WO2004007733A1 - Transgene expressionskonstrukte und verfahren zum erhöhen des vitamin e-gehaltes in pflanzlichen organismen - Google Patents

Transgene expressionskonstrukte und verfahren zum erhöhen des vitamin e-gehaltes in pflanzlichen organismen Download PDF

Info

Publication number
WO2004007733A1
WO2004007733A1 PCT/EP2003/007358 EP0307358W WO2004007733A1 WO 2004007733 A1 WO2004007733 A1 WO 2004007733A1 EP 0307358 W EP0307358 W EP 0307358W WO 2004007733 A1 WO2004007733 A1 WO 2004007733A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
plant
sequence
transgenic expression
transgenic
Prior art date
Application number
PCT/EP2003/007358
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Badur
Michael Geiger
Karin Herbers
Susanne Tropf
Rainer Lemke
Klaus-Dieter Salchert
Rüdiger SCHULZ-FRIEDRICH
Original Assignee
Sungene Gmbh & Co. Kgaa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sungene Gmbh & Co. Kgaa filed Critical Sungene Gmbh & Co. Kgaa
Priority to AU2003249996A priority Critical patent/AU2003249996A1/en
Publication of WO2004007733A1 publication Critical patent/WO2004007733A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria

Definitions

  • the invention relates to transgenic expression constructs and methods for increasing the vitamin E content in plant organisms, preferably in algae, by transgenic expression of ORF slrl263 from Synechocystis sp. PCC6803.
  • the invention further relates to transgenic expression constructs for the expression of ORF slrl263 in plant organisms, preferably in algae, transgenic plant organisms expressing slrl263, and the use of said transgenic plant organisms for the production of food, animal feed, seeds, pharmaceuticals or fine chemicals, in particular for the production of vitamin E.
  • the eight naturally occurring compounds with vitamin E activity are derivatives of 6-chromanol (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, vitamin E).
  • the group of tocopherols (la-d) has a saturated side chain
  • the group of tocotrienols (2a-d) has an unsaturated side chain:
  • vitamin E is understood to mean all eight tocopherols and tocotrienols with vitamin E activity mentioned above.
  • Vitamin E compounds have a high economic value as additives in the food and feed sector, in pharmaceutical formulations and in cosmetic applications.
  • PCC 6803 is a unicellular, non-nitrogen fixing cyanobacteria that has been genetically well studied (Churin et al. (1995) J Bacteriol 177: 3337-3343) and can be easily transformed (Williams (1988) Methods Enzymol 167: 766-778) and has a very active homologous recombination ability.
  • the PCC 6803 strain was isolated from fresh water in 1968 by R. Kunisawa as Aphanocapsa Nl in California, USA and is now available from the Pasteur Culture Collection of Axenic Cyanobacterial Strains (PCC), Unite de Physiologie Microbienne, Paris, France.
  • the protein was encoded by ORF slrl263 from Synechocystis sp. PCC 6803 (GenBank Acc.-No .: NP_441177; gi: 16330449; SEQ ID NO: 2) was surprisingly identified as a key factor in vitamin E biosynthesis (as a result of Tocen-2 for "tocopherol synthesis enhancing protein" -2).
  • Tocen-2 is classified in the GenBank as an unknown protein without any functional annotation.
  • the protein has no significant homology to other proteins of known function. Surprisingly, it was found that the transgenic expression of this protein can increase the vitamin E content in plant organisms.
  • a first object of the invention comprises methods for increasing the vitamin E content in plant organisms
  • SEQ ID NO: 2 or a functional equivalent thereof or a functionally equivalent part of the aforesaid in said plant organism or a tissue, organ, part or cell of said plant organism, and
  • the method according to the invention can be applied to all plant organisms, preferably to those which naturally produce vitamin E, very particularly preferably to those which are used for industrial production of natural vitamin E.
  • Another object of the invention relates to transgenic expression constructs for expressing a nucleic acid sequence coding for the Tocen-2 protein encoded by SEQ ID NO: 2 or a functional equivalent thereof (eg according to SEQ ID NO: 23, 25 or 27) or a functionally equivalent part of the foregoing.
  • SEQ ID NO: 2 or a functional equivalent thereof (eg according to SEQ ID NO: 23, 25 or 27) or a functionally equivalent part of the foregoing.
  • the sequence according to FIG SEQ ID NO: 1, 22, 24 or 26 and the sequences derived therefrom on account of the degeneration of the genetic code, and also functionally equivalent parts of the aforementioned.
  • Plant organism or cells derived therefrom generally means any cell, tissue, part or reproductive material (such as seeds or fruits) of an organism which is capable of photosynthesis. Included in the scope of the invention are all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Annual, perennial, monocot and dicot plants are preferred.
  • Plant in the context of the invention means all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Included under the term are the mature plants, seeds, sprouts and seedlings, and parts derived therefrom, propagation material (for example tubers, seeds or fruits), plant organs, tissues, protoplasts, callus and other cultures, for example cell or callus cultures , as well as all other types of groupings of plant cells into functional or structural units. Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • Plant includes all annual and perennial, monocotyledonous and dicotyledonous plants and includes, by way of example but not by way of limitation, those of the genera Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrallhinum, Hesisoc Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Tri
  • Plants from the following plant families are preferred: Amaranth aceae, Asteraceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceaeaeae, Rosaceaeaeae, Rosaceaeaeae Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
  • Preferred monocotyledonous plants are selected in particular from the monocotyledonous crop plants, such as, for example, the family of the Gramineae such as rice, corn, wheat or other types of cereals such as barley, millet, rye, triticale or oats, and sugar cane and all types of grasses.
  • the family of the Gramineae such as rice, corn, wheat or other types of cereals such as barley, millet, rye, triticale or oats, and sugar cane and all types of grasses.
  • the invention is very particularly preferably applied from dicotyledonous plant organisms.
  • Preferred dicotyledonous plants are in particular selected from the dicotyledonous crop plants, such as, for example
  • Asteraceae such as sunflower, tagetes or calendula and others
  • - Cruciferae especially the genus Brassica, especially the species napus (rape), campestris (beet), oleracea (e.g. cabbage, cauliflower or broccoli and other types of cabbage); and the genus Arabidopsis, especially the species thaliana as well as cress or canola and others,
  • Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini and others
  • - Leguminosae especially the genus Glycine, especially the type max (soybean) soy, as well as alfalfa, peas, beans or peanuts and others
  • Rubiaceae preferably of the subclass Lamiidae such as Coffea arabica or Coffea liberica (coffee bush) and others,
  • Solanaceae especially the genus Lycopersicon, especially the species esculentum (tomato) and the genus Solanum, especially the species tuberosum (potato) and melongena (eggplant) and the genus Capsicum, especially the species a ⁇ num (paprika), as well as tobacco and others more,
  • Sterculiaceae preferably of the subclass Dilleniidae such as Theobroma cacao (cocoa bush) and others,
  • Theaceae preferably of the subclass Dilleniidae, such as, for example, Camellia sinensis or Thea sinensis (tea bush) and others, - Umbelliferae, especially the genus Daucus (very particularly the species carota (carrot)) and Apium (particularly the species graveolens dulce (celery)) and others more;
  • decorative plants useful or ornamental trees, flowers, cut flowers, shrubs or lawn.
  • Examples include, but are not limited to, angiosperms, bryophytes such as hepaticae (liverwort) and musci (mosses); Pteridophytes such as ferns, horsetail and lycopods; Gymnosperms such as conifers, cycads, ginkgo and gnetals, the families of rosaceae such as rose, ericaceae such as rhododendrons and azaleas, euphorbiaceae such as poinsettias and croton, caryophyllaceae such as cloves, solanaceae such as petunias, Gesneriaceae such as the Usamalsaceaeideae such as the Usambaramineae , Iridaceae like gladiolus, iris, freesia and crocus, Compositae like
  • Plant organisms in the sense of the invention are further photosynthetically active capable organisms, such as
  • Example algae cyanobacteria and mosses.
  • Preferred algae are green algae, such as algae of the genus Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox or Dunaliella. Synechocystis is particularly preferred.
  • Plant organisms are particularly preferably selected from the group of oil plants consisting of Borago officinalis, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Cannabis sativa, Carthamus tinctorius, Cocos nucifera, Crambe abyssinica, Cuphea species, Elaeis guineensis, Ekeis oleiferu, Glycine max, Gossypium hirsitum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaeum, Helianthus annus, Linum usitatissimum, Oenothera biennis, Ozea europea, Oryza sativa, Ricinus communis, Sesamum indicum, Triticum species, Zea maize, walnut and almond.
  • vitamin E content means the sum of the tocopherols and tocotrienols in a plant organism or a tissue, organ, part or cell of the same.
  • Tocopherols and tocotrienols preferably include the 8 compounds ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrieno, ⁇ -tocotrienol and ⁇ -tocotrienol described above.
  • the vitamin E content in the seed of a plant organism is particularly preferably increased.
  • Increasing the vitamin E content means increasing the content of vitamin E in a plant organism or a part, tissue or organ thereof, preferably in the seminal organs thereof.
  • the vitamin E content is most at least 5%, preferably at least 10%, particularly preferably at least 15%, very particularly preferably at least 20%, in comparison to a starting plant which is not subjected to the process according to the invention but is otherwise unchanged and otherwise unchanged preferably increased at least 25%.
  • Framework conditions means all conditions relevant to the germination, cultivation or growth of the plant such as soil, climate or light conditions, fertilization, irrigation, plant protection measures etc.
  • Functional equivalents means in particular natural or artificial mutations of the Tocen-2 protein according to SEQ ID NO: 2 and homologous polypeptides from other organisms, preferably from plant organisms, which have the same essential properties.
  • “Essential properties” of the Tocen-2 protein described by SEQ ID NO: 2 means in particular the property of increasing the vitamin E content in the case of transgenic expression in a plant organism in comparison to an identical but not transgenic plant organism according to the definition given above , In a preferred embodiment, at least one property selected from the following group also applies as essential properties:
  • a theoretical isoelectric point in a range from about 8 to about 10, preferably about 8.5 to about 9.5, particularly preferably about pH 9.2
  • an acidic character preferably with a total net charge at neutral pH in a range from approximately 3 to approximately 5, preferably approximately 3.5 to approximately 4.5, particularly preferably approximately 4.2
  • a peptide sequence comprising at least one sequence motif selected from the group of sequence motifs consisting of
  • sequence motif is preferably selected from the group consisting of
  • the peptide sequence particularly preferably contains at least 2 or 3, very particularly preferably at least 4 or 5, most preferably all of the sequence motifs selected from the group of sequence motifs i), ii), iii), iv), v) and vi) or selected from the group of sequence motifs vii), viii) and ix).
  • Information in brackets means alternatively possible amino acids at this position; e.g. my (V / I) that valine or isoleucine is possible at this position).
  • Functional equivalents from other organisms for example from plant organisms whose genomic sequence is known in whole or in part, such as, for example, from Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum or Solanum tuberosum, and in particular from other cyanobacteria such as Nostoc punctiforme ATCC 29133, Anabaena sp. PCC7120, Synechococcus sp.
  • WH8102 - can, for example, by searching the database in sequence databases such as GenBank or by screening gene or cDNA banks - for example using the sequence according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a part of the aforementioned, for example in particular one of the above-mentioned sequence motifs i) to ix) as a search sequence or probe.
  • Mutations include substitutions, additions, deletions, inversions or insertions of one or more amino acid residues.
  • Said functional equivalents preferably have a homology of at least 40%, particularly preferably at least 60%, particularly preferably at least 80%, most preferably at least 90% of the protein with SEQ ID NO: 2.
  • the homology extends over at least 30 amino acids , preferably at least 60 amino acids, particularly preferably at least 90 amino acids, most preferably over the entire length of the Tocen-2 polypeptide according to SEQ ID NO: 2.
  • Gap Weight 8 Length Weight: 2
  • a sequence which has a homology of at least 80% on a protein basis with the sequence SEQ ID NO: 2 is understood to mean a sequence which, when compared with the sequence SEQ ID NO: 2 according to the above program algorithm with the above parameter set, has a homology of has at least 80%.
  • Functional equivalents also include those proteins which are encoded by nucleic acid sequences which have a homology of at least 40%, particularly preferably at least 60%, particularly preferably at least 80%, most preferably at least 90% to the nucleic acid sequence with SEQ ID NO: 1 , The homology extends over at least 100 bases, preferably at least 200 bases, particularly preferably at least 300 bases, most preferably over the entire length of the sequence according to SEQ ID NO: 1.
  • Homology between two nucleic acid sequences is understood to mean the identity of the two nucleic acid sequences over the respective sequence length, which by comparison using the program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.0,
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • a sequence which has a homology of at least 80% based on nucleic acids with the sequence SEQ ID NO: 1 is understood to mean a sequence which, when compared with the sequence SEQ ID NO: 1 according to the above program algorithm with the above parameter set Has homology of at least 80%.
  • Functional equivalents also include those proteins which are encoded by nucleic acid sequences which, under standard conditions, have one of those described by SEQ ID NO: 1
  • Standard hybridization conditions is to be understood broadly and means stringent as well as less stringent hybridization conditions. Such hybridization conditions are described, inter alia, by Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al. , in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. described.
  • the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with approximately 2X SSC at 50 ° C) and those with high stringency (with approximately 0.2X SSC at 50 ° C, preferably at 65 ° C) (20X SSC: 0.3 M sodium citrate, 3 M NaCl, pH 7.0).
  • the temperature during the washing step can be raised from low stringent conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can be kept constant and only the other can be varied.
  • Hybridization conditions can be selected from the following conditions, for example:
  • Washing steps can be selected, for example, from the following conditions:
  • Functional equivalents mean in particular the polypeptides described by SEQ ID NO: 23, 25 or 27.
  • Another object of the invention relates to transgenic expression constructs which encode a transgenic expression of the protein by SEQ ID NO: 2 or a functional equivalent thereof (eg according to SEQ ID NO: 23, 25 or 27) or a functionally equivalent part of the aforementioned in a plant Organism or a tissue, organ, part or cell of said plant organism can guarantee.
  • a nucleic acid molecule encoding a protein described by SEQ ID NO: 2 or a functional equivalent thereof (for example according to SEQ ID NO: 23, 25 or 27) or a functionally equivalent part of the abovementioned is preferably functionally linked to at least one genetic control element (for example a promoter) which ensures transgenic expression in a plant organism or a tissue, organ, part or cell thereof.
  • a functional link is understood to mean, for example, the sequential arrangement of a promoter with the nucleic acid sequence to be expressed (for example the sequence according to SEQ ID NO: 1, 22, 24 or 26) and, if appropriate, other regulatory ones Elements such as a terminator such that each of the regulatory elements can perform its function in the transgenic expression of the nucleic acid sequence.
  • This does not necessarily require a direct link in the chemical sense.
  • Genetic control sequences such as, for example, enhancer sequences, can also perform their function on the target sequence from more distant positions or even from other DNA molecules. Arrangements are preferred in which the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is positioned behind the sequence which acts as a promoter, so that both sequences are covalently linked to one another.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is preferably less than 200 base pairs, particularly preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
  • the insertion of sequences can also lead to the expression of fusion proteins.
  • the transgenic expression construct consisting of a linkage of promoter and nucleic acid sequence to be expressed, can preferably be integrated in a vector and inserted into a plant genome by, for example, transformation.
  • a transgenic expression construct is also to be understood as such constructions in which the nucleic acid sequence encoding the protein is encoded by SEQ ID NO: 2 or a functional equivalent thereof (for example according to SEQ ID NO: 23, 25 or 27) or a functionally equivalent part the aforementioned - for example by homologous recombination - is placed behind an endogenous plant promoter in such a way that it ensures transgenic expression of the said nucleic acid sequence.
  • Plant-specific promoters basically mean any promoter that can control the expression of genes, in particular foreign genes, in plants or plant parts, cells, tissues or crops. The expression can be constitutive, inducible or development-dependent, for example.
  • “Constitutive” promoters mean those promoters which ensure expression in numerous, preferably all, tissues over a relatively long period of plant development, preferably at all times during plant development (Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202).
  • a plant promoter or a plant virus-derived promoter is preferably used.
  • Particularly preferred is the promoter of the 35S transcript of the CaMV cauliflower mosaic virus (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140 : 281-288; Gardner et al.
  • promoters with specificities for the anthers ovaries, flowers, leaves, stems, roots and seeds.
  • Seed-specific promoters such as, for example, the promoter of phaseoline (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9): 839-53), of the 2S albuming gene (Joseffson LG et al.
  • legumin B4 promoter (WO 00/26388) or the legumin B4 promoter (LeB4; Baumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baumlein H et al.
  • HMWG gliadin
  • branching enzyme ADP glucose pyrophosphate
  • AGPase ADP glucose pyrophosphate
  • starch synthase also preferred are promoters that allow seed-specific expression in monocots such as corn, barley, wheat, rye, rice etc.
  • the promoter of the lpt2 or lptl gene (WO 95/15389, WO 95/23230) or the promoters described in WO 99/16890 (promoters of the hordein gene, the glutelin gene, the oryzine gene, etc.) can be used advantageously Prolamin gene, the gliadin gene, the glutelin gene, the zein gene, the kasirin gene or the secalin gene). Further seed-specific promoters are described in WO 89/03887.
  • Tuber, storage root or root specific promoters include, for example, the patatin class I (B33) promoter or the potato cathepsin D inhibitor promoter.
  • Leaf-specific promoters include, for example, the promoter of the cytosolic FBPase from potato (WO 97/05900), the SSU promoter (small subunit) of Rubisco (ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase) or the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al. ( 1989) EMBO J 8: 2445-2451).
  • Flower-specific promoters include, for example, the phytoene synthase promoter (WO 92/16635) or the promoter of the P-rr gene (WO 98/22593).
  • Anther-specific promoters include, for example, the 5126 promoter (US 5,689,049, US 5,689,051), the glob-1 promoter and the ⁇ -zein promoter. c) Chemically inducible promoters
  • the transgenic expression constructs can also contain a chemically inducible promoter (review article: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89-108), by means of which the expression of the exogenous gene in the plant can be controlled at a specific point in time can.
  • a chemically inducible promoter e.g. the PRPl promoter (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), a promoter inducible by salicylic acid (WO 95/19443), a promoter inducible by benzenesulfonamide (EP 0 388 186), a by Tetracycline-inducible promoter (Gatz et al.
  • promoters that are induced by biotic or abiotic stress such as the pathogen-inducible promoter of the PRPL gene (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), the heat-inducible hsp70 or hsp80 promoter from tomato (US 5,187,267), the cold-inducing alpha-amylase promoter from the potato (WO 96/12814), the light-inducible PPDK promoter or the wound-induced pinII promoter (EP-A 375 091).
  • pathogen-inducible promoter of the PRPL gene Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366
  • the heat-inducible hsp70 or hsp80 promoter from tomato US 5,187,267
  • the cold-inducing alpha-amylase promoter from the potato
  • the light-inducible PPDK promoter or the wound-induced pinII promoter EP-A 375 091
  • Pathogen-inducible promoters include the promoters of genes that are induced as a result of pathogen attack, such as genes from PR proteins, SAR proteins, ⁇ -1, 3-glucanase, chitinase, etc. (e.g. Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89: 245-254; Uknes, et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4: 111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9 : 335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325-342; Somssich et al.
  • wound-inducible promoters such as that of the pinll gene (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14: 494-498), the wunl and wun2 genes ( US 5,428,148), the winl and win2 gene (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215: 200-208), the Systemin gene (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573), the WIPl gene (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 783 -792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76), the MPI gene (Corderok et al. (1994) Plant J 6 (2): 141-150) and the like.
  • suitable promoters are, for example, fruit-ripening-specific promoters, such as, for example, the fruit-ripening-specific promoter from tomato (WO 94/21794, EP-A 409 625).
  • Development-dependent promoters partly include the tissue-specific promoters, since the formation of individual tissues is naturally development-dependent.
  • Constitutive, seed-specific and leaf-specific promoters are particularly preferred.
  • promoters can be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which enable transgenic expression in other plant tissues or in other organisms, such as E. coli bacteria.
  • all promoters described above can be considered as plant promoters.
  • nucleic acid sequences contained in the transgenic expression constructs or transgenic expression vectors according to the invention can be functionally linked to further genetic control sequences in addition to a promoter.
  • genetic control sequences is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the formation or the function of a transgenic expression construct according to the invention. Genetic control sequences modify, for example, transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • transgenic expression constructs according to the invention preferably comprise a plant-specific promoter 5 'upstream from the respective transgenic nucleic acid sequence and a terminator sequence 3' downstream as an additional genetic control sequence, as well as, if appropriate, other customary regulatory elements, each functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed ,
  • Genetic control sequences also include further promoters, promoter elements or minimal promoters that can modify the expression-controlling properties. Genetic control sequences can be used, for example, for tissue-specific Expression also depend on certain stress factors. Corresponding elements are, for example, for water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991; 266 (26): 17131-17135) and heat stress (Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217 (2- 3): 246-53).
  • control sequences are, for example, in the gram-positive promoters amy and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated regions, introns or non-coding 3' regions of genes such as the actin-1 intron, or the Adhl-S introns 1, 2 and 6 (general: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). It has been shown that these can play a significant role in regulating gene expression. It has been shown that 5 'untranslated sequences can increase the transient expression of heterologous genes.
  • An example of translation enhancers is the 5 'leader sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) and the like. They can also promote tissue specificity (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440).
  • the transgenic expression construct can advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable increased transgenic expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the nucleic acid sequences to be expressed transgenically.
  • the nucleic acid sequences to be expressed transgenically can be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Polyadenylation signals suitable as control sequences are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially contain T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens.
  • Examples of particularly suitable terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopalin synthase) terminator.
  • Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome. In homologous recombination, for example, the coding sequence of a specific endogenous gene can be specifically exchanged for the sequence coding for a dsRNA.
  • cre / lox technology allow tissue-specific, possibly inducible removal of the transgenic expression construct from the genome of the host organism (Sauer B (1998) Methods 14 (4): 381-92).
  • certain flanking sequences are added to the target gene (lox sequences), which later enable removal using the cre recombinase.
  • a transgenic expression construct and / or the transgenic expression vectors derived from it can contain further functional elements.
  • the term functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, multiplication or function of the transgenic expression constructs according to the invention, the transgenic expression vectors or the transgenic organisms. Examples include, but are not limited to:
  • Metabolism inhibitors eg 2-deoxyglucose-6-phosphate; WO 98/45456
  • antibiotics eg Kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin
  • phosphinotricin eg phosphinotricin
  • phosphinothricin bar and pat genes
  • glutamine synthase inhibitors glutamine synthase inhibitors
  • 5-enol pyruvylshikimat-3-phosphate giving (EPSP synthase genes) which confer resistance to glyphosate ® (N- (phosphonomethyl) glycine), glyphosate ® degrading enzymes (gox gene product; glyphosate oxidoreductase), dehalogenases which inactivate, for example, dalapon (deh gene product), sulfonylurea and imidazolinone inactivating acetolactate synthases and nitrilases which, for example, degrade bromoxynil (bxn gene product), the aasa gene product, the aasa gene product the antibiotic apectinomycin, streptomycin phosphotransferases (SPT), which confer resistance to streptomycin, neomycin phospho
  • reporter genes which code for easily quantifiable proteins and which, by means of their own color or enzyme activity, ensure an assessment of the transformation efficiency or the location or time of expression.
  • Reporter proteins Schoenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (l): 29-44) such as "green fluorescence protein” (GFP) (Sheen et al. (1995 ) Plant Journal 8 (5): 777-784), chloramphenicol transferase, a luciferase (Ow et al. (1986) Science 234: 856-859), the aequorin gene (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun
  • origins of replication which ensure an increase in the transgenic expression constructs or transgenic expression vectors according to the invention in, for example, E. coli.
  • examples are ORI (origin of DNA replication), the pBR322 ori or the P15A ori (Sambrook et al .: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • transgenic expression constructs or transgenic expression vectors can contain nucleic acid sequences which do not code for the protein encoded by SEQ ID NO: 2, encode a functional equivalent thereof or a functionally equivalent part of the abovementioned, and their transgenic expression for an additional increase in vitamin E biosynthesis leads (as a result of pro-VitE).
  • This additionally transgenically expressed pro-VitE nucleic acid sequence can be selected, by way of example, but not by way of limitation, from nucleic acids coding for homogentisate phytyl transferase, 2-methyl-6-plastoquinone methyl transferase, tocopherol cyclase, ⁇ -tocopherol methyl transferase, hydroxyphenylpyruvase dyaminate oxygenase. In the case of the aforementioned, the desired effect is ensured by overexpression.
  • pro-VitE nucleic acid sequence which, for example as antisense RNA or double-stranded RNA, suppresses the expression of certain genes.
  • Suitable target genes would be - for example but not by way of limitation - the homogentisate dioxyase.
  • Corresponding sequences are known to the person skilled in the art and from databases or corresponding cDNA banks of the respective Plants easily accessible. The person skilled in the art is aware that several different of the above-mentioned additional expressions of pro-VitE nucleic acid sequences can also be combined in the context of the invention.
  • transgenic expression constructs can be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or else agrobacteria.
  • the transgenic expression construct can be introduced into the vector (preferably a plasmid vector) via a suitable restriction site.
  • the resulting transgenic expression vector is first introduced into E. coli. Correctly transformed E. coli are selected, grown and the combined vector is obtained using methods familiar to the person skilled in the art. Restriction analysis and sequencing can be used to check the cloning step.
  • Preferred vectors are those which enable stable integration of the transgenic expression construct into the host genome.
  • RNA or protein is introduced into the corresponding host cell.
  • transformation or transduction or transfection
  • the DNA or RNA can be introduced directly by microinjection or by bombardment with DNA-coated microparticles.
  • the cell can also be chemically permeabilized, for example with polyethylene glycol, so that the DNA can get into the cell by diffusion.
  • the DNA can also be obtained by protoplast fusion with other DNA-containing units such as minicells, cells, lysosomes or liposomes. Electroporation is another suitable method for introducing DNA in which the cells are reversibly permeabilized by an electrical pulse. Appropriate methods are described (for example in Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al.
  • Suitable methods are above all the protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun, the so-called “particle bombardment” method, the electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution and the microinjection.
  • a transformation can also be carried out by bacterial infection using Agrobacterium turnefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • the Agrobacterium -mediated transformation is best suited for dicotyledonous plant cells. The methods are described, for example, by Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f).
  • the transgenic expression construct has to be integrated into special plasmids, either into a shuttle or intermediate vector or a binary vector. If a Ti or Ri plasmid is to be used for transformation, at least the right boundary, but mostly the right and the left boundary of the Ti or Ri plasmid T-DNA as the flanking region, is connected to the transgenic expression construct to be introduced.
  • Binary vectors are preferably used.
  • Binary vectors can replicate in both E.coli and Agrobacterium. They usually contain a selection marker gene (eg nptll) and a linker or polylinker flanked by the right and left T-DNA limiting sequence. They can be transformed directly into Agrobacterium (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187). Outside the T-DNA, the vector usually also contains a further selection marker gene which enables a selection of transformed agrobacteria (and / or E. coli) (for example nptlll).
  • the Agrobacterium which acts as the host organism in this case, should already contain a plasmid with the vir region.
  • T-DNA This is necessary for the transfer of T-DNA to the plant cell.
  • An Agrobacterium transformed in this way can be used to transform plant cells.
  • the use of T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and described (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkeri Kanters BV, Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287).
  • Various binary vectors are known and some are commercially available, for example pBI101.2 or pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
  • Direct transformation techniques are suitable for every organism and cell type. In the case of injection or electroporation of DNA or RNA into plant cells, there are no special requirements for the plasmid used.
  • Simple plasmids such as the pUC series can be used. If complete plants are to be regenerated from the transformed cells, it is necessary that there is an additional selectable marker gene on the plasmid.
  • Stably transformed cells i.e. those which contain the introduced DNA integrated into the DNA of the host cell can be selected by untransformed ones if a selectable marker is part of the introduced DNA.
  • a selectable marker for example, any gene that acts as a marker against biocide resistance, e.g. an antibiotic or herbicide (such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin etc.) is able to confer (see above).
  • Transformed cells that express such a marker gene are able to survive in the presence of concentrations of an appropriate antibiotic or herbicide that kill an untransformed wild type.
  • the selection marker allows the selection of transformed cells from untransformed ones (McCormick et al. (1986) Plant Cell. Reports 5: 81-84).
  • the plants obtained can be grown and crossed in the usual manner. Two or more generations should be cultivated to ensure that genomic integration is stable and inheritable.
  • the above-mentioned methods are described, for example, in Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, published by SD Kung and R Wu, Academic Press, pp. 128-143 and in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225).
  • the expression construct to be transgenic is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711f).
  • a whole plant can be obtained using methods known to those skilled in the art. This is based on callus cultures, for example. From these still undifferentiated line mass formation of shoots and roots can be induced in a known manner. The sprouts obtained can be planted out and grown. Methods are known to the person skilled in the art for regenerating from plant cells, plant parts and whole plants. 5 For example, methods described by Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14: 273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89: 525-533.
  • Transgene means - for example with regard to a nucleic acid sequence, an expression construct or an expression vector containing said nucleic acid sequence or an organism transformed with said nucleic acid sequence, expression construct or expression vector - all such by gene
  • nucleic acid sequence coding for a Tocen-2 protein according to SEQ ID NO: 2 a functional equivalent thereof
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the organism of origin
  • the natural, genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least
  • a naturally occurring expression construct for example the naturally occurring combination of the promoter of a gene coding for a protein according to SEQ ID NO: 2 or
  • transgenic expression preferably means all those expressions realized using a transgenic expression construct, transgenic expression vector or transgenic organism - according to the definitions given above.
  • Preferred host or parent organisms as transgenic organisms are, above all, plant organisms as defined above. Included within the scope of the invention are all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom, in particular plants which are used for the extraction of oils, such as, for example, rapeseed, sunflower, sesame, safflower, olive tree, soybeans, corn, wheat and nuts. Also included are the mature plants, seeds, sprouts and seedlings, as well as parts, propagation material and cultures derived from them, for example cell cultures. Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • the production of the transgenic organisms can be carried out using the processes described above for the transformation or transfection of organisms.
  • Another object of the invention relates to the use of the transgenic organisms according to the invention and the cells, cell cultures, parts derived from them, such as roots, leaves, etc. in transgenic plant organisms, and transgenic propagation material such as seeds or fruits, for the production of food - or animal feed, pharmaceuticals or fine chemicals, especially vitamin E or vitamin E derivatives such as vitamin E acetate. sequences
  • SEQ ID NO: 1 nucleic acid sequence coding for Tocen-2
  • SEQ ID NO: 2 protein sequence coding for the Tocen-2
  • SEQ ID NO: 3 oligonucleotide primers slrl263-5
  • SEQ ID NO: 4 oligonucleotide primers slrl263-3 x
  • SEQ ID NO: 5 nucleic acid sequence coding for the
  • SEQ ID NO: 6 oligo sequence coding for the sense strand of a swal linker
  • SEQ ID NO: 7 oligo sequence coding for the antisense
  • SEQ ID NO: 8 nucleic acid sequence coding for the transgenic expression vector pSUN2-l
  • SEQ ID NO: 9 nucleic acid sequence coding for the rbcS-
  • SEQ ID NO: 10 nucleic acid sequence coding for the transgenic expression vector pSUN2-2
  • SEQ ID NO: 12 oligonucleotide primer 1263exl-3 ⁇
  • SEQ ID NO: 13 nucleic acid sequence coding for the
  • SEQ ID NO: 14 nucleic acid sequence coding for the transgenic expression vector pSUN2 / NitP / slrl263 / ocs 15.
  • SEQ ID NO: 15 nucleic acid sequence coding for the transgenic expression vector pSUN2 / NitP / rbcS / slrl263 / ocs
  • SEQ ID NO: 16 nucleic acid sequence coding for the
  • SEQ ID NO: 17 oligonucleotide primer slrl263ex2-5 *
  • SEQ ID NO: 18 oligonucleotide primer Slrl263ex2-3 '
  • SEQ ID NO: 19 nucleic acid sequence coding for the transgenic expression vector pSUN2-USP-slrl263-catT
  • SEQ ID NO: 20 nucleic acid sequence coding for the rbcS-MCS-OCS fragment rbs: rbs transit peptide; MCS: multiple cloning site;
  • OCS termination signal of the octopine synthase gene.
  • SEQ ID NO: 21 nucleic acid sequence coding for the transgenic expression vector pSUN2 / USP / rbcS / slrl263 / ocs
  • SEQ ID NO: 22 nucleic acid sequence coding for a functional equivalent of the Tocen-2 protein from Synechocystis (slrl431)
  • SEQ ID NO: 23 amino acid sequence coding for a functional equivalent of the Tocen-2 protein from Synechocystis (slrl431)
  • SEQ ID NO: 24 nucleic acid sequence coding for a functional equivalent of the Tocen-2 protein from Anabaena sp. PCC 7120 (alr0436)
  • SEQ ID NO: 25 amino acid sequence coding for a functional equivalent of the Tocen-2 protein from Anabaena sp. PCC 7120 (alr0436) 26.
  • SEQ ID NO: 26 nucleic acid sequence coding for a functional equivalent of the Tocen-2 protein from Anabaena sp. PCC 7120 (alrl370)
  • SEQ ID NO: 27 amino acid sequence coding for a functional equivalent of the Tocen-2 protein from Anabaena sp. PCC 7120 (alrl370)
  • Fig. 1 pGEM-Teasy / slrl263 construct map
  • A represents the DNA fragment coding for Tocen-2
  • Fig. 2 pGEM-Teasy / slrl263 construct map:: tn903
  • Fragment A (715 base pairs): 5 ⁇ range of Tocen-2,
  • Fragment B (1286 base pairs): transposon 903 fragment 'A (703 base pairs): 3' region of Tocen-2.
  • the kanamycin cassette of the tn903 transposon inserted in pGEM-Teasy / slrl263 such that the transcription of the kanamycin resistance gene of the Tn903 runs in the opposite direction to the transcription of the open reading frame of Tocen-2.
  • Fig. 4 Construction card from pSUN2 / NitP / slrl263 / ocs (SEQ ID No: 14)
  • Fragment "B” (1413 bp): open reading frame of Tocen-2
  • Fragment "A” (1894 bp) nitrilase-1 promoter Fragment "B” (167 bp): fragment coding for the rbcS
  • Fragment "C” (1413 bp) open reading frame of Tocen-2 fragment "D” (219 bp): termination signal of the octopine
  • Fig. 6 construct card of pSUN2 / USP / slrl263 / 3 "approx.
  • Fragment "A” (674 bp): promoter of the USP gene from Vicia faba
  • Fragment "B” (1413 bp) open reading frame of Tocen-2 fragment "C” (229 bp): termination signal of the
  • Fig. 7 Construction card from pSUN2 / USP / rbcS / slrl263 / ocs
  • Fragment "A” (674 bp): promoter of the USP gene from Vicia faba
  • Fragment "B” (174 bp): fragment coding for the rbcS
  • Fragment C (1413 bp): open reading frame of Tocen-2 fragment D (219 bp): termination signal of the octopine
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the cloning steps carried out in the context of the present invention such as e.g. Restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA are carried out as in Sambrook et al , (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules takes place with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74: 5463- 5467).
  • the Arabidopsis thaliana plant represents a member of the higher plants (seed plants). This plant is closely related to other plant species from the cruciferous family such as Brassica napus, but also with other dicotyledonous plant families. Due to the high degree of homology of their DNA sequences or polypeptide sequences, Arabidopsis thaliana can be used as a model plant for other plant species.
  • the plants are grown either on Murashige-Skoog medium with 0.5% sucrose (Ogas et al. (1997) Science 277: 91-94) or on earth (Focks & Benning (1998) Plant Physiol 118: 91-101).
  • the seeds are after plating or spreading stratified on earth for two days at 4 ° C.
  • the pods are marked. According to the markings, pods are harvested 6 to 20 days after flowering.
  • the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 strain from the collection of Prof. Dr. Peter Wölk and Prof. Dr. Lee Mclntosh (Plant Research Laboratory, Michigan State University, East Lansing, Michigan, USA). This is glucose tolerant, i.e. it can also grow heterotrophically in the dark with only a few minutes of dim blue light lighting per day. These culture conditions were developed by Anderson and Mclntosh (Anderson and Mclntosh (1991) J Bacteriol 173: 2761-2767) and called “Light-activated heterotrophic growth" (LAHG). This makes it possible to cultivate these cyanobacteria without ongoing photosynthesis and thus without the production of oxygen.
  • LAHG Light-activated heterotrophic growth
  • the weighed substances are dissolved in 900 ml H 2 0 and made up to 1000 ml with 100 ml of the Trace metal mix stock lOOOx. This obtained solution serves as a stock solution.
  • solution 4 While solution 2 and 3 should be sterile filtered, solution 4 must be autoclaved. The entire BGH culture solution must be autoclaved before use and then 1 ml of iron ammonium citrate (6 mg / ml), which has been sterile filtered, must be added. Under no circumstances should the iron ammonium citrate be autoclaved. For agar plates, 1.5% (w / v) Bactoagar is added per liter of BGH medium.
  • the DNA coding for Tocen-2 was obtained by means of "Polymerase Chain Reaction” (PCR) from Synechocystis spec. PCC 6803 according to the method according to Crispin A. Howitt (Howitt CA (1996) BioTechniques 21: 32-34) using a sense-specific primer (slrl263-5 ';
  • the PCR was carried out in a 50 ⁇ l reaction mixture which contained:
  • Step 1 5 minutes 94 ° C (denaturation)
  • Step 2 3 seconds 94 ° C
  • Step 3 1 minute 52 ° C (annealing)
  • Step 4 1 minute 30 seconds 72 ° C (elongation) 35 repetitions of steps 2 to 4
  • Step 5 10 minutes 72 ° C (post-elongation)
  • Step 6 4 ° C (Holding pattern)
  • the amplificate (1425 base pairs) was cloned into the PCR cloning vector pGEM-Teasy (Promega) using standard methods.
  • the construct is called pGEM-Teasy / slrl263.
  • the identity of the amplicon generated was confirmed by sequencing using the T3 and T7 primers (cf. SEQ ID NO: 1).
  • Figure 1 represents pGEM-Teasy / slrl263, where "A" represents the DNA fragment coding for Tocen-2 (1413 base pairs).
  • a DNA construct to create a deletion mutant of Tocen-2 in Synechocystis spec. PCC 6803 was created using standard cloning techniques.
  • the vector pGEM-Teasy / slrl263 was digested using the restriction enzyme Mscl.
  • the aminoglycoside-3 'phosphotransferase of the transposon Tn903 was cloned into this blunt-ended MscI site of the open reading advisor of Tocen-2.
  • the Tn903 was isolated as an EcoRI fragment from the vector pUC4K (Vieira J and Messing J (1982) Gene 19: 259-268), the protruding ends of the restriction digest were converted into blunt ends according to standard methods and the vector pGEM-Teasy / slrl263 ligated.
  • the ligation approach was used to transform E. coli Xll blue cells. Transformants were selected using kanamycin and ampicillin.
  • a recombinant plasmid (pGEM-Teasy / slrl263:: tn903; see Fig. 2) was isolated and used to transform Synechocystis spec. PCC 6803 used according to the Williams method (Williams (1987) Methods Enzymol 167: 776-778).
  • Fragment A includes' (715 base pairs) the 5 'region of Tocen-2, Fragment B, the transposon 903 (1286 base pairs) and fragment' A (703 base pairs) the 3 ⁇ range of Tocen-2.
  • the cell culture medium was removed by centrifugation twice at 14000 rpm in an Eppendorf table centrifuge.
  • the subsequent digestion of the cells and extraction of the tocopherols and tocotrienols was carried out by incubating twice in an Eppendorf shaker at 30 ° C., 100 ° C. in 100% methanol for
  • the extracts obtained were analyzed immediately after extraction using a Waters Allience 2690 HPLC system.
  • Tocopherols and tocotrienols were run on a reverse phase column (ProntoSil 200-3-C30, Bischoff) with a mobile phase separated from 100% methanol and identified using standard (Merck).
  • the fluorescence of the substances (excitation 295 nm, emission 320 nm) was used as the detection system, which was detected with the aid of a Jasco FP 920 fluorescence detector.
  • Example 5 Manipulation of tocopherol biosynthesis in Nicotiana tabacum Samsun NN, Arabidopsis thaliana and Brassica napus by transgenic expression of Tocen-2
  • Transgenic plants are produced which contain Tocen-2 on the one hand under the control of the constitutive promoter of the nitrilase-1 (nitl) gene from A. thaliana (GenBank Acc.-No .: Y07648.2, nucleotides 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170: 197-200) and on the other hand under the control of the seed-specific promoter of the USP (unknown seed protein) gene from Vicia faba (Bäumlein et. Al. (1991) Mol Gen Genet 225: 459-467).
  • Tocen-2 is expressed as a fusion protein with the transit peptide of the rbcS protein (Guerineau et al. (1988) Nucl Acid Res 16: 11380), both constitutively and seed-specifically.
  • Derivatives of the pSUN vector (WO 02/00900) serve as the expression vector.
  • the vector pSUN2 was used for the constitutive expression
  • linker also introduces a swal interface into the polylinker (SEQ ID No: 6 and SEQ ID No: 7).
  • the DNA fragment coding for the rbcS transit peptide is amplified as a SacI-Swal fragment (sequence ID No: 9) and introduced into the pSUN2-1.
  • the vector is called pSUN2-2 (Sequence ID NO: 10).
  • the ORF is amplified as a Swal-Smal fragment using standard methods using the primers 1263exl-5 and 1263exl-3 % (SEQ ID No. 11 and SEQ ID No. 12).
  • the resulting 462 bp fragment becomes cloned into the pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions and sequenced using the T3 and T7 primers.
  • a correct clone is cut with Swal and Smal and ligated into a Swal cut pSUN2-l using standard methods.
  • the nitrilase promoter is cloned into the resulting construct, in which slrl263 is inserted in the correct orientation and cut with Ecll36II, as an Xhol fragment (SEQ ID No: 13), the overhanging ends of which are filled in with Klenow polymerase according to standard methods ,
  • This plasmid is designated pSUN2 / NitP / slrl263 / ocs (SEQ ID No: 14) and used to generate transgenic plants (cf. FIG. 4).
  • pSUN2-2 is cut with Swal.
  • the vector cut in this way is ligated with the Tocen-2 fragment, which after digestion with Swal and Smal is isolated from pCR4Blunt-TOP0 / slrl263.
  • the nitrilase promoter SEQ ID NO: 13 as Xhol fragment, the overhanging ends of which are filled in with Klenow polymerase according to standard methods, ligated.
  • This cloning allows the expression of a fusion protein which contains the transit peptide of the rbcS protein and Tocen-2 (see FIG. 5, SEQ ID No. 15).
  • the seed-specific promoter of the USP gene from Vici faba which is present as an EcoRI-Ncol fragment in a pUC derivative, is used to generate a plasmid which enables the seed-specific expression of Tocen-2 in plants (SEQ ID NO: 16 ).
  • the open reading frame of Tocen-2 is amplified using standard PCR methods in such a way that a Bbsl interface is generated at the 5 'end and an EcoRV interface is generated at the 3' end .
  • the following oligonucleotide primers are used for this:
  • the amplificate is cloned into pCR4Blunt-T0P0 and sequenced.
  • the PCR product is ligated as a Bb ⁇ l EcoRV fragment in the vector cut with Ncol (overhanging ends compatible with 5 ⁇ overhang of the PCR product) and EcoRV.
  • the expression construct is ligated as a Pmel-HindIII fragment in the pSUN2 cut with EcoRV and HindIII.
  • the resulting plasmid is called pSun2-USP-slrl263-catT (see Fig. 6, SEQ ID NO: 19).
  • the rbcS fragment is amplified together with the ocs terminator as an Ncol-HindII fragment (SEQ ID No: 20) from pSUN2-2 and into the Cloned pUC derivative containing the USP promoter.
  • Promoters, rbcS and ocs are cloned as EcoRI-HindHI fragments in pSUN2 cut with EcoRI and HindIII.
  • Tocen-2 is cloned into this expression vector as a Swal-Smal fragment.
  • the resulting plasmid is called pSUN2 / USP / rbcS / slrl263 / ocs (Fig. 7, SEQ ID No: 21).
  • Wild type A. thaliana plants (Columbia) are treated with the Agra bacterium tumefaciens strain (EHA105) on the basis of a modified method (Steve Clough and Andrew Bent (1998) Plant J 16 (6): 735-743) using the vacuum infiltration method according to Bechtold et al. (Bechtold N et al. (1993) CRAcad Sei Paris 1144 (2): 204-212).
  • the A. tumefaciens cells are previously prepared with the plasmids pSUN2 / NitP / slrl263 / ocs (SEQ ID NO: 14), pSUN2 / NitP / rbcS / slrl263 / ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2 / USP / slrl263 / catT
  • Seeds of the Agrobacterium-transformed primary transformants are selected on the basis of antibiotic resistance.
  • Antibiotic-resistant seedlings are planted in soil and used as fully developed plants for biochemical analysis.
  • transgenic rapeseed plants are based on a protocol by Bade JB and Damm B (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. And Spangenberg, G., Eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in which also specifies the composition of the media and buffers used.
  • the transformations are done with the Agrobacterium. tumefaciens strains EHA105 and GV3101.
  • the plasmids pSUN2 / NitP / slrl263 / ocs (SEQ ID NO: 14), pSUN2 / NitP / rbcS / slrl263 / ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2 / USP / slrl263 / catT (SEQ ID NO: 19 ) or pSUN2 / USP / rbcS / slrl263 / ocs (SEQ ID NO: 21).
  • Seeds of Brassica napus var. Westar are made surface-sterile with 70% ethanol (v / v), washed in water for 10 minutes at 55 ° C, in 1% hypochlorite solution (25% v / v Teepol, 0.1 % v / v Tween 20) incubated for 20 minutes and washed six times with sterile water for 20 minutes each.
  • the seeds are dried on filter paper for three days and 10-15 seeds are germinated in a glass flask with 15 ml of germination medium.
  • the roots and apices are removed from several seedlings (approx. 10 cm in size) and the remaining hypocotyls are cut into pieces approx. 6 mm long. The approx.
  • 600 explants obtained in this way are washed for 30 minutes with 50 ml of basal medium and transferred to a 300 ml flask. After adding 100 ml of callus induction medium, the cultures were incubated for 24 hours at 100 rpm.
  • Luria Broth medium with kanamycin (20 mg / 1) is prepared, of which 2 ml in Incubate 50 ml Luria Broth medium without kanamycin for 4 hours at 29 ° C to an OD600 of 0.4 to 0.5. After pelleting the culture at 2000 rpm for 25 min, the cell pellet is resuspended in 25 ml of basal medium. The concentration of the bacteria in the solution is adjusted to an OD ß oo of 0 3 by adding further basal medium.
  • the callus induction medium is removed from the oilseed rape explants using sterile pipettes, 50 ml of Agrobacterium solution are added, mixed gently and incubated for 20 min. The agrobacterial suspension is removed, the oilseed rape explant is washed for 1 min with 50 ml of callus induction medium and then 100 ml of callus induction medium is added. The co-cultivation is carried out for 24 h on a rotary shaker at 100 rpm. The co-cultivation is stopped by removing the callus induction medium and the explants are washed twice for 1 min with 25 ml and twice for 60 min with 100 ml washing medium at 100 rpm. The washing medium with the explants is transferred to 15 cm petri dishes and the medium is removed with sterile pipettes.
  • the wild-type plants from sterile culture are obtained by vegetative replication. For this purpose, only the tip of the plant is cut off and transferred to fresh 2MS medium in a sterile mason jar. The hair on the top of the leaf and the central ribs of the leaves are removed from the rest of the plant. The leaves are cut into approximately 1 cm 2 large pieces with a razor blade. The agrobacterial culture is transferred to a small petri dish (diameter 2 cm). The leaf pieces are briefly drawn through this solution and placed with the underside of the leaf on 2MS medium in Petri dishes (diameter 9 cm), so that they touched the medium.
  • the explants After two days in the dark at 25 ° C, the explants are transferred to plates with callus induction medium and heated to 28 ° C in the climatic chamber. The medium must be changed every 7 to 10 days. As soon as calli formed, the explants were placed in sterile mason jars on shoot induction medium with Claforan (0.6% BiTec agar (g / v), 2.0 mg / 1 zeatin ribose, 0.02 mg / 1 naphthylacetic acid, 0.02 mg / 1 gibberelin acid, 0.25 g / ml claforan, 1.6% glucose (g / v) and 50 mg / 1 kanamycin) transferred. Organogenesis occurs after about a month. and the rungs formed can be cut off. The shoots are cultivated on 2MS medium with Claforan and a selection marker. As soon as a strong root ball has formed, the plants can be potted in pricking soil.
  • the tocopherol and tocotrienol contents in leaves and seeds of the plants transformed with the described constructs (Arabidopsis. Thaliana, Brassica napus and Nicotiana tabacum) analyzed.
  • the transgenic plants are cultivated in the greenhouse and plants which code for the gene
  • Tocen-2 express identified at Northern level.
  • the tocopherol content and the tocotrienol content are determined in the leaves and seeds of these plants. In all cases, the tocopherol or tocotrienol concentration is increased compared to non-transformed plants.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen, bevorzugt in Algen, durch transgene Expression von ORF slr1263 aus Synechocystis sp. PCC6803. Die Erfindung betrifft ferner transgene Expressionskonstrukte zur Expression von ORF slr1263 in pflanzlichen Organismen, bevorzugt in Algen, transgene pflanzlichen Organismen exprimierend slr1263, sowie die Verwendung von besagten transgenen pflanzlichen Organismen zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere zur Herstellung von Vitamin E.

Description

Transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen, bevorzugt in Algen, durch transgene Expression von ORF slrl263 aus Synechocystis sp. PCC6803. Die Erfindung betrifft ferner transgene Expressionskonstrukte zur Expression von ORF slrl263 in pflanzlichen Organismen, bevorzugt in Algen, transgene pflanzlichen Organismen exprimierend slrl263, sowie die Verwendung von besagten transgenen pflanzlichen Organismen zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere zur Herstellung von Vitamin E.
Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E- Aktivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E) . Die Gruppe der Toco- pherole (la-d) weist eine gesättigte Seitenkette auf, die Gruppe der Tocotrienole (2a-d) eine ungesättigte Seitenkette:
Figure imgf000002_0001
la, α-Tocopherol : R1 = R2 = R3 = CH3 lb, ß-Tocopherol [148-03-8 ] : R1 = R3 = CH3 , R2 = H lc , γ-Tocopherol [ 54-28-4 ] : R1 = H, R2 = R3 = CH3 ld, δ-Tocopherol [ 119-13-1 ] : R1 = R2 = H , R3 = CH3
Figure imgf000002_0002
2a, α-Tocotrienol [1721-51-3]: R1 = R2 = R3 = CH3 2b, ß-Tocotrienol [490-23-3]: R1 = R3 = CH3 , R2 = H 2c, γ-Tocotrienol [14101-61-2]: R1 = H, R2 = R3 = CH3 2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3]: R1 = R2 = H, R3 = CH3
In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin E alle acht vorstehend erwähnten Tocopherole und Tocotrienole mit Vitamin-E- Aktivität verstanden.
Vitamin E-Verbindungen haben einen hohen wirtschaftlichen Wert als Zusatzstoffe im Food- und Feed-Bereich, in pharmazeutischen Formulierungen und in kosmetischen Anwendungen.
Es gibt Versuche zur Erhöhung des Stoffwechselflusses zur Steigerung des Tocopherol- bzw. Tocotrienolgehaltes in trans- genen Pflanzen durch Überexpression einzelner Tocopherol-Bio- synthesegene (WO 97/27285; WO 99/04622; WO 99/23231; WO 00/10380;
Shintani und Dellapenna, Science 282 (5396) :2098-2100, 1998;
Tsegaye et al . Jahrestreffen der American Society of Plant Physiologists (24.-28.07.1999, Baltimore, USA) Abstract No. 413).
Synechocystis sp. PCC 6803 ist ein einzelliges, nicht Stickstoff fixierendes Cyanobakteriu , das genetisch gut untersucht ist (Churin et al . (1995) J Bacteriol 177: 3337-3343), leicht transformiert werden kann (Williams (1988) Methods Enzymol 167:766-778) und ein sehr aktives homologes Rekombinationsvermögen aufweist. Der Stamm PCC 6803 wurde 1968 von R. Kunisawa als Aphanocapsa N-l in Kalifornien, USA, aus Süßwasser isoliert und ist heute über die "Pasteur Culture Collection of Axenic Cyanobacterial Strains" (PCC) , Unite de Physiologie Microbienne, Paris, Frankreich, erhältlich. Die genomische Gesamtsequenz von Synechocystis sp. PCC 6803 wurde ab 1995 veröffentlicht (Kaneko et al . (1995) DNA Research 2:153-166; Kaneko et al . (1995) DNA Research 2:191-198; Kaneko et al . (1996) DNA Research 3:109-136; Kaneko et al . (1996) DNA Research 3:185-209; Kaneko und Tabata (1997) Plant Cell Physiol 38:1171-1176; Kotani und Tabata (1998) Annu Rev Plant Physiol 49:151-171) und ist über das Internet (http://www.kazusa.or.jp/cyano/cyano.html) unter dem Namen "CyanoBase" veröffentlicht. Effektive Expressionssysteme für Synechocystis 6803 sind in der Literatur beschrieben (Mermet- Bouvier et al . (1993) Curr Microbiol 27:323-327; Mermet-Bouvier und Chauvat (1993) Curr Microbiol 28:145-148; Murphy und Stevens (1992) Appl Environ Microbiol 58:1650-1655; Takeshima et al . (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91:9685-9689; Xiaoqiang et al . (1997) Appl Environ Microbiol 63:4971-4975; Ren et al . (1998) FEMS Microbiol Lett 158:127-132). Trotz einiger Erfolge besteht weiterhin Bedarf an einer Optimierung der Vitamin E Biosynthese. Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, weitere Verfahren zur Verfügung zu stellen, die die Vitamin E-Biosynthese steigern und damit zu vorteilhaften trans- genen pflanzlichen Organismen führen.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst. Im Rahmen der Erfindung wurde das Protein kodiert durch ORF slrl263 aus Synechocystis sp. PCC 6803 (GenBank Acc.-No.: NP_441177; gi: 16330449; SEQ ID NO: 2) überraschenderweise als Schlüsselfaktor der Vitamin E-Biosynthese identifiziert (infolge Tocen-2 für "Tocopherol synthesis enhancing protein"-2) . Tocen-2 ist in der GenBank als unbekanntes Protein ohne jegliche Funktionsannotation klassifiziert. Das Protein weist keine signifikanten Homologien zu anderen Proteinen bekannter Funktion auf . Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die transgene Expression dieses Proteins, den Vitamin E Gehalt in pflanzlichen Organismen erhöhen kann.
Ein erster Gegenstand der Erfindung umfasst Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen, durch
a) transgene Expression des Tocen-2 Proteins kodiert durch
SEQ ID NO: 2 oder eines funktioneilen Äquivalentes desselben oder eines funktioneil äquivalenten Teils der vorgenannten in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus, und
b) Auswahl von pflanzlichen Organismen, bei denen - im Unterschied oder Vergleich zum Ausgangsorganismus - der Vitamin E- Gehalt in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus erhöht ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Prinzip auf alle pflanzlichen Organismen angewendet werden, bevorzugt auf solche die natürlicherweise Vitamin E produzieren, ganz besonders bevorzugt auf solche die für industrielle Produktion von natürlichem Vitamin E eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte zur Expression einer Nukleinsäuresequenz kodierend für das Tocen-2 Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2 oder eines funktioneilen Äquivalentes desselben (z.B. gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27) oder eines funktioneil äquivalenten Teils der vorgenannten. Besonders bevorzugt ist die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 22, 24 oder 26 und die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenzen sowie funktioneil äquivalente Teile der vorgenannten.
"Pflanzlicher Organismus oder von diesem abgeleitete Zellen" meint allgemein jede Zelle, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte) eines Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzen- reiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzugt.
"Pflanze" im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Ein- geschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte), Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zeil- oder Kalluskulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktioneilen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen EntwicklungsStadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
"Pflanze" umfasst alle einjährigen und mehrjährige, mono- kotyledonen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispielhaft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelar- gonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.
Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien: Amaranth- aceae, Asteraceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubia- ceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae. Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.
Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt aus dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
- Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr,
- Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr,
- Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea (z.B. Kohl, Blumenkohl oder Broccoli und weitere Kohlarten) ; und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola und andere mehr,
- Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr,
- Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr
- Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispielsweise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch) und andere mehr,
- Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art aπnum (Paprika) , sowie Tabak und andere mehr,
- Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
- Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr, - Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz -besonders die Art carota (Karotte) ) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Sellerie) ) und andere mehr;
sowie Lein, Soja, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat, Möhre, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinarten, insbesondere Banane und Kiwi .
Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäume, Blumen, Schnittblumen, Sträucher oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose) ; Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum
Beispiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus , Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis.
Insbesondere bevorzugt sind pflanzliche Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Ölpflanzen bestehend aus Borago officinalis, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Cannabis sativa, Carthamus tinctorius, Cocos nucifera, Crambe abyssinica, Cuphea Arten, Elaeis guineensis, Ekeis oleiferu, Glycine max, Gossypium hirsitum, Gossypium barbadense, Gossypium herba- ceum, Helianthus annus , Linum usitatissimum, Oenothera biennis, Ozea europea, Oryza sativa, Ricinus communis, Sesamum indicum, Triticum Arten, Zea maize, Walnuss und Mandel.
Am meisten bevorzugt sind pflanzliche Organismen, die zur Vitamin E-Produktion geeignet sind, wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja, Mais, Weizen oder verschiedene Nussarten wie beispielsweise Walnuss oder Mandel. "Vitamin E-Gehalt" meint die Summe der Tocopherole und Toco- trienole in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben. Dabei umfassen Tocopherole und Tocotrienole bevorzugt die oben beschriebenen 8 Verbindungen α-Tocopherol, ß-Tocopherol , γ-Tocopherol, δ-Tocopherol , α-Toco- trienol, ß-Tocotrieno, γ-Tocotrienol und δ-Tocotrienol . Besonders bevorzugt ist der Vitamin E-Gehalt im Samen eines pflanzlichen Organismus erhöht.
"Erhöhung" des Vitamin E-Gehaltes meint die Steigerung des Gehaltes an Vitamin E in einem pflanzlichen Organismus oder einem Teil, Gewebe oder Organ derselben, bevorzugt in den Samenorganen desselben. Dabei ist der Vitamin E-Gehalt im Vergleich zu einer nicht dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfenen, aber ansonsten unveränderten Ausgangspflanze unter ansonsten gleichen Rahmenbedingungen um mindestens 5 %, bevorzugt mindestens 10 %, besonders bevorzugt mindestens 15 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 20 %, am meisten bevorzugt mindestens 25 % erhöht. Rahmenbedingungen meint dabei alle für die Keimung, Kultivierung oder Wachstum der Pflanze relevanten Bedingungen wir Boden-, Klima- oder Lichtverhältnisse, Düngung, Bewässerung, Pflanzenschutzmaßnahmen usw.
Funktionelle Äquivalente meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen des Tocen-2 Proteins gemäß SEQ ID NO: 2 sowie homologe Polypeptide aus anderen Organismen, bevorzugt aus pflanzlichen Organismen, die die gleichen wesentlichen Eigenschaften aufweisen.
"Wesentliche Eigenschaften" des Tocen-2 Proteins beschrieben durch SEQ ID NO: 2 meint insbesondere die Eigenschaft, bei trans- gener Expression in einem pflanzlichen Organismus den Vitamin E Gehalt im Vergleich zu einem identischen aber nicht transgenen pflanzlichen Organismus entsprechend oben gegebener Definition zu erhöhen. In einer bevorzugten Ausführungsform gelten als wesentliche Eigenschaften ferner mindestens eine Eigenschaft ausgewählt aus nachfolgender Gruppe:
a) ein Molekulargewicht in einem Bereich von ungefähr 10 bis ungefähr 100 kDa, bevorzugt ungefähr 30 bis ungefähr 70 kDa, besonders bevorzugt ungefähr 52 kDa
b) einen theoretischen isoelektrischen Punkt in einem Bereich von ungefähr 8 bis ungefähr 10, bevorzugt ungefähr 8,5 bis ungefähr 9,5, besonders bevorzugt ungefähr pH 9,2 c) einen sauren Charakter bevorzugt mit einer Gesamtnettoladung bei neutralem pH in einem Bereich von ungefähr 3 bis ungefähr 5, bevorzugt ungefähr 3,5 bis ungefähr 4,5, besonders bevorzugt ungefähr 4,2,
d) eine Peptidse uenz umfassend mindestens ein Sequenzmotiv ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzmotiven bestehend aus
i) (V/I)R(P/A)LPG(Q/R/K)LD ii) FNSNSPE iii) IY(S/G)RVAG(V/I) iv) RYPDTAY v) FFRG(T/S)VR vi) YPPD(A/S) (T/S)PPQ
bevorzugt ist das Sequenzmotiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
vii) (V/I)R(P/A)LPGXLDXIPXFNSNSPE viii) RYPDTAYX(S/A)HGNY ix) YPPD(A/S) (T/S)PPQ(L/V/I)LTV
besonders bevorzugt enthält die Peptidsequenz mindestens 2 oder 3, ganz besonders bevorzugt mindestens 4 oder 5, am meisten bevorzugt alle der Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzmotive i) , ii) , iii) , iv) , v) und vi) oder ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzmotive vii) , viii) und ix) . (Angaben in Klammern meinen alternativ mögliche Aminosäuren an dieser Position; z.B. mein (V/I) , dass an dieser Position Valin oder Isoleucin möglich ist) .
Funktionelle Äquivalente aus anderen Organismen, beispielsweise aus pflanzlichen Organismen deren genomische Sequenz ganz oder teilweise bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum oder Solanum tuberosum sowie insbesondere aus anderen Cyanobacterien wie Nostoc punctiforme ATCC 29133, Anabaena sp. PCC7120, Synechococcus sp. WH8102 - können z.B. durch Datenbanksuche in Sequenzdatenbanken wie GenBank oder Durchmustern von Gen- oder cDNA-Banken - z.B. unter Verwendung der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder eines Teils der vorgenannten wie beispielsweise insbesondere eines der oben genannten Sequenzmotive i) bis ix) als Suchsequenz bzw. Sonde - aufgefunden werden. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurereste. Bevorzugt haben besagte funktionelle Äquivalente eine Homologie von mindestens 40 %, besonders bevorzugt mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, am meisten bevorzugt mindestens 90 % zu dem Protein mit der SEQ ID NO: 2. Dabei erstreckt sich die Homologie über mindestens 30 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 60 Aminosäuren besonders bevorzugt mindestens 90 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamt Länge des Tocen-2 Polypeptides gemäß SEQ ID NO : 2.
Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweilige Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average Match: 2,912 Average Mismatch: -2 , 003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Proteinbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die eine Homologie von mindestens 40 %, besonders bevorzugt mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, am meisten bevorzugt mindestens 90 % zu der Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 haben. Dabei erstreckt sich die Homologie über mindestens 100 Basen, bevorzugt mindestens 200 Basen besonders bevorzugt mindestens 300 Basen, am meisten bevorzugt über die gesamt Länge der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der beiden Nukleinsäuresequezen über die jeweilige Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0,
University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA; Altschul et al . (1997) Nucleic Acids Res . 25:3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10 Average Mismatch: 0 Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programm- algorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die unter Standard- bedingungen mit einer der durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen
Nukleinsäuresequenz, der zu dieser komplementären Nukleinsäure- sequenz oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und die wesentlichen Eigenschaften des Proteins beschrieben durch SEQ ID NO: 2 aufweisen.
"Standardhybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungs- bedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al . , in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3 M Natriumeitrat, 3 M NaCl, pH 7,0) . Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Para- meter konstant gehalten und nur der andere variiert werden.
Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50 % Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben: (1) Hybridisierungbedingungen zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
a) 4X SSC bei 65°C, b) 6X SSC bei 45°C, c) 6X SSC, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Fischsperma-DNA bei 68°C, f) 50 % Formamid, 4X SSC bei 42°C, h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung) , i) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung) .
(2) Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
a) 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumeitrat/0, 1 % SDS bei 50°C. b) 0,1X SSC bei 65°C. c) 0,1X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C. d) 0,1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C. e) 0,2X SSC, 0,1 % SDS bei 42°C. f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung) .
Funktionelle Äquivalente meint insbesondere die Polypeptide beschrieben durch SEQ ID NO: 23, 25 oder 27.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte, die eine transgene Expression des Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2 oder eines funktioneilen Äquivalentes desselben (z.B. gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27) oder eines funktioneil äquivalenten Teils der vorgenannten in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus gewährleisten können.
In besagten transgenen Expressionskonstrukten steht ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Protein beschrieben durch SEQ ID NO: 2 oder eines funktioneilen Äquivalentes desselben (z.B. gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27) oder eines funktioneil äquivalenten Teils der vorgenannten bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor) , das eine transgene Expression in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben gewährleistet.
Unter einer funktioneilen Verknüpfung versteht man zum Bei- spiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz (zum Beispiel der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 22, 24 oder 26) und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, .dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktioneilen Verknüpfung als auch die Herstellung eines transgenen Expressionskonstruktes kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) , in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) , in Aus- übel FM et al . (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al . (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines
Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann das transgene Expressionskonstrukt, bestehend aus einer Verknüpfung von Promoter und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Unter einem transgenen Expressionskonstrukt sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen die Nukleinsäuresequenz kodierend für das Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2 oder ein funktionelles Äquivalent desselben (z.B. gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27) oder ein funktionell äquivalentes Teil der vorgenannten - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - so hinter einen endogenen pflanzlichen Promotor platziert wird, dass dieser die transgene Expression der besagten Nukleinsäuresequenz gewährleistet. Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich .jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispiels- weise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein.
Bevorzugt sind:
a) Konstitutive Promotoren
"Konstitutive" Promotoren meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten (Benfey et al.(1989) EMBO J 8:2195-2202). Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al . (1980) Cell 21:285-294; Odell et al . (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al . (1986) Plant Mol Biol 6:221- 228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al . (1989) EMBO J 8:2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU) "-Promotor (US 4,962,028), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc . -Nr . X03677) , der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubi uitin Promotor (Holtorf S et al . (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), der Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al . (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:9692-9696), der Smas Promotor, der Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Unter- einheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991) , sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist.
b) Gewebespezifische Promotoren
Bevorzugt sind ferner Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen. Samenspezifische Promotoren wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustos MM et al . (1989) Plant Cell 1(9) :839-53) , des 2S Albumingens (Joseffson LG et al .
(1987) J Biol Chem 262:12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215 (2) : 326-331) , des USP
(unknown seed protein; Baumlein H et al . (1991) Mol Gen Genet 225 (3) : 459-67) , des Napins (US 5,608,152; Stalberg K et al .
(1996) L Planta 199:515-519), des Saccharosebindeproteins
(WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Baumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225:121-128; Baumlein H et al .
(1992) Plant J 2(2):233-9; Fiedler U et al . (1995) Biotechno- logy (NY) 13 (10) : 1090f) , der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis
(WO 98/45461), der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980). Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin"
(HMWG) , Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophos- phatase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder lptl-Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens , des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens , des Gliadin-Gens, des Glutelin-Gens, des Zein- Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens) . Weitere samenspezifische Promotoren sind beschrieben in WO 89/03887.
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren umfassen beispielsweise den Patatin Promotor Klasse I (B33) oder den Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.
Blattspezifische Promotoren umfassen beispielsweise den Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), den SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1, 5-bisphosphatcarboxylase) oder den ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al . (1989) EMBO J 8:2445-2451) .
Blütenspezifische Promotoren umfassen beispielsweise den Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder den Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593) .
Antheren-spezifische Promotoren umfassen beispielsweise den 5126-Promotor (US 5,689,049, US 5,689,051), den glob-1 Promotor und denγ-Zein Promotor. c) Chemisch induzierbare Promotoren
Die transgenen Expressionskonstrukte können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al . (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRPl Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), ein durch Salicyl- säure induzierbarer Promotor (WO 95/19443) , ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186) , ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al . (1992) Plant J 2:397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon- induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden.
d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren
Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogen-induzierbare Promotor des PRPl-Gens (Ward et al . (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hsp80-Promoter aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierare alpha-Amylase Promoter aus der Kartoffel (WO 96/12814) , der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinll-Promoter (EP-A 375 091) .
Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die Promotoren von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden, wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, ß-1, 3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, et al . (1992) Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Marineau et al . (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton et al . (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Somssich et al . (1986) Proc Natl Acad Sei USA 83:2427-2430; Somssich et al . (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen et al . (1996) Plant J 10:955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91:2507-2511; Warner, et al. (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz et al . (1989) Plant Cell 1:961-968).
Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinll Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan et al . (1996) Nat Biotech 14:494-498), des wunl- und wun2-Gens (US 5,428,148), des winl- und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215:200-208), des Systemin Gens (McGurl et al . (1992) Science 225:1570-1573), des WIPl-Gens (Rohmeier et al . (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) Plant J 6 (2) :141-150) und dergleichen.
e) Entwicklungsabhängige Promotoren
Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise frucht- reifung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP-A 409 625) . Entwicklungsabhängige Promotoren schließen zum Teil die gewebespezifische Promotoren mit ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt.
Besonders bevorzugt sind konstitutive, samenspezifische sowie blattspezifische Promotoren.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine transgene Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage .
Die in den erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstrukten oder transgenen Expressionsvektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promoter funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion eines erfindungsgemäßen transgenen Expressions- konstruktes haben. Genetische KontrollSequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotisehen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstrukte 5 '-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen pflanzenspezifischen Promoter und 3 ' -stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz .
Genetische KontrollSequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressions- steuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische KontrollSequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasser- stress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26) :17131-17135) und Hitzestress (Schoffl F et al . (1989) Mol Gen Genetics 217 (2-3) :246-53) beschrieben.
Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans- latierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3 '-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adhl-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5 '-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5 ' -Leadersequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al . (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebs- spezifität fördern (Rouster J et al . (1998) Plant J 15:435-440).
Das transgene Expressionskonstrukt kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 ' -Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase) -Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase) -Terminator. Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel die kodierende Sequenz eines bestimmten endogenen Gens gegen die für eine dsRNA kodierende Sequenz gezielt ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung des transgenen Expressionskonstruktes aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods 14 (4) : 381-92) . Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen) , die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Ein transgenes Expressionskonstrukt und/oder die von ihm abgeleiteten transgenen Expressionsvektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Ein- fluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstrukte, der transgenen Expressionsvektoren oder der transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen Biozide wie
Metabolismusinhibitoren (z.B. 2-Desoxyglucose-6-phosphat; WO 98/45456), Antibiotika (z.B. Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin) oder - bevorzugt - Herbizide (z.B. Phosphinotri- cin) verleihen. Als Selektionsmarker seien beispielhaft genannt: Phosphinothricinacetyltransferasen (bar und pat Gen), welche Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren, 5-Enol- pyruvylshikimat-3-phosphatsynthasen (EPSP Synthasegene) , die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N- (phosphonomethyl) glycin) verleihen, Glyphosat® degradierende Enzyme (gox-Genprodukt; Glyphosatoxidoreduktase) , Dehalogenasen, welche z.B. Dalapon inaktivieren (deh Genprodukt) , Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie Nitrilasen, welche z.B. Bromoxynil degradieren (bxn Genprodukt), das aasa-Gen- produkt, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectino- mycin verleih, Streptomycinphosphotransferasen (SPT) , die eine Resistenz gegen Streptomycin gewähren, Neomycinphospho- transferasen (NPTII) , die eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleihen, das Hygromycinphosphotransferasen (HPT) , die eine Resistenz gegen Hygromycin vermitteln, das Acetolactatsynthasen (ALS) , die eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleihen (z.B. mutierte ALS- Varianten mit z.B. der S4 und/oder Hra Mutation). b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -Zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevor- zugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(l):29-44) wie das "green fluore- scence protein" (GFP) (Sheen et al.(1995) Plant Journal 8 (5) : 777-784) , die Chloramphenicoltransferase, eine Luzi- ferase (Ow et al . (1986) Science 234:856-859), das Aequorin- Gen (Prasher et al . (1985) Biochem Biophys Res Commun
126 (3) :1259-1268) , die ß-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al . (1987) EMBO J 6:3901-3907) .
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstrukte oder transgenen Expressionsvektoren in zum Beispiel E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication) , der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .
d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
Zusätzlich können besagte transgene Expressionskonstrukte oder transgenen Expressionsvektoren Nukleinsäuresequenzen enthalten, die nicht für das Proteins kodiert durch SEQ ID NO : 2 , ein funktionelles Äquivalent desselben oder ein funktionell äquivalentes Teil der vorgenannten kodieren, und deren transgene Expression zu einer zusätzlichen Steigerung der Vitamin E-Biosynthese führt (infolge pro-VitE) . Diese zusätzlich transgen exprimierte pro-VitE Nukleinsäuresequenz kann - beispielhaft aber nicht einschränkend - ausgewählt sein aus Nukleinsäuren kodierend für Homogentisatphytyltransferase, 2-Methyl-6-plastochinonmethyl- transferase, Tocopherolcyclase, γ-Tocopherolmethyltransferase, Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase, Tyrosinaminotransferase, tyrA, Geranylgeranylpyrophosphatreduktase. Bei den vorgenannten wird der erwünschte Effekt durch eine Überexpression gewährleistet.
Jedoch kann ein entsprechender Effekt auch durch Expression einer einer pro-VitE Nukleinsäuresequenz erreicht werden, die z.B. als antisense RNA oder doppelsträngige RNA die Suppression der Expression bestimmter Gene bewirkt. Geeignete Zielgene wären hier - beispielhaft jedoch nicht einschränkend - die Homogentisatdi- oxygenase. Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und aus Datenbanken oder entsprechenden cDNA-Banken der jeweiligen Pflanzen leicht zugänglich. Dem Fachmann ist bewusst, dass auch mehrere unterschiedliche der oben genannten zusätzlichen Expressionen von pro-VitE Nukleinsäuresequenzen im Rahmen der Erfindung kombiniert werden können.
Die Einführung eines erfindungsgemäßen transgenen Expressions- konstruktes in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen) , kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die transgenen Expressionskonstrukte enthalten sind. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agro- bacterien sein. Das transgene Expressionskonstrukt kann in den Vektor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Der entstandene transgene Expressionsvektor wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und der kombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu prüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration des transgenen Expressionskonstruktes in das Wirtsgenom ermöglichen.
Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entsprechende DNA (z.B. der Expressionsvektor) , RNA oder Protein in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Trans- fektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al . (1990) Methods in Enzymology
185:527-537) . So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-ent- haltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al . (1991) Gene 100:247-250; Scheid et al . (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al . (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al . (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al . (1987) Nature 327:70-73 ; Howell et al . (1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231; DeBlock et al . (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic
Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology
(Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnähme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium turnefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone Pflanzenzellen geeignet. Die Verfahren sind bei- spielsweise beschrieben bei Horsch RB et al . (1985) Science 225: 1229f) .
Werden Agrobacterien verwendet, so ist das transgene Expressionskonstrukt in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: Shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit dem einzuführenden transgenen Expressionskonstrukt verbunden.
Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet . Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen (z.B. nptll) und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz . Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al . (1978) Mol Gen Genet 163:181-187) . Außerhalb der T-DNA enthält der Vektor in der Regel noch ein weiteres Selektionsmarkergen , das eine Selektion transformierter Agrobakteria (und/oder E.coli) ermöglicht (z.B. nptlll) . Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agro- bacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkeri Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al . (1985) EMBO J 4:277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA) .
Direkte Transformationstechniken eignen sich für jeden Organismus und Zeiltyp. Im Falle von Injektion oder Elektro- poration von DNA bzw. RNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt.
Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Stabil transformierte Zellen d.h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionier- barer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen ein Biozid z.B. ein Antibiotikum oder Herbizid (wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag (s.o.). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al . (1986) Plant Cell. Reports 5:81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicherweise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die oben genannten Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Jenes B et al.(1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S.128-143 sowie in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225). Vorzugsweise wird das zu transgene Expressionskonstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . (1984) Nucl Acids Res 12:8711f) .
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zeil- massen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, um aus Pflanzenzellen, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu regenerieren. 5 Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben von Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al . (1994) Theor Appl Genet 89:525-533 verwendet.
10 "Transgen" meint - zum Beispiel bezüglich einer Nukleinsäuresequenz, einem Expressionskonstrukt oder einem Expressionsvektor enthaltend besagte Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressionskonstrukt oder Expressionsvektor - alle solche durch gen-
15 technische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen sich entweder
a) die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Tocen-2 Protein gemäß SEQ ID NO: 2, ein funktionelles Äquivalent desselben
20 (z.B. gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27) oder ein funktionell äquivalentes Teil der vorgenannten, oder
b) eine mit besagter Nukleinsäuresequenz unter a) funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein
25 Promotor, oder
c) (a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden
30 oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus
35 oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens
40 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommendes Expressionskonstrukt - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des Promotors eines Gens kodierend für ein Protein gemäß SEQ ID NO: 2 oder
45 ein funktionelles Äquivalent desselben (z.B. gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27) mit seinen entsprechenden kodierenden Sequenzen wird zu einem transgenen Expressionskonstrukt, wenn diese durch nicht- natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (US 5,565,350; WO 00/15815; siehe auch oben) .
"Transgen" meint in Bezug auf eine Expression ("transgene Expression") bevorzugt all solche unter Einsatz eines transgenen Expressionskonstruktes, transgenen Expressionsvektor oder transgenen Organismus - entsprechend dem oben gegebenen Definitionen - realisierten Expressionen.
Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangs- organismen sind vor allem pflanzliche Organismen gemäß der oben genannten Definition. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches, insbesondere Pflanzen, die für die Gewinnung von Ölen verwendet werden wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja, Mais, Weizen und Nussarten. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen EntwicklungsStadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen EntwicklungsStadium.
Die Herstellung der transgenen Organismen kann mit den oben beschriebenen Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Organismen realisiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.-, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere von Vitamin E oder Vitamin E- Derivaten wie beispielsweise Vitamin E Acetat. Sequenzen
1. SEQ ID NO: 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Tocen-2
Protein
2. SEQ ID NO: 2 Proteinse uenz kodierend für das Tocen-2
Protein
3. SEQ ID NO: 3 Oligonukleotidprimer slrl263-5
4. SEQ ID NO: 4 Oligonukleotidprimer slrl263-3 x
5. SEQ ID NO: 5 Nukleinsäuresequenz kodierend für das
Sall-PacI-ocs-Hindlll Sequenzfragment
6. SEQ ID NO: 6 Oligosequenz kodierend für den sense-Strang eines Swal-Linkers
7. SEQ ID NO: 7 Oligosequenz kodierend für den antisense-
Strang eines Swal-Linkers
8. SEQ ID NO: 8 Nukleinsäuresequenz kodierend für den transgenen Expressionsvektor pSUN2-l
9. SEQ ID NO: 9 Nukleinsäuresequenz kodierend für das rbcS-
Transitpeptid
10. SEQ ID NO: 10 Nukleinsäuresequenz kodierend für den transgenen Expressionsvektor pSUN2-2
11. SEQ ID NO: 11 Oligonukleotidprimer 1263exl-5
12. SEQ ID NO: 12 Oligonukleotidprimer 1263exl-3Λ
13. SEQ ID NO: 13 Nukleinsäuresequenz kodierend für den
Nitrilase-1 Promotor aus A.thaliana
14. SEQ ID NO: 14 Nukleinsäuresequenz kodierend für den transgenen Expressionsvektor pSUN2/NitP/slrl263/ocs 15. SEQ ID NO: 15 Nukleinsäuresequenz kodierend für den transgenen Expressionsvektor pSUN2/NitP/rbcS/slrl263/ocs
16. SEQ ID NO: 16 Nukleinsäuresequenz kodierend für den
USP-Promotor aus Vicia faba in pUC-Vektor
17. SEQ ID NO: 17 Oligonukleotidprimer slrl263ex2-5 *
18. SEQ ID NO: 18 Oligonukleotidprimer Slrl263ex2-3 '
19. SEQ ID NO: 19 Nukleinsäuresequenz kodierend für den transgenen Expressionsvektor pSUN2-USP-slrl263-catT
20. SEQ ID NO: 20 Nukleinsäuresequenz kodierend für das rbcS-MCS-OCS-Fragment rbs : rbs-Transitpeptid; MCS: Multiple Klonierungsstelle;
OCS: Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens .
21. SEQ ID NO: 21 Nukleinsäuresequenz kodierend für den transgenen Expressionsvektor pSUN2/USP/rbcS/slrl263/ocs
22. SEQ ID NO: 22 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein funktionelles Äquivalent des Tocen-2 Proteins aus Synechocystis (slrl431)
23. SEQ ID NO: 23 Aminosäuresequenz kodierend für ein funktionelles Äquivalent des Tocen-2 Proteins aus Synechocystis (slrl431)
24. SEQ ID NO: 24 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein funktionelles Äquivalent des Tocen-2 Proteins aus Anabaena sp. PCC 7120 (alr0436)
25. SEQ ID NO: 25 Aminosäuresequenz kodierend für ein funktionelles Äquivalent des Tocen-2 Proteins aus Anabaena sp. PCC 7120 (alr0436) 26. SEQ ID NO: 26 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein funktionelles Äquivalent des Tocen-2 Proteins aus Anabaena sp. PCC 7120 (alrl370)
27. SEQ ID NO: 27 Aminosäuresequenz kodierend für ein funktionelles Äquivalent des Tocen-2 Proteins aus Anabaena sp. PCC 7120 (alrl370)
Abbildungen
Fig. 1: Konstruktkarte von pGEM-Teasy/slrl263
"A" repräsentiert das für Tocen-2 kodierende DNA-Fragment
(1413 Basenpaare)
Fig. 2: Konstruktkarte von pGEM-Teasy/slrl263 : : tn903
Fragment A' (715 Basenpaare): 5Λ-Bereich von Tocen-2,
Fragment B (1286 Basenpaare) : Transposon 903 Fragment 'A (703 Basenpaare): 3 '-Bereich von Tocen-2.
Die Kanamycin-Kassette des tn903 Transposons inserierte in pGEM-Teasy/slrl263 derart, dass die Transkription des Kanamycinresistenzgens des Tn903 in entgegengesetzter Richtung zur Transkription des offenen Leserasters von Tocen-2 verläuft.
Fig. 3: Tocopherolproduktion in Synechocystis/slrl263 : : tn903
Acht unabhängige Tocen-2 Knockout Mutanten zeigten im Durchschnitt im Vergleich zu den Synechocystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen (WT) eine signifikante Verminderung in der Tocopherol- und Tocotrienolproduktion. Eine Mutante, deren Mutation in einem anderen Gen des gleichen Operons liegt (slrl262), zeigt keinen Effekt auf die Tocopherol- konzentration, so dass der slrl263-vermittelte Effekt als genspezifisch gelten kann.
Fig. 4: Konstrukkarte von pSUN2/NitP/slrl263/ocs (SEQ ID No: 14)
Fragment "A" (1894 bp) : Nitrilase-1 Promotor
Fragment "B" (1413 Bp) : offenes Leseraster von Tocen-2
F Frraaggmmeenntt ""CC"" ((221199 BBpp)) : Terminationssignal des Octopin- Synthase Gens .
Fig. 5: Konstruktkarte von pSUN2/NitP/rbcS/slrl263/ocs
Fragment "A" (1894 bp) Nitrilase-1 Promoter Fragment "B" (167 bp) : Fragment kodierend für das rbcS
Transitpeptid
Fragment "C" (1413 bp) offenes Leseraster von Tocen-2 Fragment "D" (219 bp) : Terminationssignal des Octopin-
Synthase Gens . Fig. 6: Konstruktkarte von pSUN2/USP/slrl263/3 "ca .
Fragment "A" (674 bp) : Promotor des USP Gens aus Vicia faba
Fragment "B" (1413 bp) offenes Leseraster von Tocen-2 Fragment "C" (229 Bp) : Terminationssignal des
Cathepsin D Inhibitor Gens.
Fig. 7: Konstrukkarte von pSUN2/USP/rbcS/slrl263/ocs
Fragment "A" (674 bp) : Promotor des USP Gens aus Vicia faba
Fragment "B" (174 Bp) : Fragment kodierend für das rbcS
Transitpeptid
Fragment C (1413 bp) : offenes Leseraster von Tocen-2 Fragment D (219 Bp) : Terminationssignal des Octopin-
Synthase Gens.
Beispiele
Alle Chemikalien, wenn nicht anders erwähnt, stammen von den Firmen Fluka (Buchs) , Merck (Darmstadt) , Roth (Karlsruhe) , Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen) . Restriktionsenzyme, DNA- modifizierende Enzyme und Molekularbiologie-Kits wurden von den Firmen Amersham-Pharmacia (Freiburg) , Biometra (Göttingen) , Röche (Mannheim) , New England Biolabs (Schwalbach) , Novagen (Madison, Wisconsin, USA) , Perkin-Elmer (Weiterstadt) , Qiagen (Hilden) , Stratagen (Amsterdam, Niederlande) , Invitrogen (Karlsruhe) und Ambion (Cambridgeshire, United Kingdom) . Die verwendeten Reagenzien wurden entsprechend der Angaben des Herstellers eingesetzt .
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs- schritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektro- phorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al . (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al . (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74:5463- 5467) .
Beispiel 1: Allgemeine Verfahren
Die Pflanze Arabidopsis thaliana repräsentiert ein Mitglied der höheren Pflanzen (Samenpflanzen) . Diese Pflanze ist eng verwandt mit anderen Pflanzenarten aus der Familie der Cruciferen wie z.B. Brassica napus, aber auch mit anderen Pflanzenfamilien der Dikotyledonen. Aufgrund des hohen Grades an Homologie ihrer DNA-Sequenzen bzw. Polypeptidsequenzen kann Arabidopsis thaliana als Modellpflanze für andere Pflanzenarten eingesetzt werden.
a) Anzucht von Arabidopsis Pflanzen
Die Pflanzen werden entweder auf Murashige-Skoog Medium mit 0,5 % Saccharose (Ogas et al . (1997) Science 277:91-94) oder auf Erde gezogen (Focks & Benning (1998) Plant Physiol 118:91-101). Um einheitliche Keimungs- und Blühzeiten zu erreichen, werden die Samen nach Ausplattieren bzw. Ausstreuen auf Erde zwei Tage bei 4°C stratifiziert . Nach- der Blüte werden die Schoten markiert. Entsprechend der Markierungen werden dann Schoten mit einem Alter von 6 bis 20 Tagen nach der Blüte geerntet.
Anzucht von Synechocystis
Die Zellen von Synechocystis sp. PCC 6803 werden in BG11- Medium normalerweise autotroph kultiviert. Sie haben einen Durchmesser von 2,3 bis 2,5 °=m. Bei den hier geschilderten
Untersuchungen wurde der Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 Stamm aus der Sammlung von Prof. Dr. Peter Wölk und Prof. Dr. Lee Mclntosh (Plant Research Laboratory, Michigan State University, East Lansing, Michigan, USA) eingesetzt. Dieser ist Glukose-tolerant, d.h. er kann auch heterotroph im Dunkeln, mit nur wenigen Minuten schwacher Blaulicht- Beleuchtung pro Tag, wachsen. Diese Kulturbedingungen wurden von Anderson und Mclntosh (Anderson und Mclntosh (1991) J Bacteriol 173:2761-2767) entwickelt und "Light-activated heterotrophic growth" (LAHG) genannt. Damit ist es möglich, diese Cyanobakterien ohne laufende Photosynthese und damit ohne Produktion von Sauerstoff zu kultivieren.
BG 11 Kulturmedium für Synechocystis
Stammlösung 100 x BGH NaN03 1 , 76 M = 149 , , 58 g
MgS0 x 7 H20 30 , 4 mM = 7 , , 49 g CaCl2 x 2 H20 24 , 5 mM = 3 , , 6 g Zitronensäure 3 , 12 mM = 0 , , 6 g Na EDTA pH 8 0 , 279 mM = 0 , , 104 g
Die abgewogenen Substanzen werden in 900 ml H20 gelöst und mit 100 ml des Trace metal mix stock lOOOx auf 1000 ml auf- gefüllt. Diese gewonnene Lösung dient als Stammlösung.
Trace metal mix stock lOOOx:
H3B03 46,3 mM = 2,86 g/1
MnCl x 4 H20 4,15 mM = 1,81 g/1 ZnS04 x 7 H20 0,77 mM = 0.222 g/1
Na2Mo04 x 2 H20 1,61 mM = 0,39 g/1
CuS04 x 5 H20 0,32 mM = 0,079 g/1
Co(N03)2 x 6 H20 0,17 mM = 0,0494 g/1 Für 1 Liter BGH Kulturlösung werden folgende -Lösungen benötigt:
1. 10 ml der Stammlösung 100 x BG 11
2. 1 ml Na2C03 (189 mM) 3. 5 ml TES (I M, pH 8)
4. 1 ml K P0 (175 mM)
Während Lösung 2. und 3. steril filtriert werden sollten, muss Lösung 4 autoklaviert werden. Die gesamte BGH Kultur- lösung muß vor Gebrauch autoklaviert und anschließend mit 1 ml Eisen-Ammonium-Citrat (6 mg/ml) , das zuvor steril filtriert wurde, versetzt werden. Das Eisen-Ammonium-Citrat sollte auf keinen Fall autoklaviert werden. Für Agarplatten werden 1,5% (w/v) Bactoagar pro Liter BGH Medium zugesetzt.
Beispiel 2: Amplifikation und Klonierung von Tocen-2 aus Synechocystis spec. PCC 6803
Die DNA kodierend für Tocen-2 wurde mittels "Polymerase Chain Re- action" (PCR) aus Synechocystis spec. PCC 6803 gemäß der Methode nach Crispin A. Howitt (Howitt CA (1996) BioTechniques 21:32-34) unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (slrl263-5 ' ;
SEQ ID NO: 3) und eines antisense spezifischen Primers
(slrl263-3'; SEQ ID NO: 4) amplifiziert .
Primer slrl263-5': 5 ' -GGATCCATGCTTTCCCTGCTCACA-3 ' (SEQ ID NO: 3)
Primer slrl263-3': 5 ' -GTCGACCTAGCGAGTTCTCACTGT-3 ' (SEQ ID NO: 4)
Die PCR erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz in dem enthalten war:
5 μl einer Synechocystis spec. PCC 6803 Zellsuspension
0, 2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP 1 1,,5 5 mmMM Mg(OAc)2
5 μg Rinderserum-Albumin
40 p ol Oligonukleotidprimer slrl263-5'
40 pmol Oligonukleotidprimer slrl263-3'
15 μl 3,3X rTth DNA Polymerase XL Puffer (PE Applied Biosystems)
5U rTth DNA Polymerase XL (PE Applied Biosystems) Die PCR wurde unter folgenden Zyklus-Bedingungen durchgeführt :
Schritt 1 5 Minuten 94°C (Denaturierung)
Schritt 2 3 Sekunden 94°C
Schritt 3 : 1 Minute 52°C (Annealing) Schritt 4: 1 Minute 30 Sekunden 72°C (Elongation) 35 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4 Schritt 5: 10 Minuten 72°C (Post-Elongation) Schritt 6: 4°C (Warteschleife)
Das Amplifikat (1425 Basenpaare) wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert. Das Konstrukt hat die Bezeichnung pGEM-Teasy/ slrl263. Die Identität des erzeugten Amplikons wurde durch Sequenzierung unter Verwendung des T3- und des T7-Primers bestätigt (vgl. SEQ ID NO: 1). Fig. 1 stellt pGEM-Teasy/slrl263 dar, wobei "A" das für Tocen-2 kodierende DNA-Fragment (1413 Basenpaare) representiert.
Beispiel 3 : Erzeugung einer Tocen-2 Knock out Mutante
Ein DNA Konstrukt zur Erzeugung einer Deletionsmutante von Tocen-2 in Synechocystis spec. PCC 6803 wurde unter Anwendung von Standardklonierungstechniken erzeugt. Der Vektor pGEM-Teasy/ slrl263 wurde unter Verwendung des Restriktionsenzyms Mscl ver- daut. In diese mit stumpfen Enden vorliegende MscI-Schnittstelle des offenen Leseratsers von Tocen-2 wurde die Aminoglycosid- 3 'Phosphotransferase des Transposons Tn903 kloniert. Dazu wurde das Tn903 als EcoRI Fragment aus dem Vektor pUC4K (Vieira J und Messing J (1982) Gene 19:259-268) isoliert, die überstehenden Enden des Restriktionsverdaus nach Standardmethoden in glatte Enden überführt und in den Mscl geschnittenen Vektor pGEM-Teasy/ slrl263 ligiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation von E. coli Xll Blue Zellen verwendet. Transformanden wurden durch Verwendung von Kanamycin und Ampicillin selektioniert . Ein rekombinantes Plasmid (pGEM-Teasy/slrl263 : : tn903 ; siehe Fig. 2) wurde isoliert und zur Transformation von Synechocystis spec. PCC 6803 gemäß der Methode nach Williams (Williams (1987) Methods Enzymol 167:776-778) eingesetzt.
Die Kanamycin-Kasette des tn903 inserierte in pGEM-Teasy/slrl263 derart, dass die Transkription des Kanamycinresistenzgens des Tn903 in entgegengesetzter Richtung zur Transkription des offenen Leseratsers von Tocen-2 verläuft. In Fig. 2 beinhaltet Fragment A' (715 Basenpaare) den 5'-Bereich von Tocen-2, Fragment B das Transposon 903 (1286 Basenpaare) und Fragment 'A (703 Basenpaare) den 3λ-Bereich von Tocen-2.
5 Synechocystis spec. PCC 6803 Transformanden wurden auf Kanamycin haltigem (km) BG-11 Festmedium (Castenholz (1988) Methods in Enzymology Seite 68-93) bei 28_C und 30 omol Photonen* (m2*s) _1 selektioniert. Zwei unabhängige Knockout Mutanten konnten nach fünf Selektionsrunden (Passagen von Einzelkolonien auf frisches 10 BG-llkm Medium) erzeugt werden. Der vollständige Verlust des Tocen-2 Endogens bzw. der Austausch gegen die rekombinante Tocen-2 : : tn903 DNA wurde durch PCR Analysen bestätigt.
Beispiel 4: Tocopherolproduktion in Synechocystis spec. PCC 6803 15 Wildtypzellen und den Tocen-2 Knockout Mutanten
Die auf den BG-llkm Agarmedium kultivierten Zellen von jeweils acht unabhängigen Synechocystis spec. PCC 6803 Tocen-2 Knockout Mutanten sowie untransformierte Wildtypzellen (auf BGH Agar-
20 medium ohne Kanamycin) wurden zum Animpfen von Flüssigkulturen verwendet. Dazu wurden Zellen der Mutante bzw. des Wildtyps Synechocystis spec. PCC 6803 von Platte in jeweils 10 ml Flüssigkultur überführt. Diese Kulturen wurden bei 28°C und 30 μmol Photonen* (m2*s)_1 (30 μE) für ca. 3 Tage kultiviert. Nach
25 Bestimmung der OD73o der einzelnen Kulturen, wurde die OD73o aller Kulturen durch entsprechende Verdünnungen mit BG-11 (Wildtypen) bzw. BG-llkm (Mutanten) synchronisiert. Diese auf Zelldichte synchronisierten Kulturen wurden zum Animpfen von drei Kulturen der Mutante bzw. der Wildtypkontrolle verwendet. Die bio-
30 chemischen Analysen konnten somit unter Verwendung von jeweils drei unabhängig gewachsenen Kulturen einer Mutante und der entsprechenden Wildtypen durchgeführt werden. Die Kulturen wurden bis zu einer optischen Dichte von OD73o=0,3 angezogen.
35 Das Medium der Zellkultur wurde durch zweimalige Zentrifugation bei 14000 rpm in einer Eppendorf Tischzentrifuge entfernt. Der daran anschließende Aufschluss der Zellen und Extraktion der Tocopherole und Tocotrienole erfolgte durch zweimalige Inkubation im Eppendorfschüttler bei 30°C, lOOOrpm in 100% Methanol für
40 15 Minuten, wobei die jeweils erhaltenen Überstände vereinigt wurden. Weitere Inkubationsschritte ergaben keine weitere Freisetzung von Tocopherolen oder Tocotrienolen.
Um Oxidation zu vermeiden, wurden die erhaltenen Extrakte direkt 45 nach der Extraktion mit Hilfe einer Waters Allience 2690 HPLC- Anlage analysiert. Tocopherole und Tocotrienole wurden über eine Reverse Phase Säule (ProntoSil 200-3-C30, Bischoff) mit einer mobilen Phase von 100 % Methanol getrennt und anhand von Standard (Merck) identifiziert. Als Detektionssystem diente die Fluoreszenz der Substanzen (Anregung 295 nm, Emmision 320 nm) , die mit Hilfe eines Jasco Fluoreszensdetektors FP 920 nachgewiesen wurde .
Die Tocen-2 Knockout Mutanten zeigten überraschenderweise im Vergleich zu den Synechocystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen eine
Reduktion der Tocopherol- und Tocotrienolproduktion (Fig. 3).
Beispiel 5: Manipulation der Tocopherol-Biosynthese in Nicotiana tabacum Samsun NN, Arabidopsis thaliana und Brassica napus durch transgene Expression von Tocen-2
Es werden transgene Pflanzen erzeugt, die Tocen-2 zum einen unter Kontrolle des konstitutiven Promoters des Nitrilase-1 (nitl) Gens aus A. thaliana (GenBank Acc.-No.: Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand et al . (1996) Gene 170:197-200) und zum anderen unter Kontrolle des samenspezifischen Promotors des USP (unknown seed protein) Gens aus Vicia faba (Bäumlein et. al . (1991) Mol Gen Genet 225: 459-467) exprimieren. Darüber hinaus wird Tocen-2 als Fusionsprotein mit dem Transitpeptid des rbcS- Proteins (Guerineau et al . (1988) Nucl Acid Res 16: 11380) sowohl konstitutiv als auch samenspezifisch exprimiert. Als Expressions- vektor dienen Derivate des pSUN-Vektors (WO 02/00900) .
Für die konstitutive Expression wurde der Vektor pSUN2 unter
Anwendung von Standardmethoden so verändert, dass der ocs-
Ter inator (Gielen et al . (1984) EMBO J 3:835-846) als Sall-Pacl- ocs-Hindlll Fragment (Sequenz ID No: 5) eingebracht wird. Durch
Einführung eines Linkers wird zusätzlich eine Swal Schnittstelle in den Polylinker eingeführt (SEQ ID No : 6 and SEQ ID No: 7) .
Das resultierende Plasmid wird mit pSUN2-l bezeichnet (Sequenz
ID NO: 8) .
Für die Expression als Fusionsprotein mit dem rbcS-Transitpeptid wird das DNA-Fragment kodierend für das rbcS-Transitpeptid als Sacl-Swal-Fragment amplifiziert (Sequenz ID No: 9) und in den pSUN2-l eingeführt. Der Vektor wird als pSUN2-2 bezeichnet (Sequenz ID NO: 10) .
Zur Expression von Tocen-2 unter konstitutiver Kontrolle wird der ORF als Swal-Smal-Fragment unter Verwendung von Standardmethoden mit Hilfe der Primer 1263exl-5 und 1263exl-3 % (SEQ ID No. 11 und SEQ ID No. 12) amplifiziert. Das entstehende 462 bp-Fragment wird in den pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) nach Angaben des Herstellers kloniert und mit Hilfe des T3- und T7-Primers sequenziert.
Ein korrekter Klon wird mit Swal und Smal geschnitten und unter Anwendung von Standardmethoden in einen Swal geschnittenenen pSUN2-l ligiert. In das resultierende Konstrukt, in das slrl263 in der richtigen Orientierung inserierte und das mit Ecll36II geschnitten wird, wird der Nitrilase-Promoter als Xhol-Fragment (SEQ ID No: 13), dessen überhängende Enden mit Klenow-Polymerase nach Standardmethoden aufgefüllt werden, kloniert. Dieses Plasmid wird mit pSUN2/NitP/slrl263/ocs bezeichnet (SEQ ID No: 14) und zur Erzeugung transgener Pflanzen verwendet (vgl. Fig. 4).
Zur Konstruktion eines Plasmides, das Tocen-2 als Fusionsprotein mit dem Transitpeptid des rbcS-Proteins unter Kontrolle des konstitutiven Promoters NitP exprimiert, wird pSUN2-2 mit Swal geschnitten. Der so geschnittene Vektor wird mit dem Tocen-2 Fragment ligiert, das nach Verdau mit Swal und Smal aus pCR4Blunt-TOP0/slrl263 isoliert wird. In das resultierende Plasmid, das den ORF slrl263 in der richtigen Orientierung enthält und das mit Ecll36H geschnitten wird, wird der Nitrilase- Promoter (SEQ ID NO: 13) als Xhol-Fragment, dessen überhängende Enden mit Klenow-Polymerase nach Standardmethoden aufgefüllt werden, ligiert. Diese Klonierung erlaubt die Expression eines Fusionsproteins, das das Transitpeptid des rbcS-Proteins und Tocen-2 enthält (vgl. Fig. 5, SEQ ID No. 15).
Zur Erzeugung eines Plasmides, welches die samenspezifische Expression von Tocen-2 in Pflanzen ermöglicht, wird der samen- spezifiche Promotor des USP Gens aus Vici faba verwendet, der als EcoRI-Ncol-Fragment in einem pUC-Derivat vorliegt (SEQ ID NO: 16) .
Für die Klonierung unter Kontrolle des USP-Promoters wird das offene Leseraster von Tocen-2 unter Verwendung von Standard-PCR- Methoden so amplifiziert, dass am 5 '-Ende eine Bbsl-Schnittstelle und am 3 '-Ende eine EcoRV-Schnittstelle generiert werden. Dazu werden nachfolgende Oligonukleotidprimer verwendet:
slrl2636x2-5' : (SEQ ID NO: 17) und
Slrl263ex2-3 ' : (SEQ ID No: 18)
Das Amplifikat wird in pCR4Blunt-T0P0 kloniert und sequenziert. Das PCR-Produkt wird als Bbεl-EcoRV-Fragment in den mit Ncol (überhängende Enden kompatibel mit 5λ -Überhang des PCR-Produktes ) und EcoRV geschnittenen Vektor ligiert. Das Expressionskonstrukt wird als Pmel-Hindlll-Fragment in den mit EcoRV und Hindlll geschnittenen pSUN2 ligiert. Das resultierende Plasmid heißt pSun2-USP-slrl263-catT (vgl. Fig.6, SEQ ID NO: 19).
Für die Konstruktion eines Plasmides, das die samenspezifische Expression als Fusionsprotein mit dem rbcS Transitpeptid erlaubt, wird das rbcS-Fragment zusammen mit dem ocs-Terminator als Ncol- HindlII-Fragment (SEQ ID No: 20) aus pSUN2-2 amplifiziert und in das pUC-Derivat kloniert, der den USP Promoter enthält. Promoter, rbcS und ocs werden als EcoRI-HindHI-Fragment in den mit EcoRI und Hindlll geschnittenen pSUN2 kloniert. In diesen Expressions- vektor wird Tocen-2 als Swal-Smal-Fragment kloniert. Das resultierende Plasmid heißt pSUN2/USP/rbcS/slrl263/ocs (Fig. 7, SEQ ID No: 21) .
Beispiel 6: Herstellung transgener A. thaliana Pflanzen
Wildtyp A . thaliana Pflanzen (Columbia) werden mit dem Agra- bacterium tumefaciens Stamm (EHA105) auf Grundlage einer modifizierten Methode (Steve Clough und Andrew Bent (1998) Plant J 16(6) :735- 743) der Vacuum Infiltrationsmethode nach Bechtold et al. (Bechtold N et al . (1993) CRAcad Sei Paris 1144 (2) :204-212) transformiert .
Die verwendeten A . tumefaciens Zellen werden im Vorfeld mit den Plasmiden pSUN2/NitP/slrl263/ocs (SEQ ID NO: 14), pSUN2/NitP/ rbcS/slrl263/ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2/USP/slrl263/catT
(SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/slrl263/ocs (SEQ ID NO: 21) transformiert .
Samen der Agrobacterium-transformierten Primärtransformanden werden auf Grundlage der Antibiotikaresistenz selektioniert . Antibiotika resistente Keimlinge werden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet.
Beispiel 7: Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen
Die Herstellung transgener Raps Pflanzen orientiert sich an einem Protokoll von Bade JB und Damm B (in Gene Transfer to Plants, Potrykus , I . und Spangenberg, G . , eds , Springer Lab Manual , Springer Verlag, 1995, 30-38) , in welchem auch die Zusammen- setzung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist. Die Transformationen erfolgen mit den Agrobacterium. tumefaciens Stämmen EHA105 bzw. GV3101. Zur Transformation werden die Plasmide pSUN2/NitP/slrl263/ocs (SEQ ID NO: 14), pSUN2/NitP/ rbcS/slrl263/ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2/USP/slrl263/catT (SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/slrl263/ocs (SEQ ID NO: 21) verwendet .
Samen von Brassica napus var. Westar werden mit 70% Ethanol (v/v) oberflächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55?C in Wasser ge- waschen, in l%iger Hypochlorit-Lösung (25 % v/v Teepol, 0,1 % v/v Tween 20) für 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen werden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) werden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate werden 30 Minuten mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einem 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallusinduktions- medium wurden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.
Vom den einzelnen mit den Plasmiden pSUN2/NitP/slrl263/ocs (SEQ ID NO: 14), pSUN2/NitP/rbcS/slrl263/ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2/USP/slrl263/catT (SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/ slrl263/ocs (SEQ ID NO: 21) transformierten Agrobacterien Stämmen wird jeweils eine Übernachtkultur bei 29°C in Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/1) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer OD600 von 0,4 bis 0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wird das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wird durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine ODßoo von 0 3 eingestellt.
Aus den Raps-Explanten wird das Kallus-Induktionsmedium mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agro- bacterien-Suspension wird entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus-Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wird für 24 h auf einem Rotiationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co-Kultivierung wird durch Wegnahme des Kallus- Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wird in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.
Zur Regeneration werden jeweils 20 bis 30 Explante in 90 mm Petrischalen überführt, welche 25 ml Spross-Induktionsmedium mit Kanamycin enthalten. Die Petrischalen werden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage werden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Spross-Induktionsmedium überführt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen werden wie von Bade JB und Damm B (in Gene Transfer to Plants, Potrykus , I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt .
Beispiel 8 : Herstellung transgener Nicotiana tabacum Pflanzen
10 ml YEB-Medium mit Antibiotikum (5 g/1 Rinder-Extrakt, 1 g/1 Hefe-Extrakt, 5 g/1 Pepton, 5 g/1 Saccharose und 2 mM MgS0 .) werden mit einer Kolonie der einzelnen mit den Plasmiden pSUN2/NitP/slrl263/ocs (SEQ ID NO: 14), pSUN2/NitP/rbcS/slrl263/ ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2/USP/slrl263/catT (SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/slrl263/ocs (SEQ ID NO: 21) transformierten Agrobacterium tumefaciens Stämme beimpft und über Nacht bei 28°C kultiviert. Die Zellen werden 20 min bei 4°C, 3500 U/min in einer Tischzentrifuge pelletiert und danach in frischem YEB-Medium ohne Antibiotika unter sterilen Bedingungen resuspendiert. Die Zellsuspension wird für die Transformation eingesetzt.
Die Wildtyp-Pflanzen aus Sterilkultur werden durch vegetative Replikation erhalten. Dazu wird nur die Spitze der Pflanze abgeschnitten und auf frisches 2MS-Medium in ein steriles Einweckglas überführt. Vom Rest der Pflanze werden die Haare auf der Blattoberseite und die Mittelrippen der Blätter entfernt. Die Blätter werden mit einer Rasierklinge in etwa 1 cm2 große Stücke geschnitten. Die Agrobakterienkultur wird in eine kleine Petri- schale überführt (Durchmesser 2 cm) . Die Blattstücke werden kurz durch diese Lösung gezogen und mit der Blattunterseite auf 2MS- Medium in Petrischalen (Durchmesser 9 cm) gelegt, so dass sie das Medium berührten. Nach zwei Tagen im Dunkeln bei 25°C werden die Explantate auf Platten mit Kallusinduktionsmedium überführt und in der Klimakammer auf 28°C temperiert. Das Medium muß alle 7 bis 10 Tage gewechselt werden. Sobald sich Kalli bildeten, werden die Explantate in sterile Einweckgläser auf Sprossinduktionsmedium mit Claforan (0,6% BiTec-Agar (g/v) , 2,0 mg/1 Zeatinribose, 0,02 mg/1 Naphthylessigsäure, 0,02 mg/1 Gibberelinsäure, 0,25 g/ml Claforan, 1,6% Glukose (g/v) und 50 mg/1 Kanamycin) überführt. Nach etwa einem Monat tritt Organogenese. ein und die gebildeten Sprosse können abgeschnitten werden. Die Kultivierung der Sprosse wird auf 2MS-Medium mit Claforan und Selektionsmarker durchgeführt. Sobald sich ein kräftiger Wurzelballen gebildet hat, können die Pflanzen in Pikiererde getopft werden.
Beispiel 8: Charakterisierung der transgenen Pflanzen
Um zu bestätigen, dass durch die Expression von Tocen-2 die Vitamin E Biosynthese in den transgenen Pflanzen beeinflusst wird, werden die Tocopherol- und Tocotrienol-Gehalte in Blätter und Samen der mit den beschriebenen Konstrukten transformierten Pflanzen (Arabidopsis. thaliana, Brassica napus und Nicotiana tabacum) analysiert. Dazu werden die transgenen Pflanzen im Gewächshaus kultiviert und Pflanzen die das Gen kodierend für
Tocen-2 exprimieren auf Northern-Ebene identifiziert. In Blättern und Samen dieser Pflanzen wird der Tocopherolgehalt und der Toco- trienolgehalt ermittelt. In allen Fällen ist die Tocopherol- bzw. Tocotrienol-Konzentration im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen erhöht.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in einem pflanz- liehen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder
Vermehrungsgut desselben, umfassend
a) transgene Expression eines Proteins mit der SEQ ID NO: 2 oder eines funktioneilen Äquivalentes desselben mit einer Identität von mindestens 40 % zu der Sequenz mit der SEQ ID NO: 2, und
b) Auswahl von pflanzlichen Organismen, bei denen - im Unterschied oder Vergleich zur Ausgangsorganismus - der Vitamin E-Gehalt in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben erhöht ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das funktionelle Äquivalent durch eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27 beschrieben ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , wobei die Pflanze eine Ölpflanze ist.
4. Transgenes Expressionskonstrukt umfassend unter Kontrolle eines in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben funktioneilen Promotors eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Protein mit der SEQ ID NO: 2 oder ein funktionelles Äquivalent desselben mit einer Identität von mindestens 40 % zu der Sequenz mit der SEQ ID NO: 2.
5. Transgenes Expressionskonstrukt nach Anspruch 4, wobei das funktionelle Äquivalent durch eine Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 23, 25 oder 27 beschrieben ist.
Sequ + Zeichn.
6. Transgenes Expressionskonstrukt nach Anspruch 4. oder 5, wobei die Nukleinsäuresequenz beschrieben ist durch
a) eine Sequenz mit der SEQ ID NO: 1, 22, 24 oder 26 oder
b) eine Sequenz, die sich entsprechend dem degenerierten genetischen Code von einer Sequenz mit der SEQ ID NO: 1, 22, 24 oder 26 ableitet, oder
c) eine Sequenz, die eine Identität von mindestens 40 % zu der Sequenz mit der SEQ ID NO: 1, 22, 24 oder 26 aufweist.
7. Transgenes Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei der Promotor ein konstitutiver oder ein samenspezifischer Promotor ist.
8. Transgener Expressionsvektor enthaltend ein transgenes Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 4 bis 7.
9. Transgener pflanzlicher Organismus oder Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben, enthaltend ein transgenes Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 4 bis 7 oder einen transgenen Expressionsvektor nach Anspruch 8.
10. Transgener pflanzlicher Organismus nach Anspruch 9, wobei der pflanzliche Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe der Ölpflanzen bestehend aus Borago officinalis, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Cannabis sativa, Carthamus tinctorius, Cocos nucifera, Crambe abyssinica, Cuphea Arten, Elaeis guineensis, Ekeis oleiferu, Glycine max, Gossypium hirsitum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Helianthus annus, Linum usitatissimum, Oenothera biennis, Ozea europea, Oryza sativa, Ricinus communis, Sesamum indicum, Triticum Arten, Zea maize, Walnuss und Mandel .
11. Verwendung eines transgenen pflanzlichen Organismus oder Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben nach einem der Ansprüche 9 oder 10 zur Herstellung von Vitamin E, Ölen, Fetten, freien Fettsäuren oder Derivaten der vorgenannten.
PCT/EP2003/007358 2002-07-17 2003-07-09 Transgene expressionskonstrukte und verfahren zum erhöhen des vitamin e-gehaltes in pflanzlichen organismen WO2004007733A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003249996A AU2003249996A1 (en) 2002-07-17 2003-07-09 Transgenic expression constructs and methods for increasing the vitamin e content in plant organisms

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10232483.2 2002-07-17
DE2002132483 DE10232483A1 (de) 2002-07-17 2002-07-17 Transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004007733A1 true WO2004007733A1 (de) 2004-01-22

Family

ID=30010134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2003/007358 WO2004007733A1 (de) 2002-07-17 2003-07-09 Transgene expressionskonstrukte und verfahren zum erhöhen des vitamin e-gehaltes in pflanzlichen organismen

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU2003249996A1 (de)
DE (1) DE10232483A1 (de)
WO (1) WO2004007733A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011135393A1 (es) 2010-04-27 2011-11-03 Universidad Manuela Beltran Vacuna biologica autologa contra el cancer

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19903493A1 (de) * 1999-01-29 2000-08-03 Basf Ag Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine Transketolase in Pflanzen
DE10009002A1 (de) * 2000-02-25 2001-08-30 Sungene Gmbh & Co Kgaa Homogentisatphytyltransferase
WO2001079472A2 (en) * 2000-04-14 2001-10-25 Calgene Llc Nucleic acid sequences to proteins involved in tocopherol synthesis
WO2002000901A1 (de) * 2000-06-29 2002-01-03 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Veränderung des gehalts an feinchemikalien in organismen durch genetische veränderung des shikimatweges
WO2002033060A2 (en) * 2000-10-14 2002-04-25 Calgene Llc Nucleic acid sequences to proteins involved in tocopherol synthesis

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19903493A1 (de) * 1999-01-29 2000-08-03 Basf Ag Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine Transketolase in Pflanzen
DE10009002A1 (de) * 2000-02-25 2001-08-30 Sungene Gmbh & Co Kgaa Homogentisatphytyltransferase
WO2001079472A2 (en) * 2000-04-14 2001-10-25 Calgene Llc Nucleic acid sequences to proteins involved in tocopherol synthesis
WO2002000901A1 (de) * 2000-06-29 2002-01-03 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Veränderung des gehalts an feinchemikalien in organismen durch genetische veränderung des shikimatweges
WO2002033060A2 (en) * 2000-10-14 2002-04-25 Calgene Llc Nucleic acid sequences to proteins involved in tocopherol synthesis

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE TREMBL [online] 1 February 1997 (1997-02-01), KANEKO T. ET AL., XP002262222, retrieved from EBI Database accession no. P74540 *
DATABASE TREMBL [online] 1 February 1997 (1997-02-01), KANEKO T. ET AL., XP002262223, retrieved from EBI Database accession no. P73803 *
DATABASE TREMBL [online] 1 March 2002 (2002-03-01), KANEKO T. ET AL, XP002262225, retrieved from EBI Database accession no. Q8YX47 *
DATABASE TREMBL [online] 1 March 2002 (2002-03-01), KANEKO T. ET AL., XP002262224, retrieved from EBI Database accession no. Q8YZM1 *
KANEKO T ET AL: "Complete genomic sequence of the filamentous nitrogen-fixing cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120.", DNA RESEARCH: AN INTERNATIONAL JOURNAL FOR RAPID PUBLICATION OF REPORTS ON GENES AND GENOMES. JAPAN 31 OCT 2001, vol. 8, no. 5, Q8YX47, 31 October 2001 (2001-10-31), pages 205 - 213;227 - 253, XP002262221, ISSN: 1340-2838, Retrieved from the Internet <URL:EBI> *
KANEKO T ET AL: "Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions", DNA RESEARCH, UNIVERSAL ACADEMY PRESS, JP, vol. 3, no. 3, P73803, 1996, pages 109 - 136, XP002084893, ISSN: 1340-2838, Retrieved from the Internet <URL:EBI> *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011135393A1 (es) 2010-04-27 2011-11-03 Universidad Manuela Beltran Vacuna biologica autologa contra el cancer

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003249996A1 (en) 2004-02-02
DE10232483A1 (de) 2004-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1487979B1 (de) Konstrukte und verfahren zur regulation der genexpression
EP1506289B1 (de) Verfahren zum erhöhen des ölgehaltes in pflanzen
WO2003074716A2 (de) Verfahren zur herstellung von ungesättigten fettsäuren
EP1294913B1 (de) Veränderung des gehalts an feinchemikalien in organismen durch genetische veränderung des shikimatweges
WO2001062781A2 (de) Homogentisatphytyltransferase
DE19909637A1 (de) Verfahren zur Verbesserung des agronomischen Wertes und der ernährungsphysiologischen Eigenschaften von Pflanzen
DE10046462A1 (de) Verbesserte Verfahren zur Vitamin E Biosynthese
EP1200598A2 (de) Verfahren zur herstellung transgener pflanzen mit erhöhtem tocopherol-gehalt
WO2004007733A1 (de) Transgene expressionskonstrukte und verfahren zum erhöhen des vitamin e-gehaltes in pflanzlichen organismen
EP1537218B1 (de) Transgene expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in nicht-reproduktiven blütengeweben von pflanzen
WO2004007731A1 (de) Transgene expressionskonstrukte und verfahren zum erhöhen des vitamin e-gehaltes in pflanzlichen organismen
JPH09173069A (ja) ４−クマル酸：補酵素ａリガーゼ遺伝子、及び該遺伝子を用いた植物中のリグニンの低減方法
WO2003104463A1 (de) Transgene expressionskonstrukte und verfahren zum erhöhen des vitamin e-gehaltes in pflanzlichen organismen
DE10231588A1 (de) Transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen
DE10225593A1 (de) Transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen
DE10225066A1 (de) Neue Expressionssysteme für Pflanzen
WO2003077643A2 (de) Verfahren zum erhöhen des ölgehaltes in pflanzen indem die menge eines oder mehrerer speicherproteine verringert wird
WO2003080844A2 (de) Erhöhung des vitamin-e-gehalts in organismen durch erhöhung der 2-methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase-aktivität
WO2004027069A1 (de) Transgene expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in der pflanzlichen blüte
EP1576164A2 (de) VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON TRANSGENEN PFLANZEN MIT ERHöHT EM VITAMIN E-GEHALT DURCH VER äNDERUNG DES SERIN-ACETYLTRANSF ERASE-GEHALTS
DE10220753A1 (de) Verfahren zum Erhöhen des Ölgehaltes in Pflanzen
DE10226413A1 (de) Verfahren zum Erhöhen des Ölgehaltes in Pflanzen
DE10030647A1 (de) Veränderung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen durch genetische Veränderung des Shikimatweges
DE10064454A1 (de) Veränderung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen durch genetische Veränderung des Shikimatweges
EP1554388A1 (de) Transgene expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in der pflanzlichen blüte

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP