mit der intakten Pflanze verbunden waren, durchgeführt. Eine Bakteriensuspension wurde mittels einer 5 ml Spritze infiltriert. Indem 100 μl Bakteriensuspension in jeden Punkt infiltriert werden (typischerweise 2-4 cm² infiltrierte Fläche), konnten 8-16 durch Gefäße separierte Stellen auf einem einzigen Tabakblatt untergebracht werden. Nach der Infiltration wurden die Pflanzen unter Gewächshausbedingungen bei 22°C und 16 h Licht gezogen.
Konstrukt pICH9666-C wurde mit dem entsprechenden 5' Provector pICH4851 und dem Integrasekonstrukt pICP1010 (siehe 15) coinfiltriert. Als Ergebnis der Integrase-vermittelten Rekombination zwischen attP und attB Stellen, wurde ein viraler Vektor assembliert, der ein hohes Maß an GFP exprimierte. Anstatt von pICP1010 kann jeder andere Vektor verwendet werden, der PhiC31 exprimieren kann.
Die Reinigung der GFP-Fusion aus infiltriertem Pflanzenmaterial wurde auf drei verschiedene Weisen durchgeführt:
1) Reinigung durch Bindung an eine Zellwandmatrix:
Blattmaterial, dass die GFP-Fusion exprimierte, wurde mit einem Extraktionspuffer enthaltend 2 mM CaCl₂, 20 mM HEPES pH 7.0, 0.1% Triton-x 100 und 5 mM β-Mercaptoethanol gemahlen. Proben wurden bei 9500 g für 5 min bei 4°C nach Inkubation auf Eis für 60 min zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig entfernt, und das Pellet in 20 mM HEPES pH 7.0 mit 2 mM EGTA und 0.1% Tween 20 resuspendiert, um das GFP-Fusionsprotein zu lösen. Der GFP-Gehalt wurde in den Überständen der Wasch- und Elutionspuffer mittels Western Blotting analysiert.
2) Reinigung durch Elution vom Apoplasten:
Blattmaterial wurde mit 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2mM CaCl₂, 2mM EDTA infiltriert. Die intrazelluläre Flüssigkeit (IF), die sekretierte Proteine jedoch kein GFP enthielt, wurde mittels Zentrifugation bei niederer Geschwindigkeit (2000-3000 g) entfernt. Dieses Verfahren wurden mit dem zweiten Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2mM EDTA) wiederholt. Das mit dem zweiten Extraktionspuffer eluierte GFP wurde zur Western blot Analyse verwendet. Verfahren zur Extraktion von an den Apoplasten geleiteten Proteinen können in mehreren Publikationen gefunden werden (Firek et al., 1993, Plant Mol. Biol., 23, 861-870; Voss et al. 1995, Molecular Breeding, 1, 39-50; De Wilde et al., 1996, Plant Science, 114, 233-24; Kinai et al., 1995, Plant Cell, 7, 677-688; Liu et al., 1996, Plant Science, 121, 123-131). Das hier beschriebenen Verfahren kann gut zur Isolierung von Fusionsproteinen mit einer Ca²⁺-Pectat Bildungsstelle verwendet werden.
3) Reinigung durch Extraktion von ausgepresstem Pflanzengewebe
Das Pflanzengewebe wurde zwischen den Rollen eines Sap-Extraktors (Erich Pollahne, Hannover, Deutschland) drei oder sieben (im Fall des viralen Provektor-Systems) Tage nach der Agroinfiltration in der Gegenwart 2 mM CaCl₂, 20 mM HEPES pH 7.0, 0.1% Triton-x 100 and 5 mM β-Mercaptoethanol ausgepresst. Das verbliebene Pflanzenmaterial wurde einmal mit demselben Puffer gespült, und das Fusionsprotein wurde unter Verwendung von 20 mM HEPES pH 7.0 mit 2 mM EGTA und 0.1% Tween 20 eluiert. Der GFP-Gehalt wurde in den Überständen der Wasch- und Elutionspuffer mittels Western Blotting analysiert.
BEISPIEL 7
Verwendung einer Ca²⁺-Pectat Bindungsstelle zur Herstellung eines zytotoxischen Proteins
Ein synthetisches Gen, das für die EcoRI Endonuclease (Zugriffsnummer No. J01675) kodiert, von NcoI (5' Ende) und BamHI (3' Ende) Restriktionsstellen flankiert wird und ein pflanzliches Splicesomeerkennbares Intron nach 721 bp der EcoRI cDNA enthält, wurde hergestellt. Die folgende Intronsequenz (fettgedruckt) wurde zusammen mit flankierenden EcoRI Endonuclease-Sequenzen (kursiv) verwendet: 5'-tatactcaag gttcgtaaag aacttttta ttttatcagt gtagtttgag cagttgtgac atattgtagt tctttaatac tcatgaaatt gtttttaatt tttaatatgg agtatag gagatggga-3'. Das 940 bp NcoI-BamHI Fragment der synthetischen Sequenz wurde mit dem großen NcoI-XbaI Fragment aus pICH9666-C (14) und dem kleinen BamHI-XbaI Fragment enthaltend die Ca²⁺-Pectat Bindungsstelle ligiert, wobei Plasmid pICH9666-RIA (16) erhalten wurde. Die Religation des großen ClaI-NcoI Klenow- behandelten Fragments aus pICH9666-RIA ergab pICH9666-RI, worin die EcoRI Endonuclease kein Targeting-Signalpeptide für den Apoplast aufweist (16).
Die Agroinfiltration von PVX pICH9666-RIA oder pICH9666-RI zusammen mit dem 5' Provector pICH4851 und dem Integrasekonstrukt pICP1010 wurde wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt. Als Ergebnis der Integrase-vermittelten ortsspezifischen Rekombination, wurde ein Amplifikationsvektor assembliert, der das EcoRI Enzym entweder in den Apoplasten leitet (mit pICH9666-RIA) oder mit zytosolischer Lokalisation (für pICH9666-RI).
Der zytotoxische Effekt der EcoRI im Fall der zytosolischen Lokalisation der EcoRI (Konstrukt pICH9666-RI) war drei Tage später evident und 5 Tage nach der Agroinfiltration war das Blatt stark beschädigt. Das Targeting in den Apoplasten dagegen erlaubte es, die agroinfiltrierten Blätter über einen wesentlich längeren Zeitraum zu bewahren (bis zu zwei Wochen). Die Isolierung des Enzyms aus dem Pflanzengewebe wurde wie in Beispiel 6 beschrieben (1. "Reinigung durch Bindung an eine Zellwandmatrix") 3 und 5 Tage nach der Agroinfiltration aus Pflanzenmaterial durchgeführt. Die Enzymkonzentrationen in Aktivitätseinheiten wurden durch Zugabe von 1 μL verschiedener x10 – x10⁴ Verdünnungen zu 20 μL EcoRI Reaktionspuffer gemessen, der pBS(KS+) mit einem 1,2 kb EcoRI DNA Fragment enthielt. Kommerziell erhältliches EcoRI Enzym wurde zur Bestimmung der Konzentration verwendet. Die relative Ausbeute war ungefähr 50-fach größer im Fall des Targetings des Enzyms in den Apoplasten.
REFERENZBEISPIELE
Die folgenden Referenzbeispiele zeigen die Konstruktion viraler Vektoren und die Expression des GUS-Reportergens über ein IRES-Element. Für weitere Details siehe WO 02/29068.
REFERENZBEISPIEL 1
Konstruktion eines Tobamovirus-Vektors, der Kreuzblütler infiziert
Virione eines bekannten Tombaviruses, der Crucifer-Tombavirus (crTMV) genannt wird und der in der Lage ist, Kreuzblütler systemisch zu infizieren, wurden von Olearacia officinalis L.-Pflanzen, die Mosaik-Symptome auswiesen, isoliert. Die Resultate der Überprüfung der Wirtsspezifität sind in Tabelle 1 gezeigt.
Plasmid-Konstruktion
crTMV-cDNA wurde mit Hilfe der Didesoxynukleotid-Sequenzierung charakterisiert (Dorokhov er al., 1994 FEBS Letters 350, 5-8). Infektiöse voll-Länge cDNA-Klone wurden mit Hilfe des T7 RNA-Polymerase-Promotors in einer RT-PCR-Reaktion mit crTMV-RNA als Template erzeugt. Folgende Oligonukleotide wurden dabei benutzt:
crTMV1-Kpn (upstream):
5'-gcatggtaccccttaatacgactcactataGTTTTAGTTTTATTGCAACAACAACAA
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die KpnI-Restriktionsstelle dar, unterstrichen und klein geschrieben sind die Nukleotide der T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der crTMV-cDNA-Sequenz abgeleitet;
crTMV2 (downstream):
5'-gcatgcggccgcTGGGCCCCTACCCGGGGTTAGGG
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die NotI-Restriktionsstelle dar, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNA-Sequenz abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die KpnI- und BamHI-Restriktionstelle kloniert (12).
Für infektiöse voll-Länge cDNA-Klone, die mit Hilfe des SP6-RNS-Polymerase-Promotors in einer RT-PCR-Reaktion mit crTMV-RNA als Template erzeugt wurden, wurden folgende Oligonukleotide benutzt:
crTMV1-SP6 (stromaufwärts):
5'-gcatggtaccatttaggtgacactatagaactcGTTTTAGTTTTATTGCAACAACAACAA
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die KpnI-Restriktionsstelle dar, unterstrichen und klein geschrieben sind die Nukleotide der SP6-RNA-Polymerase-Promotorsequenz, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der crTMV-cDNA-Sequenz abgeleitet;
crTMV2-SP6 (stromabwärts):
5'-gcatgcggccgcTGGGCCCCTACCCGGGGTTAGGG
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die NotI-Restriktionsstelle dar, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNA-Sequenz abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die KpnI- und BamHI-Restriktionstelle kloniert (12).
Die voll-Länge crTMV-cDNA-Klone wurden mit Hilfe der Didesoxynukleotid-Sequenzierung charakterisiert. Die Fähigkeit von infektiösen crTMV-Transkripten systemisch Nicotiana- und Kreuzblütler-Arten zu infizieren, konnte in Infektions-experimenten mit Nicotiana tabacum var. Samsun bzw. Arabidopsis thaliana bestätigt werden.
REFERENZBEISPIEL 2
Konstruktion eines Tobamovius-Vektors für die Expression des GUS-Gens in Pflanzen der Gattung Nicotiana und der Familie der Kruziferen
Eine Serie von IRES-vermittelten Expressionsvektoren T7/crTMV/GUS wurden wie folgt konstruiert. Zuerst wurden HindIII- und XbaI-Restriktionsstellen in das CP-Gen des SacII/NotI-Fragment des T7/crTMV-Vektors (12) mit Hilfe einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) und zwei Paaren von spezifischen Primern inseriert. Zweitens wurden IRES_MP,75 ^CR-GUS-, IRES_MP,75 ^UI-GUS-, IRES_MP,228 ^CR-GUS-, IRES_CP,148 ^CR-GUS-, IRES_CP,148 ^UI-GUS-, PL-GUS-cDNS, die in Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154) beschrieben sind, in die HindIII- und XbaI-Restriktionsstellen des SacII/NotI-Fragmentes des T7/crTMV-Vektors inseriert, so dass eine SacI-IRES_MP,75 ^CR-GUS-NotI-, SacII-IRES_MP,75 ^UI-GUS-NotI-, SacII-IRES_MP,228 ^CR-GUS-NotI-, SacII-IRES_CP,148 ^CR-GUS-NotI-, SacII-IRES_CP,148 ^II-GUS-NotI- bzw. SacII-PL-GUS-NotI-cDNS erhalten wurde.
Drittens wurde ein SacII-NotI-cDNS-Fragment des T7/crTMV-Vektors durch ein SacI-IRES_MP,75 ^CR-GUS-NotI- oder ein SacII-IRES_MP,75 ^UI-GUS-NotI- oder ein SacII-IRE_MP,228 ^CR-GUS-NotI- oder ein SacII-IRES_CP,148 ^CR-GUS-NotI- oder ein SacII-IRES_CP,148 ^UI-GUS-NotI- oder ein SacII-PL-GUS-NotI-cDNS-Fragment ersetzt, um die Vektoren T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (13), T7/crTMV/IRES_MP,75 ^UI-GUS (13), T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS (13), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (13), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (13) bzw. T7/crTMV/PL-GUS (13) zu erhalten.
REFERENZBEISPIEL 3
Expression des GUS-Gens in transfizierten Nicotiana Pflanzen und solche der Familie der Kruziferen
Dieses Beispiel demonstriert die Tobamovirus IRES-vermittelte Expression des GUS-Gens in Nicotiana benthamiana- und Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die mit den auf dem crTMV-basierenden Vektoren – Vektor T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (13), Vektor T7/crTMV/IRES_MP,75 ^UI-GUS (13), Vektor T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS (13), Vektor T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (13), Vektor T7/crTMV/IRES_CP,148 ^UI-GUS (13) bzw. Vektor T7/crTMV/PL-GUS (13) – infiziert wurden.
In vitro Transkription
Die Plasmide T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (13), T7/crTMV/IRES_MP,75 ^UI-GUS (13), T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS (13), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (13), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^UI-GUS (13) bzw. T7/crTMV/PL-GUS (13) wurden mit NotI linearisiert. Die rekombinanten Plasmide wurden gemäß Dawson et al. (1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1832-1836) in vitro transkribiert. Agarosegelelektrophorese der RNA-Transkripte bestätigte, daß diese intakt waren. Die RNA-Konzentration wurde mittels Agarosegelelektrophorese und Spektrophotometrie quantifiziert.
GUS-Detektion
Inokulierte Blätter wurden 10-14 Tage nach der Transfektion mit geschützten (capped) voll-Länge-Transkripten geerntet. IRES-Aktivität wurde mittels histochemischer Detektion der GUS-Expression wie bei Jefferson beschrieben verfolgt (1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387-405). Die Proben wurden mit dem kolorimetrischen GUS-Substrat infiltriert, wobei die Methode von De Block und Debrouwer (1992, Plant J. 2, 261-266) folgendermaßen modifiziert wurde, um die Diffusion der intermediären Produkte der Reaktion zu limitieren: 0,115 M Phosphatpuffer, pH 7,0 versetzt mit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (x-Gluc) 600 μg/ml; 3 mM Kaliumferricyanid; 10 mM EDTA. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Blätter mit 70% Ethanol entfärbt und lichtmikroskopisch untersucht.
REFERENZBEISPIEL 4
Konstruktion eines spleißbaren Provektors auf PVX-Basis
Zwei Provektoren auf 35-PVX-Basis wurden konstruiert. Plasmid PVX-201 wurde als Ausgangskonstrukt für das Klonieren verwendet (Chapman S. et al., 1992, Plant J, 1992, 2(4):549-57). Dieses Plasmid enthält die cDNA voller Länge des Kartoffelvirus X(PVX)-Genoms (Genbank-Zugangsnummer NC 001455; AF172259), verbunden mit einem 35S-Promotor und dem Nos-Terminator. Die Region des CP-subgenomischen Promotors ist dupliziert, und einige Klonierstellen sind zwischen den verdoppelten Regionen in PVX-201 eingeführt (siehe 18).
Als erster Schritt wurde ein Zwischenkonstrukt pIC2518 erhalten. Dieses Plasmid enthält: den C-Terminus von CP (62 bp) von der XhoI-Stelle bis zum Terminator, wobei eine HindIII-Stelle direkt nach dem Stopp-Kodon eingeführt ist, ein GFP-Gen (enhanced GFP (sGFP)) (Startkodon Teil der NcoI- Stelle) und der 3'-Terminus des PVX-Virus inklusive des C-Terminus von CP (62nt), 3'-UTR und eine Poly-A-Sequenz, gefolgt von einer SacI-Stelle (18).
Zwei Sätze von Oligonucleotiden wurden synthetisiert, um 2 zwei verschiedene Paare von Donor/Akzeptor-Spleißstellen zu klonieren:
Nach dem Annealing ergaben sich die folgenden doppelsträngigen DNA Fragmente:
Im Fall von D1 und D2 sind die 5'-vorstehenden Enden der Fragmente adhäsiv zu ClaI/SalI-gespaltener DNA. Die Fragmente A1 und A2 können in HindIII-NcoI-Stellen ligiert werden.
Das oben beschriebene Plasmid PVX-201 (18) wurde mit ClaI und SalI verdaut. Dann wurden die D1- oder D2-Fragmente in den verdauten Vektor ligiert, was das Konstrukt pIC3033 (im Fall von D1) oder pIC3053 (im Fall von D2) ergab.
Plasmid pIC2518 (18) wurde mit HindIII und NcoI verdaut. Die Ligation von Fragment A1 oder A2 ergab Konstrukt pIC3041 (A1) bzw. pIC3068 (A2).
Zwei Varianten eines spleißbaren PVX-Pro-Vektor-Plasmids wurden erhalten, indem das XhoI/SacI-Fragment aus pIC3041 in pIC3033 und das XhoI/SacI-Fragment aus pIC3068 in pIC3053 kloniert wurde. Die resultierenden Plasmide wurden pIC3242 (Spleißstellen D1 + A1) und pIC3258 (Spleißstellen D2 + A2) genannt (18).
REFERENZBEISPIEL 5
Mikroprojektil-Bombardierung
Die Mikroprojektil-Bombardierung wurde mit dem Biolistic-PDS-1000/He-Particle Delivery System (Bio-Rad) durchgeführt. Getrennte N. benthamiana-Blätter wurden mit 900 psi und 15 mm Abstand vom Makroträgerstartpunkt zum Stoppschild und 60 mm Abstand vom Stoppschild zum Zielgewebe bombardiert. Der Abstand zwischen der Bruchscheibe und dem Startpunkt des Makroträgers betrug 12 mm. Die Zellen wurden nach 4 Stunden osmotischer Vorbehandlung bombardiert.
Das DNA-Gold-Beschichtungsverfahren (PEG/Mg) wurde wie folgt durchgeführt: 25 μl einer Goldsuspension (60 mg/ml in 50% Glycerin) wurden mit 10 μl Plasmid-DNA (bis zu 1 μg/μl) in einem Eppendorf-Gefäß gemischt, und 10 μl einer 40%igen PEG in 1,0 M MgCl₂-Lösung zugesetzt. Die Mischung wurde 2 Minuten lang gevortext und dann bei Raumtemperatur 30 Minuten, ohne zu schütteln, inkubiert. Nach einer Zentrifugation (2000 U/min, 1 min) wurde das Pellet zweimal mit 1 ml 70% Ethanol und einmal mit 1 ml 99,5% Ethanol gewaschen. Schließlich wurde es in 30 μl 99,5% Ethanol dispergiert. Aliquots (6 μl) der DNA-Gold-Suspension in Ethanol wurden auf Makroträgerscheiben geladen und 5 bis 10 Minuten getrocknet.
Plasmid-DNA-Präparation
Plasmide wurden in die E.coli-Stämme DH10B und JM109 transformiert. Maxipreps wurden in LB-Medium gezogen und DNA wurde mit dem Qiagen-Kit gereinigt.
REFERENZBEISPIEL 6
Mechanische Inokulation von Pflanzen mit Pro-Vektor-Plasmid-DNA
Vollentwickelte Blätter von fünf bis sieben Wochen alten Nicotiana benthamiana-Pflanzen wurden durch mechanisches Verletzen mit Plasmid-DNA inokuliert. Zu diesem Zweck wurden 10 bis 50 μg DNA mit 3 × GKP-Puffer (50 mM Glycin, 30 mM K₂HPO₄, 3% Celite, 3% Benthonit) gemisht und vorsichtig auf der Oberseite der Blätter eingekratzt.
REFERENZBEISPIEL 7
Expression eines Reportergens in Pflanzenblättern mit einem gespleißten Provektor auf PVX-Basis
Vollentwickelte N. benthamiana-Blätter wurden mit den Plasmiden pIC3242 und pIC3258 bombardiert. Es wurde erwartet, dass zwei verschiedene RNA-Transkripte von jedem dieser Plasmide in Pflanzenzellen synthetisiert werden können – die vollständige Form und die gespleißte Form (siehe 17).
Die Gegenwart des zweiten Transkripts kann in Zellen, die mit dem Pro-Vektor transfiziert wurden, anhand der GFP-Fluoreszenz detektiert werden.
Starke GFP-Fluoreszenz wurde in zahlreichen mit pIC3242 bombardierten Blattzellen (48 Stunden nach der Bombardierung) beobachtet. Keine GFP-Expression wurde im Fall von pIC3258 beobachtet, so dass dieses Konstrukt als Negativkontrolle in diesem Experiment verwendet werden kann. Dieser Unterschied trat infolge der unterschiedlichen Donor/Akzeptorstellen in den Konstrukten auf (siehe Referenzbeispiel 4). Im Fall von pIC3258 wurde eine 9-nt-Sequenz verwendet, die der Konsensussequenz der Spleißstelle von Arabidopsis thaliana entspricht. Im Fall von pIC3242 wurden die Donor- und Akzeptorstellen wie von Nussaume et al., Mol. gen. genet, 1995, 249-91-101, beschrieben entworfen. Dort wurden sie getestet und ihre Aktivität in Pflanzen bewiesen.
Gemäß zahlreichen Untersuchungen (Fedorkin et al., J Gen. Virol, 2001; 82(Pt2): 449-58, Cruz et al., Plant Cell, 1998; 10(4): 495-510), ist CP von PVX für die virale Zellausbreitung nötig. Im Fall des Konstrukts pIC3242 muss das CP-Gen aus der RNA gespleißt werden. Dies bedeutet, dass die gespleißte Form des Transkripts (18) CP nicht exprimieren und Zellausbreitung des Virus ermöglichen kann. Jedoch wurden in mehreren Experimenten mit pIC3242 nicht nur einzelne Zellen sondern auch GFP-exprimierende, vielzellige Stellen (10-1000 Zellen) detektiert. Dies zeigt an, dass das Spleißen des Pro-Vektor-Transkripts nicht mit 100%iger Effizienz geschieht. Ein Anteil der RNA voller Länge bleibt ungespleißt, und CP kann von dieser Form des Transkripts exprimiert werden, während das GFP-Gen in dieser RNA still ist (keine GFP-Expression wurde im Fall von pIC3258 detektiert).
REFERENZBEISPIEL 8
Erzeugung transgener N. benthamiana-Pflanzen, die Cre-Rekombinase exprimieren
Das Fragment Actin2-Promotor-LoxP-Cre-Orf-Nos-Terminator aus pIC1321 wurde als stumpfes NotI-SacI-Fragment in den SmaI- und SacI-Stellen des binären Vektors pBIN19 subkloniert, was das Konstrukt pIC1593 ergab (29).
Das Plasmid pIC1593 wurde über Elektroporation in den Agrobacterium-Stamm Agl1 eingeführt, und transformierte Agrobakterien wurden für die Transformation von N. benthamiana benutzt. DNA aus 10 Transformanden wurde für die Prüfung auf Anwesenheit des Transgens durch PCR verwendet. Alle Pflanzen wurden positiv befunden, wenn die PCR mit Primern für den Kanamycin-Transformationsmarker oder für das Cre-Gen durchgeführt wurde.
REFERENZBEISPIEL 9
Erzeugung funktioneller Vektoren aus Pro-Vektoren mittels ortsspezifischer Rekombination
a) Allgemeine Beschreibung des Systems
Das beschriebene System besteht aus zwei Kerntypen von Vektoren auf CrTMV-Basis, die LoxP-Rekombinationsstellen haben (23):

i) Vektor-Typ: Polymerase-MP-LoxP: Der Vektor kodiert für die RdRP von CrTMV und für das Movement-Protein (MP), das dem Virus die Zell-Zell-Ausbreitung, jedoch nicht die systemische Ausbreitung ermöglicht. Die virale Transkription wird von dem Arabidopsis-Actin-2-Promotor kontrolliert.
ii) Vektor-Typ: LoxP-gewünschtes Gen-3'NTR-nos-Terminator (siehe 23a-c): Diese Klasse von Vektoren kodiert für ein Reportergen (sGFP oder GUS) und für regulatorische Elemente (nos: Nopalin-Synthase-Terminator; 3'NTR: nicht-translatierte Region, Pseudoknoten und tRNA-ähnliche Struktur aus CrTMV). Die Expression des Hüllproteins (CP; siehe 23b) erlaubt dem Vektor die systemische Ausbreitung in der Wirtspflanze.

Nach der von der Cre-Rekombinase (über Koinfektion eines für Cre kodierenden viralen Konstrukt) katalysierten Rekombination werden funktionelle Einheiten (Replikons) gebildet, die ein Reportergen effizient exprimieren können und sich von Zelle zu Zelle (23A-C) oder systemisch (23B oder Koinfektion anderer Konstrukte mit B) ausbreiten können.
b) Plasmidkonstruktion
A. Klonierung des Vektor-Typs Polymerase-MP-LoxP (24)
Ein EcoRI-XhoI-Fragment von MP wurde aus Plasmid pIC3342 (20) genommen und in Plasmid pIC1212, das zwei LoxP-Stellen in entgegengesetzter Orientierung enthält, kloniert. Das MP-Gen von Plasmid pIC3342 enthält ein Stoppkodon, das 25 Aminosäuren vor dem natürlichen Stopp eingeführt wurde. Im erhaltenen Produkt pIC3431 befindet sich ein Fragment, das ein Teil des MP-Gens enthält, neben einer LoxP-Stelle. Beide Elemente werden über eine EcoRI-SacI-Restriktion isoliert. Nach Abstumpfen der SacI-Restriktionsstelle wurde das Fragment in den Vektor enthaltenen Teil von Plasmid pIC3301 kloniert, welches eine einzige EcoRI-Restriktionsstelle im MP-Gen enthält. NotI (stumpf) wurde als zweite Restriktionsstelle gewählt. Im erhaltenen Ligationsprodukt (pIC3461) sind das CP-Gen, die IRES-Sequenz, das Gen für sGFP und die 3'-nichttranslatierte Region von pIC3301 durch LoxP ersetzt (24).
B. Klonieren von Vektoren mit LoxP-Reportergen-3'NTR-nos-Terminator
a) Das Konstrukt LoxP-sGFP-3'NTR-nos (23a)
Das XhoI-NcoI-Fragment, das eine LoxP-Stelle neben einer Ω-Leitsequenz enthält, wurde aus Vektor pIC2744 genommen. Um die Sequenz neben ein Reportergen zu platzieren, wurde das Fragment in Plasmid pIC1721 kloniert, das die geeigneten Restriktionsstellen neben einem Gen für sGFP und einer 3'NTR-Sequenz enthält. Ersatz einer IRES-Sequenz durch das Fragment führte zu dem resultierenden Plasmid pIC3421. Um eine Nos-Terminator-Sequenz hinzuzufügen, wurde Plasmid pIC3421 mit KpnI und NotI gespalten. Das Fragment wurde in den Vektor enthaltenen Teil von Plasmid pIC3232 eingeführt, und das Endkonstrukt pIC3441 konnte erhalten werden (siehe 25 und 23a).
b) Konstrukt LoxP-CP-sGFP-3'NTR-nos (23b)
Die oben beschriebenen Plasmide pIC3342 und pIC1212 wurden als Startvektoren verwendet. Das PstI-SacI-Fragment aus pIC3342, das die Gene für CP und sGFP enthält, wurde in pIC1212 kloniert. Als Ergebnis befindet sich eine LoxP-Stelle neben CP und sGFP in dem Produkt pIC3451. Um eine Nos-Terminationssequenz hinzuzufügen, wurde ein ähnliches Verfahren wie in a) verwendet: Das EcoRI-NotI-Fragment aus pIC3451 wurde in den Vektor-enthaltenen Teil von pIC3232 eingeführt, was Plasmid pIC3491 (siehe 26) ergab.
c) Konstrukt LoxP-CP-GUS-3'NTR-nos (23c)
Plasmid pIC751 ist analog zu pIC1721 und trägt ein GUS-Reportergen anstatt von sGFP. Durch Schneiden mit NcoI und NotI kann das GUS-Gen und der 3'-untranslatierte Bereich direkt in pIC3441 kloniert werde, was das Endkonstrukt pIC3521 ergibt (27).
REFERENZBEISPIEL 10
Expression eines einzelnen Reportergens in Pflanzenblättern durch einen umgewandelten (rekombinierten) Provektor auf CrTMV-Basis
Getrennte N. benthamiana-Blätter wurden mit einem Gemisch aus drei Plasmiden partikelbombardiert: pIC3441 (LoxP-GFP, 25), pIC3461 (Actin2 Promotor-CrTMV RdRp-MP-LoxP, 24) und pIC2721 (Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des hbt-Promotors). GFP-Fluoreszenz wurde in mehreren Multizellorten 38 Stunden nach der Bombardierung detektiert. Ein starker Anstieg der Fluoreszenz und der Größe des infizierten Bereichs wurde während der folgenden Tage beobachtet. (Bombardierte Blätter wurden bei 25°C auf nassem Filterpapier inkubiert). Keine GFP-Fluoreszenz wurde in Kontrollblättern beobachtet, die mit pIC3441 zusammen mit pIC2721 ohne pIC3461 bombardiert wurden.
REFERENZBEISPIEL 11
Expression mehrerer Gene in Pflanzenzellen über einen rekombinierten Provektor auf CrTMV-Basis
Getrennte N. benthamiana-Blätter wurden partikelbombardiert mit einem Gemisch aus mehreren Plasmiden:

a) pIC3441 (LoxP-GFP, 25), pIC3461 (Actin 2 Promotor-CrTMV RdRP-MP-LoxP, 24) und pIC2721 (Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des hbt-Promotors), pIC3521 (LoxP-GUS, 27),
b) pIC3441 (LoxP-GFP, 25), pIC3461 (Actin2 Promotor-CrTMV RdRp-MP-LoxP, 24) und pIC2721 (Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des hbt-Promotors), pIC3491 (LoxP-CP, 26).

Beide Reportergene GFP und GUS wurden im Fall von a) in bombardierten Blättern stark exprimiert. Bildung viraler Partikel und systemische Ausbreitung des Virus finden im Fall b) statt.
REFERENZBEISPIEL 12
Konstruktion eines spleißbaren Provektors auf CrTMV-Basis
Spleißbare Provektoren auf der Grundlage des CrTMV-Virus haben bestimmte Vorteile im Vergleich mit solchen auf PVX-Basis. Das in 19 beschriebene System erlaubt die Herstellung eines Reportergen-exprimierenden Systems aus dem Virus, das in infizierten Blättern voll funktionsfähig ist. Im Gegensatz zu PVX ist das Hüllprotein von CrTMV nicht für die Zell-Zell-Ausbreitung des Virus notwendig, so dass das Spleißen die virale Ausbreitung im infizierten Blatt nicht beeinflusst.
A. Klonierung des Zwischenkonstrukts pIC3312
Ein PCR-Fragment wurde aus klonierter cDNA von CrTMV und den folgenden Primern erhalten: MPERI+ (entspricht der mittleren Region von MP, einschließlich der EcoRI-Stelle – Position 5455 im CrTMV-Genom): GTGGTTGACGAATTCGTC:
MP- (komplementär zum C-Terminus von MP 17 Aminosäuren stromaufwärts des natürlichen Stoppkodons, Einführung eines künstlichen Terminators mit den stromabwärts gelegenen ClaI- und XhoI-Stellen. Auch dieser Primer enthält eine Punktmutation in CP von ATG nach ACG, die den natürlichen Start des CP-Gens ohne Aminosäureaustausch in MP entfernt): GGTCTCGAGTTATCGATTATTCGGG TTTGTAATGTTGTAAGACGTTTTCTTCTTTC
Ein anderes PCR-Fragment wurde mit demselben Templat und den folgenden Primern erhalten: CP+ (entspricht dem Beginn des CP-Gens mit XhoI- und PstI-Stellen, die stromauf von ATG eingeführt werden): TAACTCGAGACCTGCAGCATGTCTTACAACATTACAAACC-CGAATCAG.
CP- (komplementär zum C-Terminus von CP; führt einen Basenaustausch zur Eliminierung der NcoI-Stelle im CP-Gen ein. Auch dieser Primer führt HindIII- und NcoI-Restriktionsstellen stromabwärts des CP-Gens ein): CTACTCCATGGTCAAGCTTAAGTAGC-AGCAGCAGTAGTCCACGGCACC.
Zuerst wurde das PCR-Fragment mit den EcoRI- und XhoI-Enzymen verdaut. Dann wurden die XhoI- und NcoI-Fragmente über die EcoRI- und NcoI-Stellen in den Vektor pIC1721 (20) hineinligiert, was Plasmid pIC3151 ergab (20). Dann wurde pIC3151 mit KpnI-EcoRV verdaut, die KpnI-Ste11e wurde mit T4 DNA-Polymerase abgestumpft, und das gespaltene Plasmid wurde selbst ligiert, um die Stellen zwischen KpnI und EcoRV zu eliminieren. Das erhaltene Plasmid wurde pIC3312 genannt (siehe 20).
B. Klonieren des spleißbaren Pro-Vektors pIC3393 und des Kontrollkonstrukts pIC3401
Die in Referenzbeispiel 4 beschriebenen Spleißdonor- und Spleißakzeptorstellen enthaltenden dsDNA-Fragmente wurden in pIC3312 kloniert unter Verwendung von ClaI- und XhoI-Stellen im Fall von Donor und HindIII und NcoI im Fall der Spleißakzeptorstellen (siehe 21). Die erhaltenen Plasmide wurden pIC3378 (Donorstelle) und pIC3382 (Akzeptorstelle) genannt.
Um das Negativkontrollkonstrukt pIC3401 zu erhalten, wurde das pIC3401 EcoRI-NotI-Fragment aus pIC3382 in pIC3301 kloniert (22).
Das Endkonstrukt pIC3393 wurde über Zwei-Fragment-Klonierung unter Verwendung des EcoRI-PstI-Fragments aus pIC3378 mit dem PstI-NotI-Fragment aus pIC3382 und dem mit EcoRI und NotI verdauten pIC3301 als Vektor erhalten (22).
REFERENZBEISPIEL 13
Expression eines Reportergens in Pflanzenblättern mit einem spleißbaren Provektor auf CrTMV-Basis
Getrennte N. benthamian-Blätter wurden partikelbombardiert mit den Plasmiden pIC3393 und pIC3401. GFP-Fluoreszenz wurde in mehreren Mehrzellorten 48 Stunden nach der Bombardierung im Fall von pIC3393 beobachtet. Keine GFP-Fluoreszenz erschien in mit dem Kontrollkonstrukt pIC3401 bombardierten Blättern.
REFERENZBEISPIEL 14
Expression eines gewünschten Gens von einem viralen Vektor, der aus zwei CrTMV-basierten Provektoren mittels ortsspezifischer att/Integrase-basierten Rekombinationssystems assembliert wird
a) Allgemeine Beschreibung des Systems
Dieses System umfasst zwei zentrale Typen von CrTMV-basierten Vektoren, die attB- oder attP-Rekombinationsstellen aufweisen (30):

i) Vektortyp: Polymerase-MP-attP: der Vektor kodiert für RdRp von CrTMV und wird das movement protein (MP), was die Ausbreitung des Virus von Zelle zu Zelle, nicht jedoch die systemische Ausbreitung ermöglicht. Die virale Transkription wird von einem Arabidopsis-Actin 2 Promotor kontrolliert.
ii) Vektortyp: attB-gewünschtes Gen-3'NTR-nos-Terminator (siehe 30a-b): dieser Vektortyp kodiert für ein Reportergen (sGFP oder GUS) und für regulatorische Elemente (nos: Nopalin-Synthase Terminator; 3' NTR: nichttranslatierte Region, Pseudoknots und tRNA-ähnliche Struktur von CrTMV).
iii) Vektortyp: attB-Ubiquitin-gewünschtes Gen-3'NTR-nos-Terminator (siehe 30c): um ein definiertes Protein zu erhalten, das aus Pflanzen isoliert werden kann, wurde eine Ubiquitin-Spaltsignalsequenz zwischen die attB-Rekombinationsstelle und das stromabwärts gelegenen gewünschte Gen (z.B. GFP, Interferon 2B, Insulin oder Somatotropin) eingeführt. Indem dieses System verwendet wird, kann jede Aminosäure außer Prolin als die erste Aminosäure des synthetisierten Proteins gewählt werden.

Nach der durch das Integraseenzym katalysierten Rekombination (über Koinfektion eines für die Integrase kodierenden viralen Konstrukts) werden funktionale Einheiten (Replikons) gebildet, die das gewünschte Gen effizient exprimieren können und zur Ausbreitung von Zelle zu Zelle befähigt sind (23A-C).
b) Plasmidkonstruktion
A) Klonieren des Vektortyps: Polymerase-MP-attP (31)

Ein KpnI-XhoI-Fragment wurde Plasmid pIC3461 (31) entnommen. Nach der Erzeugung stumpfer Enden der XhoI-Restriktionstelle wurde das Fragment in den binären Vektor pIC3994 kloniert, der zwei attB-Stellen in direkter Orientierung, linke und rechte T-DNA Grenzen (LB und RB) und eine Kanamycin-Expressionskassette als pflanzlichen Transformationsmarker enthält. Wie der analoge Klon des Cre/Lox-Systems, trägt das erhaltene Plasmid pIC4851 ein MP Gen mit einem Terminatorcodon, das 25 Aminosäuren vor dem natürlichen Stoppkodon eingeführt würde. B. Klonieren des Vektortyps: attB-gewünschtes Gen-3'NTR-nos-Terminator (Fig. 27-35) Primerkombination A)

AttB Xho(+):	ATCACTCGAGCTCGAAGCCGCGGTGCGGGT: komplementär zum 5'-Ende von attB und mit einer XhoI-Restriktionstelle am 5'-Terminus.
AttB Ω (-):	GGTAATTGTTGTAAAAATACGATGGGTGAAGGTGGAGTACG: Der 3'-Teil des Primers entspricht der 3'-Regionen der attB-Sequenz, der 5'-Teil enthält 20 Nukleotide komplementär zum 5'-Teil des Ω-Elements.

Primerkombination A wurde auf ein attB-enthaltendes Templat angewandt, um ein PCR-Produkt zu erhalten, das aus der vollständigen attB-Sequenz, 20 nt der Ω-Leadersequenz und einer XhoI-Restriktionstelle am 5'-Ende besteht. Primerkombination B)

AttB Ω (+):	CGTACTCCACCTCACCCATCGTATTTTTACAACAATTACC: Der 3'-Teil des Primers entspricht der 5'-Region der Ω-Sequenz, der 5'-Teil enthält 20 Nukleotide mit Komplementarität zum 5'-Teil des attB-Elements.
Ω-NcoI (-):	CATGCCATGGGTAATTGTAAATAGTAATTGTAATGTT: komplementär zum 3'-Teil von Ω mit einer NcoI-Restriktionstelle am 5'-Terminus.

Primerkombination B wurde auf ein Templat angewandt, das eine Ω-Sequenz enthielt, um ein PCR-Produkt zu erhalten, das die vollständige Sequenz des Ω-Leaders, 20 nt der attB-Rekombinationsstelle und eine NcoI-Restriktionstelle am 3'-Ende enthält.
Nachdem PCR Produkte mit den Primerkombinationen A und B erhalten worden waren, wurden die isolierten Oligonukleotide zusammen als Template für eine PCR-Reaktion verwendet, wobei die Primer attB XhoI (+) und Ω NcoI (-) verwendet wurden. Schließlich konnte ein PCR-Produkt synthetisiert werden, das eine Fusion der attB-Rekombinationssequenz und der Ω-Leadersequenz ist. Dieses Fragment enthält XhoI- und NcoI-Restriktionsstellen an seinen Enden. Das PCR-Produkt wurde isoliert, verdaut und in die XhoI- und NcoI-Stellen des Plasmids pICH3441 kloniert, um die LoxP-Ω-Fusion zu ersetzen. Das intermediäre Plasmid wurde mit KpnI und HindIII behandelt. Durch Inserieren dieses Fragments in die entsprechenden Stellen des binären Vektors BV10, konnte ein attB-sGFP-3'NTR-nos Vektor erhalten werden, der in Agrobacetrium transformiert werden kann (pICH5151, siehe 32).
Ein ähnlicher Ansatz wurde zum Klonieren eines analogen Provektors mit dem Reportergen GUS verfolgt. Das oben beschriebene PCR-Fragment wurde in die XhoI- und NcoI-Stellen des GUS-enthaltenden Plasmids pICH3521 kloniert, wobei Plasmid pICH4061 erhalten wurde. Schließlich wurde ein KpnI-HindIII-Fragment aus Plasmid pICH4061 in den binären Vektor BV10 ligiert, wobei der Vektor pICH5161 erhalten wurde, zur stabilen Agrobacetrium-Transformation (pICH5161, siehe 33) geeignet ist.

C) Konstruktion eines 3'-Provektors, der attB-Ubiquitin-Interferon enthält Um eine Fusion einer Ubiquitinsequenz und Interferon α2B in einen 3'-Provektor zu klonieren, wurden beide Sequenzen als Fusion synthetisiert und in pUC19 kloniert, wobei Plasmid pUC5760 erhalten wurde. Der Vektor wurde mit NcoI und PstI verdaut, und das erhaltene Fragment in die entsprechenden Restriktionstellen von Plasmid pICH5781 ligiert. Das erhaltene Plasmid pICH5951 enthält eine attB-Rekombinationsstelle, die Ubiquitin-Interferon-Fusion, eine 3'-nichttranslatierte Region, einen nos Promoter und eine Kanamycin-Expressionskassette. All diese Sequenzen werden von den T-DNA Grenzen (LB und RB, siehe 34) flankiert.
D) Um die Ω-Sequenz durch verschiedene IRES-Elemente zu ersetzen, die als Translations-Enhancer dienen, wurde ein ClaI/ApaI-Fragment aus Plasmid pIC1701 (das IRES_mp75(U1) enthält) oder pICH1731 (das IRES_mp75(cr) enthält) gewonnen. Die Fragmente wurden in das Plasmid pICH5939 (ähnlich zu Plasmid pICH5781, jedoch ohne NcoI-Restriktionstelle, mit ATG-Sequenz als Transkriptions-initiationscodon) kloniert. In den erhaltenen binären Vektoren (pICH6871, pICH6891) liegt die attB-Rekombinationsstelle benachbart zu einer IRES-Sequenz von 75 bp (6871: U1-Origin, 6891: CrTMV-Origin), einem sGFP-Reportergen und regulatorischen Elementen 3'NTR und nos.
E) Konieren des Vektortyps Polymerase-MP-LoxP in binäre Vektoren Um den Provektor enthaltend Polymerase-MP mit LoxP in einen binären Vektor zu klonieren, wurde ein KpnI/XhoI und ein XhoI/HindIII Fragment zusammen in den Vektor pICB V 10, der mit HindIII und KpnI verdaut war, kloniert. Das erhaltene Plasmid pICH4371 kann stabil in Agrobacetrium transformiert werden (36).
F) Klonieren des Vektortyps LoxP-gewünschtes Gen-3'NTR-nos-Terminator in einen binären Vektor Eine analoge Klonierungsstrategie wie in E) wurde verwendet, um den Provektor enthaltend LoxP-Reportergen in einen binären Vektor zu klonieren. Plasmid pICH3441 wurde mit den Enzymen KpnI und HindIII verdaut. Das erhaltene Fragment wurde in die entsprechenden Stellen von pICBV10 inseriert, wobei das binäre Plasmid pICH4461 (siehe 37) erhalten wurde.

REFERENZBEISPIEL 15
Einführen viraler Vektorkonstrukte durch Infiltration einer Agrobacetrium tumefaciens-Suspension in Blätter von N. benthamiana und N. tabacum
Alle Provektoren der Cre/Lox und Integrase/att-Systeme wurden in binäre Vektoren kloniert, die stabil in Agrobacetrium transformiert werden können. Alternative Methoden zum Einführen von DNA sind verfügbar.
Eine sehr einfache Methode zum Einführen ist die Infiltration von Agrobacetrium-Suspensionen in intakte Blätter. Diese so genannte Agroinfiltration wurde ursprünglich entwickelt, um die Expression von Fremdgenen und das Gene Silencing in Pflanzen zu untersuchen (Kaplia et al., 1997, Plant Science, 122, 101-108; Schöb et al. 1997, Mol. Gen. Genet., 256, 581-588). Die Agroinfiltration transgener Tabakpflanzen wurde gemäß eines modifizierten Protokolls gemäß Yang et al., 2000, The Plant J. 22(6), 543-551 durchgeführt. Der Agrobacetrium tumefaciens Stamm GV3101 wurde mit den einzelnen Konstrukten (pICH4851, pICH5151, pICP1010, 15) transformiert und bei 28°C in LB-Medium herangezogen, das Rifampicin 50 mg/l, Carbenicillin 50 mg/l und 100 μM Acetosyringon enthielt. Agrobacetrium Zellen einer Übernachtkultur (5 ml) wurde mittels Zentrifugation (10 min, 4500 g) gewonnen und in 10 mM MES (pH 5,5)-Puffer, der mit 10 mM MgSO₄ und 100 μM Acetosyringon ergänzt war, resuspendiert. Die Bakteriensuspension wurden auf eine OD₆₀₀ von 0,8 eingestellt. Wenn mehrere Konstrukte eingeführt werden sollten, wurden Agrobacetrium-Suspension verschiedener Konstrukte in gleichem Volumina vor der Infiltration gemischt.
Die Agroinfiltration wurde auf beinahe voll expandierten Blättern, die noch mit der intakten Pflanze verbunden waren, durchgeführt. Eine Bakteriensuspension wurde mittels einer 5 ml Spritze infiltriert. Indem 100 μl Bakteriensuspension in jeden Punkt infiltriert werden (typischerweise 2-4 cm² infiltrierte Fläche), konnten 8-16 durch Gefäße separierte Stellen auf einem einzigen Tabakblatt untergebracht werden. Nach der Infiltration wurden die Pflanzen unter Gewächshausbedingungen bei 22°C und 16 h Licht gezogen.
Blätter von N. benthamiana und N. tabacum, die mit den Konstrukten infiltriert waren, zeigen expandierende Sektoren starker GFP-Expression 8-12 Tage nach der Infiltration. Die Expression konnte unter UV-Licht direkt auf den infiltrierte Blättern beobachtet werden. Keine GFP-Expression konnte in den Kontrollexperimenten (Provektorkombination ohne Integraseklon) beobachtet werden.
REFERENZBEISPIEL 16
Einführen viraler Provektoren durch Infiltration einer Agrobacetrium tumefaciens-Suspension in Blätter von transgenen Tabakpflanzen, die Cre-Rekombinase exprimieren (pICH1754)
Blätter von transgenen Tabakpflanzen (transformiertes Konstrukt: pICH1754, Spezies: Nicotiana tabacum), die mit den Konstrukten pICH4371 und pICH4461 infiltriert waren, zeigten 16 Tage nach der Infiltration wachsende Sektoren starker GFP-Expression, die unter UV-Licht in intakten Pflanzen ohne Mikroskop beobachtet werden konnten. Keine GFP-Expression war in wildtyp Blättern, die mit der gleichen Agrobacterium-Suspensionsmischung infiltriert waren, sichtbar.
REFERENZBEISPIEL 17
Die Verwendung von IRES-Sequenzen viralen Ursprungs (IRES_mp75 von CrTMV oder U1) als Translationsenhancersequenzen
Die Anwesenheit einer att- oder LoxP-Rekombinationsstelle zwischen Promotor und einem stromabwärts gelegenen Gen limitiert die Effizienz der Translation. Daher ist es in den meisten Fällen nötig, Translationsenhancersequenzen zu verwenden, um ein geeignetes Expressionsniveau des Reportergens im Provektor-System zu erhalten. Das Klonieren der viralen IRES Sequenzen IRES_mp75(U1) oder IRES_mp75(cr) zwischen die attB-Rekombinationsstelle und GFP steigert die Expression des Reportergens. Während Pflanzen, die mit GFP-enthaltenden Provektoren infiltriert wurden, die keinen Translationsenhancer enthalten, beinahe keine detektierbare GFP-Expression nach 10 Tagen zeigen, führte die Verwendung der IRES-Sequenz zu einer GFP-Expression, die unter UV-Licht nach 5 Tagen ohne Mikroskop detektiert werden kann. Das Expressionsniveau des gewünschten Gens infolge IRES_mp75-basierter Translationsenhanceraktivität ist vergleichbar oder sogar höher als dasjenige des „Omega"-Translationsenhancers.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins oder Polypeptids in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen, umfassend (i) Transformieren oder Transfizieren von einer Pflanze oder von Pflanzenzellen mit einem viralen Vektor, wobei der virale Vektor eine Nukleotidsequenz enthält, die eine kodierende Region aufweist, die für ein Fusionsprotein kodiert, wobei das Fusionsprotein das gewünschte Protein oder Polypeptid, ein Signalpeptid, welches das Fusionsprotein in den Apoplast leiten kann, und ein Polypeptid umfasst, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, (ii) Anreichern von Zellwandkomponenten, die exprimiertes und gebundenes Fusionsprotein aufweisen, und (iii) Abtrennen des gewünschten Proteins oder Polypeptids oder eines Proteins, das das gewünschte Protein oder Polypeptid umfasst, von den Zellwandkomponenten.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze zur transienten Expression des Fusionsproteins transfiziert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Pflanze zu einem gewünschten Wachstumsgrad herangezogen wird bevor Schritt (i) ausgefüht wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Anreichern von Zellwandkomponenten von Schritt (ii) mechanisches, physikalisches oder chemisches Abtrennen von Zellinhaltstoffen umfasst.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, an ein Polysaccharid der pflanzlichen Zellwand bindet.
Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, an β-1,4 Glycan bindet.
Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, an Cellulose bindet.
Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, an Hemicellulose bindet.
Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, an Pectin bindet.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Fusionsprotein eine Pectin-Methylesterase oder ein funktionelles Fragment derselben umfasst, die/das als das Signalpeptid und als das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, wirkt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Fusionsprotein die cysteinreiche Domäne des Proteins NtTLPR aus Tabak oder ein funktionelles Fragment desselben umfasst, das das Fusionsprotein kovalent an eine Zellwandkomponente binden kann.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, das ferner die Spaltung des Fusionsproteins umfasst, um das gewünschte Protein oder Polypeptid frei von dem Signalpeptid und/oder dem Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Fusionsprotein eine Spaltsequenz umfasst, die die Spaltung des Fusionsproteins erlaubt.
Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Spaltsequenz von einer ortsspezifischen Protease erkannt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Spaltsequenz den C-terminalen Bereich von Ubiquitin umfasst.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Fusionsprotein das Signalpeptid an seinem N-terminalen Ende enthält gefolgt von dem Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, gefolgt von dem gewünschten Protein oder Polypeptid.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Fusionsprotein das Signalpeptid an seinem N-terminalen Ende enthält gefolgt von dem gewünschten Protein oder Polypeptid, gefolgt von dem Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Fusionsprotein das Signalpeptid an seinem N-terminalen Ende enthält, und wobei das gewünschte Protein oder Polypeptid auf beiden Seiten von einem Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, flankiert wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Nukleotidsequenz zur Transformation oder Transfektion einer Pflanze oder von Pflanzenzellen DNA ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Nukleotidsequenz zur Transformation oder Transfektion einer Pflanze oder von Pflanzenzellen RNA ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das gewünschte Protein oder Polypeptid ein oder mehrere Affinitätspeptidtags aufweist.
Das Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Affinitätspeptidmarkierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Oleosinprotein oder einem Teil desselben, einem Intein oder einem Teil desselben, einer weiteren Domaine, die an die Zellwand binden kann, ein Stärkebindeprotein, eine Streptavidinepitopmarkierungssequenz, eine Glutathion-S-Transferase (GST)-Affinitätsmarkierung, eine 6× His-Affinitätsmarkierung, eine Calmodulinbindepeptid (CBP)-Affinitätsmarkierung.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Nukleotidsequenz in der Pflanze durch ein Verfahren amplifiziert und/oder exprimiert wird, das umfasst: Versehen der Pflanze oder Zellen einer solchen mit mindestens einem Vorläufervektor, der so entworfen ist, dass er in der Zelle prozessiert wird, wobei die Pflanzenzelle infolge der Prozessierung mit mindestens einem Replikon ausgestattet wird, das die Amplifikaiton und/oder Replikation bewirkt.
Das Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Pflanze oder Zellen derselben mit mindestens zwei Vorläufervektoren versehen wird.
Das Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Pflanzenzelle infolge der Prozessierung mit mindestens zwei Replikons ausgestattet wird, die (a) infolge der Prozessierung miteinander strukturell verwandt sind, (b) funktionell voneinander verschieden sind, und (c) die Amplifizierung oder Expression erlauben.