BRPI0618295A2 - método para aumentar o teor total de óleo em plantas oleaginosas transgênicas de safra - Google Patents

Abstract

METODO PARA AUMENTAR O TEOR TOTAL DE óLEO EM PLANTAS OLEAGINOSAS TRANSGêNICAS DE SAFRA A invenção refere-se aos métodos para aumentar o teor de óleo total e/ou o teor de glicerol-3-fosfato em plantas oleaginosas transgênicas, que contêm pelo menos 20% em peso de ácido oleico em relação ao teor de ácido graxo total, preferivelmente em sementes de planta, pela expressão de glicerol-3 -fosfato-desidrogenases (G3PDH) de leveduras, preferivelmente de Saccharomyces cerevisiae. Vantajosamente, o óleo obtido por este método e/ou os ácidos graxos são adicionados em polímeros, gêneros alimentícios e rações animais, cosméticos, produtos farmacêuticos ou produtos com aplicações industriais.

Description

"MÉTODO PARA AUMENTAR O TEOR TOTAL DE ÓLEO EM

PLANTAS OLEAGINOSAS TRANSGÊNICAS DE SAFRA"

Descrição

A invenção refere-se aos métodos de aumentar o teor total deóleo e/ou o teor de glicerol-3-fosfato em plantas oleaginosas transgênicas desafra que compreendem pelo menos 20% em peso de ácido oleico baseado noteor de ácido graxo total, preferivelmente em sementes de planta, pelaexpressão de glicerol-3-fosfato-desidrogenases (G3PDHs) de leveduras,preferivelmente de Saccharomyces cerevisiae. O óleo e/ou os ácidos graxosobtidos no processo são vantajosamente adicionados em polímeros, gênerosalimentícios, rações animais, cosméticos, fármacos ou produtos comaplicações industriais.

O aumento do teor total de óleo e/ou do teor de glicerol-3 -fosfato em plantas oleaginosas transgênicas de safra e em particular emsementes de planta é de grande interesse em geração de planta tantotradicional quanto moderna e em particular em biotecnologia de planta.Devido ao consume crescente de óleos vegetais para nutrição ou aplicaçõesindustriais, possibilidades de aumentar ou modificar óleos vegetais são cadavez mais o tema de pesquisa corrente [por exemplo Tõpfer et al. (1995)Science 268:681-686]. Seu objetivo é em particular aumentar o teor de ácidograxo em óleos de semente.

Os ácidos graxos que podem ser obtidos dos óleos vegetaistambém são de interesse particular. São empregados, por exemplo, comobases para plastificantes, lubrificantes, tensoativos, cosméticos e semelhantese são empregados como matérias-primas valiosas nas indústrias de ração e dealimento. Assim, por exemplo, é de interesse particular proporcionar óleos decolza com ácidos graxos com comprimento de cadeia médio porque estesestão em demanda em particular na produção de tensoativos.

A modulação selecionada das rotas metabólicas de planta pormétodos recombinantes permite a modificação do metabolismo de planta emuma maneira vantajosa que, quando usando métodos de geração tradicionais,poderia apenas ser alcançada após um procedimento complicado, se puder.Assim, ácidos graxos incomuns, por exemplo ácidos graxos poliinsaturadosespecíficos, são apenas sintetizados em certas plantas ou não em plantas epodem ser portanto apenas produzidos pela expressão da enzima relevante emplantas transgênicas [por exemplo Millar et al. (2000) Trends Plant Sci 5:95-101].

Triacilglicerídeos e outros lipídeos são sintetizados a partir deácidos graxos. A biossíntese de ácido graxo e a biossíntese de triacilglicerídeopodem ser consideradas rotas biossintéticas separadas devido àcompartimentalização, mas como uma única rota biossintética em vista doproduto final. A síntese de lipídeo pode ser dividida em dois mecanismosparciais, um que pode ser chamado de "procariótico" e o outro que pode serchamado de "eucariótico" (Browse et al. (1986) Biochemical J 235:25-31;Ohlrogge & Browse (1995) Plant Cell 7:957-970). O mecanismo procarióticoda síntese está localizado nos plastídeos e compreende a biossíntese dosácidos graxos que são exportados para dentro do citosol, onde entram nomecanismo eucariótico na forma de ésteres de ácido-graxo-acil-CoA e sãoesterificados com glicerol-3-fosfato (G3P) para proporcionar ácido fosfatídico(PA). PA é o ponto de partida para a síntese de lipídeos neutros e polares. Oslipídeos neutros são sintetizados no retículo endoplasmático via a rota deKennedy, inter alia [Voelker (1996) Genetic Engineering, Setlow (ed.)18:111-113; Shankline & Cahoon (1998) Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol 49:611-649; Frentzen (1998) Lipids 100:161-166]. Além da biossíntesede triacilglicerídeos, G3P também desempenha um papel na síntese deglicerol (por exemplo para os propósitos de osmorregulação e contra estressede temperatura baixa).

GP3, que é essencial para a síntese, é sintetizado aqui pelaredução de di-hidróxi-acetona-fosfato (DHAP) por meio de glicerol-3-fosfato-desidrogenase (G3PDH), também chamada de di-hidróxi-acetona-fosfato-redutase. Como uma regra, NADH atua como co-substrato redutor (EC1.1.1.8). Uma outra classe de glicerol-3-fosfato-desidrogenases (EC 1.1.99.5)utiliza FAD como co-substrato. As enzimas desta classe catalisam a reação deDHAP a G3PDH. Em células eucarióticas, as duas classes de enzimas sãodistribuídas em compartimentos diferentes, aqueles que são dependentes deNAD estando localizados no citosol e aqueles que são dependentes de FADestando localizados na mitocôndria (para Saccharomyces cerevisiae, veja, porexemplo, Larsson et al., 1998, Yeast 14:347-357).

EP-A 0.353.049 descreve um G3PDH independente de NADde Bacillus sp. Um G3PDH independente de NAD também tem sidoidentificado em Saccharomyces cerevisiae [Miyata K, Nagahisa M (1969)Plant Cell Physiol 10 (3):635-643].

G3PDH é uma enzima essencial em procariotos e eucariotosque, além de ter uma função em biossíntese de lipídeo, é uma das enzimasresponsáveis pela manutenção do estado redox celular pela atuação sobre arazão de NAD+/NADH. Deleção do gene GPD2 em Saccharomycescerevisiae (uma das duas isoformas de G3PDH nesta levedura) resulta emcrescimento reduzido sob condições anaeróbicas. Em adição, G3PDH parecedesempenhar um papel na resposta ao estresse de levedura principalmente aoestresse osmótico. Deleção do gene GPDl em Saccharomyces cerevisiaecausa hipersensibilidade ao cloreto de sódio.

Seqüências para G3PDHs têm sido adicionalmente descritaspara insetos (Drosophila melanogaster, Drosophila virilis), plantas(Arabidopsis thaliana, Cuphea lanceolata), mamíferos (Homo sapiens, Musmusculus, Sus scrofa, Rattus norvegicus), peixes (Salmo salar, Osmerusmordax), aves (Ovis aries), anfíbios (Xenopus laevis), nematódeos(Caenorhabditis elegans), algas e bactérias.Células de planta possuem pelo menos duas isoformas deG3PDH, uma isoforma citoplásmica e uma isoforma plastídica [Gee RW et al.(1988) Plant Physiol 86:98-103; Gee RW et al. (1988) Plant Physiol 87:379-383]. Em plantas, a atividade enzimática de glicerol-3-fosfato-desidrogenasefoi primeiro encontrada em tubérculos de batata [Santora GT et al. (1979)Arch Biochem Biophys 196:403-411]. Ademais atividades de G3PDH queestavam localizadas no citosol e nos plastídeos foram detectadas em outrasplantas tais como ervilhas, milho ou soja [Gee RW et al. (1988) PLANTPHYSIOL 86(1): 98-103]. G3PDHs de algas tais como, por exemplo, duasisoformas de G3PDH de plastídeo e uma isoforma citosólica de G3PDH deDunaliella tertiolecta têm sido adicionalmente descritas [Gee R et al.(1993)Plant Physiol 103(l):243-249; Gee R et al. (1989) PLANT PHYSIOL91(1):345-351]. Com relação à G3PDH de planta de Cuphea lanceolata, temsido proposto obter um teor de óleo aumentado ou um deslocamento nopadrão de ácido graxo por sobreexpressão da enzima, em plantas (WO95/06733). Contudo, tais efeitos não têm sido provados.

G3PDHs bacterianas e sua função têm sido descritas [Hsu eFox (1970) J Bacteriol 103:410-416 e Bell (1974) J Baeteriol 117:1065-1076].

WO 01/21820 descreve a expressão heteróloga de umaG3PDH de E. coli mutada para tolerância ao estresse aumentada emodificação da composição de ácido graxo em óleos de armazenagem. AG3PDH de E. coli mutada (gpsA2FR) exibe uma única substituição deaminoácido que acarreta inibição reduzida via G3P. A expressão heterólogado mutante gpsA2FR leva a glicerolipídeos com um teor aumentado de ácidograxo Cl6 e, conseqüentemente, um teor reduzido de ácido graxo Cl8. Asmodificações no padrão de ácido graxo são relativamente menores: foramobservados um aumento de 2 a 5% nos ácidos graxos 16:0 e de 1,5 a 3,5% nosácidos graxos 16:3, e uma redução em ácidos graxos 18:2 e 18:3 em 2 a 5%.O teor de glicerolipídeo total permaneceu não afetado.

WO 03/095655 descreve a expressão da proteína de leveduraGpdlp em Arabidopsis. Foi possível aumentar o teor de óleo de plantasArabidopsis analisado em aproximadamente 22%. Sementes individuais deuma única linhagem transgênica mostraram um aumento em 41% emcomparação com as plantas de controle de tipo selvagem. A desvantagemdeste método é que Arabidopsis é uma planta modelo que, devido às suascaracterísticas agronômicas, é inadequada para a produção comercial deóleos. Além disso, Arabidopsis acumila quantidades significativas de ácidoeicosaenóico (20:1), que não permite que o óleo seja usado em gênerosalimentícios ou fármacos.

G3PDHs de leveduras (Ascomycetes) tais como

a) Schizosaccharomyces pombe [Pidoux AL et ai. (1990)Nucleic Acids Res 18 (23): 7145; GenBank Acc.-No.: X56162; Ohmiya R etal. (1995) Mol Microbiol 18(5):963-73; GenBank Acc.-No.: D50796,D50797],

b) Yarrowia lipolytica (GenBank Acc.-No.: AJ250328)

c) Zygosaccharomyces rouxii [Iwaki T et al. Yeast (2001)18(8):737-44; GenBank Acc.-No: AB047394, AB047395, AB047397] ou

d) Saccharomyces cerevisiae [Albertyn J et al. (1994) MolCell Biol 14(6):4135-44; Albertyn J et al. (1992) FEBS LETT 308(2): 130-132; Merkel JR et al. (1982) Anal Biochem 122 (1): 180-185; Wang HT et al.(1994) J Bacteriol. 176(22):7091-5; Eriksson P et al. (1995) Mol Microbiol.17(1):95-107; GenBank Acc.-No.: U04621, X76859, Z35169].

e) Emericella nidulans (GenBank Acc.-No.: AF228340)

f) Debaryomyces hansenii (GenBank Acc.-No.: AF210060)são adicionalmente descritas.

Nenhum dos métodos descritos até o presente de aumentar oteor de óleo em plantas transgênicas acarreta um aumento no teor de óleo emplantas cultiváveis que é suficiente para um processo técnico. Portanto, aindahá uma demanda grande pelo aumento do teor total de óleo em plantascultiváveis transgênicas, preferivelmente na semente destas plantas. Um talmétodo deve atender aos seguintes critérios:

Tão poucos genes quanto possível devem ser introduzidos naplanta com o objetivo de aumentar o teor total de óleo nas plantastransgênicas.

O método deve ser tão simples e barato quanto possível.

Com o objetivo de alcançar um rendimento em óleo tão altoquanto possível, as plantas com um teor de óleo alto devem ser empregadas.

Um rendimento de óleo alto deve ser alcançado com as plantasempregadas.

Ácidos C14-C18-graxos saturados devem estar presentes noóleo produzido em quantidades tão pequenas quanto possível.

O perfil de ácido graxo deve apenas ser pouco modificado, sepossível não modificado, entre a planta de tipo selvagem e a plantatransgênica.

Ademais, qualquer gargalos nos precursores de biossíntese deóleo ou de biossíntese de ácido graxo devem ser eliminados no método.

Portanto um objetivo foi desenvolver um método paraaumentar o teor total de óleo em plantas de safra que se caracteriza tantoquanto possível com muitas das propriedades acima mencionadas.

Este objetivo tem sido alcançado por um método paraaumentar o teor total de óleo em plantas oleaginosas transgênicas de safra, noqual as plantas oleaginosas transgênicas de safra compreendem pelo menos20% em peso de ácido oleico baseado no teor de ácido graxo total e quecompreende as seguintes etapas do método:

a) introduzir na planta oleaginosa de safra, uma seqüência deácido nucleico que codifica uma glicerol-3-fosfato-desidrogenase de umalevedura, e

b) expressar, na planta oleaginosa de safra, a glicerol-3-fosfato-desidrogenase codificada pelo ácido nucleico, e

c) selecionar aquelas plantas oleaginosas de safra nas quais oteor total de óleo é aumentado em pelo menos 25% em peso na planta emcomparação com a planta não-transgênica.

As plantas oleaginosas transgênicas de safra vantajosamentecompreendem pelo menos 21, 22, 23, 24 ou 25 % em peso de ácido oleico,vantajosamente pelo menos 26, 27, 28, 29 ou 30 % em peso de ácido oleico,baseado no teor de ácido graxo total, especialmente vantajosamente pelomenos 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 % em peso de ácido oleico baseado no teor deácido graxo total, muito especialmente vantajosamente pelo menos 61, 62, 63,64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 % em peso de ácido oleico baseado no teor deácido graxo total, ou mais. plantas que são vantajosas para o método deacordo com a invenção ademais possuem um teor de ácido palmíticopreferido de não maior do que 30, 29, 28, 27 ou 26 % em peso,vantajosamente de 25, 24, 23, 22, 21 ou 20 % em peso, especialmentevantajosamente de 15, 14, 13, 12, 11, 10 ou 9 % em peso, baseado no teor deácido graxo total. Outras plantas vantajosas possuem um teor de ácidolinoleico de pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 % em peso,vantajosamente 55, 60, 65 ou 70 % em peso, baseado no teor de ácido graxototal. Plantas vantajosas também podem se caracterizar pela combinação dosácidos graxos acima mencionados, o teor de ácido graxo total sendo de 100%em peso.

Como um resultado do método, o teor total de óleo nas plantasoleaginosas transgênicas de safra é aumentado em pelo menos 26, 27, 28, 29ou 30 % em peso, vantajosamente em pelo menos 31, 32, 33, 34 ou 35 % empeso, especialmente vantajosamente em pelo menos 36, 37, 38, 39 ou 40 %em peso, muito especialmente vantajosamente em pelo menos 41, 42, 43, 44ou 45 % em peso.

Plantas oleaginosas de safra preferidas usadas no métodopossuem um teor de óleo alto na semente. Plantas vantajosas possuem um teorde óleo de pelo menos 20, 25, 30, 35 ou 40 % em peso, vantajosamente depelo menos 41, 42, 43, 44 ou 45 % em peso, especialmente vantajosamente depelo menos 46, 47, 48, 49 ou 50 % em peso ou mais.

Plantas oleaginosas de safra que são preferidas no métodoproduzem óleos, lipídeos e/ou ácidos graxos livres que compreendem menosdo que 4, 3, 2 ou 1 % em peso, vantajosamente menos do que 0,9; 0,8; 0,7;

0,6 ou 0,5 % em peso, especialmente vantajosamente menos do que 0,4; 0,3;0,2; 0,1 ou 0,09 % em peso ou menos de ácido mirístico. Plantas oleaginosasde safra adicionalmente vantajosas compreendem menos do que 5, 4 ou 3 %em peso de ácido palmítico e/ou menos do que 2; 1,5 ou 1 % em peso deácido esteárico.

Plantas oleaginosas de safra vantajosas devem não apenaspossuir um teor de óleo alto na semente, mas também um teor de proteínabaixo na semente. Este teor de proteína deve, se possível, ser menor do que30, 25 ou 20 % em peso, vantajosamente menor do que 19, 18, 17, 16 ou 15% em peso.

As plantas oleaginosas de safra que são preferidas no métodovantajosamente se caracterizam pela modificação significativa no perfil deácido graxo dos ácidos graxos de C16:0, C16:3, C18:0, C18:l, C18:2, C18:3 eC20:0 após as seqüências de ácido nucleico codificadoras de G3PDH teremsido introduzidas, isto é as percentagens relativas dos ácidos graxosindividuais que têm sido mencionadas do teor de ácido graxo total em % empeso permanecem essencialmente as mesmas. Essencialmente as mesmassignifica que as variações nas percentagens dos ácidos graxos variam emmenos do que 5 pontos percentuais.

Plantas vantajosas usadas no método possuem um rendimentode óleo alto por hectare. Este rendimento de óleo é de pelo menos 100, 110,120, 130, 140 ou 150 kg de óleo/ha, vantajosamente pelo menos 250, 300,350, 400, 450 ou 500 kg de óleo/ha, preferivelmente pelo menos 550, 600,650, 700, 750, 800, 850, 900 ou 950 kg de óleo/ha, especialmentepreferivelmente pelo menos 1.000 kg de óleo/ha, ou mais.

Plantas que são adequadas para o método de acordo com ainvenção são, em princípio, todas plantas oleaginosas de safra cultiváveis.Plantas oleaginosas de safra que são preferivelmente empregadas no métodode acordo com a invenção são selecionadas dos grupos das plantasconsistindo das famílias Anacardiaceae, Arecaceae, Asteraceae, Brassicaceae,Cannabaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Juglandaceae, Linaceae, Lythraceae,Oleaceae, Poaceae e Rosaceae que naturalmente já possuem um teor de óleoalto e/ou que já estão sendo empregadas para a recuperação industrial deóleos.

As plantas empregadas no método são especialmentevantajosamente selecionadas do grupo das plantas oleaginosas de safraselecionadas do grupo consistindo dos gêneros e espécies Anacardiumoccidentale, Arachis hypogaea, Borago officinalis, Brassica campestris,Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea, Camelina sativa, Cannabissativa, Carthamus tinctorius, Cocos nucifera, Crambe abyssinica, Cupheaciliata, Elaeis guineensis, Glycine max, Gossypium hirsitum, Gossypiumbarbadense, Gossypium herbaceum, Helianthus annus, Linum usitatissimum,Oenothera biennis, Olea europaea, Ricinus communis, Zea mays, Juglansregia e Prunus dulcis, especialmente preferivelmente entre os gêneros eespécies Brassica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea,Camelina sativa, Helianthus annus, Linum usitatissimum e Carthamustinctorius, muito especialmente preferivelmente Brassica campestris, Brassicanapus, Brassica rapa, Brassicajuncea e Camelina sativa.

No presente método, a expressão heteróloga específica desemente do gene gpdlp de levedura acarreta um aumento significativo no teorde óleo como descrito acima na família de planta preferida de Brassicaceae,por exemplo em Brassica napus e especificamente na semente. O aumento noteor de óleo vantajosamente ocorre para aumentar os triacilglicerídeos (óleosreservas). Em 3 linhagens independentes, o teor de óleo tem sido aumentadoem aproximadamente 35% em comparação com as plantas de controle de tiposelvagem (Figura 4). A expressão transgênica da glicerol-3-fosfato-desidrogenase de levedura vantajosamente não tem mostrado efeito adversosobre o crescimento ou as outras propriedades das plantas oleaginosas desafra transformadas, tais como as plantas oleaginosas colza.

Tem sido possível demonstrar que o aumento no teor de,vantajosamente, triacilglicerídeos (óleos reservas) é alcançado pelo aumentoda atividade de G3PDH. No método de acordo com a invenção, não é apenaso teor de óleo mas, vantajosamente, também o teor de glicerol-3-fosfato que éaumentado, vantajosamente na semente madura das plantas oleaginosas desafra expressando G3PDH, preferivelmente de Brassicaceae transgênicas.Glicerol-3-fosfato é um precursor importante na biossíntese detriacilglicerídeo e assim é um precursor essencial para aumentar o teor de óleoem plantas oleaginosas de safra, especificamente na semente.

Para o propósito da invenção, as plantas, ou plantasoleaginosas de safra, incluem células de planta e certos tecidos, órgãos epartes de plantas, material de propagação (tais como sementes, tubérculos efrutas) ou semente de plantas, e plantas em todos os seus aspectos tais comoanteras, fibras, pêlos de raiz, troncos, folhas, embriões, caules, cotilédones,pecíolos, rebentos, mudas, material de safra, tecido de planta, tecidoreprodutivo e culturas de célula que são derivados da planta transgênica reale/ou podem ser usados para produzir a planta transgênica. Plantas madurastambém estão incluídas. Plantas maduras são entendidas como sendo plantasem qualquer estágio de desenvolvimento além da muda. Muda significa umaplanta imatura, jovem em um estágio de desenvolvimento inicial.

"Planta" compreende todas as plantas monocotiledôneas edicotiledôneas anuais e perenes e inclui as plantas oleaginosas de safravantajosas acima mencionadas.

Plantas monocotiledôneas preferidas são selecionadas emparticular dentre as plantas monocotiledôneas de safra tais como, porexemplo, a família Poaceae, tal como milho.

No método de acordo com a invenção, é vantajoso o uso deplantas oleaginosas de safra dicotiledôneas. Plantas dicotiledôneas preferidassão selecionadas em particular dentre as plantas de safra dicotiledôneas taiscomo, por exemplo,

Asteraceae tais como girassol, tagetes ou calêndula eoutras,

Brassicaceae, especialmente o gênero Brassica, muitoparticularmente a espécie napus (colza), napus var. napus ou rapa ssp. oleifera(canola), juncea (mostarda indiana), Camelina sative (linho falso) e outras,

Leguminosae, especialmente o gênero Glycine, muitoespecialmente a espécie max (feijão-soja) soja ou amendoim, e outrase linhaça, soja, algodoeiro ou cânhamo.

Plantas transgênicas com um teor de óleo aumentado podemser comercializadas diretamente sem isolamento do óleo sintetizado sendonecessário. No método de acordo com a invenção, as plantas são para serementendidas com o significado de plantas inteiras e também de todas as partesde planta, órgãos de planta ou partes de planta tais como folha, tronco,semente, raiz, tubérculo, anteras, fibras, pêlos de raiz, talos, embriões, caules,cotilédones, pecíolos, material de safra, tecido de planta, tecido reprodutivo,culturas de célula que são derivados de planta transgênica e/ou que podem serusados para produzir a planta transgênica. A semente inclui todas as partes dasemente tais como capaz de semente, células epidérmicas e células desemente, endosperma ou tecido embriônico. Contudo, os óleos produzidospelo método de acordo com a invenção também podem ser isolados dasplantas na forma de seus óleos, gordura, lipídeos e/ou ácidos graxos livres.Óleos produzidos pelo método podem ser obtidos por ceifa das plantas querda cultura na qual crescem quer do campo. Isto pode ser efetuado porprensagem ou extração das partes de planta, preferivelmente das sementes dasplantas. Aqui, os óleos podem ser obtidos por prensagem por "prensagem afrio ou batida a frio" sem entrada de calor. As partes de planta,especificamente as sementes, são cominuídas, tratadas com vapor ou torradasantecipadamente de modo que possam ser digeridas mais facilmente. Assementes pré-tratadas nesta maneira podem ser então prensadas ou extraídascom solventes, tal como hexano quente. Depois, o solvente é de novoremovido. Nesta maneira, mais do que 96% dos óleos produzidos pelométodo podem ser isolados. Os produtos assim obtidos são entãoadicionalmente processados, i.e. refinados. Aqui, inicialmente, a mucilagem ematéria causadora de turvação são removidas. O que é conhecido comodespectinização pode ser afetado enzimaticamente ou, por exemplo, químico-fisicamente pela adição de ácido tal como ácido fosfórico. Depois, os ácidosgraxos podem ser removidos pelo tratamento com uma base, por exemplosolução de hidróxido de sódio. Para remover o álcali ainda presente noproduto, o produto é lavado intensamente com água e seco. Para remover ospigmentos que ainda estão presentes no produto, os produtos são submetidosao alvejamento com, por exemplo, terra alvejante ou carbono ativado.Finalmente, o produto é desodorizado usando, por exemplo, vapor.

Uma modalidade de acordo com a invenção é o uso dos óleospreparados pelo método de acordo com a invenção ou obtidos por misturaçãodestes óleos com animal, microbial ou óleos vegetais, lipídeos ou ácidosgraxos vegetais, animais ou microbianos em rações, gêneros alimentícios,cosméticos ou fármacos. O óleos preparados pelo método de acordo com ainvenção podem ser usados em uma maneira conhecida pela pessoaexperiente na técnica para misturação com outros óleos, lipídeos, ácidosgraxos ou misturas de ácidos graxos de origem animal, tais como, porexemplo, óleos de peixe. Os ácidos graxos presentes nos óleos preparados deacordo com a invenção, que foram liberados dos óleos pelo tratamento combase, também podem ser adicionados em uma maneira costumeira em gênerosalimentícios, rações animais, cosméticos e/ou fármacos, quer diretamentequer após misturação com outros óleos, lipídeos, ácidos graxos ou misturas deácidos graxos de origem animal tais como, por exemplo, óleos de peixe.

Os óleos preparados pelo método compreendem compostostais como esfingolipídeos, fosfoglicerídeos, lipídeos, glicolipídeos,fosfolipídeos, monoacilglicerídeos, diacilglicerídeos, triacilglicerídeos ououtros ésteres de ácido graxo, preferivelmente triacilglicerídeos (veja Tabela1).

Dos óleos assim preparados pelo método de acordo com ainvenção, os ácidos graxos saturados e insaturados que estão presentes nosmesmos podem ser liberados por exemplo pelo tratamento com álcali, porexemplo com KOH ou NaOH aquoso, ou por hidrólise ácida, vantajosamentena presença de um álcool tal como metanol ou etanol, ou via clivagemenzimática, e isolados por exemplo por separação de fases e subseqüenteacidulação usando, por exemplo, H2SO4. Os ácidos graxos também podem serliberados diretamente sem o processamento descrito acima.

O termo "óleo" também é entendido para incluir "lipídeos" ou"gorduras" ou "misturas de ácidos graxos", que compreendem ácido(s)graxo(s) insaturado(s), saturado(s), preferivelmente esterificado(s),preferivelmente ligado(s) em triglicerídeos. É preferido para o óleo. O óleopode compreender vários outros ácidos graxos saturados ou insaturados, taiscomo, por exemplo, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico,ácido oleico, ácido linoleico ou ácido α-linolênico, e semelhantes. Emparticular, o teor dos vários ácidos graxos no óleo pode variar, dependendo daplanta original.

"Teor de óleo total" é entendido com o significado da soma detodos os óleos, lipídeos, gorduras ou misturas de ácidos graxos, preferivelmente a soma de todos os triacilglicerídeos.

"Óleos" compreende lipídeos neutros e/ou polares e misturasdestes. Aqueles mencionados na Tabela 1 podem ser mencionados por meiode exemplo, mas não por limitação.Tabela. 1: Classes de lipídeos de planta

Lipídeos neutros Triacilglicerol (TAG) Diacilglicerol (DAG) Monoacilglicerol (MAG)Lipídeos polares Monogalactosildiacilglicerol (MGDG) Digalactosildiacilglicerol (DGDG) Fosfatidilglicerol (PG) Fosfatidilcolina (PC) Fosfatidiletanolamina (PE) Fosfatidilinositol (PI) Fosfatidilserina (PS) Sulfoquinovosildiacilglicerol (SQD)

Os lipídeos neutros preferivelmente referem-se aos

triacilglicerídeos. Lipídeos ambos neutros e polares podem compreender umaampla variedade de vários ácidos graxos. Os ácidos graxos mencionados natabela 2 podem ser mencionados por meio de exemplo, mas não por limitação.Tabela 2: Visão geral de vários ácidos graxos (seleção)1 comprimento de cadeia: número de ligações duplas + ocorrendo apenas em muitos poucosgêneros de planta * não naturalmente ocorrente em plantas superiores

Nomenclatura1 Nome14:0 Aeido Mirístico16:0 Aeido Palmítico16:1 Aeido Palmitoleieo16:3 Aeido Rougânico18:0 Aeido Esteárico18:1 Aeido Oleieo18:2 Aeido Linoleieoa-18:3 Aeido Linolênicoγ-18:3 Ácido Gama-Linolênico+20:0 Aeido Araquídico20:1 Aeido Eicosaenóico<table>table see original document page 16</column></row><table>

Oleos preferivelmente significam óleos de semente.

"Aumentar" o teor total de óleo significa aumentar o teor deóleo em uma planta ou em uma parte, tecido ou órgão da mesma,preferivelmente nos órgãos de semente da planta. Neste contexto, o teor deóleo é aumentado em pelo menos 25%, preferivelmente pelo menos 30%,especialmente preferivelmente pelo menos 35%, muito especialmentepreferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 45% oumais em comparação com uma planta inicial que não é submetida ao métodode acordo com a invenção, mas diferentemente não está modificada, e sobcondições sob outros aspectos idênticas. Condições neste contexto significamtodas as condições que são relevantes para germinação, cultura oucrescimento da planta tais como condições do solo, condições climáticas,condições de luz, fertilização, irrigação, tratamentos de proteção de planta esemelhantes.

Aumentar o teor de glicerol-3-fosfato em uma plantaoleaginosa de safra é entendido com o significado de aumentar o teor em umaplanta ou em uma parte da planta, em tecidos ou em órgãos da mesma,preferivelmente a semente da planta. Aqui, o teor de glicerol-3-fosfato éaumentado em pelo menos 25, 30, 35, 40, 45 ou 50% em peso,preferivelmente em pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 100%, especialmentepreferivelmente em pelo menos 110, 120, 130, 140 ou 150%, muitoespecialmente preferivelmente em pelo menos 200, 250 ou 300%, maispreferivelmente em pelo menos 350 ou 400% ou mais em comparação comuma planta inicial que não é submetida ao método de acordo com a invenção,mas diferentemente está não-modificada, e sob condições sob outros aspectosidênticas. Condições neste contexto significam todas as condições que sãorelevantes para germinação, cultura ou crescimento da planta tais comocondições do solo, condições climáticas, condições de luz, fertilização,irrigação, tratamentos de proteção de planta e semelhantes.

"Glicerol-3-fosfato-desidrogenase de levedura" (chamada de"G3PDH" de levedura aqui abaixo) geralmente se refere a todas Aquelasenzimas que são capazes de converter di-hidróxi-acetona-fosfato (DHAP) emglicerol-3-fosfato (G3P) - preferivelmente usando um co-substrato tal comoNADH ou NADPH - e que são naturalmente expressadas em uma levedura.

Levedura refere-se ao grupo de fungos unicelulares com umaparede celular pronunciada e formação de um pseudomicélio (em contrastecom bolores). Se reproduzem vegetativamente por brotamento e/ou fissão(Schizosaccharomyces e Saccharomycodes, respectivamente).

Estão incluídas no que são conhecidas como leveduras falsas,preferivelmente as famílias Cryptococcaceae, Sporobolomycetaceae com osgêneros Cryptococcus, Torulopsis, Pityrosporum, Brettanomyces, Candida,Kloeckera, Trigonopsis, Trichosporon, Rhodotorula e Sporobolomyces eBullera, e leveduras verdadeiras (leveduras que também se reproduzem porgeração; ascus), preferivelmente as famílias Endo- e Saccharomycetaceae,com os gêneros Saccharomyces, Debaromyces, Lipomyces, Hansenula,Endomycopsis, Pichia, Hanseniaspora. Mais preferidos são os gênerosSaccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha,Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomycesrouxii, Yarrowia lipolitica, Emericella nidulans, Aspergillus nidulans,Deparymyces hansenii e Torulaspora hansenii.

G3PDH de levedura significa, em particular, polipeptídeos quepossuem as seguintes características como "características essenciais":

a) a conversão de di-hidróxi-acetona-fosfato em glicerol-3 -fosfato usando NADH como co-substrato (EC 1.1.1.8), e

b) uma seqüência de peptídeo compreendendo pelo menosuma seqüência de motivo selecionada do grupo de motivos de seqüênciaconsistindo de

c) GSGNWGT(A/T)IAK (SEQ ID NO: 22)

d) CG(V/A)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)A (SEQ ID NO: 26)

e) (L/V)FXRPYFXV (SEQ ID NO: 27)preferido é o motivo de seqüência selecionado do grupoconsistindo de

f) GSGNWGTTIAKV(V/I)AEN (SEQ ID NO: 29)

g) NT(K/R)HQNVKILP (SEQ ID NO: 30)

h) D(I/V)LVFN(I/V)PHQFL (SEQ ID NO: 31)

i) RA(LrV)SCLKGFE (SEQ ID NO: 32)

j) CGALSGANLA(P/T)EVA (SEQ ID NO: 33)

k) LFHRP YFHV (SEQ ID NO: 34)

l) GLGEII(K/R)FG (SEQ ID NO: 35)

A seqüência de peptídeo particularmente preferivelmentecompreende pelo menos 2 ou 3, muito particularmente preferivelmente pelomenos 4 ou 5, mais preferivelmente todos os motivos de seqüênciaselecionados do grupo dos motivos de seqüência i), ii) e iii) ou selecionadasdo grupo dos motivos de seqüência iv), v), vi), vii), viii), ix) e x). (Termosentre parênteses referem-se aos aminoácidos que são possíveis nesta posiçãocomo alternativas; por exemplo (V/I) significa que valina ou isoleucina sãopossíveis nesta posição. As listagens de seqüências apenas mencionam umadas possíveis variantes em cada caso).

Ademais, a G3PDH de levedura pode opcionalmente - emadição a pelo menos um dos motivos de seqüência acima mencionados i) a x)- compreender outros motivos de seqüência selecionados do grupoconsistindo de

m) H(E/Q)NVKIL (SEQ ID NO: 23)

n) (D/N)(I/V)(L/I)V(FAV)(V/N)(L/W)PHQF)(V/L/I) (SEQID NO: 24)

o) (A/G)(I/V)SC(L/I)KG (SEQ ID NO: 25)

p) G(L/M)(L/G)E(M/I)(I/Q)(R/K/N)F(G/S/A) (SEQ ID NO:

28)Mais preferivelmente, G3PDH de levedura significa a proteínade levedura Gpdlp como mostrada em SEQ ID NO: 2, e seus equivalentesfuncionais, bem como porções funcionalmente equivalentes das acima.Porções funcionalmente equivalentes são entendidas com o significado deseqüências que são de pelo menos 51, 60, 90 ou 120 pb, vantajosamente pelomenos 210, 300, 330, 420 ou 450 pb, especialmente vantajosamente pelomenos 525, 540, 570 ou 600 pb, muito especialmente vantajosamente pelomenos 660, 720, 810, 900 ou 1101 pb ou mais em comprimento.

Equivalentes funcionais significam, em particular, mutaçõesnaturais ou artificiais da proteína de levedura Gpdlp como mostrada em SEQID NO: 2 e polipeptídeos homólogos de outras leveduras que possuemessencialmente as mesmas características de uma G3PDH de levedura comodefinida acima. Mutações compreendem substituições, adições, deleção,inversão ou inserções de um ou mais resíduos de aminoácido. Especialmentepreferidos são os polipeptídeos descritos pelas SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ IDNO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 40.

As G3PDHs de leveduras a serem empregadas vantajosamentedentro do escopo da presente invenção podem ser prontamente encontradaspor pesquisas de banco de dados ou por triagem de bibliotecas de gene ou decDNA usando a seqüência de G3PDH de levedura mostrada em SEQ ID NO:2, que é dada por meio de exemplo, ou a seqüência de ácido nucleico comomostrada em SEQ ID NO: 1, que codifica a última, como sonda ou seqüênciade pesquisa.

Citados equivalentes funcionais preferivelmente possuem pelomenos 50 ou 60%, especialmente preferivelmente pelo menos 70 ou 80%,especialmente preferivelmente pelo menos 85 ou 90%, mais preferivelmentepelo menos 91, 92, 93, 94, 95 ou 96% ou mais de homologia com a proteínacom a SEQ ID NO: 2.

Homologia entre dois polipeptídeos é entendida com osignificado da identidade da seqüência de aminoácidos sobre o comprimentointeiro da seqüência que é calculada por comparação com o auxílio doalgoritmo de programa GAP (Wisconsin Package Version 10,0, University ofWisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA), ajustando osseguintes parâmetros:

Peso de Lacuna: 8 Peso de Comprimento: 2

Combinação Média: 2,912 Não-Combinação Média: -2,003Por exemplo, uma seqüência com pelo menos 80% dehomologia com a seqüência SEQ ID NO: 2 no nível de proteína é entendidocom o significado de que uma seqüência que, sob comparação com aseqüência SEQ ID NO: 2 dentro do algoritmo de programa acima e doconjunto de parâmetros acima possui pelo menos 80% de homologia.

Equivalentes funcionais também compreendem aquelasproteínas que são codificadas pelas seqüências de ácido nucleico que possuempelo menos 60, 70 ou 80%, especialmente preferivelmente pelo menos 85, 87,88, 89 ou 90%, especialmente preferivelmente pelo menos 91, 92, 93, 94 ou95%, mais preferivelmente pelo menos 96, 97, 98 ou 99% de homologia coma seqüência de ácido nucleico com a SEQ ED NO: 1.

Homologia entre duas seqüências de ácido nucleico éentendida com o significado da identidade das duas seqüências de ácidonucleico sobre o respectivo comprimento de seqüência inteiro que é calculadapor comparação com o auxílio do algoritmo de programa GAP (WisconsinPackage Version 10,0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group(GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 etseq.), ajustando os seguintes parâmetros:

Peso de Lacuna: 50 Peso de Comprimento: 3

Combinação Média: 10 Não-Combinação Média: 0Por exemplo, uma seqüência que possui pelo menos 80% dehomologia com a seqüência SEQ ID NO: 1 em nível de ácido nucleico éentendido com o significado de que uma seqüência que, sob comparação coma seqüência SEQ ID NO: 1 dentro do algoritmo de programa acima e doconjunto de parâmetros acima possui uma homologia de pelo menos 80%.

Equivalentes funcionais também compreendem aquelasproteínas que são codificadas pelas seqüências de ácido nucleico quehibridizam sob condições padrão com uma seqüência de ácido nucleicodescrita por SEQ ID NO: 1, a seqüência de ácido nucleico que écomplementar à mesma ou partes da acima e que possuem as característicasessenciais para uma G3PDH de levedura.

"Condições de hibridização padrão" são para serem entendidasno sentido amplo e significam tanto condições de hibridização estringentes emenos estringentes. Tais condições de hibridização são descritas, porexemplo, por Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., em MolecularCloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989, páginas 9,31-9,57) ou em Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6,3,1-6,3,6.

Por exemplo, as condições durante a etapa de lavagem podemser selecionadas da faixa de condições de estringência baixa (comaproximadamente 2X SSC a 50°C) e condições de estringência alta (comaproximadamente 0,2X SSC a 50°C, preferivelmente a 65°C) (20X SSC:citrato de sódio 0,3 M, NaCl 3 M, pH 7,0). Agentes desnaturantes tais como,por exemplo, formamida ou SDS também podem ser empregados durantehibridização. Na presença de formamida 50%, hibridização é preferivelmenterealizada a 42°C.No método de acordo com a invenção, as seqüências de ácidonucleico usadas são vantajosamente introduzidas em um construto deexpressão transgênico que pode garantir uma expressão transgênica de umaG3PDH de levedura em uma planta ou um tecido, órgão, parte, célula oumaterial de propagação da planta.

Nos construtos de expressão, uma molécula de ácido nucleicocodificadora de uma G3PDH de levedura está preferivelmente em ligaçãooperável com pelo menos um elemento de controle genético (por exemplo umpromotor e/ou um terminador) que garante a expressão em um organismo de planta ou um tecido, órgão, parte, célula ou material de propagação damesma.

Cassetes de expressão transgênicos que são especialmentepreferivelmente usados são aqueles que compreendem uma seqüência deácido nucleico codificadora de uma glicerol-3-fosfato-desidrogenase que é selecionada do grupo das seqüências consistindo de

a) uma seqüência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 39 ou

b) uma seqüência que de acordo com a degeneração do código genético, é derivada de uma seqüência com a seqüência mostrada em SEQ ID

NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 39, ouuma seqüência que possui pelo menos 60% de identidade coma seqüência com SEQ ID NO: 1.

Ligação operável é entendida com o significado de, porexemplo, o arranjo seqüencial de um promotor com a seqüência de ácidonucleico codificadora de uma G3PDH de levedura que é para ser expressada(por exemplo a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1) e, seapropriados, outros elementos regulatórios, tais como, por exemplo, umterminador em, um tal modo que cada um dos elementos regulatórios podemdesempenhar sua função quando a seqüência de ácido nucleico érecombinantemente expressada. Ligação direta no sentido químico não énecessariamente requerida para este propósito. Seqüências de controlegenético tais como, por exemplo, seqüências de intensificador também podemexercer sua função sobre a seqüência alvo de posições que são depoisremovidas, ou de fato de outras moléculas de DNA. Arranjos preferidos sãoaqueles nos quais a seqüência de ácido nucleico a ser expressadarecombinantemente é posicionada atrás da seqüência atuando como promotorde modo que as duas seqüências sejam ligadas covalentemente uma na outra.A distância entre a seqüência de promotor e a seqüência de ácido nucleico aser expressada recombinantemente é preferivelmente menor do que 200 paresde base, especialmente preferivelmente menor do que 100 pares de base,muito especialmente preferivelmente menor do que 50 pares de base.

Ligação operável e um cassete de expressão transgênicapodem ser ambos produzidos por meio de técnicas de clonagem erecombinação convencionais como as descritas, por exemplo, em Maniatis T,Fritsch EF e Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), em Silhavy TJ,Berman ML e Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), em Ausubel FM et al.(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience e em Gelvin et al. (1990) em: Plant Molecular BiologyManual. Entretanto, outras seqüências que, por exemplo, atuam como umlínker com sítios de clivagem específicos para enzimas de restrição, ou comoum peptídeo de sinal, também podem ser posicionadas entre as duasseqüências. Também, a inserção de seqüências podem acarretar a expressãode proteínas de fusão. Preferivelmente, o cassete de expressão composto deum promotor ligado em uma seqüência de ácido nucleico a ser expressadapode estar em uma forma integrada em vetor e pode ser inserido em umgenoma de planta por exemplo por transformação.

Contudo, um cassete de expressão também é entendido com osignificado daqueles construtos onde a seqüência de ácido nucleicocodificadora de uma G3PDH de levedura está posicionada atrás de umpromotor endógeno em uma tal maneira que o último ocasiona a expressão daG3PDH de levedura.

Promotores que são preferivelmente introduzidos nos cassetesde expressão transgênica são aqueles que são operáveis em um organismo deplanta ou um tecido, órgão, parte, célula ou material de propagação damesma. Promotores que são operáveis em organismos de planta sãoentendidos com o significado em princípio de qualquer promotor que é capazde governar a expressão de genes, em particular de genes heterólogos, emplantas ou partes de plantas, células de planta, tecido de plantas ou culturas deplanta. Neste contexto, expressão pode ser, por exemplo, constitutiva,induzível ou dependente de desenvolvimento.

Os seguintes são preferidos:a) Promotores constitutivos:

Promotores "constitutivos" referem-se àqueles promotores quegarantem a expressão em um grande número de, preferivelmente, todos, ostecidos durante um período substancial de desenvolvimento da planta,preferivelmente em todos os momentos durante o desenvolvimento da planta(Benfey et ai. (1989) EMBO J 8:2195-2202). Um promotor de planta oupromotor originário de um vírus de planta é especialmente preferivelmenteusado. O promotor de CaMV (vírus do mosaico da couve-flor) transcrito 35S(Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. (1986)Plant Mol Biol 6:221- 228) ou o promotor 19S CaMV (US 5.352.605; WO84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202) são especialmentepreferidos. Outro promotor constitutivo adequado é o promotor de subunidadepequena (SSU) Rubisco (US 4.962.028), o promotor de legumina B(GenBank Acc. No. X03677), o promotor de nopalina-sintase deAgrobacterium, o promotor dual TR, o promotor OCS (octopina-sintase) deAgrobacterium, o promotor de ubiquitina (Holtorf S et al. (1995) Plant MolBiol 29:637-649), o promotor de ubiquitina 1 (Christensen et al. (1992) PlantMol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696), o promotor Smas, o promotor de cinamil-álcool-desidrogenase-promotor (US 5.683.439), os promotores das subunidades de ATPasevacuolar, o promotor de gene de nitrilase-1 de Arabidopsis thaliana (GenBankAcc. No.: U38846, nucleotídeos 3862 a 5325 se não 5342) ou o promotor deuma proteína rica em prolina de trigo (WO 91/13991), e outros promotores degenes cuja expressão constitutiva em plantas é conhecida pelo trabalhadorexperiente. O promotor CaMV 35S e o promotor de nitrilase-1 de Arabidopsissão preferidos.

b) Promotores específicos de tecido:

São adicionalmente preferidos os promotores comespecificidades para sementes, tais como, por exemplo, o promotor defaseolina (US 5.504.200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell l(9):839-53), opromotor do gene de albumina 2S (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem262:12196- 12201), o promotor de legumina (Shirsat A et al. (1989) Mol GenGenet 215(2):326-331), o promotor de USP (proteína de sementedesconhecida (Bãumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3):459-67), opromotor de gene de napina (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta199:515-519), o promotor da proteína ligante de sacarose (WO 00/26388) ouo promotor de legumina B4 (LeB4; Bãumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet225: 121-128; Bãumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U etal. (1995) Biotechnology (NY) 13(10): 1090f), o promotor de oleosina deArabidopsis (WO 98/45461), e o promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980).Outros promotores específicos para semente adequados sãoaqueles dos genes codificadores de glutemina de peso molecular alto(HMWG), gliadina, enzima de ramificação, ADP glicose pirofosfatase(AGPase) ou amido sintase. Promotores que são adicionalmente preferidossão aqueles que permitem expressão específica em semente emmonocotiledôneas tais como milho, cevada, trigo, centeio, arroz esemelhantes. O promotor de do gene lpt2 ou Iptl (WO 95/15389, WO95/23230) ou os promotores descritos em WO 99/16890 (promotores do genede hordeína, do gene de glutelina, do gene de orizina, do gene de prolamina,do gene de gliadina, do gene de glutelina, do gene de zeína, do gene decasirina ou do gene de secalina) podem ser vantajosamente empregados,c) Promotores quimicamente induzíveis

Os cassetes de também podem compreender um promotorquimicamente induzível (artigo de revisão: Gatz et al. (1997) Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol 48:89-108), por meio dos quais a expressão do geneexógeno na planta pode ser controlada em um ponto particular no tempo. Taispromotores tais como, por exemplo, o promotor PRPl (Ward et al. (1993)Plant Mol Biol 22:361-366), um promotor induzível por ácido salicílico (WO95/19443), um promotor induzível por benzeno-sulfonamida (EP O 388 186),um promotor induzível por tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J 2:397-404),um promotor induzível por ácido abscísico (EP 0 335 528) ou um promotorinduzível por etanol ou ciclo-hexanona (WO 93/21334) podem ser igualmenteusados. Também é adequado o promotor do gene de isoforma II de glutationa-S transferase i (GST-II-27), que pode ser ativado por agentes protetoresexogenamente aplicados tal como, por exemplo, N,N-dialil-2,2-dicloro-acetamida (WO 93/01294) e que é operável em um grande número de tecidosde ambas monocotiledôneas e dicotiledôneas.

São especialmente preferidos os promotores constitutivos emuito especialmente preferidos os promotores específicos de semente, emparticular o promotor de napina e o promotor de USP.

Em adição, outros promotores que podem tornar possível aexpressão em outros tecidos de planta ou em outros organismos tais como,por exemplo bactérias E. coli, podem ser operacionalmente ligados com aseqüência de ácido nucleico a ser expressada. Promotores de plantaadequados são, em princípio, todos os promotores descritos acima.

As seqüências de ácido nucleico presentes nos vetores oucassetes de expressão transgênica podem ser ligadas com outras seqüências decontrole genético além de um promotor. O termo seqüências de controlegenético é para ser entendido no sentido amplo e refere-se a todas àquelasseqüências que possuem um efeito sobre o estabelecimento ou a função docassete de expressão de acordo com a invenção. Seqüências de controlegenético modificam, por exemplo, a transcrição e a tradução em organismosprocarióticos ou eucariótícos. Os cassetes de expressão de acordo com ainvenção preferivelmente compreendem um promotor específico de planta 5'a montante da seqüência de ácido nucleico a ser expressadarecombinantemente em cada caso e, como seqüência de controle genéticoadicional, uma seqüência de terminador 3' a jusante, e, se apropriados, outroselementos regulatórios costumeiros, em cada caso operacionalmente ligadoscom a seqüência de ácido nucleico a ser expressada recombinantemente.

As seqüências de controle genético também compreendemoutros promotores, elementos de promotor ou promotores mínimos capazes demodificar as propriedades de controle de expressão. Assim, as seqüências decontrole genético podem, por exemplo, produzir a expressão específica emtecido que é adicionalmente dependente de certos fatores de estresse. Taiselementos são, por exemplo, descritos para estresse aquoso, ácido abscísico(Lam E e Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131 -17135) e estressetérmico (Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217(2-3):246-53).

Outras seqüências de controle vantajosas estão, por exemplo,nos promotores Gram-positivos amy e SP02, e nos promotores de leveduraou de fungo ADCl, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

Em princípio, todos os promotores naturais com suasseqüências regulatórias como aqueles mencionados acima podem ser usadosno método de acordo com a invenção. Em adição, promotores sintéticostambém podem ser usados vantajosamente.

Seqüências de controle genético também compreendemadicionalmente as regiões 5'-não-traduzidas, íntrons ou região-3' não-codificadora de genes, tais como, por exemplo, o íntron de actina-1, ou osíntrons 1, 2 e 6 de Adh1-S (para referência geral, veja: The Maize Handbook,Chapter 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Tem sidodemonstrado que estes podem desempenhar um papel significativo naregulação de expressão de gene. Assim, tem sido demonstrado que asseqüências 5'-não-traduzidas podem intensificar a expressão transiente degenes heterólogos. Os intensificadores de tradução que podem sermencionados podem por meio de exemplo ser a seqüências 5'-líder do vírusdo mosaico do tabaco (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) esemelhantes. Podem adicionalmente promover especificidade em tecido(Rouster J et al. (1998) Plant J 15:435-440).

O cassete de expressão pode vantajosamente compreender umaou mais das que são conhecidas como seqüências de intensificador em ligaçãooperável com o promotor, e estas tornam possível a expressão recombinanteaumentada da seqüência de ácido nucleico. Seqüências vantajosas adicionaistais como outros terminadores ou elementos regulatórios também podem serinseridas na extremidade 3' das seqüências de ácido nucleico a seremrecombinantemente expressadas. Uma ou mais cópias das seqüências de ácidonucleico a serem expressadas recombinantemente podem estar presentes noconstruto de gene.

Sinais de poliadenilação que são adequados como seqüênciasde controle são sinais de poliadenilação de planta, preferivelmente aquelesque correspondem essencialmente ais sinais de poliadenilação de T-DNA deAgrobacterium tumefaciens, em particular aqueles de gene 3 de T-DNA(octopina sintase) de plasmídeo Ti pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J3:835 et seq.) ou seus equivalentes funcionais. Exemplos de seqüências determinador especialmente adequadas são o terminador OCS (octopina sintase)e o terminador NOS (nopalina sintase).

Seqüências de controle são adicionalmente entendidas comoaquelas que tornam possível recombinação ou inserção homóloga no genomade um organismo hospedeiro, ou remoção do genoma. No caso derecombinação homóloga, por exemplo, a seqüência codificadora de um geneendógeno específico pode ser trocada em um modo direcionado pelaseqüência codificadora de um dsRNA. Métodos tal como a tecnologia cre/loxpermitem a remoção tecido-específica, possivelmente induzível do cassete deexpressão do genoma do organismo hospedeiro (Sauer B (1998) Métodos.14(4):381-92). Aqui, certas seqüências flanqueadoras são adicionadas no genealvo (seqüências lox), e estas tornam possível a remoção por meio de crerecombinase em um ponto mais tardio no tempo.

Um cassete de expressão e os vetores derivados dele podemcompreender outros elementos funcionais. O termo elemento funcional é paraser entendido no sentido amplo e refere-se a todos aqueles elementos quepossuem um efeito sobre a geração, a replicação ou a função dos cassetes deexpressão, vetores ou organismos transgênicos de acordo com a invenção.Exemplos que podem ser mencionados, mas não por meio de limitação, são:

a) Marcadores de seleção que conferem resistência a uminibidor de metabolismo tal como 2-desóxi-glicose 6-fosfato (WO 98/45456),antibióticos ou biocidas, preferivelmente herbicidas, tais como, por exemplo,canamicina, G 418, bleomicina, higromicina, ou foesfinotricina esemelhantes. Marcadores de seleção particularmente preferidos são aquelesque conferem resistência a herbicidas. Os seguintes podem ser mencionadospor meio de exemplo: seqüências de DNA que codificam foesfinotricinaacetiltransferases (PAT) e que inativam os inibidores de glutamina sintase(gene bar e pat), genes de 5-enolpiruvil-shikimato 3-fosfate sintase (genes de EPSP sintase), que conferem resistência a Glyphosate® (N-(fosfonometil)-glicina), o gene gox, que codifica enzima degradadora de Glyphosate®(Glyphosate óxido-reductase), o gene deh (codificador de desalogenase queinativa dalapon), acetolactato sintases inativadoras de sulfonil-uréia eimidazolinona, e genes bxn que codificam enzimas nitrilase que degradam bromoxinil, o gene aasa, que confere resistência ao antibióticoapectinomicina, o gene de estreptomicina fosfotransferase (SPT), que permiteresistência à estreptomicina, o gene de neomicina fosfotransferase (NPTII),que confere resistência à canamicina ou geneticidina, o gene de higromicinafosfotransferase (HPT), que confere resistência à higromicina, o gene de acetolactato sintase (ALS), que confere resistência aos herbicidas de sulfonil-uréia (por exemplo variantes de ALS mutadas com, por exemplo, a mutaçãoS4 e/ou Hra).

b) Genes repórter que codificam proteínas prontamentequantificáveis e que permitem que a eficácia de transformação ou o tempo ou sítio de expressão sejam avaliados via sua atividade enzimática ou corintrínseca. Muito particularmente preferidos neste contexto são as proteínasrepórter (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(l):29-44) taiscomo a "proteína fluorescente verde" (GFP) (Sheen et al.(1995) Plant Journal8(5):777-784), cloranfenicol transferase, a luciferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-859), o gene de aequorina (Prasher et al. (1985) BiochemBiophys Res Commun 126(3): 1259-1268), β-galactosidase, com B-glucuronidase sendo muito particularmente preferida (Jefferson et al. (1987)EMBO J 6:3901-3907).

c) Origens de replicação que permitem a replicação dosvetores ou cassetes de expressão de acordo com a invenção em, por exemplo,E. coli. Exemplos que podem ser mencionados são ORI (origem de replicaçãode DNA), um pBR322 ori ou um Pl5A ori (Sambrook et al.: MolecularCloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, 1989).

d) Elementos que são requeridos para a transformação deplanta mediada por agrobacterium tais como, por exemplo, a borda direita ouesquerda do T-DNA, ou a região vir.

Para selecionar as células que têm sofrido bem sucedidamenterecombinação homóloga se não que têm sido bem sucedidamentetransformadas, é geralmente requerido adicionalmente introduzir ummarcador selecionável que confere resistência a um biocida (por exemplo umherbicida), um inibidor de metabolismo tal como 2-desóxi-glicose 6-fosfato(WO 98/45456) ou um antibiótico às células que tem sofrido bemsucedidamente recombinação. O marcador de seleção permite a seleção dascélulas transformadas das células não transformadas (McCormick et al.(1986) Plant Cell Reports 5:81-84).

Em adição, os vetores de expressão ou o cassete de expressãorecombinante podem compreender outras seqüências de ácido nucleico quenão codificam uma G3PDH de levedura e cuja expressão recombinante leva aum aumento adicional em biossíntese de ácido graxo (como umaconseqüência de proOIL). Por meio de exemplo, mas não por limitação, estaseqüência de ácido nucleico proOIL que é adicionalmente expressadarecombinantemente pode ser selecionada dentre os ácidos nucleicoscodificadores de acetil-CoA carboxilase (ACCase), glicerol-3-fosfatoaciltransferase (GPAT), lisofosfatidato aciltransferase (LPAT), diacilglicerolaciltransferase (DAGAT) e fosfolipídeo:diacilglicerol aciltransferase (PDAT).Tais seqüências são conhecidas pelo trabalhador experiente e são prontamenteacessíveis dos bancos de dados ou bibliotecas de cDNA adequadas dasplantas respectivas.

Um cassete de expressão de acordo com a invenção pode servantajosamente introduzido em um organismo ou em células, tecidos, órgãos,parte ou sementes dos mesmos (preferivelmente em plantas ou células deplanta, tecidos, órgãos, partes ou sementes) pelo uso de vetores nos quais oscassetes de expressão estão presentes. A invenção portanto adicionalmente serefere aos citados vetores recombinantes que compreendem um casseterecombinante de expressão para uma G3PDH de levedura.

Por exemplo, vetores podem ser plasmídeos, cosmídeos, fagos,vírus se não agrobactérias. O cassete de expressão pode ser introduzido novetor (preferivelmente um vetor plasmídeo) via um sítio de clivagem derestrição adequado. O vetor resultante é primeiro introduzido em E. coli. E.coli corretamente transformadas são selecionadas, crescidas, e o vetorrecombinante é obtido com métodos conhecidos pelo trabalhador experiente.Seqüenciamento e análise de restrição podem ser usados para verificar a etapade clonagem. Vetores preferidos são aqueles que tornam possível a integraçãoestável do cassete de expressão no genoma do hospedeiro.

Um tal organismo de planta transgênica é gerado, porexemplo, por meio de transformação ou transfecção por intermédio dasproteínas ou dos ácidos nucleicos correspondentes. A geração de umorganismo transformado (ou de um tecido transformado ou de uma célulatransformada) requer a introdução do DNA em questão (por exemplo o vetorde expressão), RNA ou proteína na célula hospedeira em questão. Umamultiplicidade de métodos está disponível para este procedimento, que échamado de transformação (ou transdução ou transfecção) (Keown et ai.(1990) Methods in Enzymology 185:527-537). Assim, o DNA ou RNA podeser introduzido por exemplo diretamente por microinjeção ou por bombardeiocom micropartículas revestidas de DNA. A célula também pode serquimicamente permeabilizada, por exemplo com poli(etileno-glicol), de modoque o DNA possa alcançar a célula por difusão. O DNA também ocorre porfusão de protoplasto com outras unidades compreendendo DNA tais comominicélulas, células, lisossomos ou lipossomos. Eletroporação é um outrométodo adequado para introduzir DNA; aqui, as células são permeabilizadasreversivelmente por um pulso elétrico. Embebimento de partes de plantas emsoluções de DNA, e transformação de pólen ou de tubo de pólen, também sãopossíveis. Tais métodos têm sido descritos (por exemplo em Bilang et al.(1991) Gene 100:247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228:104-112;Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al. (1987) TheorAppl Genet 75:30-36; Klein et al. (1987) Nature 327:70-73; Howell et al.(1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231;DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for PlantMolecular Biology (Weissbach e Weissbach, eds.) Academic Press Inc.(1988); e Methods in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielinski, eds.)

Academic Press Inc. (1989)).

Em plantas, os métodos que têm sido descritos paratransformar e regenerar plantas de tecido de plantas ou células de planta sãoexplorados para transformação transiente ou estável. Métodos adequados são,em particular, transformação de protoplasto por captação de DNA induzidapor poli(etileno-glicol), o método biolístico com a pistola de gene, que éconhecido como o método de bombardeio de partículas, eletroporação, aincubação de embriões secos em solução contendo DNA, e microinjeção.

Em adição estas técnicas de transformação "direta",transformação também pode ser efetuada por infecção bacteriana por meio deAgrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes e a transferênciados plasmídeos Ti ou plasmídeos Ri recombinantes correspondentes porinfecção com vírus de planta transgênica. Transformação mediada porAgrobacterium é melhor adequada para células de plantas dicotiledôneas. Osmétodos são descritos, por exemplo, em Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229f).

Quando agrobactérias são usadas, o cassete de expressão épara ser integrado em plasmídeos específicos, quer em um vetor bifuncionalou intermediário quer em um vetor binário. Se um plasmídeo Ti ou Ri é paraser usado para a transformação, pelo menos a borda direita, mas na maioriados casos, as bordas direita e esquerda, dos T-DNA plasmídeo Ti ou Ri éligada no cassete de expressão a ser introduzido como região flanqueadora.

Vetores binários são preferivelmente usados. Vetores bináriossão capazes de replicação tanto em E. coli quanto em Agrobacterium. Comouma regra, compreendem um gene marcador de seleção e um linker oupoliligador flanqueado pela seqüências de bordas de T-DNA direita eesquerda. Podem ser transformados diretamente em Agrobacterium (Holsterset al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). O gene marcador de seleção, queé, por exemplo, o gene nptll, que confere resistência à canamicina, permiteuma seleção de agrobactérias transformadas. A agrobactéria que atua comoorganismo hospedeiro neste caso já deve compreender um plasmídeo com aregião vir. O último é requerido para transferir o T-DNA para as células deplanta. Uma agrobactéria transformada neste modo pode ser usada paratransformar células de planta. O uso de T-DNA para a transformação decélulas de planta tem sido estudado intensivamente e descrito (EP 120 516;Hoekema, em: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij KantersB.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4:277-287). Váriosvetores binários, alguns dos quais estão comercialmente disponíveis, taiscomo, por exemplo, pBI101,2 ou pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA),são conhecidos.

Outros promotores que são adequados para expressão emplantas têm sido descritos (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl AcadSci USA 86:8402-8406).Técnicas de transformação direta são adequadas para qualquertipo de organismo e célula. Nos casos onde DNA ou RNA são injetados oueletroporados em células de planta, o plasmídeo usado não necessita atender aquaisquer requerimentos particulares. Plasmídeos adequados tais como aqueles da série pUC podem ser usados. Se plantas intactas são para seremregeneradas das células transformadas, é necessário que um gene marcadorselecionável adicional esteja presente no plasmídeo.

Células estavelmente transformadas, i.e. aquelas quecompreendem o DNA integrado no DNA da célula hospedeira, podem ser selecionadas de células não transformadas quando um marcador selecionávelé parte do DNA inserido. Por meio de exemplo, qualquer gene que é capaz deconferir resistência a antibióticos ou herbicidas (tais como canamicina, G 418,bleomicina, higromicina ou foesfinotricina e semelhantes) é capaz de atuarcomo marcador (veja acima). Células transformadas que expressam um tal gene marcador são capazes de sobreviver na presença de concentrações de umtal antibiótico ou herbicida que mata um tipo selvagem não transformado.Exemplos são mencionados acima e preferivelmente compreendem o genebar, que confere resistência ao herbicida foesfinotricina (Rathore KS et ai.(1993) Plant Mol Biol 21(5):871-884), o gene nptll, que confere resistência à canamicina, o gene hpt, que confere resistência à higromicina, ou o geneEPSP, que confere resistência ao herbicida glifosato. O marcador de seleçãopermite a seleção de células transformadas das células não transformadas(McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). As plantas obtidaspodem ser geradas e hibridizadas na maneira costumeira. Duas ou mais gerações devem ser crescidas com o objetivo de garantir que a integraçãogenômica é estável e hereditária.

Os métodos descritos acima são descritos, por exemplo, emJenes B et al.(1993) Techniques for Gene Transfer,em: Trangenics Plants,Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por SD Kung e R Wu, AcademicPress, pp, 128-143, e em Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant MolecBiol 42:205-225). O construto a ser expressado é preferivelmente clonado emum vetor que é adequado para transformar Agrobacterium tumefaciens, porexemplo pBinl9 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:871 lf).

Uma vez tenha sido gerada uma célula de planta transformada,uma planta intacta pode ser obtida usando métodos conhecidos pelotrabalhador experiente. Por exemplo, culturas de calo são usadas como omaterial inicial. O desenvolvimento de broto e raiz pode, ser induzido distocomo biomassa de célula ainda indiferenciada no modo conhecido. Asplântulas obtidas podem ser desplantadas e usadas para geração.

O trabalhador experiente está familiarizado com tais métodospara regeneração de partes de planta e de plantas intactas a partir de células deplanta. Métodos que podem ser usados para este propósito são, por exemplo,aqueles descritos por Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570;Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al. (1994) TheorAppl Genet 89:525-533.

"Transgênica" ou "recombinante" por exemplo no caso de umaseqüência de ácido nucleico, um cassete de expressão ou um vetorcompreendo a citada seqüência de ácido nucleico ou um organismotransformado com a citada seqüência de ácido nucleico, vetor ou cassete deexpressão, refere-se a todos aqueles construtos estabelecidos por métodosrecombinantes nos quais qualquer um de

a) a seqüência de ácido nucleico codificadora de uma G3PDHde levedura ou

b) uma seqüência de controle genético, por exemplo umpromotor que é funcional em organismo de planta, que está operacionalmenteligado com a citada seqüência de ácido nucleico sob a ), ouc) (a) e (b)

não estão em seu ambiente genético natural ou têm sidomodificados por métodos recombinantes, sendo possível que a modificaçãoseja, por exemplo, substituições, adições, deleções, inversão ou inserções deum ou mais resíduos de nucleotídeo. Ambiente genético natural refere-se aolocus cromossômico natural no organismo fonte ou à presença em umabiblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambientegenético natural da seqüência de ácido nucleico é preferivelmente retida, pelomenos em alguma extensão. O ambiente flanqueia a seqüência de ácidonucleico pelo menos em um lado e possui um comprimento de seqüência depelo menos 50 pb, preferivelmente pelo menos 500 pb, especialmentepreferivelmente pelo menos 1000 pb, muito especialmente preferivelmentepelo menos 5000 pb. Um cassete de expressão naturalmente ocorrente, porexemplo a combinação naturalmente ocorrente do promotor de um genecodificador de uma G3PDH de levedura, toma-se um cassete de expressãotransgênica quando o último é modificado por métodos não-naturais,sintéticos ("artificiais") tais como, por exemplo, um tratamento mutagênico.Tais métodos são descritos em (US 5,565,350; WO 00/15815; veja tambémacima).

Organismos hospedeiros ou iniciais que são preferidos comoorganismos transgênicos são, acima de tudo, plantas de acordo com adefinição acima. Estão incluídos para todos os propósitos da invenção todosos gêneros e espécies de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas do ReinoVegetal, em particular plantas que são usadas para obter óleos, tais como, porexemplo, colza, girassol, gergelim, açafrão, oliveira, soja, milho e espécies denoz. Adicionalmente incluídas estão as plantas maduras, semente, rebentos emudas, e partes, material de propagação e culturas, por exemplo culturas decélula, derivadas das mesmas. Plantas maduras referem-se às plantas emqualquer estágio de desenvolvimento desejado além do estágio de muda.Muda refere-se a uma planta jovem, imatura, em um estágio dedesenvolvimento inicial.As plantas transgênicas podem ser geradas com os métodosdescritos acima para a transformação ou transfecção de organismos.

A invenção adicionalmente se refere ao uso direto das plantastransgênicas de acordo com a invenção e às células, culturas de célula, partes- tais como, por exemplo, no caso de plantas transgênicas, raízes, folhas esemelhantes - e material transgênico de propagação tais como sementes oufrutas que são derivadas dos mesmos para a produção de gêneros alimentíciosou rações animais, cosméticos ou fármacos, em particular óleos, gorduras,ácidos graxos ou derivados destes. Para este fim, as plantas ou partes deplantas são adicionadas nas quantidades normais nos gêneros alimentícios,rações animais, cosméticos, fármacos ou produtos com aplicações industriais.Também, é possível obter os óleos e/ou se apropriados ácidos graxos livresdas plantas, preferivelmente das sementes, e adicioná-los nas quantidadesnormais nos gêneros alimentícios, rações animais, cosméticos, fármacos ouprodutos com aplicações industriais.

Além de influenciar o teor de óleo, a expressão transgênica deuma G3PDH de levedura em plantas pode conferir ainda outros efeitosvantajosos tais como, por exemplo, uma resistência ao estresse aumentada a,por exemplo, ao estresse osmótico. Via níveis de glicerol aumentados, aG3PDH de levedura confere proteção contra este tipo de estresse, comglicerol atuando como substância osmoprotetora. Tal estresse osmóticoocorre, por exemplo em solos salinos e água e é um problema crescente emagricultura. Tolerância ao estresse aumentada torna possível, por exemplo,usar áreas nas quais plantas aráveis convencionais não são capazes deflorescer para uso agrícola.

Ademais, expressão recombinante da G3PDH de levedurapode influenciar o nível de NADH e assim o balanço redox no organismo deplanta. Estresse tal como, por exemplo, seca, temperaturas altas ou baixas, luzUV e semelhantes podem acarretar níveis de NADH aumentados e umaformação aumentada de oxigênio reativo (RO). Expressão transgênica daG3PDH de levedura pode degradar NADH excessivo, que se acumula sobcondições de estresse, e assim estabilizar o balanço redox e aliviar o efeito doestresse.Seqüências:

1. SEQ ID NO: 1 Seqüência de ácido nucleico codificadora deG3PDH de Saccharomyces cerevisiae (Gpdlp)

2. SEQ ID NO: 2Seqüência de proteína de G3PDH deSaccharomyces cerevisiae (Gpdlp)

3. SEQ ID NO: 3Seqüência de ácido nucleico codificadora deG3PDH de Saccharomyces cerevisiae (Gpd2p)

4. SEQ ID NO: 4Seqüência de proteína de G3PDH deSaccharomyces cerevisiae (Gpd2p)

5. SEQ ID NO: 5Seqüência de proteína de G3PDH deSaccharomyces cerevisiae (Gpd2p) com segundo códon de iniciaçãoalternativo

6. SEQ ID NO: óSeqüência de ácido nucleico codificadora deG3PDH de Schizosaccharomyces pombe

7. SEQ ID NO: 7Seqüência de proteína de G3PDH deSchizosaccharomyces pombe

8. SEQ ID NO: 8Seqüência de ácido nucleico codificadora deG3PDH de Schizosaccharomyces pombe

9. SEQ ID NO: 9Seqüência de proteína de G3PDH deSchizosaccharomyces pombe

10. SEQ ID NO: 1 ÓSeqüência de ácido nucleico codificadorade G3PDH de Yarrowinia lipolytica

11. SEQ ID NO: 11 Seqüência de proteína de G3PDH deYarrowinia lipolytica

12. SEQ ID NO: 12Seqüência de proteína de G3PDH deYarrowinia lipolytica com segundo eódon de iniciação alternativo

13. SEQ ID NO: 13Seqüência de ácido nucleico codificadorade G3PDH de Zygosaccharomyces rouxii

14. SEQ ID NO: 14Seqüência de proteína de G3PDH deZygosaccharomyces rouxii

15. SEQ ID NO: 15Seqüência de ácido nucleico codificadorade G3PDH de Zygosaccharomyces rouxii

16. SEQ ID NO: lóSeqüência de proteína de G3PDH deZygosaccharomyces rouxii

17. SEQ ID NO: 17Vetor de expressão baseado em pSUN-USP para G3PDH de S.cerevisiae (Gpdlp; inserto de 1017 - 2190 pb)

18. SEQ ID NO: 18 Iniciador oligonucleotídeo OPNl 5'-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3'

19. SEQ ID NO: 19 Iniciador oligonucleotídeo OPN2 5'-CTCG AG ATCTTC ATGT AG ATCT AATT-3'

20. SEQ ID NO: 20 Iniciador oligonucleotídeo OPN3 5'-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3'

21. SEQ ID NO: 21 Iniciador oligonucleotídeo OPN45'-GCGGCCGC ATCTTC ATGT AGATCT AATT-3'

22-35: SEQ ID NP 22 - 35: Motivos de seqüência paraG3PDH de leveduras; possíveis variações de seqüência são dadas (vejaacima). As variações de um motivo individual podem ocorrer em cada casosozinhas, mas também nas combinações diferentes de uma com as outras.

36. SEQ ID NO: 36Vetor de expressão pGPTV-gpdl baseado25 em pGPTV-napina para G3PDH de S.cerevisiae (Gpdlp; inserto gdpl de11962-13137 pb; terminador nos: 13154-13408; promotor de napina: 10807-11951).

37. SEQ ID NO: 37Seqüência de ácido nucleico codificadorade G3PDH de Emericella nidulans38. SEQ ID NO: 38Seqüência de proteína de G3PDH deEmericella nidulans

39. SEQ ID NO: 39Seqüência de ácido nucleico codificadorade G3PDH de Debaryomyces hansenii (parcial)

40. SEQ ID NO: 40Seqüência de proteína de G3PDH de

Debaryomyces hansenii (parcial)Figuras:

Figura 1: Northern blot. Detecção da transcrição do geneGPDl de levedura em sementes maturando de linhagens de colza transgênicas(8, 6, 9 e 3). Por meio de comparação, a mesma detecção tem sido realizadacom plantas de tipo selvagem (WT). O transcrito GPDl foi detectado emlinhagens 8, 6 e 9. Em linhagem 3, o gene GPDl não foi expressado. Estalinhagem foi empregada em outras análises como controle adicional.

Figura 2: Quantidade de glicerol-3-fosfato em sementesmaturando (40 DAF = dias após florescimento) de linhagens 8, 6 e 9transgênicas de colza GPDl (barras pretas). Por meio de comparação, o teorde plantas de tipo selvagem (WT) não-transfomadas, correspondentes e delinhagem 3 transgênica não-expressando (narras mais claras) tem sidodeterminado. Os desvios padrão indicados são o resultado de em cada caso 6medições independentes de todas as sementes obtidas.

Figura 3: Atividade de glicerol-3-fosfato-desidrogenase emsementes maturando (40 DAF) de linhagens 8, 6 e 9 de colza transgênicaGPDl (barras pretas). Por meio de comparação, o teor de plantas de tiposelvagem (WT) não-transfomadas, correspondentes e de linhagem 3transgênica não-expressando (barras mais claras) tem sido determinado. Osdesvios padrão indicados são o resultado de em cada caso 6 mediçõesindependentes de todas as sementes obtidas.

Figura 4: Quantidade total de lipídeos nas sementes delinhagens de colza transgênica GPDlp (barras pretas) em relação à biomassada semente. Por meio de comparação, o teor de plantas de tipo selvagem(WT) não-transfomadas, correspondentes e de linhagem 3 transgênica não-expressando (narras mais claras) tem sido determinado. Todas as 3 plantastransgênicas e expressando mostram um aumento significativo na quantidadetotal de lipídeos em sementes maduras. Os desvios padrão indicados são oresultado de em cada caso 5 medições independentes de todas as sementesobtidas.

Figura 5 Figura 5 mostra uma comparação de seqüências dehomólogos de G3PDH de outras leveduras.TabelasTabela 1:

Perfil de ácido graxo de óleos de semente em linhagens 8, 6 e9 de colza GPDlp (% em mol). Por meio de comparação, é dado o perfil deácido graxo nas plantas de tipo selvagem (WT) não transformadascorrespondentes e de linhagem 3 transgênica não-expressando.

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Métodos Gerais:

A não ser que especificado de outro modo, todos os compostosquímicos foram de Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe),Serva (Heidelberg) e Sigma (Deisenhofen). Enzimas de restrição, enzimasmodificadoras de DNA kits de biologia molecular foram de Amersham-Pharmacia (Freiburg), Biometra (Gõttingen), Roche (Mannheim), NewEngland Biolabs (Schwalbach), Novagen (Madison, Wisconsin, USA),Perkin-Elmer (Weiterstadt), Qiagen (Hilden), Stratagen (Amsterdam, Países-Baixos), Invitrogen (Karlsruhe) e Ambion (Cambridgeshire, Reino Unido).Os reagentes usados foram empregados de acordo com as instruções dofabricante.

Por exemplo, oligonucleotídeos podem ser sintetizadosquimicamente na maneira conhecida usando o método de fosfoamidito (Voet,Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, páginas 896-897). As etapas declonagem realizadas para os propósitos da presente invenção tais como, porexemplo, clivagens de restrição, eletroforese em gel de agarose, purificaçãode fragmentos de DNA, transferência de ácidos nucleicos para membranas denitrocelulose e de náilon, ligação de fragmentos de DNA, transformação decélulas de E. coli, culturas bacterianas, multiplicação de fagos, e análise deseqüência de DNA recombinante, são realizadas como descrito por Sambrooket al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6.Moléculas de DNA recombinante são seqüenciadas usando um seqüenciadorde DNA por fluorescência de laser ABI seguindo o método de Sanger (Sangeret al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467).Exemplo 1: Clonagem de gene Gpdl de levedura

DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae S288C (Matalpha SUC2 mal mel gal2 CUPl flol flo8-l; Invitrogen, Karlsruhe,Alemanha) foi isolado seguindo o protocolo descrito aqui abaixo:

Uma cultura de 100 ml foi crescida a 3O0C para uma densidadeóptica de 1,0. 60 ml da cultura foram centrifugados por 3 minutos a 3.000 x g.A pelota foi ressuspensa em 6 ml de H2O duplamente destilada e a suspensãofoi dividida entre recipientes de 1,5 ml e centrifugada, e o sobrenadante foidescartado. As pelotas foram ressuspensas em 200 μΐ de solução A, 200 μΐ defenol/clorofórmio (1:1) e 0,3 g de glóbulos de vidro por agitação vigorosa eentão lisadas. Após adição de 200 μl de tampão TE, pH 8,0, os lisados foramcentrifugados por 5 minutos. O sobrenadante foi submetido à precipitação emetanol com 1 ml de etanol. Após a precipitação, a pelota resultante foidissolvida em 400 μl de tampão TE de pH 8,0 + 30 μg/ml de RNaseA. Apósincubação por 5 minutos a 37°C, 18 μl de solução de acetato de sódio 3 M depH 4,8 e 1 ml de etanol foram adicionados, e O DNA precipitado foipelotizado por centrifugação. A pelota de DNA foi dissolvida em 25 μl deH2O duplamente destilada. A concentração de DNA genômico foideterminada por sua absorção a 260 nm.

Solução A:

Triton-X1OO 2%SDS 1%NaCl 0,1 MTris-HCl 0,01 M de pH 8,0EDTA 0,001 M

Para clonar o gene Gpdl, o DNA de levedura que havia sidoisolado foi empregado em uma reação PCR com os iniciadoresoligonucleotídeos ONPl e ONP2.

Seqüência de par de iniciador 1: 5'-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG

Seqüência de par de iniciador 2: 5'-CTCGAGATCTTCATGTAGATCTAATTComposição da reação PCR (50 μl):

5,00 μl de 5 μg de DNA genômico de levedura

5,00 μl de tampão IOx (Advantage polymerase) + MgCl2 25mM

5,00 μl de dNTP 2 mM1,25 μl de cada iniciador (10 pmol/uL)0,50 μl de Advantage polymeraseA Advantage polymerase empregada foi de Clontech.Programa de PCR:

Desnaturação inicial por 2 min a 95°C, então 35 ciclos de 45 sa 95°C, 45 s a 55°C e 2 min a 72°C. Extensão final por 5 min a 12°C.Os produtos de PCR foram clonados no vetor pCR2,1-TOPO(Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante, resultando no vetorpCR2,1-gpd1, e a seqüência foi verificada por seqüenciamento.

Clonagem no vetor de agrotransformação pGPTV envolveuincubação de 0,5 μg de vetor pCR2,1-gpd1 com a enzima de restrição XhoI(New England Biolabs) por 2 horas e subseqüente incubação por 15 minutoscom fragmento de Klenow (New England Biolabs). Após incubação por 2horas com SpeI, os fragmentos de DNA foram separados por eletroforese emgel. O segmento de 1185 pb da seqüência gpdl próxima ao vetor (3,9 kb) foicortado do gel, purificado com o "Gel Purification" kit de Qiagen seguindo asinstruções do fabricante e eluído com 50 μl de tampão de eluição. 0,1 μg devetor pGPTV foi primeiro digerido por 1 hora com a enzima de restrição SacIe então incubados por 15 minutos com fragmento de Klenow (New EnglandBiolabs). 10 μ1 de eluato do fragmento gpdl e 10 ng de vetor pGPTV tratadoforam ligados durante a noite a 16°C (T4 ligase, New England Biolabs). Osprodutos de ligação são então transformados em células TOPlO (Stratagene)seguindo as instruções do fabricante e adequadamente selecionados,resultando no vetor pGPTV-gpd1. Clones positivos foram verificados porseqüenciamento e PCR usando os iniciadores 1 e 2.

Para gerar o vetor pSUN-USP-gpd1, uma PCR foi realizadacom o vetor pCR2,1-gpd1 usando os iniciadores 3 e 4.

Seqüência de iniciador 3: 5'-

GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG

Seqüência de iniciador 4: 5'-

GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATTComposição da reação PCR (50 μΐ):

5 ng de DNA plasmídeo pCR2,1-gpd1

5,00 μl de tampão 10x (Advantage polymerase) + MgCl2 25mM5,00 μl de dNTP 2 mM

1,25 μl de cada iniciador (10 pmol/μl)

0,50 μl de Advantage polymerase

A Advantage polymerase empregada foi de Clontech.

Programa de PCR:

Desnaturação inicial por 2 min a 95°C, então 35 ciclos de 45 sa 95°C, 45 s a 55°C e 2 min a 72°C. Extensão final por 5 min a 72°C.

O produto de PCR de 1190 pb foi digerido por 24 horas com aenzima de restrição NotI. O vetor pSUN-USP foi digerido por 2 horas comNotI e então incubado por 15 minutos com fosfatase alcalina (New EnglandBiolabs). 100 ng de fragmento gpdl pré-tratado e 10 ng de vetor pGPTVtratado foram ligados durante a noite a 16°C (T4 ligase, New EnglandBiolabs). Os produtos de ligação são então transformados em células TOPlO(Stratagene) seguindo as instruções do fabricante e adequadamenteselecionados, resultando no vetor pSUN-USP-gpdl. Clones positivos sãoverificados por seqüenciamento Positive clones are e PCR usando osiniciadores 3 e 4.

Exemplo 2: Plasmídeos para transformação de plantas

Vetores binários tal como pBinAR podem ser usados para atransformação de plantas (Hõfgen e Willmitzer (1990) Plant Science 66: 221-230). Os vetores binários podem ser construídos pela ligação de cDNA em T-DNA na orientação de senso e de anti-senso. Em 5' de cDNA, um promotorde planta ativa a transcrição de cDNA. Uma seqüência de poliadenilação estálocalizada em 3' de cDNA.

A expressão específica em tecido pode ser realizada usandoum promotor específico de tecido. Por exemplo, expressão específica emsemente pode ser realizada por clonagem de promotor de napina ou depromotor de LeB4- ou de promotor de USP em 5' de cDNA. Qualquer outroelemento de promotor específico de semente também pode ser usado. Opromotor CaMV 35S pode ser usado para expressão constitutiva na plantainteira.

Um outro exemplo de vetores binários é o vetor pSUN-USP epGPTV-napina, em cujos fragmentos o fragmento de Exemplo 2 foi clonado.

O vetor pSUN-USP compreende o promotor de USP o terminador OCS. Ovetor pGPTV-napina compreende uma versão truncada do promotor denapina, e o terminador nos.

Os fragmentos de Exemplo 2 foram clonados em múltiplossítios de clonagem do vetor pSUN-USP e pGPTV-napina respectivamente,para tornar possível a expressão específica em semente de GPD1. O construtocorrespondente pSUN-USP-gpdl é descrito pela seqüência SEQ ED NO: 16, eo construto de G3PDH em pGPTV-napina por SEQ ID NO: 36.

Exemplo 3: Transformação de Agrobacterium

Transformação de planta mediada por Agrobacterium pode serrealizada usando as cepas de Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90)(Koncz e Schell (1986) Mol Gen Genet 204: 383-396) ou LBA4404(Clontech). Técnicas de transformação padrão podem ser usadas para atransformação (Deblaere et al.(1984) Nucl Acids Res 13:4777-4788).

Exemplo 4: Transformação de plantas

Transformação de planta mediada por Agrobacterium foiefetuada usando técnicas de transformação e regeneração padrão (GelvinStanton B., Schilperoort Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2nd ed.,Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, em Sect., Ringbuch ZentraleSignatur: BTll-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick Bernard R., Thompson JohnE., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton:CRC Press, 1993, 360 pp., ISBN 0-8493-5164-2).

Por exemplo, colza foi transformada por transformação decotilédone ou hipocótilo (Moloney et al.(1989) Plant Cell Report 8:238-242;De Block et al.(1989) Plant Physiol 91: 694-701). O uso de antibióticos para aseleção de agrobactérias e plantas depende do vetor binário usado para atransformação e da cepa de agrobactéria. A seleção de colza foi realizadausando canamicina como marcador de planta selecionável.

Transferência de gene mediada por Agrobacterium em linho(Linum usitatissimum) pode ser realizada por exemplo usando uma técnicadescrita por Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13:282-285.

Soja pode ser transformada por exemplo usando uma técnicadescrita em EP-A-O 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) ou em EP-A-0.0397.687, US 5.376.543, US 5.169.770 (University of Toledo).

A transformação de plantas usando bombardeio de partículas,captação de DNA mediada por poli(etileno-glicol) ou via técnica de fibra decarbonato de silício é descrita, por exemplo, por Freeling e Walbot "TheMainze Handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag NewYork).

Exemplo 5: Estudo da expressão de um produto de gene recombinante em umorganismo transformado

Um método adequado para determinar o nível de transcriçãodo gene (que indica a quantidade de RNA disponível para tradução doproduto de gene) é a realização de um Northern blot como descrito aquiabaixo (para referência veja Ausubel et al. (1988) Current Protocols inMolecular Biology, Wiley: New York, ou a seção de exemplos acima), ondeum iniciador que é planejado de tal modo que se ligue no gene de interesse émarcado com um marcador detectável (normalmente um marcadorquimioluminescente ou um marcador radioativo) de modo que, quando oRNA total de uma cultura do organismo é extraído, separado sobre um gel,transferido para uma matriz estável e incubado com esta sonda, a ligação e aextensão da ligação da sonda indica a presença e também a quantidade demRNA para este gene. Esta informação incida o grau de transcrição do genetransformado. RNA total celular pode ser preparado de células, tecidos ouórgãos usando vários métodos, todos os quais são conhecidos na técnica, porexemplo o método descrito por Bormann, E.R., et al. (1992) Mol. Microbiol.6:317-326.

Hibridização de Northern:

Para realizar a hibridização de RNA, 20 μg de RNA total ou 1μg de poli(A)+ RNA foram separados por meio de eletroforese em gel emgeles de agarose de concentração de 1,25% usando formaldeído e seguindo ométodo descrito por Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304), transferidopara membranas de náilon positivamente carregadas (Hybond N+,Amersham, Brunswick) por força capilar usando 10 χ SSC, imobilizado porluz UV e pré-hibridizado por 3 horas a 68°C usando tampão de hibridização(sulfato de dextrano 10% p/v, NaCl 1 M, SDS 1%, 100 mg de DNA deesperma de arenque). A sonda de DNA foi marcada com Highprime DNAlabeling kit (Roche, Mannheim, Alemanha) durante a etapa de pré-hibridização, usando alfa- P-dCTP (Amersham Pharmacia, Brunswick,Alemanha). Hibridização foi realizada durante a noite a 68°C após adição dasonda de DNA marcada no mesmo tampão. As etapas de lavagem foramrealizadas duas vezes por 15 usando 2 X SSC e duas vezes por 30 minutosusando 1 X SSC, SDS 1%, a 68°C. Os filtros vedados foram expostos a -70°Cpor um período de 1 a 14 dias.

Para estudar a presença ou a quantidade relativa de proteínatraduzida deste mRNA, técnicas padrão tal como um Western blot podem serempregadas (veja, por exemplo, Ausubel et al. (1988) Current Protocols inMolecular Biology, Wiley: New York). Neste método, as proteínas celularestotais são extraídas, separadas por meio de eletroforese em gel, transferidaspara uma matriz como nitrocelulose e incubadas com uma sonda tal como umanticorpo que se liga especificamente na proteína desejada. Esta sonda énormalmente provida com um marcador colorimétrico ou quimioluminescenteque pode ser prontamente detectado. A presença e a quantidade do marcadorobservado indicam a presença e a quantidade da proteína mutada desejada queestá presente na célula.

Figura 1 mostra os resultados do Northern Blot de 4 linhagensde colza transgênicas independentes e de tipo selvagem. As plantas delinhagens 6, 8 e 9 mostram um sinal de detecção pronunciado no NorthernBlot. Conseqüentemente, as plantas expressam o gene GPDl em sementesmaduras. Em contraste, nenhuma transcrição do gene GPDl foi detectada naamostra de semente de linhagem 3, que, em adição um tipo selvagem, serviucomo controle adicional. Além disso, linhagem 3 demonstra que a expressãodo gene transferido não é bem sucedida em cada caso individual, dependendoda integração no genoma de Brassica napus.

Exemplo 6: Análise do efeito das proteínas recombinantes sobre a produçãodo produto desejado

O efeito da modificação genética em plantas ou sobre aprodução de um composto desejado (tal como um ácido graxo) pode serdeterminado pelo crescimento da planta modificada sob condições adequadas(tais como aquelas descritas acima) e exame do meio e/ou dos componentescelulares para a produção aumentada do produto desejado (i.e. lipídeos ou umácido graxo). Estas técnicas analíticas são conhecidas pelo trabalhadorexperiente e compreendem espectroscopia, cromatografia em camada fina,vários métodos de coloração, métodos enzimáticos e microbiológicos, ecromatografia analítica ta cromatografia líquida de desempenho alto (veja, porexemplo, Ullmann, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, pp. 89-90e pp. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon A et al. (1987) "Applicationsof HPLC in Biochemistry" em: Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology, vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol. 3, chapterIII: "Product recovery and purification", pp. 469-714, VCH: Weinheim;Belter PA et al. (1988) Bioseparations: downstream processing forBiotechnology, John Wiley e Sons; Kennedy JF e Cabral JMS (1992)Recovery processes for biological Materials, John Wiley e Sons; ShaeiwitzJA e Henry JD (1988) Biochemical Separations, em: Ullmann's Encyclopediaof Industrial Chemistry, vol. B3; chapter 11, p. 1-27, VCH: Weinheim; eDechow, F.J. (1989) "Separation and purification techniques inbiotechnology", Noyes Publications).

Em adição aos métodos acima mencionados, lipídeos de plantasão extraídos do material de planta como descrito por Cahoon et al. (1999)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22): 12935-12940, e Browse et al. (1986)Analytic Biochemistry 152:141-145. Análise qualitativa e quantitativa delipídeos e de ácidos graxos é descrita por Christie, William W., Advances inLipid Métodoology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2);Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide -Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 pp. (Oily Press LipidLibrary; 1); "Progress in Lipid Research", Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) -16 (1977) sob o título: "Progress in the Chemistry of Fats and Other LipidsCODEN".

Um exemplo é a análise de ácidos graxos (abreviações:FAME, metil-ésteres de ácido graxo;; GC-MS, cromatografia de gás-líquido /espectrometria de massa; TAG, triacil-glicerol; TLC, cromatografia emcamada fina).

Prova clara da presença de produtos de ácido graxo pode serobtida pela análise de organismos recombinantes por métodos analíticospadrão: GC, GC-MS ou TLC, como descrito variadamente por Christie e asreferências lá citadas (1997, em: Advances on Lipid Methodology, fourthedition: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren [métodos de cromatografia gasosa /espectrometria de massa], Lipide 33:343-353).

O material a ser analisado pode ser submetido ao rompimentopor sonicação, moagem em moinho de vidro, nitrogênio líquido e moagem ououtros métodos aplicáveis. Após rompimento, o material tem que sercentrifugado. O sedimento é ressuspenso em água destilada, aquecido por 10minutos a 100°C, esfriado sobre gelo e recentrifugado, seguido por extraçãoem ácido sulfurico 0,5 M em metanol com dimetóxi-propano 2% por 1 hora a90°C, que dá óleo hidrolisado e compostos de lipídeo, que dá lipídeostransmetilados. Estes metil-ésteres de ácido graxo são extraídos em éter depetróleo e finalmente submetidos à análise de GRAUS CELSIUS usando umacoluna capilar (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 μπι,0,32 mm) em um gradiente de temperatura de entre 170°C e 240°C por 20minutos e por 5 minutos a 240°C. A identidade dos metil-ésteres de ácidograxo obtidos tem que ser definida usando padrões que estão disponíveis emfontes comerciais (i.e. Sigma).

Material de planta é primeiro mecanicamente homogeneizadopor cominuição em um almofariz para torná-lo mais acessível à extração.

O seguinte protocolo foi usado para a análise quantitativa deóleo das plantas Brassica transformadas com o gene Gpdl:

Extração de lipídeo de sementes é realizada pelo método deBligh & Dyer (1959) Can J Biochem Physiol 37:911. Para este fim, 5 mg desementes de Arabidopsis Brassica são pesados em microtubos Qiagen de 1,2ml (Qiagen, Hilden) usando uma microbalança Sartorius (Gõttingen). Omaterial de semente é homogeneizado em 1 ml de clorofórmio/metanol (1:1;contém mono-C17-glicerol de Sigma como padrão interno) em um moinhoMM300 Retsch de Retsch (Haan) e incubado por 20 minutos na RT. Apóscentrifugação, o sobrenadante foi transferido para um vaso fresco, e osedimento foi reextraído com 1 ml de clorofórmio/metanol (1:1). Ossobrenadantes foram combinados e evaporados até a secura. Os ácidos graxosforam derivados por metanólise ácida. Para este fim, os lipídeos que haviamsido extraídos foram tratados com ácido sulfurico 0,5 M em metanol edimetóxi-propano 2% (v/v) e incubados por 60 minutos a 80°C. Isto foiseguido por duas extrações com éter de petróleo seguido por etapas delavagem com hidrogeno-carbonato de sódio 100 mM e água. Os metil-ésteresde ácido graxo assim preparados foram evaporados até a secura e recolhidosem um volume definido de éter de petróleo. 2 μΐ de solução de metil-éster deácido graxo foram finalmente separados por cromatografia gasosa (HP 6890,Agilent Technologies) em uma coluna capilar (Chrompack, WCOT FusedSilica, CP-Wax-52 CB5 25 m, 0,32 mm) e analisados via um detector deionização por chama. O óleo foi quantificado por comparação dasintensidades de sinal dos ácidos graxos derivados com aquelas do padrãointerno mono-C17-glicerol (Sigma). Por meio de exemplo, Figura 4 mostra osresultados para a determinação quantitativa do teor de óleos em sementes T3de 3 linhagens de colza transgênicas independentes e de uma linhagem decontrole não-expressando e das plantas de tipo selvagem não-transformadas.Cinco extrações independentes foram realizadas com as porções de sementede cada linhagem, e os extratos foram medidos independentemente. A médiae o desvio padrão foram calculados das três medições independentes.

Um aumento significativo do teor de lipídeo total sobre aqueleda linhagem de tipo selvagem e da linhagem de controle não-expressando foidetectado nas amostras de semente de linhagens transgênicas 6, 8, e 9. Esteaumento esteve entre aproximadamente 20 e 22% do peso de semente. Emcontraste, os teores de lipídeo na linhagem de tipo selvagem e na linhagem 3de controle foram de aproximadamente 15%. Isto corresponde a um aumentono teor total de óleo de 33% ou de aproximadamente 47%, respectivamente.Em contraste, a composição de ácido graxo não foi modificada como umresultado da expressão de GPDl (veja Tabela 1).

Tabela 1 mostra a composição de ácido graxo nas sementes T3das linhagens 8, 6 e 9 transgênicas expressando GDH e de uma linhagem 3 decontrole não-expressando e das plantas de tipo selvagem não-transformadas.Cinco extrações independentes foram realizadas com as porções de sementede cada linhagem, e os extratos foram medidos independentemente. A médiae o desvio padrão foram calculados de três medições independentes.

Acido oleico (18:1) totaliza a maior parte no óleo, com maisde 55%, não apenas nas linhagens 8, 6 e 9 transgênicas e expressando GDH,mas também na linhagem 3 de controle não-expressando e nas plantas de tiposelvagem não-transformadas.Exemplo 7: Extração de glicerol-3-fosfato

Para glicerol-3-fosfato de sementes de colza maturando, asúltimas são homogeneizadas em um moinho oscilatório (Retsch), tratadascom 500 μΐ de TCA 16% (p/v) / dietil-éter e incubadas sobre gelo por 20minutos. Depois, 800 μΐ de TCA 16% / H2O / EGTA 5 mM são adicionados ea mistura é incubada sobre gelo por 3 horas. Componentes insolúveis sãosedimentados por centrifiigação. As fases de topo líquidas são transferidaspara um vaso fresco, lavadas com 500 μΐ de dietil-éter saturado com água a4°C, e recentrifugadas. A fase de fundo hidrofílica é submetida a mais 3etapas de lavagem, e o pH é trazido para 6-7 usando KOH 5 M / TEA 1M. Afase hidrofílica é congelada por choque térmico em nitrogênio líquido, secaem um liofilizador (Christ) e subseqüentemente dissolvida em 800 μΐ de H2O.Exemplo 8: Determinar a quantidade de glicerol-3-fosfato (G3P)A quantidade de G3P foi determinada por meio de ensaio deciclização enzimática (Gibon et ai. 2002). Para este fim, 10 μΐ de fasehidrofílica (veja acima) ou de replicados de G3PDH (veja aqui abaixo) sãotratados com 46 μΐ de Tricina/KOH (200 mM, pH 7,8) / MgCl2 10 mM e for20 minutos a 950C com o objetivo de destruir o di-hidróxi-acetona-fosfato.Depois, as amostras são brevemente submetidas à centrifugação incipiente, eo sobrenadante é tratado com 45 μΐ de mistura reacional (2 U de glicerol-3-fosfato oxidase, 0,4 Ude glicerol-3-fosfato-desidrogenase, 130 U de catalase,0,12 μπιοί de NADH). A reação leva a um consumo efetivo de NADH, quepode ser monitorado diretamente no potenciômetro pela diminuição daabsorção a 340 nm. A quantidade de G3P é calculada via uma linha decalibração de concentrações de G3P diferentes.

O interessante é que a sobreexpressão semente-específica deGDP de Saccharomyces acarreta um aumento significativo no teor de G3P emsementes maduras de plantas transgênicas de colza (40 DAF). Os teores deG3P nas sementes (40 DAF) de linhagens 6, 8 e 9 estiveram entreaproximadamente 350 e 420 nmol G3P/g de peso fresco. O teor de G3P nassementes de tipo selvagem e nas sementes da linhagem não-expressando, emcontraste, foi de apenas entre aproximadamente 50 e 100 nmol G3P/g de pesofresco (veja Figura 2).

Exemplo 9: Determinação da atividade de G3PDH

Para determinar a atividade de G3PDH nas sementes de colzamaturando, as sementes maturando são isoladas de vagens congeladas,pesadas em uma microbalança e homogeneizadas usando um moinhooscilatório (Retsch). Depois, as amostras são recongeladas em nitrogêniolíquido.

Quinhentos microlitros de um tampão de extração frio(HEPES 50 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM,ditiotreitol 5 mM, glicerol 10% (v/v), benzamidina 2 mM, ácido capróico 2mM, fluoreto de fenil-metil-sulfonila 0,5 mM, poli(vinil-pirrolidona) 1 g/l)são adicionados nas amostras homogeneizadas, misturados totalmente eincubados por 30 minutos a 4°C no escuro com agitação contínua. Depois, asamostras são centrifugadas por 15 minutos a 14.000 rpm e 4°C (centrífugaEppendorf). O sobrenadante, que compreende as proteínas solúveis, étransferido em um vaso Eppendorf fresco e pode ser empregado diretamentepara determinar a atividade de G3PDH se não é usado a -80°C.

10 μl de extratos de proteína são pipetados juntos com 90 μlde mistura reacional (di-hidróxi-acetona-fosfato 4 mM; NADH 0,2 mM emHEPES 50 mM pH 7,4) e incubados por 30 minutos a 24°C. A reação é entãoterminada por aquecimento por 20 minutos a 95°C.

3 Replicações de cada amostra são empregadas paradeterminar a atividade de G3PDH, uma amostra sendo aquecida diretamente eatuando como branco. A quantificação de um glicerol-3-fosfato (G3P)formado é subseqüentemente realizada pelo método de Gibon et al. 2002 (vejaacima).

As linhagens transgênicas 6, 8 e 9 que têm testadopositivamente em nível de transcrição mostraram uma atividade de glicerol-3 -fosfato-desidrogenase significativamente aumentada nas sementes maturando(40 DAF) em comparação com a linhagem de tipo selvagem e a linhagem 3não-expressando. Em linhagens 6, 8 e 9, foi detectada uma atividade de atéaproximadamente 400 nmol G3P/g de peso fresco e minuto. Na linhagem detipo selvagem e na linhagem 3 de controle não-expressando, em contraste, aatividade apenas totalizou aproximadamente 250 nmol de G3P/g de peso secoe minuto. Isto demonstra que GPDl é expressada em linhagens 6, 8 e 9 nãoapenas em nível de RNA, mas também em nível de enzima.Equivalentes:

O trabalhador experiente reconhece ou pode identificar muitosequivalentes das modalidades específicas de acordo com a invenção aquidescrita por mera realização de experimentos de rotina. Estes equivalentes sãopara serem compreendidos pelas reivindicações de patente.Reivindicações:LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BASF Plant Science GmbH

<120> Método para aumentar o teor de óleo total em plantas oleagonisas.<130> PF57253

<140> 20050715<141> 2006-21-07<160> 40

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1<211> 1176<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<221> CDS

<222> (1).. (1173)

<223> codificador de G3PDH

<400> 1

atg tct gct gct gct gat aga tta aac tta act tcc ggc cac ttg aat 48Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn15 10 15

gct ggt aga aag aga agt tcc tct tct gtt tct ttg aag gct gcc gaa 96Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu20 25 30

aag cct ttc aag gtt act gtg att gga tct ggt aac tgg ggt act act 144Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr35 40 45

att gcc aag gtg gtt gcc gaa aat tgt aag gga tac cca gaa gtt ttc 192Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe50 55 60

gct cca ata gta caa atg tgg gtg ttc gaa gaa gag ate aat ggt gaa 240Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu65 70 75 80

aaa ttg act gaa ate ata aat act aga cat caa aac gtg aaa tac ttg 288Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu85 90 95

cct ggc ate act cta ccc gac aat ttg gtt gct aat cca gac ttg att 336Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile100 105 110

gat tca gtc aag gat gtc gac ate ate gtt ttc aac att cca cat caa 384Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln115 120 125

ttt ttg ccc cgt ate tgt age caa ttg aaa ggt cat gtt gat tca cac 432Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His130 135 140

gtc aga gct ate tcc tgt cta aag ggt ttt gaa gtt ggt gct aaa ggtVal Arg Ala Xle Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly145 150 155 160

gtc caa ttg cta tcc tet tac ate act gag gaa cta ggt att caa tgtVal Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys165 170 175

ggt gct cta tet ggt gct aac att gcc acc gaa gtc gct caa gaa cacGly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His180 185 190

tgg tet gaa aca aca gtt gct tac cac att cca aag gat ttc aga ggcTrp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly195 200 205

gag ggc aag gac gtc gac cat aag gtt cta aag gcc ttg ttc cac agaGlu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg210 215 220

cct tac ttc cac gtt agt gtc ate gaa gat gtt gct ggt ate tcc atePro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile225 230 235 240

tgt ggt gct ttg aag aac gtt gtt gcc tta ggt tgt ggt ttc gtc gaaCys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu245 250 255

ggt cta ggc tgg ggt aac aac gct tet gct gcc ate caa aga gtc ggtGly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly260 265 270

ttg ggt gag ate ate aga ttc ggt caa atg ttt ttc cca gaa tet agaLeu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg275 280 285

gaa gaa aca tac tac caa gag tet gct ggt gtt gct gat ttg ate accGlu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr290 295 300

acc tgc gct ggt ggt aga aac gtc aag gtt gct agg cta atg gct actThr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr305 310 315 320

tet ggt aag gac gcc tgg gaa tgt gaa aag gag ttg ttg aat ggc caaSer Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln325 330 335

tcc gct caa ggt tta att acc tgc aaa gaa gtt cac gaa tgg ttg gaaSer Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu340 345 350

aca tgt ggc tet gtc gaa gac ttc cca tta ttt gaa gcc gta tac caaThr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln355 360 365

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<213> Saccharomyces cerevisiae<400> 2

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<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1296)

<223> codificador de G3PDH

<220><221> CDS

<222> (145)..(1296)

<223> codificador de G3PDH (códon de iniciação alternativo)<400> 3

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<220>

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<220>

<221> CDS

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Leu

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Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Pro Lys Gly Val145 150 155 160

Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Val Thr Gln Glu Leu Gly Ile Gln Cys Gly165 170 175

Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu His Trp180 185 190

Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Val Pro Asp Asp Phe Lys Gly Glu195 200 205

Gly Lys Asp Ile Asp His Arg Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Pro210 215 220

Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala225 230 235 240

Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Thr Gly245 250 255

Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly Leu260 265 270

Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser Lys Val275 280 285

Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr290 295 300

Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Arg Val Ala Thr Glu Met Ala Lys Thr305 310 315 320

Gly Lys Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Gln Ser325 330 335Ala Gln Gly Leu Ile340

Thr Ala Lys Glu Val345

His Gln Trp Leu Glu Ser350

Ser Gly His Thr Glu Glu355

Tyr Pro Leu360

Phe Glu Ala Val Tyr Gln Ile365

Thr Tyr Glu Asn Val370

Pro Met Lys Glu Leu Pro375

Ser Met Ile Glu Glu380

Leu Asp Ile Val Glu385

<210> 17<211> 8809<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: vetor de expressão pSUN-USPcontendo G3PDH de Saccharomyces

<220>

<221> caracter!stica_misc<222> (1017)..(2189)<223> codificador de G3PDH

aatattcaaa caaacacata cagcgcgact tatcatggac atacaaatgg acgaacggat 60

aaaccttttc acgccctttt aaatatccga ttattctaat aaacgctctt ttctcttagg 120

tttacccgcc aatatatcct gtcaaacact gatagtttaa actgaaggcg ggaaacgaca 180

atcagatcta gtaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt 240

cgactctaga ctagtggatc cgatatcgcc cgggctcgag gtaccgagct cgaattcggc 300

gcgccgagct cctcgagcaa atttacacat tgccactaaa cgtctaaacc cttgtaattt 360

gtttttgttt tactatgtgt gttatgtatt tgatttgcga taaattttta tatttggtac 420

taaatttata acacctttta tgctaacgtt tgccaacact tagcaatttg caagttgatt 480

aattgattct aaattatttt tgtcttctaa atacatatac taatcaactg gaaatgtaaa 540

tatttgctaa tatttctact ataggagaat taaagtgagt gaatatggta ccacaaggtt 600

tggagattta attgttgcaa tgatgcatgg atggcatata caccaaacat tcaataattc 660

ttgaggataa taatggtacc acacaagatt tgaggtgcat gaacgtcacg tggacaaaag 720

gtttagtaat ttttcaagac aacaatgtta ccacacacaa gttttgaggt gcatgcatgg 780

atgccctgtg gaaagtttaa aaatattttg gaaatgattt gcatggaagc catgtgtaaa 840

accatgacat ccacttggag gatgcaataa tgaagaaaac tacaaattta catgcaacta 900

gttatgcatg tagtctatat aatgaggatt ttgcaatact ttcattcata cacactcact 960

aagttttaca cgattataat ttcttcatag ccagcccacc gcggtgggcg gccgccatgt 1020

ctgctgctgc tgatagatta aacttaactt ccggccactt gaatgctggt agaaagagaa 1080

gttcctcttc tgtttctttg aaggctgccg aaaagccttt caaggttact gtgattggat 1140

ctggtaactg gggtactact attgccaagg tggttgccga aaattgtaag ggatacccag 1200

aagttttcgc tccaatagta caaatgtggg tgttcgaaga agagatcaat ggtgaaaaat 1260

tgactgaaat cataaatact agacatcaaa acgtgaaata cttgcctggc atcactctac 1320

ccgacaattt ggttgctaat ccagacttga ttgattcagt caaggatgtc gacatcatcg 1380

tcttcaacat tccacatcaa tttttgcccc gtatctgtag ccaattgaaa ggtcatgttg 1440

attcacacgt cagagctatc tcctgtctaa agggttttga agttggtgct aaaggtgtcc 1500

aattgctatc ctcttacatc actgaggaac taggtattca atgtggtgct ctatctggtg 1560

ctaacattgc cactgaagtc gctcaagaac actggtctga aacaacagtt gcttaccaca 1620

ttccaaagga tttcagaggc gagggcaagg acgtcgacca taaggttcta aaggccttgt 1680

tccacagacc ttacttccac gttagtgtca tcgaagatgt tgctggtatc tccatctgtg 1740

gtgctttgaa gaacgttgtt gccttaggtt gtggtttcgt cgaaggtcta ggctggggta 1800

acaacgcttc tgctgccatc caaagagtcg gtttgggtga gatcatcaga ttcggtcaaa 1860

tgtttttccc agaatctaga gaagaaacat actaccaaga gtctgctggt gttgctgatt 1920

tgatcaccac ctgcgctggt ggtagaaacg tcaaggttgc taggctaatg gctacttctg 1980

gtaaggacgc ctgggaatgt gaaaaggagt tgttgaatgg ccaatccgct caaggtttaa 2040

ttacctgcaa agaagttcac gaatggttgg aaacatgtgg ctctgtcgaa gacttcccat 2100

<400> 17tatttgaagc cgtataccaa atcgtttacatgattgaaga attagatcta catgaagatttgctttaatg agatatgcga gacgcctatgtgcacgttgt aaaaaacctg agcatgtgtattctaatgaa tatatcaccc gttactatcgttactgattg tccgtcgacg aattcactggaggaggcccg atctagtaac atagatgacagctatatttt gttttctatc gcgtattaaacccatctcat aaataacgtc atgcattacaacagaaatta tatgataatc atcgcaagacattgccaaat gtttgaacga tcggggatcatatccgaacg cagcaagatc tagagcttgggatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggagcagcccattc gccgccaagc tcttcagcaaagcggtccgc cacacccagc cggccacagtccatgatatt cggcaagcag gcatcgccattgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgggatcatcctg atcgacaaga ccggcttccatcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccgcagccatgat ggatactttc tcggcaggaggcacttcgcc caatagcagc cagtcccttccgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacgtcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaaggaacacggc ggcatcagag cagccgattgtctccaccca agcggccgga gaacctgcgtatccagatcc ggtgcagatt atttggattggaggggaatt tatggaacgt cagtggagcagtgaccttag gcgacttttg aacgcgcaattaaactccag aaacccgcgg ctgagtggctacgtaaaacg gcttgtcccg cgtcatcggccgctcatgat cagattgtcg tttcccgcctcactgcttgg taataattgt cattagattgcaattttaga caagtatcaa acggatgttattattaagtt gtctaagcgt caatttgtttcaacagctcc ccgaccggca gctcggcacatatttgagta aaacagcttg cgtcatgcggaacaaatacg caaggggaac gcatgaaggtaggcaagacg accatcgcaa cccatctagctctgttagtc gattccgatc cccagggcagtcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccgcggccggcgc gacttcgtag tgatcgacggcgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgatggccaccgcc gacctggtgg agctggttaaacaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgatcgaggcgctg gccgggtacg agctgcccatctacccaggc actgccgccg ccggcacaactgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctgaggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaacagcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctgtttcagttgc cggcggagga tcacaccaagaccattaccg agctgctatc tgaatacatcataaatgagt agatgaattt tagcggctaaaggcaccgac gccgtggaat gccccatgtgcggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgggtgagcggtc gcaaaccatc cggcccggtagtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgccccggtgaatc gtggcaaggg gccgctgatccagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgcttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcgtccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctgggcacgtaga ggtttccgca gggccggccgtactgatggc ggtttcccat ctaaccgaatacaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg

acaactaccc aatgaagaac ctgccggaca 2160aggcggccgc ctgcagtcta gaaggcctcc 2220atcgcatgat atttgctttc aattctgttg 2280gctcagatcc ttaccgccgg tttcggttca 2340tatttttatg aataatattc tccgttcaat 2400ccgtcgtttt acaacgactc agagcttgac 2460ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc 2520tgtataattg cgggactcta atcataaaaa 2580tgttaattat tacatgctta acgtaattca 2640cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt 2700tccgggtctg tggcgggaac tccacgaaaa 2760gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc 2820cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt 2880tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat 2940cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca 3000gtgtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca 3060ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca 3120tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt 3180gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat 3240caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg 3300ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg 3360atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat 3420aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc 3480tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc 3540gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg 3600agagtgaata tgagactcta attggatacc 3660tttttgacaa gaaatatttg ctagctgata 3720aatggtttct gacgtatgtg cttagctcat 3780ccttcaacgt tgcggttctg tcagttccaa 3840gggggtcata acgtgactcc cttaattctc 3900tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat 3960tttttatgca tagatgcact cgaaatcagc 4020attcagtaca ttaaagacgt ccgcaatgtg 4080acaccacaat atatcctgcc accagccagc 4140aaatcaccac gcgtctaaaa aggtgatgtg 4200tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata 4260tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc 4320ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt 4380tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga 4440cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat 4500agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc 4560tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg 4620gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct 4680caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc 4740tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag 4800cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc 4860aattaaatca aaactcattt gagttaatga 4920acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc 4980gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac 5040ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag 5100gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga 5160aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc 5220tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag 5280cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc 5340caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg 5400cagcggcaac gcatcgaggc agaagacgcc 5460gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg 5520ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg 5580atagtcgcag catcatggac gtggccgttt 5640gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg 5700gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg 5760ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag 5820ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag 5880ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctggacgttgccat gcagcgtacg aagaaggccagtgaagcctt gattagccgc tacaagatcgtcgagatcga gctagctgat tggatgtacctgctgacggt tcaccccgat tactttttgagcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcagaacgcagtgg cagcgccgga gagttcaagaggtcaaatga cctgccggag tacgatttgatagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgaggagcagatgct agggcaaatt gccctagcagtggatagcac gtacattggg aacccaaagcggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggtaaaaaggcga tttttccgcc taaaactctttggcctgtgc ataactgtct ggccagcgcattcggtcgct gcgctcccta cgccccgccgtgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggagatcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgttaaggcggtaa tacggttatc cacagaatcaaaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaactccgccccc ctgacgagca tcacaaaaatacaggactat aaagatacca ggcgtttcccccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcctctcatagct cacgctgtag gtatctcagttgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgacgagtccaacc cggtaagaca cgacttatcgagcagagcga ggtatgtagg cggtgctacatacactagaa ggacagtatt tggtatctgcagagttggta gctcttgatc cggcaaacaatgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaaacggggtctg acgctcagtg gaacgaaaacatatctccca atttgtgtag ggcttattatacctgatagt ttggctgtga gcaattatgtgcgccgcgaa gcggcgtcgg cttgaacgaattggtgatct cgcctttcac gtagtggacaaagcgatctt cttcttgtcc aagataagcctgggccggca ggcgctccat tgcccagtcggttactgcgc tgtaccaaat gcgggacaaccagtcgggcg gcgagttcca tagcgttaagtcaggaaccg gatcaaagag ttcctccgcccttgcttttg tcagcaagat agccagatcagcaagaatgt cattgcgctg ccattctccacacggaatga tgtcgtcgtg cacaacaatgtctccagggg aagccgaagt ttccaaaaggtcaagcctta cggtcaccgt aaccagcaaatccactgcgg agccgtacaa atgtacggccacgccaacta cctctgatag ttgagtcgattttaactttg ttttagggcg actgccctgcaaacatcgac ccacggcgta acgcgcttgcccaaaaaaac agtcataaca agccatgaaa

tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc 5940agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg 6000taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca 6060gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg 6120tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc 6180aagccagatg gttgttcaag acgatctacg 6240agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg 6300aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc 6360gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg 6420gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg 6480cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg 6540cacacatgta agtgactgat ataaaagaga 6600taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc 6660cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc 6720cttcgcgtcg gcctatcgcg gcctatgcgg 6780aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc 6840cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 6900ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 6960aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 7020cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 7080cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 7140gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 7200tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 7260cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 7320ccactggcag cagccactgg taacaggatt 7380gagttcttga agtggtggcc taactacggc 7440gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 7500accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 7560ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 7620tcacgttaag ggattttggt catgcatgat 7680gcacgcttaa aaataataaa agcagacttg 7740gcttagtgca tctaacgctt gagttaagcc 7800tttctagcta gacattattt gccgactacc 7860aattcttcca actgatctgc gcgcgaggcc 7920tgtctagctt caagtatgac gggctgatac 7980gcagcgacat ccttcggcgc gattttgccg 8040gtaagcacta catttcgctc atcgccagcc 8100gtttcattta gcgcctcaaa tagatcctgt 8160gctggaccta ccaaggcaac gctatgttct 8220atgtcgatcg tggctggctc gaagatacct 8280aattgcagtt cgcgcttagc tggataacgc 8340gtgacttcta cagcgcggag aatctcgctc 8400tcgttgatca aagctcgccg cgttgtttca 8460tcaatatcac tgtgtggctt caggccgcca 8520agcaacgtcg gttcgagatg gcgctcgatg 8580acttcggcga tcaccgcttc ccccatgatg 8640tgcgtaacat cgttgctgct ccataacatc 8700tgcttggatg cccgaggcat agactgtacc 8760accgccactg cgttccatg 8809

<210> 18<211> 26<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Descrição de seqüência artificial:iniciador oligonucleotídeo

<400> 18actagtatgt ctgctgctgc tgatag 26<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial:iniciador oligonucleotideo

<400> 19

ctcgagatct tcatgtagat ctaatt 26

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial:iniciador oligonucleotideo

<400> 20

gcggccgcca tgtctgctgc tgctgatag 29

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial:iniciador oligonucleotideo

<400> 21

gcggccgcat cttcatgtag atctaatt 28

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8)

<223> Thr

<400> 22

Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys15 10

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE<222> (2)<223> Gln

<400> 23

His Glu Gln Asn Val Lys Tyr Leu1 5

<210> 24<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE<222> (1)<223> Asn

<220>

<221> VARIANTE<222> (2)<223> Val

<220>

<221> VARIANTE<222> (3)<223> Ile

<220>

<221> VARIANTE<222> (5)<223> Trp

<220>

<221> VARIANTE<222> (6)<223> Asn

<220>

<221> VARIANTE<222> (7)<223> Ile or Val

<220>

<221> VARIANTE<222> (12)<223> Leu or Ile

<400> 24

Asp Ile Leu Val Phe Val Leu Pro His Gln Phe Val15 10

<210> 25<211> 7<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE<222> (1)<223> Gly

<220>

<221> VARIANTE<222> (2)<223> Val

<220>

<221> VARIANTE<222> (5)<223> Ile

<400> 25

Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly1 5

<210> 26<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE<222> (3)<223> Ala

<220>

<221> VARIANTE<222> (9)<223> Ile or Val

<220>

<221> VARIANTE<222> (13)<223> Ile

<400> 26

Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Xaa Glu Val Ala1 5 10

<210> 27<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220><223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE<222> (1)<223> Val

<400> 27

Leu Phe Xaa Arg Pro Tyr Phe Xaa Val1 5

<210> 28<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE<222> (2)<223> Met

<220>

<221> VARIANTE<222> (3)<223> Gly

<220>

<221> VARIANTE<222> (5)<223> Ile

<220>

<221> VARIANTE<222> (6)<223> Gln

<220>

<221> VARIANTE<222> (7)<223> Lys or Asn

<220>

<221> VARIANTE<222> (9)<223> Ser or Ala

<400> 28

Gly Leu Leu Glu Met Ile Arg Phe Gly1 5

<210> 29<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220><223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE

<222> (13)

<223> Ile

<400> 29

Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn15 10 15

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE

<222> (3)

<223> Arg

<400> 30

Asn Thr Lys His Gln Asn Val Lys Tyr Leu Pro15 10

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE

<222> (2)

<223> Val

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7)

<223> Val

<400> 31

Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu15 10

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura<220>

<221> VARIANTE<222> (3)<223> Val

<400> 32

Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu15 10

<210> 33<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE<222> (11)<223> Thr

<400> 33

Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala15 10

<210> 34<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<400> 34

Leu Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val1 5

<210> 35<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: motivo de seqüência de G3PDHde levedura

<220>

<221> VARIANTE<222> (7)<223> Arg

<400> 35

Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly1 5

<210> 36<211> 13718<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Descrição de seqüência artificial: vetor de expressão pGPTV-gpdl<220><221> promoter<222> (10807)..(11951)<223> promotor de napina<220><221> terminador<222> (13154)..(13408)<223> terminador nos<220><221> caracteristica_misc<222> (11962)..(13137)<223> codificador de G3PDH (gpdl) de levedura

<400> 36

gatctggcgc cggccagcga gacgagcaag attggccgcc gcccgaaacg atccgacagc 60gcgcccagca caggtgcgca ggcaaattgc accaacgcat acagcgccag cagaatgcca 120tagtgggcgg tgacgtcgtt cgagtgaacc agatcgcgca ggaggcccgg cagcaccggc 180ataatcaggc cgatgccgac agcgtcgagc gcgacagtgc tcagaattac gatcaggggt 240atgttgggtt tcacgtctgg cctccggacc agcctccgct ggtccgattg aacgcgcgga 300ttctttatca ctgataagtt ggtggacata ttatgtttat cagtgataaa gtgtcaagca 360tgacaaagtt gcagccgaat acagtgatcc gtgccgccct ggacctgttg aacgaggtcg 420gcgtagacgg tctgacgaca cgcaaactgg cggaacggtt gggggttcag cagccggcgc 480tttactggca cttcaggaac aagcgggcgc tgctcgacgc actggccgaa gccatgctgg 540cggagaatca tacgcattcg gtgccgagag ccgacgacga ctggcgctca tttctgatcg 600ggaatgcccg cagcttcagg caggcgctgc tcgcctaccg cgatggcgcg cgcatccatg 660ccggcacgcg accgggcgca ccgcagatgg aaacggccga cgcgcagctt cgcttcctct 720gcgaggcggg tttttcggcc ggggacgccg tcaatgcgct gatgacaatc agctacttca 780ctgttggggc cgtgcttgag gagcaggccg gcgacagcga tgccggcgag cgcggcggca 840ccgttgaaca ggctccgctc tcgccgctgt tgcgggccgc gatagacgcc ttcgacgaag 900ccggtccgga cgcagcgttc gagcagggac tcgcggtgat tgtcgatgga ttggcgaaaa 960ggaggctcgt tgtcaggaac gttgaaggac cgagaaaggg tgacgattga tcaggaccgc 1020tgccggagcg caacccactc actacagcag agccatgtag acaacatccc ctcccccttt 1080ccaccgcgtc agacgcccgt agcagcccgc tacgggcttt ttcatgccct gccctagcgt 1140ccaagcctca cggccgcgct cggcctctct ggcggccttc tggcgctctt ccgcttcctc 1200gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 1260ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 1320aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 1380ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 1440aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 1500gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttt 1560ccgctgcata accctgcttc ggggtcatta tagcgatttt ttcggtatat ccatcctttt 1620tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg ttcgtgtaga ctttccttgg tgtatccaac 1680ggcgtcagcc gggcaggata ggtgaagtag gcccacccgc gagcgggtgt tccttcttca 1740ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc tgctctgcga ggctggccgg 1800ctaccgccgg cgtaacagat gagggcaagc ggatggctga tgaaaccaag ccaaccagga 1860agggcagccc acctatcaag gtgtactgcc ttccagacga acgaagagcg attgaggaaa 1920aggcggcggc ggccggcatg agcctgtcgg cctacctgct ggccgtcggc cagggctaca 1980aaatcacggg cgtcgtggac tatgagcacg tccgcgagct ggcccgcatc aatggcgacc 2040tgggccgcct gggcggcctg ctgaaactct ggctcaccga cgacccgcgc acggcgcggt 2100tcggtgatgc cacgatcctc gccctgctgg cgaagatcga agagaagcag gacgagcttg 2160gcaaggtcat gatgggcgtg gtccgcccga gggcagagcc atgacttttt tagccgctaa 2220aacggccggg gggtgcgcgt gattgccaag cacgtcccca tgcgctccat caagaagagc 2280gacttcgcgg agctggtgaa gtacatcacc gacgagcaag gcaagaccga gcgcctttgc 2340gacgctcacc gggctggttg ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg gccctgcaaa 2400cgcgccagaa acgccgtcga agccgtgtgc gagacaccgc ggccgccggc gttgtggata 2460cctcgcggaa aacttggccc tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca cttgaggggc 2520cgactcaccc ggcgcggcgt tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc cggcgacgtg 2580gagctggcca gcctcgcaaa tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt tcccacagat 2640gatgtggaca agcctgggga taagtgccct gcggtattga cacttgaggg gcgcgactac 2700tgacagatga ggggcgcgat ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca gatgaggggc 2760gcacctattg acatttgagg ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt gcaagggttt 2820ccgcccgttt ttcggccacc gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac caatatttat 2880aaaccttgtt tttaaccagg gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc cgaagggggg 2940tgccccccct tctcgaaccc tcccggcccg ctaacgcggg cctcccatcc ccccaggggc 3000tgcgcccctc ggccgcgaac ggcctcaccc caaaaatggc agcgctggca gtccttgcca 3060ttgccgggat cggggcagta acgggatggg cgatcagccc gagcgcgacg cccggaagca 3120ttgacgtgcc gcaggtgctg gcatcgacat tcagcgacca ggtgccgggc agtgagggcg 3180gcggcctggg tggcggcctg cccttcactt cggccgtcgg ggcattcacg gacttcatgg 3240cggggccggc aatttttacc ttgggcattc ttggcatagt ggtcgcgggt gccgtgctcg 3300tgttcggggg tgcgataaac ccagcgaacc atttgaggtg ataggtaaga ttataccgag 3360gtatgaaaac gagaattgga cctttacaga attactctat gaagcgccat atttaaaaag 3420ctaccaagac gaagaggatg aagaggatga ggaggcagat tgccttgaat atattgacaa 3480tactgataag ataatatatc ttttatatag aagatatcgc cgtatgtaag gatttcaggg 3540ggcaaggcat aggcagcgcg cttatcaata tatctataga atgggcaaag cataaaaact 3600tgcatggact aatgcttgaa acccaggaca ataaccttat agcttgtaaa ttctatcata 3660attgggtaat gactccaact tattgatagt gttttatgtt cagataatgc ccgatgactt 3720tgtcatgcag ctccaccgat tttgagaacg acagcgactt ccgtcccagc cgtgccaggt 3780gctgcctcag attcaggtta tgccgctcaa ttcgctgcgt atatcgcttg ctgattacgt 3840gcagctttcc cttcaggcgg gattcataca gcggccagcc atccgtcatc catatcacca 3900cgtcaaaggg tgacagcagg ctcataagac gccccagcgt cgccatagtg cgttcaccga 3960atacgtgcgc aacaaccgtc ttccggagac tgtcatacgc gtaaaacagc cagcgctggc 4020gcgatttagc cccgacatag ccccactgtt cgtccatttc cgcgcagacg atgacgtcac 4080tgcccggctg tatgcgcgag gttaccgact gcggcctgag ttttttaagt gacgtaaaat 4140cgtgttgagg ccaacgccca taatgcgggc tgttgcccgg catccaacgc cattcatggc 4200catatcaatg attttctggt gcgtaccggg ttgagaagcg gtgtaagtga actgcagttg 4260ccatgtttta cggcagtgag agcagagata gcgctgatgt ccggcggtgc ttttgccgtt 4320acgcaccacc ccgtcagtag ctgaacagga gggacagctg atagacacag aagccactgg 4380agcacctcaa aaacaccatc atacactaaa tcagtaagtt ggcagcatca cccataattg 4440tggtttcaaa atcggctccg tcgatactat gttatacgcc aactttgaaa acaactttga 4500aaaagctgtt ttctggtatt taaggtttta gaatgcaagg aacagtgaat tggagttcgt 4560cttgttataa ttagcttctt ggggtatctt taaatactgt agaaaagagg aaggaaataa 4620taaatggcta aaatgagaat atcaccggaa ttgaaaaaac tgatcgaaaa ataccgctgc 4680gtaaaagata cggaaggaat gtctcctgct aaggtatata agctggtggg agaaaatgaa 4740aacctatatt taaaaatgac ggacagccgg tataaaggga ccacctatga tgtggaacgg 4800gaaaaggaca tgatgctatg gctggaagga aagctgcctg ttccaaaggt cctgcacttt 4860gaacggcatg atggctggag caatctgctc atgagtgagg ccgatggcgt cctttgctcg 4920gaagagtatg aagatgaaca aagccctgaa aagattatcg agctgtatgc ggagtgcatc 4980aggctctttc actccatcga catatcggat tgtccctata cgaatagctt agacagccgc 5040ttagccgaat tggattactt actgaataac gatctggccg atgtggattg cgaaaactgg 5100gaagaagaca ctccatttaa agatccgcgc gagctgtatg attttttaaa gacggaaaag 5160cccgaagagg aacttgtctt ttcccacggc gacctgggag acagcaacat ctttgtgaaa 5220gatggcaaag taagtggctt tattgatctt gggagaagcg gcagggcgga caagtggtat 5280gacattgcct tctgcgtccg gtcgatcagg gaggatatcg gggaagaaca gtatgtcgag 5340ctattttttg acttactggg gatcaagcct gattgggaga aaataaaata ttatatttta 5400ctggatgaat tgttttagta cctagatgtg gcgcaacgat gccggcgaca agcaggagcg 5460caccgacttc ttccgcatca agtgttttgg ctctcaggcc gaggcccacg gcaagtattt 5520gggcaagggg tcgctggtat tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga 5580cggccagacg gtctacggga ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa 5640ggcaccaggc gggtcaaatc aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat 5700cccgcaagga gggtgaatga atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat 5760cgacgcgggg ttttccgccg aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc 5820gccccgcgaa accttccagt ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga 5880gcgcgacagc gtgcaactgg ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg 5940ttcgcgtcgt ctcgaacagg aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg 6000aggaactatg acgaccaaga agcgaaaaac cgccggogag gacctggcaa aacaggtcag 6060cgaggccaag caggccgcgt tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct 6120ttccttgttc gatattgcgc cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc 6180ccgctctgcc ctgttcacca cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa 6240ggtcattttc cacgtcaaca aggacgtgaacgacgatgac gaactggtgt ggcagcaggtcgagccgatc accttcacgt tctacgagctccggtattac acgaaggccg aggaatgcctcacgtccgac cgcgttgggc acctggaatcggaccgtggc aagaaaacgt cccgttgccagtttgctggc gaccactaca cgaaattcatggcccgacgg atgttcgact atttcagctcaaccttccgc ctcatgtgcg gatcggattccggcgaagcc tgcgaagagt tgcgaggcagtgacctggtg cattgcaaac gctagggcctagccagcgct ttactggcat ttcaggaacatcagtatcgc tcgggacgca cggcgcgctcttgacaattg tgattaaggc tcagattcgacgcgagatcc gattgtcggc cctgaagaaacacgaggaga aaaagcccat ggaggcgttcggcgcctaca tcgacggcga gatcattgggaaggacgctc acaaggcgca tctgtccggcggggtcgccg gtatgctgct gcgggcgttgcgacagattc caacgggaat ctggtggatgtcgctattct ggagcttgtt gtttatttcgacggtaggcg ctgtgcagcc gctgatggtcccgatacgat tgatggcggt cctgggggctgtgttgacac caaacgcagc gctagatcctgtttccatgg cgttcggaac cgtgctgaccacctttaccg cctggcaact ggcggccggatttgatccgc caatcccgat gcctacaggactgatcggag cgggtttaac ctacttccttacagttgttt ccttactggg ctttctcagccatcaggccg acagtcggaa cttcgggtccaggggagttg atatcgtcaa cgttcacttccggctttatc cagcgatttc ctattatgtccggttaagcg agaaatgaat aagaaggctgtttgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatctcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagtgagcaaagtc tgccgcctta caacggctctgcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgagtggcaggata tattgtggtg taaacaaattgacgttttta atgtactggg gtggtttttctgcccttcac cgcctggccc tgagagagttgcaggcgaaa atcctgtttg atggtggttcagaatagccc gagatagggt tgagtgttgtgaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaatgaaccatca cccaaatcaa gttttttgggccctaaaggg agcccccgat ttagagcttgggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgcgatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgccgattaagttg ggtaacgcca gggttttcccaattaattcc catcttgaaa gaaatatagtggtattatag tccaagcaaa aacataaatttcaataactg attatatcag ctggtacatttgtgtaatac ataaattgat gatatagctaagcttgggtc ccgctcagaa gaactcgtcatcgggagcgg cgataccgta aagcacgaggtcagcaatat cacgggtagc caacgctatgccacagtcga tgaatccaga aaagcggccatcgccatggg tcacgacgag atcctcgccgagttcggctg gcgcgagccc ctgatgctctgcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatggtagccggat caagcgtatg cagccgccgcgcaggagcaa ggtgagatga caggagatcctcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagcagccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc

gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc 6300gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg 6360ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg 6420gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt 6480ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct 6540ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct 6600atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac 6660gcaccgggag ccgtacccgc tcaagctgga 6720cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt 6780cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga 6840tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc 6900agcgggcact gctcgacgca cttgcttcgc 6960tacgaactgc cgataaacag aggattaaaa 7020cggcttggag cggccgacgt gcaggatttc 7080gctccagaga tgttcgggtc cgtttacgag 7140gctgaacggt tgcgagatgc cgtggcattc 7200ctgtcggtct tcaaacagga ggacggcccc 7260gttttcgtgg agcccgaaca gcgaggccga 7320ccggcgggtt tattgctcgt gatgatcgtc 7380cgcatcttca tcctcggcgc acttaatatt 7440gtctaccgcc tgccgggcgg ggtcgcggcg 7500gtgttcatct ctgccgctct gctaggtagc 7560atttgcggaa ctgcgggcgt ggcgctgttg 7620gtcggcgtcg cagcgggcct ggcgggggcg 7680cgcaagtggc aacctcccgt gcctctgctc 7740ggacttctgc tcgttccagt agctttagtg 7800accaatgttc tcggcctggc gtggctcggc 7860tggttccggg ggatctcgcg actcgaacct 7920cccagatctg gggtcgatca gccggggatg 7980ccgacctgta ccattcggtg agcaatggat 8040taaagaaata gcgccactca gcttcctcag 8100ggcatagttc tcaagatcga cagcctgtca 8160ataattcgga tctctgcgag ggagatgata 8220gttacaatca acatgctacc ctccgcgaga 8280tgccgttctt ccgaatagca tcggtaacat 8340cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct 8400ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg 8460gacgcttaga caacttaata acacattgcg 8520ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat 8580gcagcaagcg gtccacgctg gtttgcccca 8640cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa 8700tccagtttgg aacaagagtc cact.att.aaa 8760aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg 8820gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa 8880acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa 8940cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 9000agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc 9060agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg 9120ttaaatattt attgataaaa taacaagtca 9180tattgatgca agtttaaatt cagaaatatt 9240gccgtagatg aaagactgag tgcgatatta 9300gcttagctca tcgggggatc cgtcgaagct 9360agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa 9420aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct 9480tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg 9540ttttccacca tgatattcgg caagcaggca 9600tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac 9660tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg 9720cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag 9780attgcatcag ccatgatgga tactttctcg 9840tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag 9900acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc 9960agttcattca gggcaccgga caggtcggtc 10020ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgctccgattgtct gttgtgccca gtcatagccgcctgcgtgca atccatcttg ttcaatccaatctggattga gagtgaatat gagactctaaagtggagcat ttttgacaag aaatatttgcacgcgcaata atggtttctg acgtatgtgctgagtggctc cttcaacgtt gcggttctgtgtcatcggcg ggggtcataa cgtgactcccgcgccatcag atccttggcg gcaagaaagccttaccagag ggcgccccag ctggcaattcgtctagctat cgccatgtaa gcccactgcattcccttgtc cagatagccc agtagctgacactggctttc tacgtgttcc gcttcctttagcgtgaagct ttcttcatcg gtgattgatttctgaggcaa gtattcagtt accagttacctcatttttcc aacattttaa atttcactatcaattcagat ggcagaaatg tatcaaccaaaaaacatcta tcggatggtt ccatttgcttttcactcctc tttattacta ttttcatgcgttgacgctat tgagcgtttt tcttcaattttgttagagtt gggttgaatg agatatacgtggatgaccta cccattcttg agacaaatgtctataactca aattcgattg acatgtatcctgcatccaca tttcaagtat tttcaaaccgcggattccga atttggaaga ttttgactcatcaactttaa cttctataat tctgattaagtccaaaattt atagactctc atccccttttattttatgaa gttaagtttt taccttgtttcagaacatta gctacacgtt acacatagcaacttgtcact cccttcaaac acctaagagcatgcgtgcat gcattattac acgtgatcgcaactcatccg cttcactctt tactcaaacccatacacgag gatccactag tatgtctgctcacttgaatg ctggtagaaa gagaagttcccctttcaagg ttactgtgat tggatctggtgccgaaaatt gtaagggata cccagaagttgaagaagaga tcaatggtga aaaattgactaaatacttgc ctggcatcac tctacccgactcagtcaagg atgtcgacat catcgtcttctgtagccaat tgaaaggtca tgttgattcatttgaagttg gtgctaaagg tgtccaattgattcaatgtg gtgctctatc tggtgctaactctgaaacaa cagttgctta ccacattccagaccataagg ttctaaaggc cttgttccacgatgttgctg gtatctccat ctgtggtgctttcgtcgaag gtctaggctg gggtaacaacggtgagatca tcagattcgg tcaaatgtttcaagagtctg ctggtgttgc tgatttgatcgttgctaggc taatggctac ttctggtaagaatggccaat ccgctcaagg tttaattacctgtggctctg tcgaagactt cccattattttacccaatga agaacctgcc ggacatgattgacgaatttc cccgatcgtt caaacatttgtgccggtctt gcgatgatta tcatataatttaacatgtaa tgcatgacgt tatttatgagatacatttaa tacgcgatag aaaacaaaatcgcggtgtca tctatgttac tagatcgggattgcggntct gtcagtncca aacgtaaaacttaaccgtgn actnccntna ttnctccggccntcagttta aactatcagg tgtttgacagagagcgttta ttagaataat cggatatttatccatttgta tgngcatgcc naccaccagg

gacagccgga acacggcggc atcagagcag 10080aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa 10140gctcccatgg gccctcgact agagtcgaga 10200ttggataccg aggggaattt atggaacgtc 10260tagctgatag tgaccttagg cgacttttga 10320ttagctcatt aaactccaga aacccgcggc 10380cagttccaaa cgtaaaacgg cttgtcccgc 10440ttaattctcc gctcatgatc ttgatcccct 10500catccagttt actttgcagg gcttcccaac 10560cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca 10620agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt 10680attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg 10740gcagcccttg cgccctgagt gcttgcggca 10800cctttaaaga cttatgtttc ttatcttgct 10860acttatattc tggactttct gactgcatcc 10920tggctgaatg cttcttcttt gaggaagaaa 10980tgcatatata caaatgtacc tcttgttctc 11040tgtcatccaa ttagtgacta ctttatatta 11100aggttgccat gtacattata tttgtaagga 11160tctttatttt agacatgggt atgaaatgtg 11220tcaagtgaat ggcataccgt tctcgagtaa 11280tacattttag tatcagagta aaatgtgtac 11340attcaacata aaattaaacc agcctgcacc 11400ttcggctcct atccaccggg tgtaacaaga 11460aattcccaat ttatattgac cgtgactaaa 11520ctcccaattt atattcccaa cggcactacc 11580aaaccaactt agtaaacgtt ttttttttta 11640ttaaaaagaa tcgttcataa gatgccatgc 11700tgcagccgcg gagaattgtt tttcttcgcc 11760ttctctctca cagcacacac atacaatcac 11820catgcaaatc tcctttatag cctataaatt 11880aaaactcatc aatacaaaca agattaaaaa 11940gctgctgata gattaaactt aacttccggc 12000tcttctgttt ctttgaaggc tgccgaaaag 12060aactggggta ctactattgc caaggtggtt 12120ttcgctccaa tagtacaaat gtgggtgttc 12180gaaatcataa atactagaca tcaaaacgtg 12240aatttggttg ctaatccaga cttgattgat 12300aacattccac atcaattttt gccccgtatc 12360cacgtcagag ctatctcctg tctaaagggt 12420ctatcctctt acatcactga ggaactaggt 12480attgccactg aagtcgctca agaacactgg 12540aaggatttca gaggcgaggg caaggacgtc 12600agaccttact tccacgttag tgtcatcgaa 12660ttgaagaacg ttgttgcctt aggttgtggt 12720gcttctgctg ccatccaaag agtcggtttg 12780ttcccagaat ctagagaaga aacatactac 12840accacctgcg ctggtggtag aaacgtcaag 12900gacgcctggg aatgtgaaaa ggagttgttg 12960tgcaaagaag ttcacgaatg gttggaaaca 13020gaagccgtat accaaatcgt ttacaacaac 13080gaagaattag atctacatga agattagctc 13140gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt 13200tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat 13260atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 13320atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 13380attcagatcg gctgagtggc tccttcaacg 13440gggttggtcc gcggnatcgg gcggggggcc 13500ttcantgnnn agaattggnc ntttccccgn 13560gatatatttg gcgggtaaac ctaaganaaa 13620aaagggccgn gaaaaggttt atcccttccg 13680gttcccca 13718<210> 37<211> 1254<212> DNA

<213> Emericella nidulans

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1251)

<223> codificador de G3PDH

<400> 37

atg ggc tct ctt gga ccg tat aag caa aag cac aag gtg act gtg gtg 48Met Gly Ser Leu Gly Pro Tyr Lys Gln Lys His Lys Val Thr Val Val

1 5 10 15

gga tcg ggt aac tgg ggc acc gct ata gcc aaa ate gtc gcc gag aat 96Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Val Ala Glu Asn

20 25 30

act gcc age aac cct gcg gtc ttt gag aag gat gtt cag atg tgg gtt 144Thr Ala Ser Asn Pro Ala Val Phe Glu Lys Asp Val Gln Met Trp Val

35 40 45

ttc gag gaa aag gtc gag att ccg aaa tcg tcg aag cat tat gat cct 192Phe Glu Glu Lys Val Glu Ile Pro Lys Ser Ser Lys His Tyr Asp Pro

50 55 60

gcc tct tct ctt tgc cag ggc ccg cag aat ctg aca gat att ate aac 240Ala Ser Ser Leu Cys Gln Gly Pro Gln Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn

65 70 75 80

cat acc cat gag aat ate aag tac etc ccc gga att acc ctt ccg gaa 288His Thr His Glu Asn Ile Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Thr Leu Pro Glu

85 90 95

aac ttg att gcc aat cca tcg cta gtc gac gcg gtt caa gac age act 336Asn Leu Ile Ala Asn Pro Ser Leu Val Asp Ala Val Gln Asp Ser Thr

100 105 110

ate ctc gtc ttc aac cta ccc cat caa ttc ate ate aat att tgt gaa 384Ile Leu Val Phe Asn Leu Pro His Gln Phe Ile Ile Asn Ile Cys Glu

115 120 125

cag ate aag ggc aag att gtc cca tac gcg cgt gga att tct tgc ata 432Gln Ile Lys Gly Lys Ile Val Pro Tyr Ala Arg Gly Ile Ser Cys Ile

130 135 140

aag ggc gtg gat gtg aat gag gaa gga gtc cac ctg ttt tcc gaa aca 480Lys Gly Val Asp Val Asn Glu Glu Gly Val His Leu Phe Ser Glu Thr

145 150 155 160

att gga aag att ctc ggg ate tac tgt ggc gcc ctg tcc ggt gcc aac 528Ile Gly Lys Ile Leu Gly Ile Tyr Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn

165 170 175

ate gcg aat gag gtc gcc cag gaa aag tgg tcc gag tct age att ggt 576Ile Ala Asn Glu Val Ala Gln Glu Lys Trp Ser Glu Ser Ser Ile Gly

180 185 190

tat gat cca ccg cat ttt gac tct aaa gcc cct tct cct ccc aac cga 624Tyr Asp Pro Pro His Phe Asp Ser Lys Ala Pro Ser Pro Pro Asn Arg

195 200 205tcc cct tcc gca tcg act gac aat ate ctg cac ttc gag cac aaa gac 672Ser Pro Ser Ala Ser Thr Asp Asn Ile Leu His Phe Glu His Lys Asp210 215 220

gtt tcg ggt caa ctt tcg cgg gta aag cta cag gct cta cct tcc gaa 720Val Ser Gly Gln Leu Ser Arg Val Lys Leu Gln Ala Leu Pro Ser Glu225 230 235 240

ttt cct ccc ate gac cat gcc ctt ctc aag tcg cta ttc cac cgt cct 768Phe Pro Pro Ile Asp His Ala Leu Leu Lys Ser Leu Phe His Arg Pro245 250 255

tac ttc cat att ggt gtg gta agt gac gtc gca ggt gtt tcg tta gga 816Tyr Phe His Ile Gly Val Val Ser Asp Val Ala Gly Val Ser Leu Gly260 265 270

ggt gcc ctt aag aat gtc gtt gct gtc gcg gca ggg tgg gtt gtg ggc 864Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Val Ala Ala Gly Trp Val Val Gly275 280 285

aaa gga tgg gga gac aat gcg aag gct gca att atg cga gtt ggg ctt 912Lys Gly Trp Gly Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Met Arg Val Gly Leu290 295 300

ttg gaa atg gtg aag ttc ggc gaa cag ttt ttc ggt gct acc ate aac 960Leu Glu Met Val Lys Phe Gly Glu Gln Phe Phe Gly Ala Thr Ile Asn305 310 315 320

act cgc acc ttc act gaa gaa agt gct ggt gtt gcc gat cta ate acg 1008Thr Arg Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr325 330 335

agt tgc agt ggc gga cga aac ttc cgc tgc gca aag ctt age att gaa 1056Ser Cys Ser Gly Gly Arg Asn Phe Arg Cys Ala Lys Leu Ser Ile Glu340 345 350

aga aac cag ccg att gag aaa ate gag gag aca gag ttg aac ggc cag 1104Arg Asn Gln Pro Ile Glu Lys Ile Glu Glu Thr Glu Leu Asn Gly Gln355 360 365

aag ctg caa ggc act ttg act gca gtc gaa gtc aac agt ttc ttg aaa 1152Lys Leu Gln Gly Thr Leu Thr Ala Val Glu Val Asn Ser Phe Leu Lys370 375 380

aag caa ggt tta gaa gaa gag ttc cca ttg ttt act gca gtc tac cga 1200Lys Gln Gly Leu Glu Glu Glu Phe Pro Leu Phe Thr Ala Val Tyr Arg385 390 395 400

gtt ctt caa ggc acc atg tet gtg gac gag att cct tet ttc att gag 1248Val Leu Gln Gly Thr Met Ser Val Asp Glu Ile Pro Ser Phe Ile Glu405 410 415

cgg taa 1254

Arg

<210> 38<211> 417<212> PRT

<213> Emericella nidulans

<400> 38Met Gly Ser Leu Gly Pro Tyr Lys Gln Lys His Lys Val Thr Val Val15 10 15

Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Val Ala Glu Asn20 25 30

Thr Ala Ser Asn Pro Ala Val Phe Glu Lys Asp Val Gln Met Trp Val35 40 45

Phe Glu Glu Lys Val Glu Ile Pro Lys Ser Ser Lys His Tyr Asp Pro50 55 60

Ala Ser Ser Leu Cys Gln Gly Pro Gln Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn65 70 75 80

His Thr His Glu Asn Ile Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Thr Leu Pro Glu85 90 95

Asn Leu Ile Ala Asn Pro Ser Leu Val Asp Ala Val Gln Asp Ser Thr100 105 110

Ile Leu Val Phe Asn Leu Pro His Gln Phe Ile Ile Asn Ile Cys Glu115 120 125

Gln Ile Lys Gly Lys Ile Val Pro Tyr Ala Arg Gly Ile Ser Cys Ile130 135 140

Lys Gly Val Asp Val Asn Glu Glu Gly Val His Leu Phe Ser Glu Thr145 150 155 160

Ile Gly Lys Ile Leu Gly Ile Tyr Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn165 170 175

Ile Ala Asn Glu Val Ala Gln Glu Lys Trp Ser Glu Ser Ser Ile Gly180 185 190

Tyr Asp Pro Pro His Phe Asp Ser Lys Ala Pro Ser Pro Pro Asn Arg195 200 205

Ser Pro Ser Ala Ser Thr Asp Asn Ile Leu His Phe Glu His Lys Asp210 215 220

Val Ser Gly Gln Leu Ser Arg Val Lys Leu Gln Ala Leu Pro Ser Glu225 230 235 240

Phe Pro Pro Ile Asp His Ala Leu Leu Lys Ser Leu Phe His Arg Pro245 250 255

Tyr Phe His Ile Gly Val Val Ser Asp Val Ala Gly Val Ser Leu Gly260 265 270

Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Val Ala Ala Gly Trp Val Val Gly275 280 285

Lys Gly Trp Gly Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Met Arg Val Gly Leu290 295 300

Leu Glu Met Val Lys Phe Gly Glu Gln Phe Phe Gly Ala Thr Ile Asn305 310 315 320

Thr Arg Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr325 330 335Ser Cys Ser Gly Gly Arg Asn Phe Arg Cys Ala Lys Leu Ser Ile Glu340 345 350

Arg Asn Gln Pro Ile Glu Lys Ile Glu Glu Thr Glu Leu Asn Gly Gln355 360 365

Lys Leu Gln Gly Thr Leu Thr Ala Val Glu Val Asn Ser Phe Leu Lys370 375 380

Lys Gln Gly Leu Glu Glu Glu Phe Pro Leu Phe Thr Ala Val Tyr Arg385 390 395 400

Val Leu Gln Gly Thr Met Ser Val Asp Glu Ile Pro Ser Phe Ile Glu405 410 415

Arg

<210> 39<211> 999<212> DNA

<213> Debaryomyces hansenii

<220><221> CDS<222> (1)..(996)

<223> codificador de G3PDH (parcial)<400> 39

gga tct ggt aac tgg ggt act gct gtt gct aag ate gta tet gaa aac 48Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Val Ala Lys Ile Val Ser Glu Asn1 5 10 15

acg gct gaa aaa cca gaa gtg ttc gaa aag caa gtg aac atg tgg gtt 96Thr Ala Glu Lys Pro Glu Val Phe Glu Lys Gln Val Asn Met Trp Val20 25 30

ttt gaa gaa gaa gtt gac gga caa aag ttg act gaa ate ate aac gcc 144Phe Glu Glu Glu Val Asp Gly Gln Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Ala35 40 45

aaa cac gaa aac gtt aag tac ttg cca gaa gtc aag ttg ccg gaa aac 192Lys His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Glu Val Lys Leu Pro Glu Asn50 55 60

ttg gtt gea aac cca gac gtt gtt gac act gtc aag gat gea gac tta 240Leu Val Ala Asn Pro Asp Val Val Asp Thr Val Lys Asp Ala Asp Leu65 70 75 80

tta att ttt aac att cca cat caa ttc tta cca aga gtg tgt aag caa 288Leu Ile Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu Pro Arg Val Cys Lys Gln85 90 95

ttg gtt ggc cat gtc aag cca tct gcc aga gcc ate tcc tgt ttg aag 336Leu Val Gly His Val Lys Pro Ser Ala Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys100 105 110

ggt ttg gaa gtt ggc cca gaa ggt tgt aag ttg tta tcg caa tct ate 384Gly Leu Glu Val Gly Pro Glu Gly Cys Lys Leu Leu Ser Gln Ser Ile115 120 125

aac gat act tta ggt gtc cac tgt ggt gtc tta tct ggt gcc aac att 432Asn Asp Thr Leu Gly Val His Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Ile130 135 140gcc aac gaa gtt gcc aga gaa aga tgg tct gaa acc acc att gcc tac 480Ala Asn Glu Val Ala Arg Glu Arg Trp Ser Glu Thr Thr Ile Ala Tyr145 150 155 160

aac att cca gaa gat ttc aga ggt aag ggt aga gat ate gac gaa tac 528Asn Ile Pro Glu Asp Phe Arg Gly Lys Gly Arg Asp Ile Asp Glu Tyr165 170 175

gtc tta aag caa tta ttc cac aga acc tac ttc cat gtc aga gtc ate 576Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Thr Tyr Phe His Val Arg Val Ile180 185 190

aac gac ate ata ggt gct tct ttc gct ggt gct ttg aag aat gtt gtt 624Asn Asp Ile Ile Gly Ala Ser Phe Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val195 200 205

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aag gcc gct ate atg aga ate ggt ate aga gaa ate ate cac ttt gcc 720Lys Ala Ala Ile Met Arg Ile Gly Ile Arg Glu Ile Ile His Phe Ala225 230 235 240

tct tac tac caa aag ttc ggt gtc aag ggt cca gct cca gaa tcc act 768Ser Tyr Tyr Gln Lys Phe Gly Val Lys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Thr245 250 255

act ttc act gag gaa tct gcc ggt gtc gct gac tta ate acc act tgt 816Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys260 265 270

tcc ggt ggt aga aat gtc aag gtt gct aga tac atg att gaa aac aac 864Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Tyr Met Ile Glu Asn Asn275 280 285

gtt gac gct tgg gaa gcc gaa aag att gtc tta aag ggt caa tct tct 912Val Asp Ala Trp Glu Ala Glu Lys Ile Val Leu Lys Gly Gln Ser Ser290 295 300

caa ggt ate tta act gcc aag gaa gtc cac gaa ttg tta act aac tac 960Gln Gly Ile Leu Thr Ala Lys Glu Val His Glu Leu Leu Thr Asn Tyr305 310 315 320

aac tta tcg aat gaa ttc cca tta ttt gaa gcc gta tac 999

Asn Leu Ser Asn Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val325 330

<210> 40<211> 332<212> PRT

<213> Debaryomyces hansenii<400> 40

Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Val Ala Lys Ile Val Ser Glu Asn1 5 10 15

Thr Ala Glu Lys Pro Glu Val Phe Glu Lys Gln Val Asn Met Trp Val20 25 30

Phe Glu Glu Glu Val Asp Gly Gln Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Ala35 40 45

Lys His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Glu Val Lys Leu Pro Glu Asn50 55 60

Leu Val Ala Asn Pro Asp Val Val Asp Thr Val Lys Asp Ala Asp Leu65 70 75 80

Leu Ile Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu Pro Arg Val Cys Lys Gln85 90 95

Leu Val Gly His Val Lys Pro Ser Ala Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys100 105 110

Gly Leu Glu Val Gly Pro Glu Gly Cys Lys Leu Leu Ser Gln Ser Ile115 120 125

Asn Asp Thr Leu Gly Val His Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Ile130 135 140

Ala Asn Glu Val Ala Arg Glu Arg Trp Ser Glu Thr Thr Ile Ala Tyr145 150 155 160

Asn Ile Pro Glu Asp Phe Arg Gly Lys Gly Arg Asp Ile Asp Glu Tyr165 170 175

Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Thr Tyr Phe His Val Arg Val Ile180 185 190

Asn Asp Ile Ile Gly Ala Ser Phe Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val195 200 205

Ala Cys Ala Val Gly Phe Val Ile Gly Ala Gly Trp Gly Asp Asn Ala210 215 220

Lys Ala Ala Ile Met Arg Ile Gly Ile Arg Glu Ile Ile His Phe Ala225 230 235 240

Ser Tyr Tyr Gln Lys Phe Gly Val Lys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Thr245 250 255

Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys260 265 270

Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Tyr Met Ile Glu Asn Asn275 280 285

Val Asp Ala Trp Glu Ala Glu Lys Ile Val Leu Lys Gly Gln Ser Ser290 295 300

Gln Gly Ile Leu Thr Ala Lys Glu Val His Glu Leu Leu Thr Asn Tyr305 310 315 320

Asn Leu Ser Asn Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val325 330

PF 5725345

PF 57253

Claims (15)

1. Método para aumentar o teor total de óleo em plantasoleaginosas transgênicas de safra, caracterizado pelo fato de que as plantasoleaginosas transgênicas de safra compreendem pelo menos 20% em peso deácido oleico baseado no teor de ácido graxo total e que compreende asseguintes etapas do método:a) introduzir na planta oleaginosa de safra, uma seqüência deácido nucleico que codifica uma glicerol-3-fosfato-desidrogenase de umalevedura, eb) expressar, na planta oleaginosa de safra, a glicerol-3-fosfato-desidrogenase codificada pelo ácido nucleico, ec) selecionar aquelas plantas oleaginosas de safra nas quais oteor total de óleo é aumentado em pelo menos 25% em peso na planta emcomparação com a planta não-transgênica.

2. Método para aumentar o teor total de óleo em plantasoleaginosas transgênicas de safra, caracterizado pelo fato de que as plantasoleaginosas transgênicas de safra compreendem pelo menos 20% em peso deácido oleico baseado no teor de ácido graxo total e onde o teor total de óleo éaumentado em pelo menos 45% em peso na planta em comparação com aplanta não-transgênica.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a seqüência de ácido nucleico que codifica uma glicerol-3-fosfato-desidrogenase é derivada de uma levedura que é is selecionada dogrupo consistindo dos gêneros Cryptococcus, Torulopsis, Pityrosporum,Brettanomyces, Candida, Kloeckera, Trigonopsis, Trichosporon, Rhodotorul,Sporobolomyces, Bullera, Saccharomyces, Debaromyces, Lipomyces,Hansenula, Endomycopsis, Pichia e Hanseniaspora.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, caracterizado pelo fato de que a seqüência de ácido nucleico que codificaum glicerol-3-fosfato-desidrogenase é derivado de uma levedura que éselecionada do grupo consistindo dos gêneros e das espécies Saccharomycescerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomycespombe, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces rouxii, Yarrowialipolitica, Emerieella nidulans, Debaryomyees hansenii e Torulasporahansenii.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo fato de que a glicerol-3-fosfato-desidrogenase que écodificada pela seqüência de ácido nucleico ocasiona a conversão de di-hidróxi-acetona-fosfato em glicerol-3-fosfato utilizando NADH ou NADPHcomo co-substrato e possuindo uma seqüência de peptídeo compreendendopelo menos uma seqüência de motivo selecionada do grupo de motivos deseqüência consistindo de:i) GSGNWGT(A/T)IAKii) CG(WA)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)Aiii) (LzrV)FXRPYFXV

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, caracterizado pelo fato de que a glicerol-3-fosfato-desidrogenase que écodificada pela seqüência de ácido nucleico ocasiona a conversão de di-hidróxi-acetona-fosfato em glicerol-3-fosfato utilizando NADH ou NADPHcomo co-substrato e possuindo uma seqüência de peptídeo compreendendopelo menos uma seqüência de motivo selecionada do grupo de motivos deseqüência consistindo de:iv) GSGNWGTTIAKV(V/I)AENv) NT(K/R)HQNVKILPvi) D(LrV)LVFN(ITV)PHQFLvii) RA(I/V)SCLKGFEviii) CGALSGANLA(P/T)EVAix) LFHRP YFHVχ) GLGEII(K/R)FG

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5ou 6, caracterizado pelo fato de que a glicerol-3-fosfato-desidrogenasecodificada pela seqüência de ácido nucleico adicionalmente compreende pelomenos uma seqüência de motivo selecionada do grupo de motivos deseqüência consistindo de:xi) H(E/Q)NVKILxii) (D/N)(I/V)(L/I)V(F/W)(V/N)(L/I/V)PHQF(V/L/I)xiii) (A/G)(I/V)SC(L/I)KG xiv) G(L/M)(L/G)E(M/I)(I/Q)(R/K/N)F(G/S/A)

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo fato de que a glicerol-3-fosfato-desidrogenase codificadapela seqüência de ácido nucleico é selecionada do grupo consistindo de:a) uma seqüência de ácido nucleico com a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 14, 16, 38 ou 40, oub) um equivalente funcional de a) que codifica as proteínascom pelo menos 60% de identidade com a seqüência mostrada em SEQ IDNO: 2.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a- 8, caracterizado pelo fato de que, para expressar a seqüência de ácido nucleicode acordo com a reivindicação 1 (a) e (b), esta seqüência é operacionalmenteligada com um promotor ou terminador.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 9, caracterizado pelo fato de que o teor total de óleo na semente da planta oleaginosa de safra é aumentado.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a semente da planta oleaginosa de safra é ceifada após ocrescimento da planta e, se apropriado, o óleo presente na semente é isolado.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 10, caracterizado pelo fato de que a planta oleaginosa de safra é selecionadado grupo das plantas oleaginosas de safra consistindo de Anacardiumoccidentale, Arachis hypogaea, Borago officinalis, Brassica campestris,Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea, Camelina sativa, Cannabissativa, Curthamus tinetorius, Cocos nucifera, Crambe abyssinica, Cupheaciliata, Elaeis guineensis, Glicinae max, Gossypium hirsitum, Gossypiumbarbadense, Gossypium herbaceum, Helianthus annus, Linum usitatissimum,Oenothera biennis, Olea europaea, Rieinus communis, Zea mays, Juglansregia e Prunus dulcis.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 12, caracterizado pelo fato de que não apenas o teor total de óleo éaumentado, mas também o teor de glicerol-3-fosfato é aumentado em pelomenos 20% em peso na planta oleaginosa transgênica de safra.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que os ácidos graxos presente no óleo são liberados.

15. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11,caracterizado pelo fato de que o óleo ou os ácidos graxos que têm sidoliberados são adicionados em polímeros, gêneros alimentícios, raçõesanimais, cosméticos, fármacos ou produtos com aplicações industriais ouempregados como lubrificantes.