EP1180149A2 - Überexpression einer dna-sequenz codierend für eine 1-desoxy-d-xylulose-5-phosphat reduktoisomerase in pflanzen - Google Patents

Überexpression einer dna-sequenz codierend für eine 1-desoxy-d-xylulose-5-phosphat reduktoisomerase in pflanzen

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EP1180149A2
EP1180149A2 EP00922642A EP00922642A EP1180149A2 EP 1180149 A2 EP1180149 A2 EP 1180149A2 EP 00922642 A EP00922642 A EP 00922642A EP 00922642 A EP00922642 A EP 00922642A EP 1180149 A2 EP1180149 A2 EP 1180149A2
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EP
European Patent Office
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plants
plant
dxpri
dna sequence
gene
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00922642A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hartmut Lichtenthaler
Jörg SCHWENDER
Andreas Reindl
Karin Herbers
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
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    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis

Definitions

  • the invention relates to a DNA coding for a polypeptide with l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXPRI) activity of plant origin.
  • DXPRI l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase
  • the invention relates to the use of DNA sequences coding for a polypeptide
  • DXPRI activity of plant origin for the production of plants with an increased content of tocopherols, carotenoids, vitamin K, chlorophylls and polyterpenes in particular the use of the DNA sequence SEQ-ID No. 1 or with this hybridizing DNA sequences, a process for the production of plants with an increased content of tocopherols, carotenoids, vitamin K, chlorophylls and polyterpenes, and the plant itself prepared in this way.
  • the eight naturally occurring compounds with vitamin E activity are derivatives of 6-chromanol (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, vitamin E).
  • the first group (la-d) is derived from tocopherol, the second group consists of derivatives of tocotrienol (2ad):
  • ⁇ -Tocopherol is of great economic importance.
  • the genetic engineering process for example isolating the essential biosynthesis genes coding for the tocopherol synthesis performance and transferring them in crop plants in a targeted manner, is superior to the classic breeding method. This method assumes that biosynthesis and its regulation are known and that genes that influence biosynthesis performance are identified.
  • Isoprenoids or terpenoids consist of different classes of lipid-soluble molecules and are partially or completely formed from Cs-isoprene units.
  • Pure prenyl lipids e.g. carotenoids
  • mixed prenyl lipids e.g. chlorophylls, tocopherols and vitamin K
  • isoprenoid side chain that is linked to an aromatic nucleus.
  • the starting point for the biosynthesis of prenyl lipids are 3 x acetyl-CoA units, which via ß-hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) and mevalonate into the starting isoprene unit (C5), the isopentenyl pyrophosphate (IPP). It has recently been shown by in vivo feeding experiments with C 13 that in various eubacteria, green algae and plant chloroplasts a Mevalonate-independent path to the formation of IPP is followed (Figure 1).
  • Hydroxyethylthiamine which is formed by the decarboxylation of pyruvate, and glyceraldehyde-3-phosphate (3-GAP) are converted into a "transketolase” mediated by 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DOXS) "Reaction first converted to l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate (Lange et al, 1998; Schwender et al, 1997; Arigoni et al, 1997; Lichtenthaler et al, 1997; Sprenger et al, 1997).
  • DOXS 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase
  • the mevalonate-independent route is localized plastidically and leads primarily to the formation of carotenoids and plastidic prenyl lipids (Schwender et al, 1997; Arigoni et al, 1997).
  • IPP is in equilibrium with its isomer, dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP).
  • DMAPP dimethylallyl pyrophosphate
  • a condensation of IPP with DMAPP in head-tail attachment gives the monoterpene (C10) geranyl pyrophosphate (GPP).
  • GPP monoterpene
  • IPP units leads to the sesquiterpene (C15) farnesy pyrophosphate (FPP) and to the diterpene (C20) geranyl-geranyl pyrophosphate (GGPP). Linking two GGPP molecules leads to the formation of the C40 precursors for carotenoids.
  • the isoprene side chain of various lengths is connected to non-isoprene rings, such as a porphyrin ring in chlorophyll a and b.
  • the chlorophylls and phylloquinones contain a C20 phytyl chain in which only the first isoprene unit contains a double bond.
  • GGPP is transformed by geranylgeranyl pyrophosphate oxidoreductase (GGPPOR) into phytyl pyrophosphate (PPP), the starting material for the further formation of tocopherols.
  • the ring structures of the mixed prenyl lipids that lead to the formation of vitamins E and K are quinones, the starting metabolites of which come from the Shikimate pathway.
  • the aromatic amino acids phenylalanine and tyrosine are converted into hydroxyphenyl pyruvate, which is converted into homo- gentisic acid is transferred.
  • the chorismat is on the one hand
  • phenylalanine ammonium lyase catalyzes the breakdown of phenylalanine, i.e. it removes it from phenylpropanoid biosynthesis (BHencee et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 91 (16): 7608-7612 (1994); Howles et al., Plant Physiol. 112, 1617-1624 (1996)).
  • the object of the present invention was to develop a transgenic plant with an increased content of tocopherols, vitamin K, carotenoids, chlorophylls and polyterpenes.
  • the object was surprisingly achieved by overexpressing an 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXPRI) gene in the plants.
  • DXPRI 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase
  • DXPRI 2-C-methyl-D-erythritol-4-P
  • the activity of DXPRI in transgenic plants was increased by overexpressing the DXPRI gene from Arabidopsis thaliana. In principle, this can also be achieved by expressing homologous or heterologous DXPRI genes 5.
  • a nucleotide sequence coding for a DXPRI has been described from E. coli (accession number AB 013300; Kuzuyama et al., 1998; Takahashi et al., 1998).
  • a plant DXPRI gene (Fig. 2, 10 SEQ-ID No. 1) from Arabidopsis thaliana is described for the first time and is increasingly expressed in transgenic plants.
  • the DXPRI nucleotide sequence from Arabidopsis thaliana is preceded by a transit signal sequence (Fig. 3, Fig. 4).
  • Fragment A (529 bp) in Figure 4 contains the 35S-15 promoter of the Cauliflower Mosaic Virus (nucleotides 6909 to 7437 of the Cauliflower Mosaic Virus).
  • Fragment B (259 bp) contains the transit peptide of the transketolase.
  • Fragment E contains the DXPRI gene.
  • Fragment D (192 bp) contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the Ti plasmid pTIACH5 (Gielen et al., 20 1984) for transcription termination.
  • a DNA sequence which codes for a DXPRI gene which is identified by SEQ-ID No. 1 hybridizes and that comes from other organisms or from other plants.
  • the transgenic plants are produced by transforming the plants with a construct containing the DXPRI gene.
  • Tobacco and rapeseed were used as model plants for the production of tocopherols, vitamin K, carotenoids, chlorophylls and polyterpenes.
  • Fragment A (529 bp) in Figure 5 contains the 35S promoter of the Cauliflower mosaic virus (nucleotides 6909 bis
  • Fragment B (259 bp) contains the transit peptide of transketolase ( Figure 3).
  • Fragment E contains the DXPRI gene in antisense orientation.
  • Fragment D (192 bp) contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the Ti plasmid pTIACH5 (Gielen et al., 1984)
  • the invention relates to the use of the DNA sequence SEQ-ID No. 1 from Arabidopsis thaliana, which code for a DXPRI or its functional equivalents, for producing a plant with an increased content of tocopherols, carotenoids, vitamin K, chlorophylls and polyterpenes.
  • the nucleic acid sequence can e.g. be a DNA or cDNA sequence. Coding sequences suitable for insertion into an expression cassette are, for example, those which code for a DXPRI and which give the host the ability to overproduce tocopherols, carotenoids, vitamin K, chlorophylls and polyterpenes.
  • the expression cassettes also contain regulatory nucleic acid sequences which control the expression of the coding sequence in the host cell.
  • an expression cassette comprises upstream, i.e. at the 5 'end of the coding sequence, a promoter and downstream, i.e. at the 3 'end, a polyadenylation signal and optionally further regulatory elements which are operatively linked to the intervening coding sequence for the DXPRI gene.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended when expressing the coding sequence.
  • sequences preferred but not limited to the operative linkage are targeting sequences to ensure subcellular localization in the apoplast, in the vacuole, in plastids, in the mitochondrion, in the endoplasmic reticulum (ER), in the cell nucleus, in oil cells or other compartments and translation enhancers such as the 5 'guiding sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).
  • the plant expression cassette can be installed in the tobacco transformation vector pBinAR-Hyg.
  • Fig. 6 shows the tobacco transformation vectors pBinAR-Hyg with 35S promoter (A) or pBinAR-Hyg with seed-specific promoter Phaseolin 796 (B):
  • any promoter which can control the expression of foreign genes in plants is suitable as promoters of the expression cassette.
  • a plant promoter or a plant virus-derived promoter is preferably used.
  • the CaMV 35S promoter from the cauliflower mosaic virus is particularly preferred (Franck et al., Cell 21 (1980),
  • this promoter contains different recognition sequences for transcriptional effectors, which in their entirety lead to permanent and constitutive expression of the introduced gene (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202).
  • the expression cassette can also contain a chemically inducible promoter, by means of which the expression of the exogenous DXPRI gene in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • a chemically inducible promoter by means of which the expression of the exogenous DXPRI gene in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • promoters as e.g. the PRPl promoter (Ward
  • 25 ethanol or cyclohexanone inducible (WO 93/21334) promoter can include be used.
  • promoters are particularly preferred which ensure expression in tissues or parts of plants in which
  • a foreign protein was able to stably express up to 0.67% of the total soluble seed protein in the seeds of transgenic tobacco plants.
  • the expression cassette can therefore, for example, be a seed-specific promoter (preferably the phaseolin promoter (US 5504200), the USP- (Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) or LEB4 promoter (Fiedler and Conrad.
  • An expression cassette is produced by fusing a suitable promoter with a suitable DXPRI-DNA sequence and preferably a DNA inserted between the promoter and DXPRI-DNA sequence, which codes for a chloroplast-specific transit peptide, and a polyadenylation signal according to common recombination and cloning techniques, as described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J.
  • Sequences are particularly preferred which ensure targeting in the apoplasts, in plastids, in the vacuole, in the mochondrium, in the endoplasmic reticulum (ER) or by a lack of corresponding operative sequences to ensure that they remain in the compartment of formation, the cytosol ( Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423). Localization in the ER has proven to be particularly beneficial for the amount of protein accumulation in transgenic plants (Schouten et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792).
  • Transit peptides are preferred for the chloroplasts, which are cleaved enzymatically from the DXPRI part after translocation of the DXPRI gene into the chloroplasts.
  • Particularly preferred is the transit peptide derived from the plastid DXPRI or a functional equivalent of this transit peptide (e.g. the Rubisco small subunit transit peptide or the Ferredoxin NADP oxidoreductase).
  • DNA sequences from three cassettes of the plastid transit peptide of potato plastid transketolase in three reading frames are particularly preferred as Kpnl / BamHI fragments with an ATG codon in the Ncol interface:
  • the inserted nucleotide sequence coding for a DXPRI can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components, as well as consist of different heterologous DXPRI gene sections of different organisms.
  • synthetic nucleotide sequences are generated with codons that are preferred by plants. These codons preferred by plants can be determined from codons with the highest protein frequency, which are expressed in most interesting plant species.
  • various DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which expediently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the promoter and terminator regions can expediently be provided in the transcription direction with a linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6, restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp within the regulatory ranges.
  • the promoter can be native or homologous as well as foreign or heterologous to the host plant.
  • the expression cassette contains in the 5 '-3' transcription direction the promoter, a DNA sequence which codes for a DXPRI gene and a region for the transcriptional termination. Different termination areas are interchangeable.
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) or functional equivalents.
  • An expression cassette can contain, for example, a constitutive promoter (preferably the CaMV 35 S promoter), the LeB4 signal peptide, the gene to be expressed and the ER retention signal.
  • a constitutive promoter preferably the CaMV 35 S promoter
  • the amino acid sequence KDEL lysine, aspartic acid, glutamic acid, leucine
  • KDEL lysine, aspartic acid, glutamic acid, leucine
  • the fused expression cassette which codes for a DXPRI gene, is preferably cloned into a vector, for example pBin19, which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens.
  • Agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as, for example, tobacco plants, for example by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • the transformation of plants by agrobacteria is known, inter alia, from FF White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38. From the transformed cells of the wounded leaves or leaf pieces, transgenic plants can be regenerated in a known manner which contain a gene integrated in the expression cassette for the expression of a DXPRI genes included.
  • an expression cassette is inserted as an insert into a recombinant vector whose vector DNA contains additional functional regulatory signals, for example sequences for replication or integration.
  • additional functional regulatory signals for example sequences for replication or integration.
  • Suitable vectors are inter alia in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Chap. 6/7, pp. 71-119 (1993).
  • the expression cassettes can be cloned into suitable vectors that allow their proliferation, for example in E. coli.
  • suitable cloning vectors include pBR332, pUC series, M13mp series and pACYC184.
  • Binary vectors which can replicate both in E. coli and in agrobacteria are particularly suitable.
  • Another object of the invention relates to the use of an expression cassette containing DNA sequences SEQ-ID No. 1 or hybridizing with these DNA sequences for transforming plants, cells, tissues or parts of plants.
  • the aim of the use is preferably to increase the content of tocopherols, vitamin K, carotenoids, chlorophylls and polyterpenes of the plant.
  • the expression can take place specifically in the leaves, in the seeds or in other parts of the plant.
  • Such transgenic plants, their reproductive material and their plant cells, tissue or parts are a further subject of the present invention.
  • the expression cassette can also be used to transform bacteria, cyanobacteria, yeast, filamentous fungi and algae with the aim of increasing the content of tocopherols, vitamin K, carotenoids, chlorophyll and polyterpenes.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • the methods described for the transformation and regeneration of plants from plant tissues or plant cells become transient or stable Transformation used. Suitable methods are protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene cannon - the so-called particle bombardment method, electroporation, the incubation of 5 dry embryos in DNA-containing solution, microinjection and the gene transfer mediated by Agrobacterium .
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, published by SD Kung and R. Wu, Academic
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res.
  • Agrobacteria transformed with an expression cassette can also be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as cereals, corn, oats, soybeans,
  • 20 rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • Functionally equivalent sequences which code for a DXPRI gene are those sequences which, despite the differing nucleotide sequence, still have the desired functions. Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the
  • a functional equivalent is understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of an originally isolated sequence coding for a DXPRI, which furthermore show the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also includes those nucleotide sequences which are obtained by modifying the DXPRI nucleotide sequence. The aim of such a modification can, for example, be to further narrow down the coding sequence contained therein or, for example, also to insert further restriction enzyme interfaces.
  • Functional equivalents are also those variants whose function is weakened or enhanced compared to the original gene or gene fragment.
  • artificial DNA sequences are suitable as long as, as described above, they impart the desired property, for example to increase the tocopherol content in the plant by overexpressing the DXPRI gene in crop plants.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translation of proteins constructed using molecular modeling which have DXPRI activity or by in vitro selection. Coding DNA sequences which are obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host plant are particularly suitable. The specific codon usage can easily be determined by a person skilled in plant genetic methods by computer evaluations of other, known genes of the plant to be transformed.
  • Suitable equivalent nucleic acid sequences are sequences which code for fusion proteins, part of the fusion protein being a DXPRI polypeptide or a functionally equivalent part thereof.
  • the second part of the fusion protein can e.g. be another polypeptide with enzymatic activity or an antigenic polypeptide sequence that can be used to detect DXPRI expression (e.g. myc-tag or his-tag).
  • this is preferably a regulatory protein sequence, such as e.g. a signal or transit peptide that directs the DXPRI protein to the desired site of action.
  • Increasing the content of tocopherols, vitamin K, chlorophylls, carotenoids and polyterpenes means in the context of the present invention the artificially acquired ability to increase the biosynthesis of these compounds by functional overexpression of the DXPRI gene in the plant compared to the non-genetically modified plant for the long term at least one plant generation.
  • the biosynthesis site of tocopherols is generally the leaf tissue, so that leaf-specific expression of the DXPRI gene is useful.
  • the tocopherol biosynthesis need not be limited to the leaf tissue, but can also be tissue-specific in all other parts of the plant - for example in fatty seeds.
  • constitutive expression of the exogenous DXPRI gene is advantageous.
  • inducible expression may also appear desirable.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed DXPRI gene can be determined, for example, in vitro by proliferation of the shoot meristem.
  • a change in the type and level of expression of the DXPRI gene and its effect on the tocopherol biosynthesis performance on test plants can be tested in greenhouse experiments.
  • the invention also relates to transgenic plants transformed with an expression cassette containing the sequence SEQ-ID No. 1 or hybridizing with these DNA sequences, as well as transgenic cells, tissues, parts and propagation material of such plants.
  • Transgenic crop plants such as e.g. Barley, wheat, rye, corn, oats, soy, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rape, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species.
  • Plants in the sense of the invention are mono- and dicotyledonous plants or algae.
  • DOX 1-deoxy-D-xylulose
  • ME methyllerythritol
  • cloning steps carried out in the context of the present invention such as e.g. Restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as with Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6.
  • the bacterial strains used below (E. coli, XL-I Blue) were obtained from Stratagene.
  • the Agrobacterium strain used for plant transformation (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 with the plasmid pGV2260 or pGV3850kan) was developed by Deblaere et al. in nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777.
  • the LBA4404 agrobacterial strain (Clontech) or other suitable strains can be used.
  • the vectors pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitro- gen), pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984),
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out using a laser fluorescence DNA sequencer from Licor (sold by MWG Biotech, Ebersbach) according to the method of Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463 - 5467).
  • DXPRI-homologous bacterial protein sequences could be identified in gene databases.
  • a comparison of the only 400 amino acid long protein sequences showed several conserved amino acid sequence motifs. Such a motif showed homologies with a stored genomic Arabidopsis sequence (accession number AB009053).
  • RNA from Arabidopsis thaliana was isolated and cDNA (according to manufacturer's information Stratagene) generated.
  • PCR primers were derived from the sequences AB009053 and AA586087, with which a 1215 bp DNA fragment was amplified from the cDNA produced.
  • the primer ATRv3 has a BamHI cleavage site and is selected such that after restriction digestion and ligation in pBluescript or pET5b (expression plasmid; Promega) the coding sequence is ligated in from the N-terminal first conserved sequence in the reading frame of the protein translation.
  • Atrv3 5 'TCAGGATCCGGCGCCTCGTCAATCT 3' Atrrl 5 'GACGAATTCTTCTTCCAACAACCAATTCT 3'
  • the primers Atrv3 and Atrrl contained a BamHI and an EcoRI interface, respectively (underlined).
  • the PCR product (Atrv3 / Atrrl) was purified using the Gene Clean Kit (Dianova GmbH, Hilden) and digested with BamHI and EcoRI.
  • the vector pET5b was also cut with BamHI and EcoRI for ligation.
  • the ligation products were transformed into E. coli XLlBlue (Stratagene).
  • the plasmid pET5bAtr contains a gene fragment coding for DXPRI from Arabidopsis thaliana. Its sequence was determined ( Figure 2, SEQ-ID No. 1). The nucleotide sequence obtained from the plasmid pEt5bAtr can be compared with the sequences AB009053 and AA586087. Accordingly, the genomic sequence AB009053 contains 10 introns.
  • the expression vector pET5b (Promega) is an expression vector for the expression of recombinant proteins in E. coli.
  • the plasmid is derived from pBR322 and carries a bacteriophage T7 promoter for expression.
  • the plasmid is propagated in an E. coli strain which carries an inducible gene for the T7 polymerase (e.g. JM109 (DE3); Promega).
  • the expression of the recombinant protein is activated by induction of the T7 polymerase.
  • pET5bAtr codes for a fusion protein with 420 amino acids
  • Amino acids 1 to 14 are derived from pET5b (fusion peptide; Figure 3).
  • Amino acids 15 to 420 come from the cloned DXPRI fragment (Fig. 2).
  • Fig. 3 the DNA sequence for the fusion peptide is underlined.
  • a molecular weight of 45.6 KDa for the protein can be calculated from the entire sequence.
  • the transgenic strain was incubated in the culture medium "2x YT" (per 1 l: bacto-trypton 16 g, yeast extract 10 g, NaCl 5 g). The cultivation took place at 37 ° C up to an OD 560 nm . from 0.6. According to IPTG (ImM), the growth continued for another 10 min at 37 ° C, then for another 4 h at 22 ° until harvest. The cells were centrifuged off and washed in 1% NaCl.
  • a crude protein extract was used for enzyme tests (in 4 ml extraction buffer (Tris / HCl (pH 7.5) 100 mM, MgCl 2 5mM, DTT 2mM, PMSF 0.1 mM).
  • the crude extracts were frozen with 20% glycerol at -20 ° C.
  • Detection was carried out by separating the product by thin layer chromatography on silica gel 60 (Merck) with acetone / ethyl acetate / water (50 + 50 + 2) with subsequent evaluation via instant imager.
  • 1-Deoxy-D-xylulose (DOX; Rf 0.4) and methyllerythritol (ME; Rf 0.2) are obtained.
  • Figure 9 shows the thin-layer chromatographic, autoradiographic evaluation after heterologous expression of the DXPRI from Arabidopsis thaliana in E. coli and enzyme assay using different total protein concentrations ( ⁇ g protein / ⁇ l).
  • K control E. coli JM 109 (DE3) with plasmid pET5b without DXPRI.
  • DOXS cloned from Chlamydomonas reinhardtii was used for the production of DOXP (pET5b, E. coli JM109 (DE3)).
  • Enzyme extracts from induced with IPTG E. coli cells were incubated with [3- 14 C] pyruvate and DL-GAP. The reaction was stopped after 30 min. by heat denaturation of the proteins. After centrifugation, the conversion of the radioactive pyruvate was checked by TLC / autoradiography and the supernatant was used as a substrate for the reductoisomerase.
  • DOXP as a reaction product was identified according to the following criteria: 1. A radioactive product is formed which, after treatment with alkaline phosphatase, behaves less polar in DC separations. This suggests that a phosphorylated product was formed from 14 C pyruvate and GAP.
  • the dephosphorylier e product runs in the TLC (silica gel, acetone / ethyl acetate / water 50/50/2) with a synthetic sample of 1-deoxy-D-xylulose.
  • the reaction mixture contained protein extract (20 ⁇ l / 100 ⁇ l mixture), Tris / HCl (pH 7.5) 100 mM, DTT 2 mM, MgCl 2 5 mM, Na-EDTA 500 ⁇ M, PMSF 100 ⁇ M, NaF 5 mM, TPP 1 mM , Na-pyruvate 1 mM, Na [2- 14 C] pyruvate 20 KBq / 100 ul and DL-glyceraldehyde hyd 3-phosphate 3.75 mM.
  • the primers were chosen such that after restriction digestion and ligation in pBin19AR-TP (Promega), the coding sequence from the N-terminal first conserved sequence is ligated in the reading frame of the protein translation.
  • AtrvpBinl 5 TCAGGATCCGGCGCCTCGTCAATCT 3'
  • AtrrpBin2 5 GACCCCGGGTTCTTCCAACAACCAATTCT 3'
  • the primers AtrvpBinl and AtrrpBin2 contained a BamHI and a Smal interface, respectively (underlined).
  • the PCR product (AtrvpBinl / AtrrpBin2) was purified using the Gene Clean Kit (Dianova GmbH, Hilden) and digested with BamHI and Smal.
  • the vector pBinl9AR-TP was also cut with BamHI and Smal, which additionally contains the transit peptide of the transketolase from potato behind the CaMV 35S promoter. The transit peptide ensures plastid localization.
  • the construct is shown in Figure 4.
  • the following primers were selected for cloning the DXPRI into a binary vector in antisense orientation.
  • AtrvpBin3 5 TCACCCGGGGGCGCCTCGTCAATCT 3' AtrrpBin4 5 'GACGGATCCTTCTTCCAACAACCAATTCT 3'
  • the primers AtrvpBin3 and AtrrpBin4 contained a Smal and a BamHI interface, respectively (underlined).
  • the PCR product (AtrvpBin3 / AtrrpBin4) was purified using a gene clean kit (Dianova GmbH, Hilden) and digested with Smal and BamHI.
  • the vector pBinl9AR-TP was also cut with Smal and BamHI, which additionally contains the transit peptide of the transketolase from potato behind the CaMV 35S promoter. The transit peptide ensures plastid localization.
  • the construct is shown in Figure 5.
  • Tobacco plants with reduced DXPRI activity were subjected to self-cultivation and the seeds obtained were harvested. Seeds from the Fl generation were used for further analysis of the plants.
  • the biomass analysis showed a correlation between the reduction in DXPRI activity and the reduction in biomass.
  • Extraction buffer 80% ethanol, 10 mM Hepes pH 7.0, 1 mM ascorbate
  • Fluorescence detection excitation at 295 nm, emission at
  • tobacco leaf disks with sequences of DXPRI (SEQ-ID No. 1), cloned as described in Example 4, were transformed into the transformation vector pBin19AR-TP.
  • SEQ-ID No. 1 sequences of DXPRI (SEQ-ID No. 1), cloned as described in Example 4 were transformed into the transformation vector pBin19AR-TP.
  • 10 ml of an overnight culture of Agrobacterium tumefaciens grown under selection were centrifuged off, the supernatant was discarded and the bacteria were resuspended in the same volume of antibiotic-free medium.
  • Leaf disks of sterile plants (diameter approx. 1 cm) were bathed in this bacterial suspension in a sterile petri dish.
  • the leaf disks were then placed in Petri dishes on MS medium (Murashige and Skoog, Physiol. Plant (1962) 15, 473) with 2% sucrose and 0.8% Bacto agar. After 2 days incubation in the dark at 25 ° C, they were on MS medium with 100 mg / l kanamycin, 500 mg / l claforan, 1 mg / 1 benzylaminopurine (BAP), 0.2 mg / l naphthylacetic acid (NAA), 1.6% glucose and 0.8% Bacto agar transferred and cultivation continued (16 hours light / 8 hours dark). Growing rungs were growing up hormone-free MS medium with 2% sucrose, 250mg / l Claforan and
  • transgenic rapeseed plants which have an altered prenyl lipid content, was based on a protocol by Bade, J.B. and Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Polypus, I. and Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in which the compositions of the media and buffers used are specified.
  • the transformations were carried out with the Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 (Clontech GmbH, Heidelberg).
  • the binary construct already described in Example 4 with the entire cDNA of DXPRI from Arabidopsis thaliana (SEQ-ID No. 1) was used as binary vectors.
  • the NOS terminator sequence was replaced by the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the Ti plasmid pTIACH5 (Gielen et al., 1984) for transcription termination.
  • Brassica napus seeds were sterilized with 70% (v / v) ethanol, washed for 10 min at 55 ° C in H 2 0, in 1% hypochlorite solution (25% v / v Teepol, 0.1% v / v Tween 20) incubated for 20 min and washed six times with sterile H0 for 20 min each.
  • the seeds were dried on filter paper for three days and 10-15 seeds were germinated in a glass flask with 15 ml of germination medium.
  • the roots and apices were removed from several seedlings (approx. 10 cm in size) and the remaining hypocotyls in approx. 6 mm long
  • the approx. 600 explants obtained in this way are washed with 50 ml of basal medium for 30 min and transferred to a 300 ml flask. After adding 100 ml of callus induction medium, the cultures were incubated for 24 h at 100 rpm.
  • An overnight culture of the Agrobacterium strain was set up at 29 ° C. in Luria Broth medium with kanamycin (20 mg / l), of which 2 ml in 50 ml Luria Broth medium without kanamycin for 4 h at 29 ° C. up to one OD 500 incubated from 0.4-0.5. After pelleting the culture at 2000 rpm for 25 min, the cell pellet was resuspended in 25 ml of basal medium. The concentration of the bacteria in the solution was adjusted to an OD OOO of 0.3 by adding further basal medium.
  • the callus induction medium was removed from the oilseed rape explants using sterile pipettes, 50 ml of Agrobacterium solution were added, mixed gently and incubated for 20 min.
  • the Agrobacteria Suspension was removed, the oilseed rape explant washed with 50 ml callus induction medium for 1 min and then 100 ml callus induction medium added.
  • the co-cultivation was carried out on a rotary shaker at 100 rpm for 24 h.
  • the co-cultivation was stopped by removing the callus induction medium and the explants were washed twice for 1 min with 25 ml and twice for 60 min with 100 ml washing medium at 100 rpm.
  • the washing medium with the explants was transferred to 15 cm petri dishes and the medium removed with sterile pipettes.
  • Takak plants transformed with the appropriate constructs were grown in the greenhouse.
  • the ⁇ -tocopherol content of the whole plant or the seeds of the plant was then determined. In all cases, the ⁇ -tocopherol concentration was increased compared to the non-transformed plant.
  • the Arabidopsis thaliana DXPRI cDNA (SEQ-No.I) was provided with a CaMV35S promoter and overexpressed in oilseed rape using the 35S promoter.
  • the seed-specific promoter of the phaseolin gene was used to specifically increase the tocopherol content in the rapeseed.
  • Rapeseed plants transformed with the appropriate constructs were grown in the greenhouse.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen durch Überexpression eines DXPRI-Gens.

Description

Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine 1-Desoxy- D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase in Pflanzen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine DNA kodierend für ein Polypeptid mit l-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase (DXPRI) -Aktivität pflanzlichen Ursprungs. Zudem betrifft die Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen codierend für ein Polypeptid mit
DXPRI-Aktivität pflanzlichen Ursprungs zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Carotinoiden, Vitamin K, Chlorophyllen und Polyterpenen, speziell die Verwendung der DNA- Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit dieser hybridisierenden DNA-Sequen- zen, einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Carotinoiden, Vitamin K, Chlorophyllen und Polyterpenen, sowie die derart hergestellte Pflanze selbst.
Ein wichtiges Ziel pflanzenmolekulargenetischer Arbeiten ist bis- her die Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Zuckern, Enzymen und Aminosäuren. Wirtschaftlich interessant ist jedoch auch die Entwicklung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitaminen, wie z.B. der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes.
Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-Ak- tivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E) . Die erste Gruppe (la-d) stammt von Tocopherol ab, die zweite Gruppe besteht aus Derivaten des Tocotrienols (2a- d) :
la , α-Tocopherol : R1 = R2 = R3 = CH3 lb , ß-Tocopherol [ 148-03-8] : R1 = R3 = CH3 , R2 = H lc , γ-Tocopherol [ 54-28-4 ] : R1 = H, R2 = R3 = CH3 ld, δ-Tocopherol [ 119-13-1 ] : R1 = R2 = H , R3 = CH3
2a, α-Tocotrienol [1721-51-3] : R1 = R2 = R3 = CH3
2b, ß-Tocotrienol [490-23-3]: R1 = R3 = CH3, R2 = H 2c, γ-Tocotrienol [14101-61-2]: R1 = H, R2 = R3 = CH3
2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3]: R1 = R2 = H, R3 = CH3
Wirtschaftlich große Bedeutung besitzt α-Tocopherol .
Der Entwicklung von Kulturpflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen durch Gewebekultur oder Samenmutagenese und natürliche Auswahl sind Grenzen gesetzt. So muß einerseits beispielsweise der Toco- pherol-Gehalt bzw. der Gehalt des gewünschten Stoffwechselendpro- duktes bereits in Gewebekultur erfaßbar sein und andererseits können nur diejenigen Pflanzen über Gewebekulturtechniken manipuliert werden, deren Regeneration zu ganzen Pflanzen aus Zellkulturen gelingt. Außerdem können Kulturpflanzen nach Mutagenese und Selektion unerwünschte Eigenschaften zeigen, die durch teil- weise mehrmalige Rückkreuzungen wieder beseitigt werden müssen. Auch wäre beispielsweise die Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes durch Kreuzung auf Pflanzen der selben Art beschränkt .
Aus diesen Gründen ist das gentechnische Vorgehen, beispielsweise die für die Tocopherol Syntheseleistung kodierenden, essentiellen Biosynthesegene zu isolieren und in Kulturpflanzen gezielt zu übertragen, dem klassischen Züchtungsverfahren überlegen. Dieses Verfahren setzt voraus, daß die Biosynthese und deren Regulation bekannt ist und daß Gene, die die Biosyntheseleistung beeinflus- sen, identifiziert werden.
Isoprenoide oder Terpenoide bestehen aus verschiedenen Klassen lipidlöslicher Moleküle und werden teilweise oder vollständig aus Cs-Isopren-Einheiten gebildet. Reine Prenyllipide (z.B. Carotinoide) bestehen aus C-Gerüsten, die ausschließlich auf Isopren-Einheiten zurückgehen, während gemischte Prenyllipide (z.B. Chlorophylle, Tocopherole und Vitamin K) eine Isoprenoid-Seiten- kette besitzen, die mit einem aromatischen Kern verbunden ist.
Ausgangspunkt der Biosynthese von Prenyllipiden sind 3 x Acetyl- CoA Einheiten, die über ß-Hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) und Mevalonat in die Ausgangs-Isopren-Einheit (C5) , dem Isopentenyl- pyrophosphat (IPP), umgewandelt werden. Kürzlich wurde durch in vivo Fütterungsexperimente mit C13 gezeigt, daß in verschiedenen Eubakterien, Grünalgen und pflanzlichen Chloroplasten ein Mevalo- nat-unabhängiger Weg zur Bildung von IPP beschritten wird (Abbil- düng 1) . Dabei werden Hydroxyethylthiamin, das durch De- carboxylierung von Pyruvat entsteht, und Glycerinalde- hyd-3-Phosphat (3-GAP) in einer durch die 1-Deoxy-D-Xylu- lose-5-Phosphat Synthase (DOXS) vermittelten "Transketolase"-Reaktion zunächst in l-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat umgewandelt (Lange et al, 1998; Schwender et al, 1997; Arigoni et al, 1997; Lichtenthaler et al, 1997; Sprenger et al, 1997). Dieses wird dann durch eine intramolekulare Umordnung durch die DXPRI in 2-c-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat und im weiteren zu IPP umgesetzt (Arigoni et al, 1997; Zeidler et al, 1998). Biochemische Daten deuten darauf hin, daß der Mevalonat-Weg im Zytosol operiert und zur Bildung von Phytosterolen führt. Das Antibiotikum Mevinolin, ein spezifischer Inhibitor der Mevalonat-Bildung, führt lediglich zur Inhibition der Sterol-Biosynthese im Zyto- plasma, während die Prenyllipid-Bildung in den Piastiden unbeein- flußt ist (Bach & Lichtenthaler, 1993). Der Mevalonat-unabhängige Weg ist dagegen plastidär lokalisiert und führt vornehmlich zur Bildung von Carotinoiden und plastidären Prenyllipiden (Schwender et al, 1997; Arigoni et al, 1997).
IPP steht im Gleichgewicht mit seinem Isomer, dem Dimethylallyl Pyrophosphat (DMAPP) . Eine Kondensation von IPP mit DMAPP in Kopf-Schwanz Anlagerung ergibt das Monoterpen (C10) Geranyl-Pyro- phosphat (GPP) . Die Addition von weiteren IPP Einheiten führt zum Sesquiterpen (C15) Farnesy-Pyrophosphat (FPP) und zum Diterpen (C20) Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat (GGPP) . Die Verknüpfung zweier GGPP Moleküle führt zur Bildung der C40-Vorläufer für Carotinoide.
Bei gemischten Prenyllipiden ist die Isopren-Seitenkette ver- schiedener Länge mit Nicht-Isopren Ringen verbunden wie beispielsweise ein Porphyrin-Ring bei Chlorophyll a und b. Die Chlorophylle und Phylloquinone enthalten eine C20 Phytyl-Kette, in der nur die erste Isopren-Einheit eine Doppelbindung enthält. GGPP wird durch die Geranylgeranyl-Pyrophosphat-Oxidoreduktase (GGPPOR) zum Phytyl-Pyrophosphat (PPP) umgeformt, dem Ausgangsstoff für die weitere Bildung von Tocopherolen.
Bei den Ringstrukturen der gemischten Prenyllipide, die zur Bildung der Vitamine E und K führen, handelt es sich um Quinone, deren Ausgangsmetabolite aus dem Shikimat-Weg stammen. Die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin bzw. Tyrosin werden in Hydroxy- phenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch Dioxygenierung in Homo- gentisinsäure überführt wird. Das Chorismat wird einerseits über
Erythrose-4-Phosphat, 3 '-Dehydrochinat, 3 '-Dehydroshikimat, Shi- kimat, Shikimat-3-Phosphat und 5 '-Enolpyruvylshikimat-S-Phosphat gebildet ( Abb. 1 ) . Dabei werden Fruktose-6-Phosphat und Glyce- rinaldehyd-3-Phosphat zu Xylulose-5-Phosphat und Eryt- hrose-4-Phosphat umgesetzt. Die oben beschriebene Homogentisin- säure wird anschließend an PPP gebunden, um den Vorläufer von α-Tocopherol und α-Tocoquinon, das 2-Methyl-6-phytylquinol, zu bilden. Durch Methylierungsschritte mit S-Adenosylmethionin als Methyl-Gruppen-Donor entsteht zunächst 2 , 3-Dimethyl-6-phytylqui- nol, dann durch Zyklisierung α-Tocopherol und durch nochmalige
Methylierung α-Tocopherol (Richter, Biochemie der Pflanzen, Georg
Thieme Verlag Stuttgart, 1996) .
In der Literatur finden sich Beispiele die zeigen, daß die Manipulation eines Enzyms den Metabolit-Fluß direktional beeinflußen kann. In Experimenten mit einer veränderten Expression der Phy- toen Synthase, welche zwei GGPP-Moleküle zu 15-cis-Phytoen miteinander verknüpft, konnte ein direkter Einfluß auf die Carotino- id-Mengen dieser transgenen Tomatenpflanzen gemessen werden (Fray und Grierson, Plant Mol .Biol .22 (4) , 589-602 (1993 ) ; Fray et al . , Plant J., 8, 693-701(1995)). Wie zu erwarten, zeigen transgene Tabakpflanzen mit verringerten Mengen an Phenylalanin-Ammonium Lyase reduzierte Phenylpropanoid-Mengen. Das Enzym Phenylalanin- Ammonium Lyase katalysiert den Abbau von Phenylalanin, entzieht es also der Phenylpropanoid-Biosynthese (Bäte et al.,Proc. Natl. Acad. Sei USA 91 (16): 7608-7612 (1994); Howles et al . , Plant Physiol. 112. 1617-1624(1996)).
Über die Erhöhung des Metabolitflusses zur Steigerung des Toco- pherol-Gehaltes in Pflanzen durch Überexpression einzelner Biosynthesegene ist bisher wenig bekannt. Lediglich WO 97/27285 beschreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch verstärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hy- droxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD) .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen.
Die Aufgabe wurden überraschenderweise gelöst durch die Über- expression eines l-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase (DXPRI)-Gens in den Pflanzen.
Um beispielsweise den Metabolit-Fluß aus dem Primärstoffwechsel in die Tocopherol-Biosynthese zu verstärken, wurde die Bildung von 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-P als essentiellem AusgangsSubstrat für alle plastidären Isoprenoide erhöht. Zu diesem Zweck wurde in transgenen Pflanzen die Aktivität der DXPRI durch Überexpression des DXPRI-Gens aus Arabidopsis thaliana erhöht. Dies kann prinzipiell auch durch Expression homologer oder heterologer DXPRI-Gene 5 erreicht werden. Eine Nukleotidsequenz codierend für eine DXPRI wurde aus E.coli beschrieben ( Accession Nummer AB 013300; Ku- zuyama et al . , 1998; Takahashi et al . , 1998).
In Beispiel 1 wird erstmals ein pflanzliches DXPRI-Gen (Abb. 2, 10 SEQ-ID No. 1) aus Arabidopsis thaliana beschrieben und in transgenen Pflanzen verstärkt exprimiert. Um eine Plastidenlokalisa- tion zu gewährleisten wird der DXPRI-Nukleotidsequenz aus Arabidopsis thaliana eine Transitsignalsequenz (Abb. 3, Abb. 4) vorangestellt. Fragment A (529 bp) in Abbildung 4 beinhaltet den 35S- 15 Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Nukleotide 6909 bis 7437 des Cauliflower-Mosaik-Virus) . Fragment B (259 bp) beinhaltet das Transitpeptid der Transketolase. Fragment E beinhaltet das Gen der DXPRI. Fragment D (192 bp) enthält das Polyadenylierungssi- gnal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTIACH5 (Gielen et al . , 20 1984) zur Transkriptionstermination. Auch geeignet als Expressionskassette ist eine DNA-Sequenz, die für ein DXPRI-Gen codiert, das mit SEQ-ID No . 1 hybridisiert und das aus anderen Organismen bzw. aus anderen Pflanzen stammt.
25 Das durch die zusätzliche Expression des DXPRI-Gens nun vermehrt zur Verfügung stehende 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-P wird weiter in Richtung Tocopherole, Carotinoide, Vitamin K, Chlorophylle und Polyterpene umgesetzt.
30 Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt durch Transformation der Pflanzen mit einem das DXPRI-Gen enthaltenden Konstrukt. Als Modellpflanzen für die Produktion von Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen wurden Tabak und Raps eingesetzt.
35
Antisensekonstrukte sowie homologe bzw. heterologe pflanzliche DXPRI-Gene wurden unabhängig voneinander in Pflanzen transformiert (Abb. 5). Fragment A (529 bp) in Abbildung 5 beinhaltet den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Nukleotide 6909 bis
40 7437 des Cauliflower-Mosaik-Virus) . Fragment B (259 bp) beinhaltet das Transitpeptid der Transketolase (Abbildung 3). Fragment E beinhaltet das Gen der DXPRI in Antisense-Orientierung. Fragment D (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTIACH5 (Gielen et al . , 1984) zur
45 Transkriptionstermination. Messungen an DXPRI-Antisensepflanzen ergaben bezüglich des Gehaltes an Tocopherolen und Carotinoiden eine drastische Abnahme. Dies belegt den direkten Einfluß der plastidären pflanzlichen DXPRI auf die Synthese von Carotinoiden und Tocopherolen.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 aus Arabidopsis thaliana, die für eine DXPRI oder deren funktioneile Äquivalente kodieren, zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Carotinoiden, Vitamin K, Chlorophyllen und Polyterpenen. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei z.B. eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine Expressionskassette geeignete kodierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für eine DXPRI kodieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion von Tocopherolen, Carotinoiden, Vitamin K, Chlorophyllen und Polyterpenen verleihen.
Die Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nuklein- säuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5 '-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3 '-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für das DXPRI-Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokali- sation im Apoplasten, in der Vakuole, in Piastiden, im Mitochon- drium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER) , im Zellkern, in Öl- körperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärker wie die 5 '-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res . 15 (1987), 8693 -8711).
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Tabak-Transformationsvektor pBinAR-Hyg eingebaut werden. Abb. 6 zeigt die Tabaktransformationsvektoren pBinAR-Hyg mit 35S-Promo- tor (A) bzw. pBinAR-Hyg mit samenspezifischem Promotor Phaseolin 796 (B) :
HPT: Hygromycin-Phosphotransferase OCS: Octopin-Synthase-Terminator - PNOS: Nopalin-Synthase-Promotor außerdem sind solche Restriktionsschnittstellen eingezeichnet, die nur einmal den Vektor schneiden.
Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder 5 Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al . , Cell 21 (1980),
10 285 - 294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al . , EMBO J. 8 (1989), 2195-2202) .
15
Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen DXPRI- Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z.B. der PRPl-Promotor (Ward
20 et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzeneεul- fonamid-induzierbarer (EP-A 388186), ein durch Tetrazyklin- induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch
25 Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können u.a. verwendet werden.
Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen
30 beispielsweise die Biosynthese von Tocopherol bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al . , EMBO J. 8 (1989),
35 2445 - 245) .
Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremdprotein stabil bis zu einem Anteil von 0,67 % des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen expri-
40 miert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094) . Die Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin- Promotor (US 5504200), den USP- (Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459 - 467) oder LEB4-Promotor (Fiedler und
45 Conrad, 1995)), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssignal enthalten. Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten DXPRI-DNA Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und DXPRI-DNA-Sequenz inserierten DNA, die für ein chloroplastenspezifisches Transit- peptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. En- quist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Piastiden, in die Vakuole, in das Mi ochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423). Für die Menge der Proteinakkumulation in transgenen Pflanzen besonders förderlich erwiesen hat sich eine Lokalisation im ER (Schouten et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792).
Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren DNA- Sequenz für ein DXPRI-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloroplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation des DXPRI-Gens in die Chloroplasten vom DXPRI-Teil enzymatisch abgespalten werden. Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidären DXPRI oder einem funktionellen Äquivalent dieses Transitpeptids (z.B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase) abgeleitet ist.
Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden-Transitpeptids der plastidären Transketolase aus Kartoffel in drei Leserastern als Kpnl/BamHI Fragmente mit einem ATG-Codon in der Ncol Schnittstelle:
pTP09
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA
ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGA TCC_BamHI
pTPlO
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTG GATCC_BamHI
pTPll
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGG ATCC_BamHI
Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine DXPRI kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen DXPRI-Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthe- tische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können ver- schiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5 '-3 '-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz die für ein DXPRI- Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnitt- stellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vi tro-Mutagenese, "primerre- pair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Von Bedeutung für den erfindungsgemäßen Erfolg kann u.a. das An- hängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schou- ten, A. et al . , Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781 - 792), die durchschnit liche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny- lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al . , EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.
Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor (bevorzugt den CaMV 35 S-Promotor) , das LeB4-Signalpep- tid, das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthalten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.
Vorzugsweise wird die fusionierte Expressionskassette, die für ein DXPRI-Gen kodiert, in einen Vektor, beispielsweise pBinl9, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15 - 38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Ex- pression eines DXPRI-Gens enthalten.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine DXPRI kodierenden DNA wird eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzli- ehe funktioneile Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Bio- technology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71 - 119 (1993) beschrieben.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u.a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer Expressionskassette enthaltend DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen zur Transformation von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Gehaltes an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen der Pflanze.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des Gehaltes an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyll und Polyterpenen eingesetzt werden.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnähme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation 5 trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic
10 Press (1993), 128 - 143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Phy- siol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205 - 225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res.
15 12 (1984) , 8711) .
Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Hafer, Soja,
20 Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
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Funktioneil äquivalente Sequenzen, die für ein DXPRI-Gen kodieren, sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotid- sequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der
30 hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere 35 auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine DXPRI kodierende Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise 40 auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der DXPRI-Nukleotid- sequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnitt- 45 stellen sein. Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes in der Pflanze durch Überexpression des DXPRI-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rücküber- setzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die DXPRI-Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spe- zifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein DXPRI-Polypeptid oder ein funktioneil äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf DXPRI-Expression möglich ist (z.B. myc-tag oder his-tag) . Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z.B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das DXPRI-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.
Erhöhung des Gehaltes an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Carotinoiden und Polyterpenen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung dieser Verbindungen durch funktionelle Überexpression des DXPRI-Gens in der Pflanze gegenüber der nicht gen- technisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.
Der Biosyntheseort von Tocopherolen beispielsweise ist im allgemeinen das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression des DXPRI-Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Tocopherol-Biosynthese nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann. Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen DXPRI-Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten DXPRI- Gens kann beispielsweise in vi tro durch Sproßmeristemvermehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des DXPRI-Gens und deren Auswirkung auf die Tocopherol- Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen gete- stet werden.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, transformiert mit einer Expressionskassette enthaltend die Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z.B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies.
Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen oder Algen.
Da es sich bei diesem Biosyntheseweg um einen ausschließlich chloroplastidär-lokalisierten Stoffwechselweg handelt, bietet er optimale Targetenzyme für die Entwicklung von Inhibitoren. Da sich nach heutigem Stand der Technik kein mit der Arabidopsis thaliana DXPRI identisches oder ähnliches Enzym in anderen höhe- ren Organi-smen befindet, ist davon auszugehen, daß Inhibitoren sehr spezifisch auf Pflanzen wirken sollten. Der Wirkort eines Inhibitors, Fosmidomycin (3- (N-formyl-N-hydroxyamino) -propyl- phosphonsäure; Fujisawa Pharmaceutical Co.) konnte als DXPRI identifiziert werden. Im biochemischen Assay findet man eine ef- fektive Hemmung der enzymatischen Aktivität (Abb. 7) . Folgende Abkürzungen wurden in Abb. 7 verwendet: DOX = 1-Deoxy-D-xylulose, ME = Methylerythritol . Die gleiche Wirkung findet man in einem Pflanzenassay, in dem Gerstenkeimlinge nach Fosmidomycinwirkung auf ihren Chlorophyll- und Carotinoidgehalt untersucht werden. Beide Substanzen, die sich aus Vorläufern des Isoprenoidstoff- wechsels ableiten, sind in ihren Mengen stark erniedrigt (Abb. 8) .
Durch Überexpression der für eine DXPRI kodierenden Gensequenz SEQ-ID NO. 1 bzw. SEQ-ID No. 3 in einer Pflanze kann prinzipiell eine erhöhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der DXPRI erreicht werden. Die derart hergestellten transgenen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind:
Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekennzeichnet, daß man Expressionskassetten enthaltend eine DNA- Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflanzen einbringt.
Verwendung der Expressionskassette enthaltend eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der DXPRI durch verstärkte Expression der DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA Sequenzen.
Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hy- bridisierende DNA-Sequenzen zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Carotinoiden und Polyterpenen durch Expression einer DXPRI DNA-Sequenz in Pflanzen.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:
Allgemeine Klonierungsverfahren
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonie- rungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gel- elektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al . (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt.
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli , XL-I Blue) wurden von Stratagene bezogen. Der zur Pflanzentransformation verwendete Agrobakterienstamm (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kan) wurde von Deblaere et al. in Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777 beschrieben. Alternativ können auch der Agrobakterienstamm LBA4404 (Clontech) oder andere geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung können die Vektoren pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103 - 119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega) , pZerO (Invitro- gen), pBinl9 (Bevan et al . , Nucl . Acids Res. 12 (1984),
8711 - 8720) und pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66
(1990), 221 - 230) benutzt werden.
Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463 - 5467).
Beispiel 1
Klonierung der Arabidopsis thaliana DXPRI
Ausgehend von der in der Genbank abgelegten Sequenz der E. coli DXPRI konnten in Gendatenbanken andere DXPRI-homologe bakterielle Proteinsequenzen identifiziert werden. Ein Vergleich der je lediglich 400 Aminosäuren langen Proteinsequenzen zeigte mehrere konservierte Aminosäure-Sequenzmotive. Ein solches Motif zeigte Homologien mit einer abgelegten genomischen Arabidopsis-Sequenz (Accession Nummer AB009053).
Da die bakteriellen DXPRI-Sequenzen nahe am vermeintlichen N-Ter- minus eine konservierte Aminosäurensequenz aufweisen, wurde der Beginn eines funktionellen Teils der AraJidopsis-DXPRI-Sequenz sehr genau in abgelegten genomischen Sequenzen lokalisiert. Das C-terminale Ende der Sequenz (Stop-Codon) konnte durch einen Vergleich mit dem EST-Klon (Accession Nummer AA586087) gefunden wer- den. Es wurde ein 1215 bp großes Fragment der DXPRI kloniert, welches durch heterologe Expression auf enzymatische Funktionalität untersucht wurde.
Es wurde mRNA aus Arabidopsis thaliana (var. Columbia) isoliert und cDNA (nach Herstellerangaben Stratagene) erzeugt. Es wurden aus den Sequenzen AB009053 und AA586087 PCR-Primer abgeleitet, mit welchen aus der hergestellten cDNA ein 1215 bp großes DNA- Fragment amplifiziert wurde. Der Primer ATRv3 besitzt eine BamHI- Schnittstelle und ist so gewählt, daß nach Res riktionsverdau und Ligation in pBluescript oder pET5b (Expressionsplasmid; Promega) die kodierende Sequenz ab der N-terminalen ersten konservierten Sequenz im Leserahmen der Proteintranslation einligiert wird.
Atrv3 5 ' TCAGGATCCGGCGCCTCGTCAATCT 3 ' Atrrl 5' GACGAATTCTTCTTCCAACAACCAATTCT 3' Die Primer Atrv3 und Atrrl enthielten eine BamHI- bzw. eine EcoRI-Schnittstelle (jeweils unterstrichen) . Das PCR-Produkt (Atrv3 /Atrrl) wurde mittels Gene-Clean-Kit (Dianova GmbH, Hilden) gereinigt und mit BamHI und EcoRl verdaut. Zur Ligation wurden der Vektor pET5b ebenfalls mit BamHI und EcoRl geschnitten. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli XLlBlue (Stratagene) transformiert.
Das Plasmid pET5bAtr enthält ein Genfragment kodierend für DXPRI aus Arabidopsis thaliana. Dessen Sequenz wurde bestimmt (Abbildung 2, SEQ-ID No.l). Die aus dem Plasmid pEt5bAtr erhaltene Nu- cleotid-Sequenz läßt sich mit den Sequenzen AB009053 und AA586087 abgleichen. Demnach enthält die genomische Sequenz AB009053 10 Introns.
Beispiel 2
Klonierung der Arabidopsis thaliana DXPRI in den Expressionsvek- tor pET5bAtr und Nachweis der enzymatischen Aktivität.
Der Expressionsvektor pET5b (Promega) ist ein Expressionsvektor für die Expression rekombinanter Proteine in E. coli . Das Plasmid ist abgeleitet von pBR322 und trägt für die Expression einen Bak- teriophage T7-Promotor. Zur Expression wird das Plasmid in einem E. coli-Stamm vermehrt, welcher ein induzierbares Gen für die T7-Polymerase trägt (z.B. JM109(DE3); Promega). Die Expression des rekombinanten Proteines wird aktiviert über die Induktion der T7-Polymerase .
pET5bAtr codiert für ein Fusionsprotein mit 420 Aminosäuren
Länge. Die Aminosäuren 1 bis 14 stammen aus pET5b (Fusionspeptid; Abbildung 3). Die Aminosäuren 15 bis 420 stammen aus dem klonier- ten DXPRI-Fragment (Abb. 2). In Abb. 3 ist die DNA-Sequenz für das Fusionspeptid unterstrichen. Aus der gesamten Sequenz läßt sich ein Molekulargewicht von 45,6 KDa für das Protein berechnen.
Der transgene Stamm wurde im Anzuchtsmedium "2x YT" (pro 1 1: Bacto-Trypton 16 g, Hefe-Extrakt 10 g, NaCl 5g) inkubiert. Die Anzucht erfolgte bei 37°C bis zu einer OD560 nm. von 0,6. Nach Zu- gäbe von IPTG (ImM) erfolgte das Wachstum weitere 10 min bei 37°C, dann weitere 4h bei 22° bis zur Ernte. Die Zellen wurden abzentri- fugiert und in 1% NaCl gewaschen. Nach Aufbruch der Zellen (50 bis 500 ml Zellkultur (OD560 nm von 1,0) mittels French Press wurde ein Protein-Rohextrakt für Enzymtests verwendet (in 4 ml Extrak- tionspuffer (Tris/HCl (pH 7,5) 100 mM, MgCl2 5 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,1 mM) . Zur Aufbewahrung wurden die Rohextrakte mit 20% Glycerin bei -20°C eingefroren.
Für den Enzymtest wurden 15 μl (auf 1 bis 7 mg Protein/ml ver- dünnt) Proteinextrakt mit MnCl2 (1 mM) , NaF (5 mM) , NADPH (0,5 mM) und 14C-l-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat (0,25 mM, 3 KBq) für 30 min. bei 30°C inkubiert. Das Abstoppen der Reaktion erfolgte bei 100°C (30 sec.) durch Zugabe von CaCl2 (auf 100 mM) und alkalischer Phosphatase (0.5 units) . Das Dephosphorylieren des Produk- tes erfolgte für 2h bei 30°C. Die Detektion erfolgte durch die dünnschichtchromatographische Auftrennung des Produktes auf Kieselgel 60 (Merck) mit Aceton/Ethylacetat/Wasser (50+50+2) mit anschließender Auswertung via Instant Imager. Man erhält 1-Deoxy- D-xylulose (DOX; Rf 0,4) und Methylerythritol (ME; Rf 0,2). Ab- bildung 9 gibt die dünnschichtchromatographische, autoradiographische Auswertung nach heterloger Expression der DXPRI aus Arabidopsis thaliana in E. coli und Enzymassay bei Einsatz verschiedener Gesamt-Proteinkonzentrationen (μg Protein/μl) wieder. K = Kontrolle E. coli JM 109 (DE3) mit Plasmid pET5b ohne DXPRI. Proben: E. coli JM 109 (DE3) mit Plasmid pET5b mit DXPRI aus Arabidopsis thaliana. Die Bildung von ME kann effektiv inhibiert werden durch Verwendung von Fosmidomycin in verschiedenen Konzentrationen. Dies zeigt den "mode-of-action" von Fosmidomycin als Inhibitor der DXPRI.
Beispiel 3
Herstellung des Substrats l-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat (DOXP) für den Enzymassay
Für die Herstellung von DOXP wurde aus Chlamydomonas reinhardtii klonierte DOXS verwendet (pET5b, E. coli JM109(DE3)).
Enzymextrakte aus mit IPTG induzierten E. coli-Zellen wurde mit [3-14C] -Pyruvat und DL-GAP inkubiert. Die Reaktion wurde abgestoppt nach 30 min. durch Hitzedenaturierung der Proteine. Nach Abzentrifugieren wurde der Umsatz des radioaktiven Pyruvats mittels DC/Autoradiographie überprüft und der Überstand als Substrat für die Reduktoisomerase verwendet.
DOXP als Reaktionsprodukt wurde nach folgenden Kriterien identifiziert: 1. Es entsteht ein radioaktives Produkt, welches nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase sich in DC-Trennungen weniger polar verhält. Dies legt nahe, daß ein phosphoryliertes Produkt aus 14C-Pyruvat und GAP gebildet wurde.
2. Das dephosphorylier e Produkt läuft in der DC (Kieselgel, Aceton/Ethylacetat/Wasser-50/50/2) gleich mit einer synthetischen Probe von 1-Desoxy-D-Xylulose.
Der Reaktionsansatz enthielt Proteinextrakt (20 μl/lOOμl Ansatz), Tris/HCl (pH 7,5) 100 mM, DTT 2 mM, MgCl2 5 mM, Na- EDTA 500 μM, PMSF 100 μM, NaF 5 mM, TPP 1 mM, Na-Pyruvat 1 mM, Na-[2-14C] Pyruvat 20 KBq/100 μl und DL-Glycerinalde- hyd-3-Phosphat 3,75 mM.
Beispiel 4
Klonierung der Arabidopsis thaliana DXPRI in den Pflanzentransformationsvektor pBinl9AR-TP
Zur Klonierung der DXPRI in einen binären Vektor wurden die Primer so gewählt, daß nach Restriktionsverdau und Ligation in pBinl9AR-TP (Promega) die kodierende Sequenz ab der N-terminalen ersten konservierten Sequenz im Leserahmen der Proteintranslation einligiert wird.
AtrvpBinl 5 ' TCAGGATCCGGCGCCTCGTCAATCT 3 '
AtrrpBin2 5' GACCCCGGGTTCTTCCAACAACCAATTCT 3 '
Die Primer AtrvpBinl und AtrrpBin2 enthielten eine BamHI- bzw. eine Smal-Schnittstelle (jeweils unterstrichen) . Das PCR-Produkt (AtrvpBinl/AtrrpBin2) wurde mittels Gene-Clean-Kit (Dianova GmbH, Hilden) gereinigt und mit BamHI und Smal verdaut. Zur Ligation wurden der Vektor pBinl9AR-TP ebenfalls mit BamHI und Smal ge- schnitten, der zusätzlich das Transitpeptid der Transketolase aus Kartoffel hinter dem CaMV 35S Promotor enthält. Das Transitpeptid gewährleistet die plastidäre Lokalisierung. Das Konstrukt ist in Abbildung 4 dargestellt.
Beispiel 5
Herstellung von DXPRI-Antisense-Konstrukten
Zur Klonierung der DXPRI in einen binären Vektor in Antisense- Orientierung wurden folgende Primer gewählt.
AtrvpBin3 5 ' TCACCCGGGGGCGCCTCGTCAATCT 3 ' AtrrpBin4 5 ' GACGGATCCTTCTTCCAACAACCAATTCT 3 '
Die Primer AtrvpBin3 und AtrrpBin4 enthielten eine Smal- bzw. eine BamHI- Schnittstelle (jeweils unterstrichen) . Das PCR- Produkt (AtrvpBin3/AtrrpBin4) wurde mittels Gene-Clean-Kit (Dianova GmbH, Hilden) gereinigt und mit Smal und BamHI verdaut. Zur Ligation wurden der Vektor pBinl9AR-TP ebenfalls mit Smal und BamHI geschnitten, der zusätzlich das Transitpeptid der Transketolase aus Kartoffel hinter dem CaMV 35S Promotor enthält. Das Transitpeptid gewährleistet die plastidäre Lokalisierung. Das Konstrukt ist in Abbildung 5 dargestellt.
Tabakpflanzen mit reduzierter DXPRI-Aktivität wurden einer Selb- stung unterzogen und der erhaltene Samen geerntet. Zur weiteren Analyse der Pflanzen wurde Samen aus der Fl-Generation verwendet.
Alle untersuchten Antisense-Pflanzen zeigten hinsichtlich der Pflanzengröße deutliche Unterschiede auf. Es wurden Pflanzen gefunden, die die gleiche Größe hatten wie der Wildtyp, bis hin zu ganz kleinen Pflanzen. Die nachfolgenden Generationen waren also nicht einheitlich. Dies gilt auch für die Reduktion in der DXPRI- Aktivität, die innerhalb einer Linie nicht einheitlich war, d.h. man kann eine Linie nicht durch eine spezifische Reduktion in der DXPRI-Aktivität definieren, sondern die Linien spalten auf (Sedo- heptulose-1, 7-Bisphosphatase-antisense-Tabak-Pflanzen weisen ein vergleichbares Phänomen auf; vgl. Harrison et al. 1998, Planta 204: 27-36) .
Die Biomassen-Analyse ergab eine Korrelation zwischen Reduktion der DXPRI-Aktivität und Reduktion in der Biomasse.
Beispiel 6
Extraktion und Detektion von Tocopherol
Extraktionsverfahren :
100 mg Feuchtgewicht Blattmaterial
Extraktionspuffer : 80 % Ethanol, 10 mM Hepes pH 7,0, 1 mM Ascorbat
Extraktion: 1:5 ( w/v)
Inkubation bei 50°C, 30 Minuten
Keine Zentrifugation
Zugabe von Vi Volumen n-Hexan zu dem Extrakt - Vortex und Zentrifugation (5 Minuten, Raumtemperatur )
Gewinnung der oberen sehr grün gefärbten Phase
Wiederholung der n-Hexan Extraktion mit der unteren Phase Vereinigung der n-Hexan Phasen
Vakuum Trocknung ( 2-3 Stunden für 1 ml n-Hexan bei Raumtemperatur )
Wiederauflösung des Rückstandes in ca. 1/5 des ursprünglichen n-Hexan Volumens
Injektion von 30 - 50 μl auf die HPLC
HPLC-Detektion für Tocopherol
Detektion der Fluoreszenz: Anregung bei 295 nm, Emission bei
330 nm - Säule: RP-18 ( Nucleosil 100, C18, 3μm, Fa. Knauer )
Isokratisches System: n-Hexan plus 0,2 % 2-Propanol
Fluß: 0,8 ml/min ( Druck: 110 bar )
Standards von Sigma oder Merck
Laufzeit: 15 Minuten
Beispiel 7
Extraktion phenolischer Substanzen aus Blättern und HPLC-Analytik
Die Extraktion phenolischer Substanzen aus Blättern wurde wie bei Yao et al., The Plant Cell, 7 (1995), 1787 - beschrieben durchgeführt .
Beispiel 8
Herstellung von transgenen Tabakpflanzen
(Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) .
Für die Herstellung transgener Tabakpflanzen, die einen veränderten Prenyllipidgehalt aufweisen, wurden Tabakblattscheiben mit Sequenzen der DXPRI ( SEQ-ID No. 1), kloniert wie in Beispiel 4 beschrieben in den Transformationsvektor pBinl9AR-TP, transformiert. Zur Transformation von Tabakpflanzen wurden 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Bakterien in gleichem Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (Durchmesser ca. 1 cm) in dieser Bakteriensuspension gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog, Physiol. Plant (1962) 15, 473) mit 2% Saccharose und 0.8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach 2-tä- giger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 100mg/l Kanamycin, 500mg/l Claforan, lmg/1 Benzylaminopurin (BAP), 0.2mg/l Naphtylessigsäure (NAA) , 1.6% Glukose und 0.8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 2% Saccharose, 250mg/l Claforan und
0.8% Bacto-Agar überführt .
Beispiel 9
Herstellung von transgenen Rapspflanzen (Brassica napus)
Die Herstellung der transgenen Rapspflanzen, die einen veränderten Prenyllipidgehalt aufweisen, orientierte sich an einem Proto- koll von Bade, J.B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Po- trykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzungen der verwendeten Medien und Puffer angegeben sind.
Die Transformationen erfolgten mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404 (Clontech GmbH, Heidelberg) . Als binäre Vektoren wurden das bereits in Beispiel 4 beschriebene binäre Konstrukt mit der gesamten cDNA der DXPRI aus Arabidopsis thaliana ( SEQ-ID No.l ) verwendet. In allen hier verwendeten binären Vektoren wurde die NOS-Terminatorsequenz durch das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTIACH5 (Gielen et al . , 1984) zur Transkriptionstermination ersetzt. Brassica napus Samen wurden mit 70% (v/v) Ethanol oberflächensteril gemacht, 10 min bei 55°C in H20 gewaschen, in l%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 min inkubiert und sechsmal mit sterilem H0 für jeweils 20 min gewaschen. Die Samen wurden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glasskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange
Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explante werden 30 min mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einen 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallus-Induktionsmedium wurden die Kulturen für 24 h bei 100 U/min inkubiert.
Vom Agrobacterium-Stamm wurde eine Übernachtkultur bei 29°C in Lu- ria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/1) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 h bei 29°C bis zu einer OD500 von 0,4 - 0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine ODÖOO von 0.3 eingestellt.
Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien- Suspension wurde entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus- Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co- Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wurde in 15 cm Pe- trischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten ent- fernt.
Zur Regeneration wurden jeweils 20-30 Explante in 90 mm Petri- schalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kanamycin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wurden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß- Induktionsmedium überführt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen wurde wie von Bade, J.B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G. , eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt .
Beispiel 10
Steigerung der Tocopherolbiosynthese in Tabak
Die Überexpression der DXPRI aus Arabidopsis thaliana in Tabak erfolgte wie in Beispiel 8 beschrieben.
Mit den entsprechenden Konstrukten transformierte Takakpflanzen wurden im Gewächshaus angezogen. Anschließend wurde der α-Toco- pherolgehalt der Gesamtpflanze bzw. der Samen der Pflanze bestimmt. In allen Fällen war die α-Tocopherolkonzentration im Verg- leich zur nicht transfomierten Pflanze erhöht.
Beispiel 11
Steigerung der Tocopherolbiosynthese in Raps
Die cDNA der DXPRI aus Arabidopsis thaliana ( SEQ-No.l ) wurde mit einem CaMV35S-Promotor versehen und in Raps unter Verwendung des 35S-Promotors überexprimier . Parallel dazu wurde der samenspezifische Promotor des Phaseolingenes verwendet, um den Tocopherol- gehalt spezifisch im Rapssamen zu erhöhen. Mit den entsprechenden Konstrukten transformierte Rapspflanzen wurden im Gewächshaus angezogen. Anschließend wurde der α-Tocopherolgehalt der Gesamtp- flanze bzw. der Samen der Pflanze bestimmt. In allen Fällen war die α-Tocopherolkonzentration im Vergleich zur nicht transformierten Pflanze erhöht.
Abbildung 1
Schematische Übersicht des Prenyllipidstof fwechsels
Pyruvat, Glyzerinaldehyp osphat
Chlorophylie Carotinoide
SAM-Methyltransferase Phylioquinone
2,3-Mefe-P ytylquinol Tocopherol Cyclase
Y-Tocop Iherol
SAM-Methyltransferase
"-Tocopherol Abbildung 2
Nukleotid-Sequenz der DXPRI aus Arabidopsis thaliana
5 GCGCCTCGTCAATCTTGGGATGGACCAAAACCCATCTCTATCGTTGGATCTACTGGTTCTATTGG CACTCAGACATTGGATATTGTGGCTGAGAATCCTGACAAATTCAGAGTTGTGGCTCTAGCTGCTG GTTCGAATGTTACTCTACTTGCTGATCAGGTAAGGAGATTTAAGCCTGCATTGGTTGCTGTTAGA AACGAGTCACTGATTAATGAGCTTAAAGAGGCTTTAGCTGATTTGGACTATAAACTCGAGATTAT TCCAGGAGAGCAAGGAGTGATTGAGGTTGCCCGACATCCCGAAGCTGTAACCGTTGTTACCGGAA
10 TAGTAGGTTGTGCGGGACTAAAGCCTACGGTTGCTGCAATTGAAGCAGGAAAGGACATTGCTCTT GCAAACAAAGAGACATTAATCGCAGGTGGTCCTTTCGTGCTTCCGCTTGCCAACAAACATAATGT AAAGATTCTTCCGGCAGATTCAGAACATTCTGCCATATTTCAGTGTATTCAAGGTTTGCCTGAAG GCGCTCTGCGCAAGATAATCTTGACTGCATCTGGTGGAGCTTTTAGGGATTGGCCTGTCGAAAAG CTAAAGGAAGTTAAAGTAGCGGATGCGTTGAAGCATCCAAACTGGAACATGGGAAAGAAAATCAC
15 TGTGGACTCTGCTACGCTTTTCAACAAGGGTCTTGAGGTCATTGAAGCGCATTATTTGTTTGGAG CTGAGTATGACGATATAGAGATTGTCATTCATCCGCAAAGTATCATACATTCCATGATTGAAACA CAGGATTCATCTGTGCTTGCTCAATTGGGTTGGCCTGATATGCGTTTACCGATTCTCTACACCAT GTCATGGCCCGATAGAGTTCCTTGTTCTGAAGTAACTTGGCCAAGACTTGACCTTTGCAAACTCG GTTCATTGACTTTCAAGAAACCAGACAATGTGAAATACCCATCCATGGATCTTGCTTATGCTGCT
20 GGACGAGCTGGAGGCACAATGACTGGAGTTCTCAGCGCCGCCAATGAGAAAGCTGTTGAAATGTT CATTGATGAAAAGATAAGCTATTTGGATATCTTCAAGGTTGTGGAATTAACATGCGATAAACATC GAAACGAGTTGGTAACATCACCGTCTCTTGAAGAGATTGTTCACTATGACTTGTGGGCACGTGAA TATGCCGCGAATGTGCAGCTTTCTTCTGGTGCTAGGCCAGTTCATGCATGA
25
Abbildung 3
Nukleotid-Sequenz der DXPRI aus Arabidopsis thaliana als Fusionssequenz
30
1 ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCCGGCGCCTCG
51 TCAATCTTGGGATGGACCAAAACCCATCTCTATCGTTGGATCTACTGGTT
101 CTATTGGCACTCAGACATTGGATATTGTGGCTGAGAATCCTGACAAATTC
151 AGAGTTGTGGCTCTAGCTGCTGGTTCGAATGTTACTCTACTTGCTGATCA
35 201 GGTAAGGAGATTTAAGCCTGCATTGGTTGCTGTTAGAAACGAGTCACTGA
251 TTAATGAGCTTAAAGAGGCTTTAGCTGATTTGGACTATAAACTCGAGATT
301 ATTCCAGGAGAGCAAGGAGTGATTGAGGTTGCCCGACATCCCGAAGCTGT
351 AACCGTTGTTACCGGAATAGTAGGTTGTGCGGGACTAAAGCCTACGGTTG
401 CTGCAATTGAAGCAGGAAAGGACATTGCTCTTGCAAACAAAGAGACATTA
40 451 ATCGCAGGTGGTCCTTTCGTGCTTCCGCTTGCCAACAAACATAATGTAAA
501 GATTCTTCCGGCAGATTCAGAACATTCTGCCATATTTCAGTGTATTCAAG
551 GTTTGCCTGAAGGCGCTCTGCGCAAGATAATCTTGACTGCATCTGGTGGA
601 GCTTTTAGGGATTGGCCTGTCGAAAAGCTAAAGGAAGTTAAAGTAGCGGA
651 TGCGTTGAAGCATCCAAACTGGAACATGGGAAAGAAAATCACTGTGGACT
45 701 CTGCTACGCTTTTCAACAAGGGTCTTGAGGTCATTGAAGCGCATTATTTG
751 TTTGGAGCTGAGTATGACGATATAGAGATTGTCATTCATCCGCAAAGTAT
801 CATACATTCCATGATTGAAACACAGGATTCATCTGTGCTTGCTCAATTGG 851 GTTGGCCTGATATGCGTTTACCGATTCTCTACACCATGTCATGGCCCGAT 901 AGAGTTCCTTGTTCTGAAGTAACTTGGCCAAGACTTGACCTTTGCAAACT 951 CGGTTCATTGACTTTCAAGAAACCAGACAATGTGAAATACCCATCCATGG 1001 ATCTTGCTTATGCTGCTGGACGAGCTGGAGGCACAATGACTGGAGTTCTC 1051 AGCGCCGCCAATGAGAAAGCTGTTGAAATGTTCATTGATGAAAAGATAAG 1101 CTATTTGGATATCTTCAAGGTTGTGGAATTAACATGCGATAAACATCGAA 1151 ACGAGTTGGTAACATCACCGTCTCTTGAAGAGATTGTTCACTATGACTTG 1201 TGGGCACGTGAATATGCCGCGAATGTGCAGCTTTCTTCTGGTGCTAGGCC 1251 AGTTCATGCATGAAGAATTGGTTGTTGGAAGAAGAATTC
Abbildung 4
Binärer Vektor zur Überexpression des DXPRI-Gens aus Arabidopsis thaliana im Piastiden transgener Pflanzen
Abbildung 5
Binärer Vektor zur Antisense-Expression des DXPRI-Gens aus Arabi - dopsis thaliana im Piastiden transgener Pflanzen
Abbildung 6
Abbildung 7
Nachweis der Hemmbarkeit mit Fosmidomycin und Cofaktorbedarf der DXPRI :
ME
• • • kemNADPH
5 μM Fosmidomycin Abbildung 8
Einfluß von Fosmidomycin auf die Neubildung von Pigmenten in etiolierten Gerstenkeimlingen
Abbildung 9
Heterologe Expression der DXPRI aus Arabidopsis thaliana in E. coli
27 10 20 50 100 μg Protein / 20 μl K

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Sequenz SEQ ID No. 1 und damit hybridisierende DNA-Se- quenzen kodierend für eine pflanzliche 1-Desoxy-D-Xylu- lose-5-Phosphat Reduktoisomerase .
2. Verwendung von DNA-Sequenzen codierend für eine 1-Desoxy- D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen.
3. Verwendung einer DNA-Sequenz SEQ ID No. 1 oder einer mit dieser hybridisierenden DNA-Sequenz kodierend für eine 1-Desoxy- D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen.
4. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und
Polyterpenen, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder eine mit dieser hybridisierenden DNA-Sequenz in Pflanzen exprimiert wird.
5. Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekennzeichnet, daß man eine Expressionskassette enthaltend einen Promotor und eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder eine mit dieser hybridisierende DNA-Sequenz in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflan- zenzellen einbringt.
6. Verfahren zur Transformation von Pflanzen gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe des Stammes Agrobacterium tumefaciens, der Elektroporation oder der particle bombardment Methode erfolgt.
7. Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen enthaltend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 5.
8. Pflanze nach Anspruch 7, ausgewählt aus der Gruppe Soja, Ca- nola, Gerste, Hafer, Weizen, Raps, Mais oder Sonnenblume. Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine 1-Desoxy- D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase in Pflanzen
Zusammenfassung
Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen durch Überexpression eines DXPRI-Gens.
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